MX2009001867A - Proteinas de union especificas y de alta afinidad que comprenden dominios sh3 modificados de fyn cinasa. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con una proteína de unión recombinante que comprende por lo menos un derivado del dominio Src de homología 3 (SH3) de la FYN cinasa, en donde por lo menos un aminoácido dentro o colocado con hasta dos aminoácidos adyacentes al bucle Src y/o por lo menos un aminoácido dentro o colocado con hasta dos aminoácidos adyacentes al bucle RT está sustituido, suprimido o agregado. Además, la invención se relaciona con proteínas de fusión que comprenden una proteína de unión de acuerdo con la invención fusionada a un componente farmacéutico y/o diagnósticamente activo. Además, la invención se relaciona con nucleótidos que codifican para estas proteínas de unión y/o fusión así como los vectores correspondientes y células hospedadoras. Finalmente, la presente invención se relaciona con el uso de proteínas de unión y/o fusión de la presente invención para preparara un medicamento o un medio de diagnóstico así como con composiciones farmacéuticas o de diagnóstico que comprenden dichas proteínas de unión y/o de fusión.

Description

PROTEINAS DE UNION ESPECIFICAS Y DE ALTA AFINIDAD QUE COMPRENDEN DOMINIOS SH3 MODIFICADOS DE FYN CINASA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con una proteína de unión recorabinante que comprende por lo menos un derivado del dominio de Src homología 3 (SH3) de FYN cinasa, en donde por lo menos un aminoácido dentro o colocado con hasta dos aminoácidos adyacentes del bucle Src y/o por lo menos un aminoácido en o colocado con hasta dos aminoácidos adyacente al bucle RT está sustituido, suprimido o agregado. Además, la invención se relaciona con proteínas de fusión que comprenden una proteína de unión de acuerdo con la invención fusionada a un componente farmacéutica y/o diagnósticamente activo. Además, la invención se relaciona con nucleótidos codificados para estas proteínas de unión y/o fusión así como los vectores y células hospedadoras correspondientes. Finalmente, la presente invención se relaciona con el uso de proteínas de unión y/o de fusión de la presente invención para preparar un medicamento o un medio de diagnóstico así como con composiciones farmacéuticas o de diagnóstico que comprenden las proteínas de unión y/o de fusión. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los agentes de unión específicos y de alta afinidad son herramientas indispensables para investigación biológica y REF. : 199680 médica y también tienen utilidad para diagnóstico, profilaxis y tratamientos médicos. Actualmente, los anticuerpos monoclonales son la clase predominante de moléculas de unión que se pueden aislar rápidamente con alta afinidad y especificidad para virtualmente cualquier objetivo. No obstante, las inmunoglobulinas presentan limitaciones que se basan en su mayor parte en las propiedades biofísicas generales y su estructura molecular, más bien complicada. Por lo tanto, ya desde la década de 1990 varios grupos de investigación han estudiado proteínas globulares pequeñas como sustitutos para los anticuerpos. La idea detrás de este concepto es la transferencia de un sitio de .unión universal desde una estructura de anticuerpo a infraestructuras de proteína alternativas, las denominadas andamios (scaffolds) . Hasta ahora se han descrito más de 40 andamios, entre estos dos dominios SH3, los dominios SH3 de la Abl y Src cinasa (véase Binz et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 10, 1257-1268, 2005) . Los dominios SH3 se encuentran en muchas proteínas diferentes involucradas en la señalización y organización citoesquelética intracelulares (Cohén et al., "Modular binding domains in signal transduction proteins." Cell 80(2): 237-48, 1995) . Pese a la variabilidad en sus estructuras primarias, estos dominios SH3 comparten una estructura general y modo de unión a proteínas muy similares que comparten la secuencia de consenso mínima PxxP que es un determinante crítico para la unión de SH3 natural. Una función importante de los dominios SH3 es participar en interacciones proteína-proteína altamente selectivas . Erpel et al, ( "Mutational analysis of the Src SH3 domainrthe same residues of the ligand binding surface are important for intra- and intermolecular interactions . " Embo J. 14(5): 963-75, 1995) investigaron la influencia de mutaciones en los bucles RT y n-Src de los dominios Src SH3 y demostraron que las mutaciones de ambos bucles las cuales son adyacentes a la superficie hidrofóbica pueden alterar la capacidad de este dominio para participar en asociaciones intermoleculares e intramoleculares . Hiipakka et al. ("SH3 domains with high affinity and engineered ligand specificities targeted to HIV-1 Nef." J. Mol. Biol. 293(5): 1097-106, 1999) investigaron la capacidad del bucle RT del dominio Hck SH3 para actuar como un determinante versátil de especificidad y afinidad. Los autores construyeron una biblioteca de fago de los dominios Hck en donde 6 aminoácidos de bucle RT estaban distribuidos aleatoriamente (denominados RRT-SH3) . Utilizando esta estrategia identificaron dominios RRT-SH3 individuales que pueden unirse a Nef de VIH-1 hasta 40 veces mejor que Hck-Sh3. Los autores indican la importancia del bucle RT en la selección del ligando SH3 como una estrategia general para crear dominios SH3 con propiedades de unión deseadas. Lee et al., ("A single amino acid in the SH3 domain of Hck determines its high affinity and specificity in binding to HIV-1 NEf protein, "Embo. J. 14(20): 5006-15, 1995) investigaron la base estructural de las diferentes afinidades de unión de SH3 y especificidades de Hck a la proteina Nef de VIH-1 y pudieron transferir la propiedad de unión de Hck SH3 a través de Nef al dominio Fyn SH3 o una mutación única en el bucle RT del dominio Fyn SH3. Hosse et al. ("A new generation of protein display scaffolds for molecular recognition" , Protein Science, 15:14-27, 2006) determinaron específicamente los requerimientos para proteínas de unión adecuadas para aplicaciones terapéuticas. Los autores notaron la importancia de algunas características para proteínas de unión terapéuticamente útiles tales como estabilidad a suero, penetración de tejido, depuración sanguínea, retención en objetivo y respuesta inmunitaria. En este último aspecto, es de notar que las proteínas terapéuticas no humanas se pueden fabricar tan similares a sus contrapartes humanas como se pueda y un andamio humano puede ser menos inmunogénico justo desde el inicio. Estos autores concluyen : "No obstante, incluso un andamio completamente humano no garantiza una proteína que no induzca una respuesta inmunitaria humana, específicamente si es una proteína intracelular . La distribución aleatoria de los aminoácidos durante la construcción de la biblioteca puede introducir potencialmente epitopos novedosos para linfocitos T. Incluso mutaciones puntuales únicas pueden volver inmunogénica a una proteina humana. Además, la