MX2009014243A

MX2009014243A - Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-saccharomyces.

Info

Publication number: MX2009014243A
Application number: MX2009014243A
Authority: MX
Inventors: Dulce Maria Diaz Montano; Juan Octavio Valle Rodriguez
Original assignee: Ct De Investigacion Y Asistencia En Tecnologia Y Diseno Del Estado De Jalisco A C
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2009-12-21
Publication date: 2011-06-21
Also published as: MX337330B; WO2011078642A3; WO2011078642A2

Abstract

Esta invención se refiere a procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces en la fermentación de jugo de frutas, vegetales, tubérculos y macerados de cereales. Las levaduras no-Saccharomyces han recobrado interés por su capacidad de generar aromas y perfumes agradables; sin embargo, su uso en la elaboración de bebidas alcohólicas está limitada por su baja capacidad fermentativa debido a una presunta intolerancia al etanol. En esta invención se presenta un proceso de propagación para obtener levaduras no-Saccharomyces activas así como un proceso para alcanzar una alta eficiencia fermentativa en las condiciones que utiliza la industria de bebidas alcohólicas.

Description

"Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no- Saccharomyces." CAMPO TECNICO DEL INVENTO La presente invención esta relacionada a la etapa de fermentación en el proceso de producción de bebidas alcohólicas destiladas como no destiladas, el cual se refiere a un proceso para propagar levaduras no-Saccharomyces, así como para utilizarlas en la fermentación de jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada en cultivos puros.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La fermentación alcohólica tradicional a partir de jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada para producir bebidas alcohólicas destiladas como no destiladas (tequila, vinos, cerveza, ron, bacanora, mezcal, whisky, vodka,), se realiza de forma espontánea en cultivos por lotes. La fermentación espontánea se lleva a cabo mediante una sucesión de poblaciones de diferentes levaduras. En vinos se ha reportado 15 géneros de levaduras durante la fermentación de jugo de uva (Pretorius et al., 1999): Dekkera y su versión asexual Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora y su equivalente asexual Kloeckera, Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycodes, Schizosaccharomyces y Zygosaccharomyces; mientras que en tequila se han identificado 10 géneros (Lachance, 1995): Brettanomyces, Candida, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes, Zygosaccharomyces, Torulaspora y Iwatchenkia, de los cuales, la mayoría se hallan en vinos. Durante la fermentación alcohólica, las levaduras consumen azúcares y producen principalmente etanol y C02 como también numerosos compuestos volátiles como productos secundarios que imparten aromas y perfumes a la bebida final. La levaduras no-Saccharomyces, proliferan en las primeras etapas de la fermentación y su crecimiento es rápidamente inhibido por la presencia de etanol, aprox. 5 a 6 % v1, cediendo progresivamente el lugar a levaduras mas tolerantes al alcohol con alta capacidad fermentativa, principalmente S. cerevisiae (Kunkee, 1984; Fleet GH and Heard G „ 1993; Ciani M and Picciotti G, 1995). A pesar que las levaduras no-Saccharomyces están activas en un corto periodo (pocas horas) en la fermentación alcohólica, contribuyen en la calidad aromática de la bebida final (Comi et al, 2001 ; Romano et al., 2003). En contraste con levaduras Saccharomyces, las no-Saccharomyces tienen la capacidad de sintetizar varias enzimas extracelulares tales como esterasas y ß-glucosidasas las cuales poseen un importante rol en las características aromáticas del vino, convirtiendo los compuestos precursores de aromas en el jugo de uva a compuestos aromáticos activos (Charoenchai et al., 1997). En efecto, se ha detectado que las levaduras no-Saccharomyces del género KIoeckeralHanseniaspora producen altas concentraciones de compuestos volátiles interesantes, como son: etil acetato (aroma frutal), fenil etil acetato (aroma floral), fenetil alcohol (aroma a rosas) y acetoína (aroma a mantequilla), los cuales impactan en el bouquet (Romano et al., 2003; Moreira et ai, 2005). En tequila, se ha reportado que las levaduras nativas no-Saccharomyces del género Kloeckera sintetizan en mayor medida (Díaz-Montaño & Estarrón-Espinosa, 2008): etil fenil acetato (aroma a rosas), acetoína (aroma a mantequilla), etil acetato (aroma frutal), acido acético (olor a vinagre) y benzaldehído (aroma a almendras). Por otro lado, se ha obtenido una alta aceptabilidad de vinos elaborados con jugo de uva Pinot Noir y Chardonay utilizando levaduras no-Saccharomyces del género P. membranaefaciens y Kloeckera apiculata, respectivamente en cultivo puro (Mamede et al, 2005). Los anteriores estudios, revalúa el rol de las levaduras no-Sacharomyces para ser utilizadas en la elaboración de bebidas alcohólicas a partir de la fermentación de jugos de frutas, vegetales, tubérculos o de macerados de cereales, sin embargo, la baja capacidad fermentativa que presentan, hace que estos géneros solo puedan ser utilizados en cultivos mixtos junto con S. cerevisiae. No obstante, estudios recientes en vinos (Albergaría et al., 2003) como en tequila (Díaz-Montaño et al., 2008; Valle-Rodríguez et al., 2009; Juan Octavio Valle-Rodríguez, 2009), han mostrado que la baja capacidad fermentativa de las levaduras no-Saccharomyces del género Kloeckera se debe principalmente a una limitación nutricional mas que a una intolerancia a etanol. Efectivamente, medios de cultivos de jugo de agave suplementados con ciertos nutrientes (minerales, extracto de levadura y sulfato de amonio), han permitido elevar las capacidades fermentativas de levaduras no-Saccharomyces del género Kloeckera (Díaz-Montaño et al., 2010).