mayor parte de los andamios humanos provocan cierta respuesta autoinmune". Actualmente, los dominios SH3 de las cinasas Abl y Hck se reconocen como andamios proteinicos para generar aglutinantes de proteina con especificidad prescrita, aunque únicamente los aglutinantes hacia ligandos conocidos como las proteínas Nef o los péptidos sintéticos se han identificado hasta ahora (véase Binz et al., antes) . El dominio SH3 de la Fyn cinasa (Fyn SH3) comprende 63 residuos (aminoácidos 83-145 de la secuencia reportada por Semba et al. ( "yes-related protooncogene, syn, belongs to the potein-tyrosine kinase family. "Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 83 (15) : 5459-63, 1986) y Kawakami et al. ("Isolation and oncogenic potential of a novel human src-like gene." Mol Cell Biol. 6(12): 4195-201, 1986). El dominio Fyn es un miembro de 59 kDa de la familia Src de las tirosina cinasas. Como un resultado de empalme alternativo la proteína Fyn existe en dos isoformas diferentes que difieren en sus dominios cinasa; una forma se encuentra en timocitos, esplenocitos y algunas líneas de células hematolimfoides mientras que la segunda forma se acumula principalmente en el cerebro (Cooke and Perimutter, "Expression of a novel form of the Fyn proto-oncogene in hematopoietic cells." New Biol. 1(1)66-74, 1989). Las funciones biológicas de Fyn son diversas e incluyen señalización vía el receptor de linfocitos T, regulación de la función cerebral asi como señalización mediada por adhesión (Resh, M. D. "Fyn, a Src family tyrosine kinase." Int. J. Biochem, Cell Biol. 30 ( 11 ): 1159-62 , 1998). Se trata de una proteina intracelular . La SEC ID NO: 1 muestra la secuencia Fyn SH3 (aminoácidos 83-145 de Fyn cinasa como se presentaron por Kawakami et al., y Semba et al., en 1986, véase antes): GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEKFQILNSSEGDWWEARSKTTGETGYIPSNYVA PVDSIQ (SEC ID NO: 1) La secuencia de RT-Src y el bucle n-Src están con un subrayado sencillo y otro doble respectivamente. La secuencia de aminoácido de Fyn SH3 está completamente conservada en el hombre, ratón, rata y mono (gibbon) . La secuencia Fyn SH3 de pollo difiere en una posición de aminoácido, la de Xenopus laevis en dos posiciones de aminoácidos del dominio humano correspondiente. Al igual que otros dominios SH3, Fyn SH3 está constituido de dos láminas ß antiparalelas y contiene dos bucles flexibles (denominados bucles RT-Src y n-Src) con el fin de interactuar con otras proteínas. Resumiendo, la técnica anterior describe infraestructuras proteínicas, los denominados andamios, como alternativas para establecer estructuras de anticuerpo. El dominio de Src homología 3 (SH3) es uno de estos aproximadamente 40 o más andamios. Entre los muchos diferentes dominios SH3 (aproximadamente 300 en el genoma humano y varios miles descritos hasta ahora en la naturaleza) Fyn SH3 es uno el cual ha sido utilizado una vez antes con el fin de dilucidar la especificidad y afinidad de unión de SH3 en general. Una persona experta en la técnica también sabrá que las proteínas intracelulares son particularmente susceptibles a producir respuestas inmunitarias y por lo tanto típicamente son menos útiles o incluso inútiles para aplicaciones in vivo como terapia y diagnóstico. El objetivo en el que se basa la presente invención es proporcionar proteínas de unión específicas y de alta afinidad hacia el objetivo, mejoradas, que sean adecuadas como agentes de investigación y en particular como agentes de diagnóstico y médicos. Además, estas proteínas de unión deben ser estables y solubles bajo condiciones fisiológicas, inducir efectos inmunitarios mínimos o nulos en humanos que las reciben y proporcionar una estructura de unión que también sea accesible por estructuras de objetivo grande, es decir, que no queden enmascaradas por impedimento estérico. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION encontrado sorprendentemente que el dominio SH3 de la Fyn cinasa de la familia Src proporciona excelentes propiedades para diseñar dominios de unión recombinantes con especificidad y alta afinidad para seleccionar objetivos. En particular, se ha encontrado que la especificidad objetivo se puede diseñar al mutar el bucle RT y/o el bucle Src lo que resulta en una variabilidad mayor y propiedades de unión mejoradas para muchos objetivos. Además, se ha encontrado inesperadamente que no solo la proteina de unión Fyn SH3 nativa sino también las proteínas de unión derivadas de Fyn SH3 mutadas no son inmunogénicas in vivo. Por lo tanto, las proteínas de unión Fyn SH3 mutantes recombinantes son particularmente útiles para el desarrollo de proteínas no inmunogénicas terapéuticas y/o de diagnóstico. Como un resultado de lo anterior, un primer aspecto de la presente invención se relaciona con una proteína de unión recombinante que comprende por lo menos un derivado del dominio de homología 3 de Src (SH3) de la Fyn cinasa, en donde : (a) por lo menos un aminoácido dentro o colocado con hasta dos aminoácidos adyacente al bucle src, y/o (b) por lo menos un aminoácido dentro o colocado con hasta dos aminoácidos adyacente al bucle RT está sustituido, suprimido o agregado, en donde el derivado de dominio SH3 tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70, preferiblemente por lo menos 80, de manera más preferible por lo menos 90 y de manera mucho más preferible por lo menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1, preferiblemente con la condición de que la proteina de unión recombinante no comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, preferiblemente que la proteína recombinante no sea una proteína que contenga un dominio SH3 natural que exista en la naturaleza. La secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 (la Fyn SH3, variante R961 de Lee et al., véase antes) se proporciona a continuación GVTLFVALYDYEAITEDDLSFHKGEKFQILNSSEGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVA PVDSIQ (SEC ID NO: 2) En el contexto de esta invención, el bucle RT de la Fyn cinasa (algunas veces también denominado bucle RT-Src) consiste de los aminoácidos E A R T E D que se localizan en las posiciones 12 a 17 en la SEC ID NO: 1. Las posiciones que se van a sustituir, suprimir y/o agregar, es decir, que se van a mutar, en o adyacentes al bucle RT son los aminoácidos 10 a 19, preferiblemente 11 a 18, de manera más preferible 12 a 17. En el contexto de esta invención, el bucle src de la Fyn cinasa (algunas veces también denominado como bucle n-Src) , consiste de los aminoácidos N S S E que se localizan en las posiciones 31 a 34 en la SEC ID NO: 1. Las posiciones van a ser sustituidas, suprimidas o agregadas, es decir, van a ser mutadas en o adyacentes al bucle src son los aminoácidos 29 a 36, preferiblemente 30 a 35, de manera más preferible 31 a 34. La proteina recombinante de la invención preferiblemente es una proteina no natural que contiene el dominio SH3 que existe en o que se aisla de la naturaleza. En otras palabras, el alcance de la invención preferiblemente excluye las proteínas de tipo silvestre que contengan el dominio SH3. Existen abundantes proteínas que contienen el dominio SH3 en la naturaleza. Estas proteínas naturales con SH3 tienen una afinidad de unión por sus ligandos naturales. La mayoría, si no todos estos ligandos SH3 naturales tienen un motivo o secuencia PxxP. No obstante, las proteínas recombinantes de la invención son proteínas manipuladas diseminadas para tener afinidades a objetivos no naturales, es decir, los objetivos no naturales son cualquier objetivo, por ejemplo en la naturaleza, de manera preferible en un mamífero, de manera más preferible en un humano, excluyendo a los ligandos naturales SH3 (de tipo silvestre) . De manera más preferible, las proteínas recombinantes de la invención esencialmente no tienen afinidad de unión por los ligandos de unión SH3 naturales, de manera más preferible de ninguno de ligando de unión SH3 natural tiene un motivo PxxP. Preferiblemente, el número de aminoácidos que se van a agregar en uno y/o ambos bucles es 1 a 20, de manera más preferible 1 a 10 o 1 a 5 aminoácidos y de manera más preferible no se agregan aminoácidos en los bucles. En otra modalidad preferida, las porciones del derivado de dominio SH3 que se encuentran fuera de los bucles RT y src se conservan tanto como se pueda con el fin de no introducir secuencias o motivos inmunogénicos . Se prefiere que las proteínas recombinantes de la invención esencialmente no induzcan una reacción inmunogénica en mamíferos, preferiblemente en ratón, rata y/o humano, de manera más preferible en humano. Por supuesto, la inmunogenicidad de la proteína recombinante completa de la invención no solo dependerá de la porción de derivado de dominio SH3 sino que se puede alterar por otras porciones de la proteína completa. En una modalidad preferida de la invención, por lo menos la porción del derivado de dominio SH3 de la proteína recombinante es esencialmente no inmunogénica en ratones, preferiblemente en ratón, rata y/o humano, de manera más preferible en humano. Por ejemplo, una persona experta en la técnica puede determinar las reacciones inmunogénicas de la proteína recombinante o su porción de derivado de dominio SH3 por técnicas estándar y sistemáticas, por ejemplo al administrar (por ejemplo mediante inyección i.v.) una proteína recombinante de interés o su derivado de dominio SH3 a un mamífero tal como un ratón y analizar la respuesta de las células sanguíneas inmunogénicas y/o de los factores (por ejemplo interleucinas) después de un tiempo apropiado para que se produzca una reacción inmunitaria. En una modalidad más preferida, la proteína de unión de acuerdo con la invención es una en donde el derivado de dominio SH3 tiene por lo menos 70 o por lo menos 85, preferiblemente por lo menos 90, de manera más preferible por lo menos 95, de manera mucho más preferible por lo menos 98 a 100% de identidad con el dominio de homología 3 de Src (SH3) de la FYN cinasa fuera de los bucles src y RT . En una modalidad preferida se introducen mutaciones en los bucles tanto RT como src. En una modalidad más preferida adicional, la proteína de unión de la invención comprende uno o preferiblemente dos residuos alterados en las posiciones 37 y/o 50 del derivado de dominio SH3, preferiblemente dos residuos alterados hidrofóbicos, de manera más preferible Trp37 y/o Tyr50, prefiriéndose de manera adicional Trp37 y Tyr50. Como se demuestra en la figura 3b en la parte inferior su aleatorización por incrementar la afinidad. El término "derivado del dominio de homología 3 Src (SH3) de la FYN cinasa", como se utiliza en la presente, indica abarcar una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70, preferiblemente por lo menos 80, de manera más preferible por lo menos 90 y de manera mucho más preferible por lo menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1. El mismo significado es válido para un derivado de dominio SH3 que tiene por lo menos 70 o por lo menos 85, preferiblemente por lo menos 90, de manera más preferible por lo menos 95, de manera mucho más preferible por lo menos 98% de identidad con el dominio de homología 3 Src (SH3) de la FYN cinasa fuera de los bucles src y RT, excepto que los aminoácidos que forman los bucles se excluyen cuando se determina la identidad de la secuencia. Con el propósito de determinar el grado de identidad de secuencia de un derivado del dominio Fyn SH3 a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1, por ejemplo el programa de similitud SIM local se puede utilizar (Xiaoquin Huang and Webb Miller, "A Time-Efficient , Linear-Space Local Similarity Algorithm." Advances in Applied atematics , vol. 12: 337-357, 1991.), disponible libremente de los autores y su instituto (véase también la red mundial: http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html); para análisis de alineaciones múltiples se puede utilizar ClustalW (Thompson et al., " CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice.", Nucleic Acids Res., 22 (22) : 673-4680, 1994). Preferiblemente, el grado de identidad de secuencia del derivado con la SEC ID NO: 1 se determina en relación a la secuencia completa de la SEC ID NO: 1. En una modalidad preferida la proteina de unión de la invención comprende por lo menos dos derivados del dominio Fyn SH3. De manera más preferible, es una proteina de unión bivalente. Por lo menos dos derivados del dominio SH3 pueden ser iguales o diferentes, preferiblemente son iguales. La proteina de unión de la invención se puede diseñar para que tenga una afinidad de unión especifica para un objetivo dado. En una modalidad preferida, el objetivo es un objetivo basado en aminoácido tal como un péptido o proteina, de manera más preferible uno que comprenda un motivo o secuencia PxxP. Por supuesto, solo una minoría de proteínas objetivo naturales y fisiológicamente relevantes contienen un motivo PxxP. Los ejemplos siguientes demuestran que las proteínas de unión de acuerdo con la invención a objetivos (por ejemplo el dominio ED-B de fibronectina ) con motivos diferentes de PxxP están disponibles. Por lo tanto, la proteína de unión de la invención de ninguna manera se limita al motivo PxxP y puede tener una afinidad de unión específica por cualquier objetivo dado, por ejemplo azúcares, polipéptidos , etc. De manera más preferible, la proteína de unión de acuerdo con la invención tiene una afinidad de unión específica por un objetivo de 10"7 a 1CT12 , de manera preferible de 10 a 10 M, de manera preferible un objetivo terapéutica y/o diagnósticamente relevante, de manera más preferible un objetivo basado en aminoácido que comprenda un motivo PxxP. En un aspecto más preferido, la proteina de unión de acuerdo con la invención tiene una afinidad de unión especifica {in vivo y/o in vitro) de 10~7 a 10~12M, de manera preferible 10"8 a 10~12M para el dominio extracelular de fibronectina oncofetal (ED-B) . En una modalidad preferida, la presente invención se relaciona con una proteina de unión