Debido a que la mayoría de los compuestos aromáticos que impactan en la bebida final son producidos en la fermentación por la acción de levaduras principalmente no- Saccharomyces y que el grado de contribución al perfil aromático del bouquet depende en gran medida del periodo de supervivencia de estas levaduras en las fermentaciones, el objetivo de la presente invención "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces", es el de establecer los procesos adecuados de propagación de levaduras no-Saccharomyces de los géneros: Candida shehatae, Pichia pastoris, Debaryomyces hansenii, Torulaspora delbruec ii, Hanseniaspora uvarum, Pichia membranaefaciens, Kloeckera africana y apiculata, Kluyveromyces marxianus y Pichia kluyveri, para utilizarlas precisamente en la etapa de fermentación de jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada, lo que permitirá que las levaduras no-Saccharomyces mencionadas anteriormente, presenten un alto consumo de azucares así como una alta producción de etanol, para que de esta manera puedan ser utilizadas en la elaboración de bebidas alcohólicas destiladas y no destiladas.

Lo anterior permitirá que las levaduras no-Saccharomyces aumenten su duración en la etapa fermentativa así como su capacidad fermentativa, traduciéndose en una alta conversión de azúcar a etanol (Yp,s=0.49), mayor tolerancia al etanol así como una rápida fermentación de los azúcares, de forma similar a las que presentan las levaduras de las especies S. cerevisiae, la cual es la levadura universalmente utilizada en la producción de bebidas alcohólicas.