recombinante que comprende por lo menos un derivado del dominio de homología 3 Src (SH3) de la FYN cinasa, en donde: (a) por lo menos un aminoácido dentro o colocado con hasta dos aminoácidos adyacente al bucle src, y/o (b) por lo menos un aminoácido dentro o colocado con hasta dos aminoácidos adyacente al bucle RT, está sustituido, suprimido o agregado, en donde el derivado de dominio SH3 tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70, preferiblemente por lo menos 80, de manera más preferible por lo menos 90 y de manera mucho más preferible por lo menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1, preferiblemente con la condición de que la proteína de unión recombinante no comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, y preferiblemente con la condición de que la proteína recombinante no sea un dominio SH3 natural que contiene proteína que existe en la naturaleza, en donde dicha proteína de unión tiene una afinidad de unión específica {in vivo y/o in vítro) preferiblemente de 10~7 a 10~12M, de manera más preferible de 10"8 a 10"12M para el dominio extracelular de fibronectina oncofetal (ED-B) . En una modalidad más preferida, el derivado de dominio SH3 tiene por lo menos 85, preferiblemente por lo menos 90, de manera más preferible por lo menos 95 y de manera mucho más preferible por lo menos 98 a 100% de identidad con el dominio de homología 3 Src de la FYN cinasa fuera de los bucles src y RT . En otra modalidad más preferida, la proteína de unión específica para ED-B anterior comprende por lo menos dos derivados del dominio SH3, preferiblemente es una proteína de unión bivalente. Preferiblemente, la proteína de unión específica para ED-B tiene uno o más, preferiblemente dos residuos preferiblemente hidrofóbicos, alterados, en las posiciones 37 y/o 50 del derivado de dominio SH3, en particular Trp37 y/o Tyr50, prefiriéndose de manera adicional Trp37 y Tyr50. Junto a la afinidad de unión específica al polipéptido y los objetivos proteinicos, la proteina de unión de la invención también puede tener una afinidad de unión especifica para un compuesto orgánico pequeño o no basado en aminoácidos, por ejemplo un azúcar, oligosacárido o polisacárido, ácido graso, etc. Ya se han investigado numerosas proteínas de fusión de anticuerpo-citocina para aplicaciones, por ejemplo, en artritis o tratamiento contra el cáncer, con frecuencia con resultados impresionantes. Por ejemplo, el anticuerpo humano L19 específico para el dominio ED.B de fibronectina (un marcador de angiogénesis ) se ha utilizado para suministrar citocinas proinflamatorias (tales como IL-2, IL-12 o TNF) a tumores sólidos, algunas veces con beneficios terapéuticos sorprendentes para una revisión y referencias correspondientes véase Neri & Bicknell, Nat . Rev. Cáncer (2005) 5: 436-446 y también el documento WO 01/62298]. La proteína de unión de la presente invención ahora permite sustituir anticuerpos en proteínas de fusión de la técnica anterior y también diseñar proteínas de fusión nuevas y menos inmunogénicas para aplicaciones farmacéuticas y de diagnóstico tanto in vivo como in vitro. En un segundo aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión que comprende una proteína de unión de la invención fusionada a un componente farmacéutica y/o diagnósticamente activo.

Una proteína de fusión de la invención puede comprender componentes no polipeptídicos, por ejemplo enlazantes no peptídicos, ligandos no peptídicos, por ejemplo para radionuclidos terapéutica o diagnósticamente pertinentes. Preferiblemente, el componente activo es una citocina, preferiblemente una citocina que se selecciona del grupo que consiste de IL-2, IL-12, TNF-a, IFN a, IFN ß, IFN ?, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3-IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF ß, LT-ß, ligando CD-40, ligando Fas, TGF-ß, IL-?a e IL-?ß. De manera más preferible, el componente es un compuesto tóxico, preferiblemente un compuesto orgánico pequeño o un polipéptido, preferiblemente un compuesto tóxico que se selecciona del grupo que consiste de caliceamicina , neocarzinostatina, esperamicina , dinemicina, kedarcidina , maduropeptina, doxorrubicina, daunorrubicina, auristatina, cadena A de ricina, modeccina, exotoxina A de Pseudomonas truncada, toxina diftérica y gelonina recombinante . En otra modalidad preferida, la proteína de fusión de acuerdo con la invención es una en donde el componente activo es una quimiocina, preferiblemente una quimiocina que se selecciona del grupo que consiste de IL-8, GRO , GRO ß, GRO ?, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-la/ß, BUNZO/STRC33 , I-TAC, BLC/BCA-1, ???-la, ???-?ß, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, IP-3a, MIP-3 ß, MCP-1-5, eotaxina, eotaxina-2, 1-309, MPIF-1, 6Ccina, CTACK, MEC, limfotactina y fractalcina. En una modalidad preferida adicional la proteina de unión de acuerdo con la invención contiene aminoácidos artificiales. En modalidades preferidas adicionales de la proteina de fusión de la presente invención, el componente activo es un colorante fluorescente, preferiblemente un componente que se selecciona de los grupos de colorantes Alexa flúor o Cy (Berlier et al., "Quantitative Comparison of Long-wavelength Alexa Fluor Dyes a Cy Dyes: Fluorescence of the Dyes and Their Bioconjugates", J. Histochem Cytochem. 51 (12) : 1699-1712, 2003) ; un fotosensibilizante, preferiblemente bis ( trietanolamina) Sn ( IV) cloro6 (SnChe6) ; un factor pro-coagulante, preferiblemente factor tisular; una enzima para activación de un fármaco precursor, preferiblemente una enzima que se selecciona del grupo que consiste de carboxi-peptidasas, glucuronidasas y glucosidasas ; un radionuclido del grupo de isótopos emisores ?, preferiblemente 99mTc, 123I, li:LIn, o del grupo de emisores de positrones, preferiblemente 18F, 64Cu, 68Ga, 86Y, 12 I, o del grupo de emisores ß, preferiblemente 131I, 90Y, 177Lu, 67Cu, o del grupo de emisores a, preferiblemente 213Bi, 211At y/o un dominio Fe funcional, preferiblemente un dominio Fe funcional humano. El dominio Fe funcional mencionado antes permitirá dirigir la respuesta inmunitaria de un mamífero a un sitio de unión de objetivo específico del componente de proteína de unión de la proteína de fusión, por ejemplo en aplicaciones terapéuticas, profilácticas y/o de diagnóstico. Una modalidad preferida adicional se relaciona con proteínas de fusión de acuerdo con la invención como se menciona en lo anterior, que comprenden además un componente que modula la semivida sérica, preferiblemente un componente que se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol (PEG) , inmunoglobulina y péptidos que unen albúmina. En una modalidad más preferida, la proteína de fusión de la invención como se menciona en lo anterior comprende una proteína de unión de la invención que tiene una afinidad de unión específica {in vitro y/o in vivo) de 10~7 a 10"12M, preferiblemente de 10"8 a 10"12M para el dominio extracelular de fibronectina oncofetal (ED-B) .

Preferiblemente, la proteína de unión específica para ED-B tiene uno o más, preferiblemente dos residuos hidrofóbicos en las posiciones 37 y/o 50 del derivado de dominio SH3, en particular Trp37 y/o Tyr50, siendo más preferido Trp37 y Tyr50. Las proteínas de unión y fusión de acuerdo con la invención se pueden preparar por cualquiera de las muchas técnicas convencionales y bien conocidas tales como estrategias de síntesis orgánica planeada, técnicas de síntesis asistida en fase sólida o por sintetizadores automatizados disponibles comercialmente . Por otra parte, también se pueden preparar por técnicas recombinantes convencionales solas o en combinación con técnicas de síntesis convencionales. Los aspectos adicionales de la presente invención se relacionan con: (i) un polinucleótido que codifica para una proteína de unión o proteína de fusión de acuerdo con la invención, (ii) un vector que comprende dicho polinucleótido, (iii) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido o dicho vector. Los polinucleótidos pueden ser ADN, ARN, PNA o cualquier otro análogo del mismo. Los vectores y células hospedadoras pueden ser de cualquier tipo convencional que cumpla con el propósito, por ejemplo producción de proteínas de unión y fusión de la invención, vectores y células hospedadoras terapéuticamente útiles, por ejemplo para genoterapia. Una persona experta en la técnica será capaz de seleccionar aquellos polinucleótidos, vectores y células hospedadoras de una técnica anterior abundante y confirmar lo adecuado en particular para el propósito deseado mediante métodos sistemáticos y sin una carga indebida. Las proteínas de unión y de fusión de la presente invención no inducen una respuesta inmunitaria fuerte, y de manera preferible esencialmente no presentan respuesta inmunitaria en mamíferos, en particular, en humanos y ratones, como se demuestra para ratones y se espera de manera análoga que sea cierto también para humanos, debido a que Fyn SH3 es idéntica en ambas especies de mamíferos. Se ha encontrado sorprendentemente que ni Fyn SH3 nativa, ni Fyn SH3 mutada provoca una respuesta inmunitaria en ratones inyectados i.v. con cualquiera de ellas. Esto es inesperado debido a que Fyn cinasa es una proteína intracelular y no participa en la selección neonatal de linfocitos B. Por lo tanto, las proteínas de unión y de fusión derivadas de Fyn SH3 con especi icidad y afinidad objetivo diseñadas son particularmente adecuadas para aplicaciones terapéuticas, profilácticas y/o de diagnóstico in vivo. Por lo tanto, un aspecto altamente relevante de la presente invención se relaciona con el uso de una proteína de unión o fusión de acuerdo con la invención para preparar un medicamento . En un aspecto adicional, la proteína de unión o de fusión de la invención se utiliza para preparar un medio de diagnóstico, en particular para aplicaciones in vivo. Preferiblemente, una proteína de unión o de fusión específica ED-B como se describe en lo anterior se utiliza para preparar un medicamento o un medio de diagnóstico para el tratamiento o diagnóstico de cáncer. Otro aspecto de la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una proteina de unión o de fusión de la invención y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la presente invención se relaciona con una composición de diagnóstico, preferiblemente para aplicaciones in vivo, que comprende una proteina de unión o de fusión de la invención y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la composición farmacéutica o de diagnóstico comprende una proteina de unión o de fusión especifica ED-B de la invención y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéutica y los medios de diagnóstico para aplicaciones in vivo de la presente invención típicamente comprenden una cantidad eficaz terapéuticamente o de diagnóstico de una proteína de unión y/o de fusión de acuerdo con la invención y opcionalmente sustancias auxiliares tales como uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones farmacéuticas se preparan de una manera bien conocida en el campo farmacéutico. Un portador o excipiente puede ser un material líquido que sirva como un vehículo o medio para el ingrediente activo. Los portadores o excipientes adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, estabilizantes, antioxidantes, sustancias reguladoras de pH, excipientes de liberación controlada. La preparación farmacéutica de la invención se puede adaptar, por ejemplo, para uso parenteral y se puede administrar al paciente en forma de soluciones o similares. Finalmente, otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método de tratamiento o diagnóstico en donde una cantidad eficaz de la composición farmacéutica o de diagnóstico anterior se administra a un paciente en necesidad del mismo, preferiblemente un paciente que sufre o se sospecha que padece de cáncer y/o enfermedades inflamatorias. Al llevar a cabo el tratamiento o diagnóstico de un sujeto que padece de enfermedades, se puede administrar una proteina de unión o de fusión de la presente invención en cualquier forma o modo, el cual vuelva al compuesto terapéutico o de diagnóstico biodisponible en una cantidad eficaz, incluyendo las vías oral o parenteral. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención se pueden administrar por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa o similar. Una persona experta en la técnica en el campo de preparación de formulaciones puede seleccionar fácilmente la forma y modo de administración apropiados en base en las características particulares del producto seleccionado, la enfermedad o condición que va a ser tratada o diagnosticada, la etapa de la enfermedad o condición y otras circunstancias pertinentes (véase, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (1990)). Las composiciones de la presente invención se pueden administrar solas o en forma de una preparación farmacéutica o de diagnóstico combinada con portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables, la proporción y naturaleza de los cuales está determinada por la solubilidad y propiedades químicas del producto seleccionado, la vía de administración seleccionada y la práctica habitual farmacéutica y de diagnóstico. Aunque son efectivos por sí mismos, los productos de la presente invención se pueden formular y administrar en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables tales como sales de adición de ácido o sales de adición de base, para propósito de estabilidad, comodidad de cristalización, solubilidad aumentada y similares. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras la-lc ilustran un análisis dot blot (de punto y mancha) . El porcentaje de clones que expresan una cantidad detectable de mutantes Fyn SH3 solubles se determina por análisis dot blot de lisados de células bacterianas utilizando un conjugado de anticuerpo anti-HIS-HRP (Sigma) como reactivo de detección. Se detecta la actividad de peroxidasa utilizando el sistema de detección de transferencia Western ECL plus (Amersham) . Figura la. Mutantes FynSH3 con bucle RT-Src aleatorizado . Figura Ib. Mutantes FynSH3 con un bucle n-Src extendido (4->6) y aleatorizado.