Actualmente existe una solicitud de patente MX/a/2006/000053, titulada: Procesos para fermentar jugo de Agave utilizando Kloeckera spp., la cual describe un proceso para aumentar las capacidades fermentativas de levaduras no-Saccharomyces del género Kloeckera en la elaboración de tequila, en donde se determina las condiciones fisicoquímicas y nutrimentales de la etapa de propagación y de fermentación, pero no contienen lo que se propone en esta invención, ya que sólo se limita a un sólo género de levaduras no-Saccharomyces (Kloeckera) y a un sólo medio de cultivo (jugo de agave), además de que las condiciones nutrimentales que menciona, son diferentes a las que se propone en la presente invención. Por otro lado, la solicitud de patente No. WO2004072271 propone una composición de levaduras no-Saccharomyces para ser utilizadas como cultivos iniciadores en la fermentación de jugo de uva, incluyendo los métodos de preparación de la composición y del uso de ésta en la etapa fermentativa en el proceso de elaboración de vinos. No obstante que en esta solicitud se utilizan levaduras no-Saccharomyces, no contempla un proceso para aumentar las capacidades fermentativas de levaduras no-Saccharomyces; igualmente la solicitud de patente No. WO2004072271 no incluye diferentes medios de propagación y de fermentación como se propone en la presente patente (jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada). Las ventajas directas que obtiene la industria de bebidas alcohólicas destiladas y no destiladas con la utilización de los "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces", propuestos en esta invención son: proporcionar diferentes aromas y olores a la bebida final de forma natural mediante el uso de las levaduras no-Saccharomyces como cultivos iniciadores con alta eficiencia fermentativa en la fermentación de jugos de: agave, uva, caña y macerado de cebada, siendo este un aspecto de gran interés en la industria de bebidas alcohólicas y que resuelve la invención que proponemos en la presente solicitud.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los detalles característicos de esta invención que se refiere a los "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces" , se muestran claramente en las siguientes figuras: Figura 1 .- Es una tabla que presenta los valores del % de azúcares consumidos utilizando levaduras del género no-Saccharomyces, propagadas conforme al proceso que proponemos para obtener levaduras no-Saccharomyces activas y puestas a fermentar de acuerdo al "Proceso para fermentar jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada utilizando levaduras no-Saccharomyces" nombrada como proceso de la invención comparado con el proceso tradicional de propagación y de fermentación de la industria de bebidas alcohólicas.

Figura 2 - Es una tabla que presenta los valores de la productividad de etanol (g/lh) utilizando levaduras del género no-Saccharomyces, propagadas conforme al proceso que proponemos para obtener levaduras no-Saccharomyces activas y puestas a fermentar de acuerdo al "Proceso para fermentar jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada utilizando levaduras no-Saccharomyces" nombrada como proceso de la invención comparado con el proceso tradicional de propagación y de fermentación de la industria de bebidas alcohólicas.

En la Figura 1 y 2, se presentan los resultados obtenidos en la fermentación de jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada a 100 g/l de azúcares reductores adicionado con 1 g/l de sulfato de amonio y/o fosfato de amonio monobásico o mezclas de estos compuestos en una fermentación por lotes utilizando levaduras no-Saccharomyces y fermentadas mediante la forma tradicional proceso tradicional y mediante el proceso presentado en esta invención.

En las Figuras 1 y 2 se puede observar que las levaduras propagadas por los procesos de la invención "levaduras no-Saccharomyces activas" y "Proceso para fermentar jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada utilizando levaduras no-Saccharomyces", consumen una mayor cantidad de azucares y presentan alta productividad de etanol que las levaduras no-Saccharomyces propagadas de la forma tradicional proceso tradicional. Además las productividades de etanol obtenidas con las levaduras no-Saccharomyces propagadas mediante los procesos de esta invención, son similares en algunas levaduras no-Saccharomyces, a lo que se obtiene con levaduras con alta capacidad fermentativa, como son las de la especie Saccharomyces cerevisiae (control) a las mismas condiciones de fermentación.

Fig. 3- Es un diagrama de flujo de los "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces" en la producción de bebidas alcohólicas tanto destiladas como no destiladas.

La invención muestra las condiciones óptimas de propagación y de fermentación para levaduras no-Saccharomyces. La invención asegura un alto consumo del azúcar por parte de las levaduras no-Saccharomyces así como un alto rendimiento de conversión azúcar etanol, altas productividades y una mayor tolerancia al etanol con respecto a lo que se obtiene normalmente con levaduras no-Saccharomyces con el proceso tradicional. No obstante que en esta invención se utilizaron solamente con levaduras no- Saccharomyces, en jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada, pueden ser aplicados para fermentar cualquier jugo de frutas, vegetales, tubérculos y macerados de cereales.