Figura le. FynSH3 con bucles aleatorizados RT y n-Src . La figura 2 ilustra una prueba de fago monoclonal-ELISA. Después de la tercera ronda de análisis sistemático contra sobrenadantes bacterianos monoclonales MSA que contienen fagos que muestran mutantes Fyn SH3 se prueban por ELISA utilizando placas MaxiSorp (Nunc) recubiertas con MSA (100 g/ml durante la noche, 100 µ? por pozo) . Los fagos unidos se detectan utilizando conjugados de anticuerpo anti M-13-HRP (Amersham) . Las figuras 3a-3c ilustran fago monoclonal-ELISA (contra MSA) después de una ronda de selección por maduración de afinidad utilizando placas MaxiSorp (Nunc) recubiertas con MSA (100 yg/ml durante la noche, 100 µ? por pozo) . Figura 3a. Fago ELISA de la primera sub-biblioteca de G4 (bucle n-Src aleatorizado y Trp37 y Tyr50) . El clon G4 de origen se indica con una flecha. Figura 3b. Fago ELISA de la segunda sub-biblioteca de G4 (bucle n-Src aleatorizado y extendido) . El clon G4 de origen se indica con una flecha. Figura 3c. Fago ELISA de la primera y segunda sub-bibliotecas después de una ronda de análisis sistemático, realizado bajo condiciones que favorecen los compuestos que se unen con una ksalida grande. El clon de origen G4 se indica con una flecha.

La figura 4 muestra la prueba de ELISA soluble (utilizando placas MaxiSorp (Nunc) recubiertas con MSA (100 µg/ml durante la noche, 100 µ? por pozo) sobre varios clones de unión MSA, después de clonación (vector pQE-12) , expresión y purificación de la proteina soluble, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, condiciones de origen) . Como agentes de detección se utilizaron los conjugados de anticuerpo anti-HIS-HRP . Como un control se agregaron las mismas proteínas de unión a los pozos bloqueados únicamente con MPBS 4%. La figura 5 es la especificidad de ELISA de proteína soluble. Se probaron mutantes de Fyn SH3 que se unen a MSA seleccionados para unión contra albúmina sérica humana (HSA) , albúmina sérica de rata (RSA) , albúmina sérica bovina (BSA) y ovalbúmina utilizando placas MaxiSorp (Nunc) recubiertas con las diferentes albúminas (cada una, 100 g/ml durante la noche, 100 µ? por pozo) . La figura 6 es el análisis BIACore de D3. Las concentraciones que se utilizaron son: 4, 2, 1, y 0.5 µ? (desde la parte superior) . Las figuras 7a-7c son el análisis por ELISA de muestras de sangre para determinar la presencia de anticuerpos murinos . Figura 7a. Se recubren placas MaxiSorp (Nunc) con Fyn SH3 (20 µg/ml durante la noche, 100 µ? por pozo) . Se aplicaron muestras de sangre (que varían de 75-200 µ?) para cada uno de los 5 ratones en series en dilución (de 1:4 a 1:100). La detección de anticuerpos se realizó utilizando un conjugado de anticuerpo anti-IgG de ratón-HRP (Sigma) . Como un control de la eficacia de recubrimiento se utilizaron conjugados anti-HIS-HRP (Sigma) . Figura 7b. Se recubrieron placas axiSorp (Nunc) con Fyn SH3 D3 (20 µg/ml durante la noche, 100 µ? por pozo) . Se aplicaron muestras de sangre (que varían de 75-200 µ?) de cada uno de 5 ratones en series de dilución (desde 1:4 hasta 1:100). La detección de anticuerpos se realizó utilizando un conjugado de anticuerpo anti-IgG de ratón-HRP (Sigma) . Como un control de la eficacia de recubrimiento se utilizaron conjugados anti-HIS-HRP (Sigma) . Figura 7c. Se recubrieron placas MaxiSorp (Nunc) con scFv (60 µg/ml durante la noche, 100 µ? por pozo). Se aplicaron en muestras de sangre (que varían de 75-200 µ?) de cada uno de los 4 ratones en series de dilución (de 1:4 a 1:100). La detección de anticuerpos se realizó utilizando un conjugado de anticuerpo anti-IgG de ratón-HRP (Sigma) . Como un control de la eficacia de recubrimiento se utilizaron conjugados anti-myc-HRP (Roche) . La figura 8a muestra la inmunofluorescencia de D3, el control negativo correspondiente (figura 8b), la tinción anti-CD31 (figura 8c) y el control negativo correspondiente (figura 8d) en cortes histológicos de teratocarcinoma murino F9. La figura 9a muestra la retención de tumor de Fyn SH3-D3, mientras que no se pudo observar acumulación para Fyn SH3wt (figura 9b) . Los resultados dirigidos se expresan como % de dosis inyectada de proteina marcada con 12 I retenida, por g de tejido (% de ID/g) . DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En lo siguiente, la materia objeto de la invención se describirá con mayor detalle con referencia a las modalidades especificas las cuales no se pretende que consideren como limitantes del alcance de la invención. Ejemplos Ejemplo 1: Expresión de mutantes Fyn SH3 Con el propósito de evaluar la expresión de mutantes de Fyn SH3 se realizó un análisis dot blot de tres sub-bibl iotecas diferentes de Fyn SH3 (Figuras la-lc) : En la primera biblioteca únicamente se aleatorizó el bucle RT, en la segunda se aleatorizó el bucle Src y se extendió a seis residuos, y en la tercera biblioteca se aleat ori zaron simultáneamente los bucles RT y Src, este último bucle se extendió de 4 a 6 residuos. El porcentaje de mutantes Fyn SH3 expresados varia de 59-90%.

Tabla 1.

Ejemplo 2: Selecciones de presentación de fago contra albúmina sérica de ratón Se generó una biblioteca de 107 Fyn SH3 diferentes (únicamente se aleatorizó el bucle RT) y se clonó en el vector fagémido pHENl (Hoogenboom et al. "Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains", Nucleic Acids Res, 19 (15) : 4133-7, 1991). La biblioteca se mostró en los fagos y se realizaron tres rondas de análisis sistemático contra albúmina sérica de ratón (MSA) . Después de la tercera ronda, el cribado para proteínas de unión se realizó por fago monoclonal-ELISA; se detectaron 13 clones positivos (figura 2). El secuenciado de los 13 clones mostró que las dos secuencias diferentes estaban enriquecidas, indicadas como G3 y C4. No obstante, después de subclonación y expresión de G4 en el vector pQE-12 (Qiagen, expresión y purificación de acuerdo con el manual de los fabricantes bajo las condiciones de origen) , la unión de la proteina a MSA no se puede detectar por ELISA (figura 4) debido a baja afinidad (el fago ELISA es más sensible que ELISA de la proteina soluble) . Por lo tanto, se utilizó la secuencia de G4 para dos bibliotecas de maduración de afinidad diferentes (tamaño: 107 clones para cada biblioteca) . En la primera, los 4 residuos del bucle n-Src y los residuos Trp37 (SEC ID NO: 1) y Tyr50 (SEC ID NO: 1) fueron aleatorizados , en la segunda, uno del bucle n-Src se extendió de 4 a 6 residuos aleatorizados. Después de una ronda de análisis sistemático varios clones de ambas sub-bibliotecas proporcionaron señales más fuertes en el fago ELISA en comparación con el clon C4 de origen (figuras 3a-3c) . Después de subclonación y expresión de varios clones, se confirmó la unión de la proteina soluble por ELISA (figura 4). Las constantes de disociación aparentes están en el intervalo de 100 nm (determinado por BIAcore) . Algunos de los clones dan reacción cruzada con otras albúminas séricas (probadas: albúmina sérica humana (HSA) , albúmina sérica de rata (RSA) , albúmina sérica bovina (BSA) y ovalbúmina) , mientras que otros clones son altamente específicos para MSA, lo que indica que es posible aislar proteínas de unión altamente específicas (figura 5 ) . Ejemplo 3: Selecciones de presentación de fago contra el dominio b adicional de fibronectina (ED-B) Se selecciona ED-B como una proteína objetivo con el fin de demostrar la capacidad de los aglutinantes derivados de Fyn SH3 contra una proteina farmacéuticamente relevante. ED-B es un dominio de homología tipo III de 91 aminoácidos que se inserta en la molécula de fibronectina por un mecanismo de empalme alternativo a nivel del transcrito primario siempre que se lleva a cabo remodelado de tejido (Zardi et al., "Transformed human cells produce a new fibronectin isoform by preferential alternative splicing of a previously unobserved exon." Embo J. 6(8): 2337-42, 1987). Es un buen marcador de calidad de angiogénesis que se sobreexpresa en una diversidad de tumores sólidos (por ejemplo carcinoma de células renales, carcinoma colorrectal, carcinoma hepatocelular , astrocitomas de alto grado, tumores de las vías respiratorias y digestivas altas, cáncer de vejiga, etc.) pero es virtualmente indetectable en tejido adulto normal (excepto por el endometrio en la fase proliferativa y algunoas vasos en los ovarios) . (Para más detalles respecto a ED-B como objetivo véase enrad y Menssen, "ED-B fibronectin as a target for antibody-based cáncer treatments." Expert Opin. Ther. Targets 9(3) : 491-500, 2005) . Se prepara una biblioteca de más de mil millones de mutantes Fyn SH3 y se presentan en fagos (aleatorización simultánea en los bucles RT-Src y n-Src) . Después de tres rondas de análisis sistemático contra ED-B, se identifican 3 clones de unión por fago ELISA. El secuenciado mostró dos secuencias diferentes (los clones indicados Bll y D3) . La constante de disociación de D3 se determina por análisis de interacción en tiempo real de resonancia de plasmón de superficie utilizando un instrumento BIAcore 3000 y mostró un valor de 8.5 x 10"8 M (figura 6). D3 (SEC ID NO: 3) GVTLFVALYDYHAQSGADLSFHKGEKFQILKFGRGKGDWWEARSLTTGETGYIPSNYV APVDSIQ Ejemplo 4: Inmunogenicidad La inmunogenicidad de las proteínas es uno de los principales inconvenientes en tratamientos relacionados con proteínas, especialmente para tratamientos que involucran administraciones repetitivas de un medicamento. Debido a la conservación de la secuencia Fyn SH3 en ratones y hombres se investigó in vivo el potencial inmunogénico de la proteína de tipo silvestre Fyn SH3 (Fyn SH3wt) y de un mutante de Fyn SH3 (Fyn SH3D3, una sustancia que se une contra ED-B) al inyectar a 5 ratones repetidamente con las dos proteínas. Se inyectó a los ratones 4 veces (cada tercer día) con 20 µg de proteína. Un día después de la cuarta inyección se mató a los ratones y se tomaron muestras de sangre para examinar la presencia o ausencia de anticuerpos murinos anti-Fyn SH3wt y anti-Fyn SH3D3. Como un control positivo se inyectó a 4 ratones (puntos de tiempo iguales de inyección y dosificaciones iguales (= 60 yg) ) con un anticuerpo humano en el formato Fv de cadena sencilla (scFv) . No obstante, un ratón del grupo scFv murió 20 minutos después de la tercera inyección y los otros tres estuvieron a punto de morir de manera que las muestras se tomaron de inmediato después de la tercera inyección. Las figuras 7a y 7b demuestran que no hay anticuerpos detectables contra Fyn SH3wt y Fyn SH3D3, mientras que se observaron señales fuertes en el grupo control (Figura 7c). Ejemplo 5: Inmunohistofluorescencia Con el fin de explorar si Fyn SH3-D3 (D3, una sustancia que se une contra ED-B) reconoce su objetivo en la conformación de origen en el tejido, se realizó inmunofluorescencia en secciones o cortes de teratocarcinoma F9. La figura 8a ilustra que D3 unido se une al estroma de tumor alrededor de los vasos sanguíneos. La detección se realizó con un conjugado de anticuerpo anti-His-Alexa488. En el control negativo no se agregó proteína D3 (figura 8b) . Con el fin de visualizar los vasos sanguíneos se tiñeron de manera conjunta las mismas secciones con un anticuerpo de rata anti-CD31 de ratón y como un anticuerpo secundario se utilizó un conjugado de burro anti-Alexa 594 de rata (figura 8c) . El control negativo se realizó utilizando un anticuerpo secundario sin el anticuerpo primario (figura 8d) . Ejemplo 6: Biodistribución cuantitativa in vivo Se evaluó el desempeño de direccionamiento in vivo de Fyn SH3-D3 (que se une contra ED-B) y Fyn SH3 tipo silvestre (que no se une a ED-B) por experimentos de biodistribución en ratones que presentan teratocarcinoma murino F9 injertado, s.c. Dado