MEJOR METODO CONOCIDO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN El "Proceso para propagar las levaduras no-Saccharomyces" , constan de las siguientes cuatro fases: Fase 1. Obtención de los jugos: con el fin de realizar la propagación de las levaduras no- Saccharomyces, se requiere obtener jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada a la concentración de 100 a 200 g/l de azúcares reductores, según el proceso tradicional utilizado por la industria de bebidas alcohólicas; una vez adquirido el jugo a estas concentraciones, se procede la realización del medio de propagación, Fase 2. Medio de propagación: con la finalidad de que las levaduras no-Saccharomyces presenten un crecimiento vigoroso y una alta concentración de biomasa, para lo cual se requiere formular un mecí/o de propagación para evitar que las levaduras no-Saccharomyces sufran de limitación de nutrientes y/o inhibición por altas concentraciones de sustrato; el medio de propagación se realiza diluyendo el jugo de: agave, uva, caña y macerado de cebada obtenido de la Fase 1 , con agua potable hasta la concentración entre 3 a 6 °Bx, inmediatamente después de haber diluido el jugo de agave, uva, caña y el macerado de cebada a la concentración mencionada, se le agrega a este último 1.0 g/l, extracto de levadura; inmediatamente después se homogeneiza agitando durante 5 minutos con una espátula o cuchara el medio de propagación y a continuación se esteriliza a 15 psi durante 15 minutos; se deja enfriar el medio de propagación hasta temperatura ambiente (30±5°C) para que se pueda continuar con el pre-inóculo, Fase 3. Pre-inóculo de las levaduras no-Saccharomyces a fin de iniciar la activación de cada una de levaduras, se debe de realizar los siguiente pasos: en 50 mi de medio de propagación obtenido de la fase anterior, se le adiciona en condiciones de esterilidad aprox. 2 a 5 x106 células/ml de un género de las levaduras no-Saccharomyces: Candida shehatae, Pichia pastoris, Debaryomyces hansenii, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora uvarum, Pichia membranaefaciens, Kloeckera africana y apiculata, Kluyveromyces marxianus y Pichia Kluyveri; al medio de propagación inoculado con cada una de las levaduras no-Saccharomyces en cultivo puro, se incuba a 33±3 °C, 200 a 300 rpm durante 24 horas; a partir de este cultivo se preparará el inoculo, Fase 4. Inoculo para cada levadura no-Saccharomyces: para preparar el inoculo se agrega en condiciones de esterilidad a 250ml del medio de propagación obtenido de la fase 2 dos, 2 a 5 x106 células/ml de alguna de las levaduras no- Saccharomyces Candida shehatae, Pichia pastoris, Debaryomyces hansenii, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora uvarum, Pichia membranaefaciens, Kloeckera africana y apiculata, Kluyveromyces marxianus y Pichia Kluyveri, obtenidas del pre-inóculo de la fase anterior; el medio de propagación inoculado con cada una de las levaduras no-Saccharomyces en cultivo puro, se incuba a las mismas condiciones que se indican en la fase 3 (30±5°C, 200 a 300 rpm) durante 10 a 12 horas con la finalidad de obtener >100 x106 células/ml de cada una de las levaduras no-Saccharomyces. A cada una de las levaduras no- Saccharomyces propagada según este proceso se le llamará levadura no- Saccharomyces activa, la cual estará apta y lista para ser utilizada en la fermentación de jugo de: agave, uva, caña y macerado de cebada dentro del proceso para elaborar bebidas alcohólicas; una vez obtenida la levadura no- Saccharomyces activa, se procede para que sean utilizadas como cultivos iniciadoras en la etapa de fermentación.