que ED-B es idéntico en ratón y en hombre, los resultados en los estudios de direccionamiento de tumor pueden ser un elemento de predicción del funcionamiento de D3 en humanos. Se inyectó D3 y SH3wt marcado con 125I, i.v. 24 horas después se mató a los animales, se extirparon los órganos, se pesaron y se realizó una cuenta de radioactividad. La figura 9a muestra que D3 se acumula de manera selectiva en el tumor (las proporciones tumor: órgano varían de 3:1 a 10:1) mientras que no se pudo observar incremento en la concentración para la proteína de tipo silvestre Fyn SH3 (figura 9b) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una proteina de unión recombinante, que comprende por lo menos un derivado del dominio de homología 3 de Src (SH3) de la FYN cinasa, caracterizada porque: (a) por lo menos un aminoácido en o colocado con hasta dos aminoácidos adyacente al bucle src, y (b) por lo menos un aminoácido en o colocado hasta en dos aminoácidos adyacente al bucle RT, está sustituido, suprimido o agregado, en donde el derivado del dominio SH3 tiene por lo menos 85, preferiblemente por lo menos 90, de manera más preferible por lo menos 95, de manera mucho más preferible por lo menos 98 a 100% de identidad con el dominio de homología 3 Src (SH3) de la FYN cinasa fuera de los bucles src y RT y preferiblemente con la condición de que la proteína recombinante no sea una proteína que contenga el dominio SH3 natural que existe en la naturaleza . 2. La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende por lo menos dos derivados del dominio SH3, preferiblemente una proteína de unión bivalente.
3. 3. La proteina de unión de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque comprende uno o preferiblemente dos residuos alterados en las posiciones 37 y/o 50 del derivado de dominio SH3, preferiblemente dos residuos alterados hidrofóbicos , de manera más preferible Trp37 y/o Tyr50, prefiriéndose de manera adicional Trp37 y Tyr50.
4. 4. La proteina de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque tiene afinidad de unión especifica de 10~7 a 10~12 M, de manera preferible 10"8 a 10~12 M para el dominio extracelular de fibronectina oncofetal (ED-B) .
5. 5. La proteina de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. NO.: 3.
6. 6. Una proteina de fusión caracterizada porque comprende una proteina de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 fusionada a un componente farmacéutica y/o diagnósticamente activo.
7. 7. La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el componente se selecciona del grupo que consiste de: (i) citocinas, preferiblemente citocinas que se seleccionan del grupo que consiste de IL-2, IL-12, TNF-a, IFN a, IFN ß, IFN ?, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF ß, LT-ß, ligando CD-40, ligando Fas, TGF-ß, IL-?a e IL-?ß; (ii) compuestos tóxicos, preferiblemente compuestos orgánicos pequeños o polipéptidos , preferiblemente compuestos tóxicos que se seleccionan del grupo que consiste de caliceamicina, neocarzinostatina, esperamicina, dinemicina, kedarcidina , maduropeptina, doxorrubicina, daunorrubicina, auristatina, cadena A de ricina, modeccina, exotoxina A de Pseudomonas truncada, toxina de difteria y gelonina recombinante ; (iii) quimiocinas, preferiblemente quimiocinas que se seleccionan del grupo que consiste de IL-8, GRO a, GRO ß, GRO y, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-la/ß, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-la, MIP-1 ß, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP-3 a, MIP-3 ß, MCP-1-5, eotaxina, eotaxina-2, 1-309, MPIF-1, 6Ccina, CTACK, MEC, linfotactina y fractalcina ; (iv) colorantes fluorescentes, preferiblemente un componente que se selecciona de colorantes Alexa Fluor o Cy; (v) fotosensibilizantes , preferiblemente bis (trietanolamina) Sn (IV) cloro6 (SnChe6); (vi) factores procoagulantes, preferiblemente factores tisulares; (vii) enzimas para activación de profármaco, preferiblemente enzimas que se seleccionan del grupo que consiste de carboxipeptidasas, glucuronidasas y glucosidasas ; (viii) radionúclidos ya sea del grupo de isótopos emisores ?, preferiblemente 99raTc, 123I, ? ?? o del grupo de emisores de positrones, preferiblemente 18F, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I o del grupo de emisores ß, preferiblemente 131I, 90Y, 177Lu, 67Cu, o del grupo de emisores a, preferiblemente 213Bi, 211At; y (ix) dominios Fe funcionales, preferiblemente dominios Fe funcionales humanos.
8. 8. La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizada porque comprende además un componente que modula la semivida en suero, preferiblemente un componente que se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol (PEG), inmunoglobulina y péptidos que unen albúmina .
9. 9. La proteina de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque comprende la proteína de unión de conformidad con la reivindicación 5 ó 6.
10. 10. Un polinucleótido caracterizado porque codifica para una proteína de unión o una proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. 11. Un vector, caracterizado porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 10.
12. 12. Una célula hospedadora, caracterizada porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 10 y/o un vector de conformidad con la reivindicación 11.
13. 13. El uso de una proteina de unión o de fusión, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para preparar un medicamento o un medio de diagnóstico, preferiblemente un medicamento para el tratamiento de cáncer o un medio de diagnóstico para el diagnóstico de cáncer.
14. 14. Una composición farmacéutica o de diagnóstico, caracterizada porque comprende una proteina de unión o de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. 15. Un método para producir una biblioteca que comprende las proteínas de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) generar polinucleótidos que codifican para proteínas de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, preferiblemente por aleatorización simultánea de por lo menos un aminoácido en o colocado con hasta dos aminoácidos adyacente el bucle src y sustitución, supresión o adición aleatorias de por lo menos un aminoácido en o colocado hasta dos aminoácidos adyacente al bucle RT, (ii) generar bibliotecas, preferiblemente bibliotecas de presentación de fago que expresan las proteínas de unión, (iii) opcionalmente someter las bibliotecas a cribado de selección.
16. 16. Una biblioteca, caracterizada porque se obtiene por el método de conformidad con la reivindicación 17, preferiblemente una biblioteca que comprende más de 1000 millones de proteínas de unión.