El "Proceso para fermentar jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada utilizando levaduras no-Saccharomyces', constan de las siguientes cinco fases: Fase 1. Propagación de las levaduras no-Saccharomyces, el cual se desarrolla según como se indica en el "Proceso para propagar las levaduras no- Saccharomyces" una vez obtenida las levaduras no-Saccharomyces activas se procede a realizar el medio de fermentación, Fase 2. Medio de fermentación, el medio de fermentación se realiza como a continuación se indica: para concentraciones de jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada entre 100 a 200 g/L de azucares reductores, se adiciona: 40 a 800 mgN/L de asparagina, glutamina, glutamato, aspartato y/o arginina o mezcla de de estos compuestos, 30 a 800 mg N/L de sulfato de amonio y/o fosfato de amonio monobásico y/o mezclas de estos compuestos y 10 a 1200 g L de tiamina, riboflavina y/o biotina o mezcla de estos compuestos; habiendo efectuado la adición de los nutrientes en el jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada, éstos se mezclan durante 10±5 min con una espátula o cuchara hasta su homogenización completa; al jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada adicionado con los nutrientes se le llamará; medio de fermentación; una vez que se haya obtenido el medio de fermentación homogenizado se procede a la inoculación, Fase 3. Inoculación: la inoculación se realiza agregando 10±3 x10e células/ml de un género de las levaduras no-Saccharomyces activas en 2.5 litros de medio de fermentación obtenido en la fase anterior; una vez que el medio de fermentación esté inoculado con un género de levadura no-Saccharomyces activa, se inicia la fermentación, Fase 4. Fermentación: con el fin de que todo el azúcar presente en el medio de fermentación se convierta principalmente en etanol y en compuestos aromáticos mediante el uso de las levaduras no-Saccharomyces activas; se requiere que se mantenga el medio de fermentación inoculado con un género seleccionado de las levaduras no-Saccharomyces activas en un equipo fermentador en condiciones de anaerobiosis no estrictas a 30±5 °C de temperatura y 250 rpm de agitación durante 72 horas. El equipo fermentador a utilizar puede ser un tanque abierto o cerrado de fondo redondo con agitación mecánica. El material del equipo fermentador no debe ser tóxico ni corrosivo como por ejemplo: vidrio o acero inoxidable. Para un buen control en el equipo fermentador, éste debe de estar equipado para que pueda medir y regular la temperatura, una vez que concluya las 72 horas de fermentación, se obtiene el mosto muerto el cual se somete a una destilación, si la bebida que se va a obtener es un destilado; en el caso del vino y la cerveza la fase 5 no se realiza.

Fase 5. Destilación: con el objetivo de separar el alcohol del mosto muerto, en aquellos productos que son bebidas destiladas, se puede realizar en alambiques de cobre o de acero inoxidable o también en torres de destilación en forma continua; la metodología para destilar el mosto muerto es mediante la técnica tradicional utilizada por la industria de bebidas alcohólicas destiladas. Terminado ésta fase es como obtenemos el producto destilado, si se desea madurar, este se lleva a añejar en barricas de roble blanco por los procesos ya conocidos.

DOCUMENTOS CITADOS 1. Pretorius, I.S., van der Westhuizen T.J. and Augustyn O.P.H.. Yeast biodiversity in vineyards and wineries and its importance to the South African wine industry. South African Journal of Enology and Viticulture 20:61 -74 (1999). 2. Lachance MA, Yeast communities in a natural tequila fermentation. Ant. Van Leeuw 68: 151 -160 (1995). 3. unkee RE, Selection and modification of yeasts and lactic acid bacteria for wine fermentation. Food Microbiol V. 315-332 (1984). 4. Fleet GH and Heard GM, Yeast: growth during fermentation, in Wine Microbiology and Biotechnology, ed by Fleet GH, Harwood Academic Publishers, Chur Switzerland, pp. 27-57 (1993). 5. Ciani M and Picciotti G, The growth kinetics and fermentation behavior of some non- Saccharomyces yeast associated with wine-making. Biotech. Lett 17: 1247-1250 (1995). 6. Comi G, Romano P, Cocolin L and Fiore C, Characterization of Kloeckera apiculata strains from Friuli región in North Italy. World J Microbiol Biotech. 17: 391 -394 (2001 ). 7. Romano P, Fiore C, Paraggio M, Caruso M and Capece A, Function of yeast species and strains in wine flavour. Int J Food Microbiol 86: 169-180 (2003). 8. Charoenchai C, Fleet GH, Henschke PA and Todd BEN, Screening of non- Saccharomyces wine yeasts for the presence of extracellular hydrolytic enzymes. Aus J Grape Wine Res 3: 2-8 (1997). 9. Moreira, N., Mendes, F., Hogg, T. and Vasconcelos, I. Alcohols, esters and heavy sulfur compounds productions by puré and mixed cultures of apiculate wine yeast.

Int. J. Food Microbiol. 103: 285-294 (2005). 10. Díaz-Montaño D. M., Estarrón-Espinosa M. 2008. Aplicación de las levaduras Saccharomyces y KIoeckera nativas en la fermentación de jugo de agave para generar un perfil aromático distintivo. Número de Expediente Mx/a/2008/016577 (entregado el 19 de diciembre del 2008, aprobación del examen de forma el 3 de julio del 2009). 11. Mamede, M. E. O., Cardello, H. . A. B., and Pastore, G. M. Evaluation of an aroma similar to that of sparkling wine: Sensory and gas chromatography analyses of fermented grape musts. Food Chemistry, 89, 63-68 (2005). 12. Albergaría H, Torrao AR, Hogg T and Gírio FM, Physiological behavior of Hanseniaspora guilliermondii ¡n aerobic glucose-limited continuous culture. FEMS Yeast Res 3: 21 1-216 (2003). 13. Diaz-Montaño Dulce, Délia Marie-Line, Estarrón Mima and Strehaiano Pierre. (2008).

Fermentative capability and aroma compound production by yeast strain isolated from Agave tequilana Weber juice. Enzyme and Microbial Technology. 42: 608-616. 14. Valle-Rodríguez JO, Córdova JA, Estarrón-Espinosa M, Morán-Marroquín GA, Hernández-Cortés G, Díaz-Montaño DM. "Influencia de las fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico en la fermentación de jugo de agave con una levadura no convencional (KIoeckera africana)" "Influence of the organic and inorganic nitrogen sources in the fermentation of agave juice with a non-conventional yeast (KIoeckera africana)". Bebidas Mexicanas. "Bebidas Mexicanas". Edición Junio-Julio. Alfa Editores Técnicos. México D.F., México Vol 18 No. 3. ISSN 0188-8080. (2009). 15. Juan Octavio Valle-Rodriguez. Estudio Fisiológico y de los requerimientos nutricionales de KIoeckera africana implicados en una fermentación alcohólica eficiente del jugo de Agave tequilana Weber var. azul". Tesis de Maestría en procesos Agroindustriales. Posgardo del PICYT sede CIATEJ, examen el 3 de noviembre del 2009. 16. Díaz-Montaño D. M., Favela E. and Córdova J. Improvement of growth, fermentative efficiency and ethanol tolerance of KIoeckera africana during the fermentation of agave tequilana juice by addition of yeast extract. J of Science of food and Agriculture. 90: 321 -328. (2010). 17. Sommer Peter and Nielsen Jan Clair. Yeast Compositions and starter cultures. WO 2004072271. Entregada el 26 de agosto del 2004.

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficientemente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:

1.- Un "Proceso para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces" caracterizado porque se compone de las siguientes fases: Fase 1 : Propagación de levaduras no-Sacharomyces, el cual se desarrolla conforme al "Proceso para propagar levaduras no-Saccharomyces", obtenidas las levaduras no-Saccharomyces activas se realiza el medio de fermentación, Fase 2 Medio de fermentación, para concentraciones de jugo de agave, caña, uva o macerado de cebada entre 100 a 200 g/L se adiciona al medio líquido de 40 a 800 mgN/L de asparagina, glutamina, glutamato, aspartato y/o arginina o mezclas de estos compuestos, 30 a 800 mg N/L de sulfato de amonio y/o fosfato de amonio monobásico y/o mezclas de estos compuestos y de 10 a 1200 Mg/L de tiamina, riboflavina y/o biotina o mezclas de estos compuestos; habiendo efectuado la adición de los nutrientes en el jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada, estos se mezclan durante 10±5 min con una espátula o cuchara hasta su homogenización completa, al jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada adicionado con los nutrientes se le llama: medio de fermentación; a continuación se procede a la inoculación, Fase 3. Inoculación: la inoculación se realiza agregando 10±3 x106 células/ml de un género de las levaduras no-Saccharomyces activas en 2.5 litros de medio de propagación obtenido en la fase anterior; una vez que el medio de fermentación este inoculado con un género de las levaduras no-Saccharomyces activas, se inicia la fermentación, Fase 4. Fermentación: el medio de fermentación inoculado con un género seleccionado de las levaduras no-Saccharomyces activas, debe de estar en condiciones de anaerobiosis no estrictas a 30±5 °C de temperatura y 250 rpm de agitación durante 72 horas. El equipo fermentador a utilizar puede ser un tanque abierto o cerrado de fondo redondo con agitación mecánica, equipado para que pueda medir y regular la temperatura, una vez que concluya las 72 horas de fermentación, se obtiene el mosto muerto el cual se somete a una destilación, si la bebida que se va a obtener es un destilado; en el caso del vino y la cerveza la fase 5 no se realiza Fase 5. Destilación: se debe separar el alcohol del mosto muerto, en alambiques de cobre o de acero inoxidable o en torres de destilación en forma continua; la metodología para destilar el mosto muerto es mediante la técnica tradicional utilizada por la industria de bebidas alcohólicas, obteniendo así el producto destilado, si se desea madurar el tequila, este se lleva a añejar en barricas de roble blanco por los procesos ya conocidos.

2 - Un "Proceso para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces" según la cláusula 1 caracterizado porque en la fase uno, propagación de levaduras no-Sacharomyces se desarrolla conforme al "proceso para propagar levaduras no-Saccharomyces", que consiste de cuatro fases: Fase 1. Obtención del jugos: con el fin de realizar la propagación de las levaduras no- Saccharomyces, se requiere obtener jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada a la concentración de 100 a 200 g/l de azucares reductores, según el proceso tradicional utilizado por la industria de bebidas alcohólicas; una vez adquirido el jugo a estas concentraciones, se procede la realización del medio de propagación, Fase 2. Medio de propagación: el medio de propagación se realiza diluyendo el jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada obtenido de la Fase 1 , con agua potable hasta la concentración entre 3 a 6 °Bx, inmediatamente después de haber diluido el jugo de frutas o el macerado de cereal a la concentración mencionada, se le agrega a este último 1 .0 g/l, extracto de levadura; inmediatamente después se homogeneiza agitando durante 5 minutos con una espátula o cuchara el medio de propagación y a continuación se esteriliza a 15 psi durante 15 minutos; se deja enfriar el medio de propagación hasta temperatura ambiente (30±5 °C) para que se pueda continuar con el pre- inóculo, Fase 3. Pre-inóculo de las levaduras no-Saccharomyces, sigue los siguiente pasos: en 50 mi de medio de propagación obtenido de la fase anterior, se le adiciona en condiciones de esterilidad aprox. 2 a 5 x106 células/ml de un género de las levaduras no-Saccharomyces: Candida shehatae, Pichia pastoris, Debar omyces hansenü, Torulaspora delbruec ii, Hanseniaspora uvarum, Pichia membranaefaciens, Kloeckera africana y apiculata, Kluyveromyces marxianus y Pichia Kluyveri; al medio de propagación inoculado con cada una de las levaduras no-Saccharomyces en cultivo puro, se incuba a 33±3 °C, 200 a 300 rpm durante 24 horas. Fase 4. Inoculo para cada levadura no-Saccharomyces: para preparar el inoculo se agrega en condiciones de esterilidad a 250 mi del medio de propagación obtenido de la fase 2, 10±3 x106 células/ml de alguna de las levaduras no- Saccharomyces activas. Candida shehatae, Pichia pastoris, Debaryomyces hansenü, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora uvarum, Pichia membranaefaciens, Kloeckera africana y apiculata, Kluyveromyces marxianus y Pichia Kluyveri, obtenidas del pre-inóculo de la fase anterior; el medio de propagación inoculado con cada una de las levaduras no-Saccharomyces en cultivo puro, se incuba a las mismas condiciones que se indican en la fase 3 (30±5°C, 200 a 300 rpm) durante 10 a 12 horas con la finalidad de obtener >100 x106 células/ml de cada una de las levaduras

3.- Un "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces" según la cláusula 1 caracterizado porque en la fase dos, el Medio de fermentación, se realiza con jugo de agave, caña, uva y macerado de cebada entre 100 a 200 g/L de azúcares reductores añadiendo de 40 a 800 mgN/L de asparagina, glutamina, glutamato, aspartato y/o arginina o mezclas de estos compuestos, 30 a 800 mgN/L de sulfato de amonio y/o fosfato de amonio monobásico o mezclas de estos compuestos y de 10 a 1200 µg/L de tiamina, riboflavina y/o biotina o mezclas de estos compuestos; habiendo efectuado la adición de los nutrientes en el jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada, estos se mezclan durante 10±5 minutos con una espátula o cuchara hasta su homogeneización completa.

4 - Un "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces" según la cláusula 1 caracterizado porque en la fase cuatro las condiciones de fermentación del medio de fermentación utilizando levaduras no-Saccharomyces activas son de 100 a 200 g/l de azucares reductores así como los siguientes parámetros de fermentación: 250 rpm, 30 a 35 °C, anaerobiosis no estricta y sin control de pH.

5 - "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces." según la cláusula 1, caracterizado porque se adiciona en condiciones de esterilidad aprox. 2 a 5 x106 células/ml de un género de las levaduras no-Saccharomyces: Candida shehatae, Pichia pastoris, Debaryomyces hansenii, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora uvarum, Pichia membranaefaciens, Kloeckera africana y apiculata, Kluyveromyces marxianus y Pichia kluyveri.

6 - "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces." según la cláusula 1 y 2, caracterizado porque las levaduras no-Saccharomyces aumenten su duración en la etapa fermentativa, así como su capacidad fermentativa, traduciéndose en una alta conversión de azúcar a etanol (Y p s =0.49), mayor tolerancia al etanol, así como una rápida fermentación de los azúcares.

7 - "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces." según la cláusula 1 y 2, caracterizado porque se utilizan en la etapa de fermentación jugo de agave, uva, caña y macerado de cebada.

8.- "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces." según la cláusula 1 y 2, caracterizado porque se utilizan en la producción de bebidas alcohólicas.

9 - "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces." según la cláusula 1 y 2, caracterizado porque proporciona diferentes aromas y olores a la bebida final de forma natural mediante el uso de las levaduras no-Saccharomyces .

10 - "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces." según la cláusula 1 y 2, caracterizado porque se aplica como cultivos de iniciadores las siguientes levaduras: Candida shehatae, Pichia pastoris, Debaryomyces hansenii, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora uvarum, Pichia membranaefaciens, Kloeckera africana y apiculata, Kluyveromyces marxianus y Pichia kluyveri, con alta eficiencia fermentativa en la fermentación de jugos de: agave, uva, caña y macerado de cebada. 1 1 - "Procesos para aumentar la capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces." según la cláusula 1 y 2, caracterizado porque se aplica para fermentar cualquier jugo de frutas, vegetales, tubérculos y macerados de cereales.