MX2008014733A - Cepa bg1 de thermoanaerobacter mathranii. - Google Patents

Abstract

Se describe una bacteria termofílica anaeróbica estricta que pertenece al grupo de Thermoanaerobacter mathranii y mutantes y derivativos de la misma. La bacteria es particularmente adecuada para la producción de productos de fermentación tales como etanol, ácido láctico, ácido acético e hidrógeno a partir de biomasa lignocelulósica.

Description

CEPA BG1 DE THERMOANAEROBACTER MATHRA II CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una nueva bacteria termofilica que pertenece al grupo de Thermoanaerobacter mathranii.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La industria de la producción de productos de fermentación tales como etanol y ácido láctico, está enfrentando el reto de redirigir el proceso de producción de la fermentación de materiales almidonados relativamente fácil de convertir pero caros, a la biomasa lignocelulósica compleja pero barata, tal como la madera y residuos de las cosechas agrícolas, por ejemplo, paja. De manera contraria, el almidón el cual contiene polímeros homogéneos y fácilmente hidrolizados , la biomasa lignocelulósica contiene celulosa (25-53%), hemicelulosa (20-35%), lignina polifenólica (10- 25%) y otros componentes extraíbles. Típicamente, el primer paso en la utilización de la biomasa lignocelulósica es un paso de pre-tratamiento, con el fin de fraccionar los componentes del material lignocelulósico e incrementar su área superficial. El método de pre-tratamiento más frecuentemente utilizado es la hidrólisis ácida, donde el material lignocelulósico es sometido a un ácido tal como REF. : 198307 ácido sulfúrico, con lo cual los polímeros de azúcar, celulosa y hemicelulosa son parcial o completamente hidrolizados a sus monómeros de azúcares constituyentes. Otro tipo más de hidrólisis de lignocelulosa es la explosión de vapor, un proceso que comprende el calentamiento del material lignocelulósico mediante inyección de vapor a una temperatura de 190 a 230°C. Un tercer método es la oxidación húmeda en donde el material es tratado con oxígeno a 150-185°C. Los pre- tratamientos pueden ser seguidos por hidrólisis enzimática para completar la liberación de los monómeros de azúcar. Este paso de pre- tratamiento da como resultado la hidrólisis de la celulosa en glucosa, mientras que la hemicelulosa es transformada en las pentosas xilosa y arabinosa, y las hexosas glucosa, galactosa y mañosa. De este modo, en contraste al almidón, la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica da como resultado la liberación de azúcares de pentosa además de los azúcares de hexosa. Esto implica que los organismos de fermentación útiles necesitan ser capaces de convertir los azúcares de hexosa y pentosa a productos de fermentación deseados tales como etanol . Los microorganismos tradicionales utilizados, por ejemplo, para la fermentación del etanol, Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis, no metabolizan las pentosas tales como la xilosa y la arabinosa, y la ingeniería metabólica extensa es de este modo necesaria para mejorar el funcionamiento sobre sustratos lignocelulósicos . Las bacterias termofílicas gram-positivas tienen ventajas únicas sobre las cepas de producción de etanol convencionales. Las principales ventajas son sus amplias especificidades de sustrato y la alta producción natural de etanol. Además, la fermentación etanólica a altas temperaturas (55-70°C) tiene muchas ventajas sobre la fermentación mesofílica. Una ventaja de la fermentación termofílica es la minimización del problema de contaminación en cultivos continuos, ya que únicamente unos pocos microorganismos son capaces de desarrollarse a tales altas temperaturas en un hidrolizado de lignocelulosa no destoxificado . Actualmente, dependiendo del método de pre-tratamiento, las celulasas y hemicelulasas a menudo tienen que ser agregadas al hidrolizado lignocelulósico pre-tratado con el fin de liberar los monómeros de azúcar. Estas enzimas contribuyen significativamente a los costos de producción de los productos de fermentación. Sin embargo, muchas cepas gram-positivas termofílicas poseen una gama de enzimas relevantes, y las adiciones suplementarias podrían volverse menos caras si se utiliza una cepa gram-positiva termofílica. La fermentación a alta temperatura tiene también las ventajas adicionales de las altas productividades y las conversiones de sustrato y la recuperación facilitada del producto. Los hidrolizados de lignocelulosa contienen inhibidores tales como furfural, fenoles y ácidos carboxílieos , los cuales pueden inhibir potencialmente el organismo termentador. Por lo tanto, el organismo debe también ser tolerante a estos inhibidores. El efecto inhibitorio de los hidrolizados puede ser reducido por la aplicación de un proceso de destoxificación antes de la fermentación. Sin embargo, la inclusión de este paso de proceso extra incrementa significativamente el costo total del producto de fermentación y debe ser evitado preferentemente. Por ejemplo, se ha estimado que el sobreencalado del hidrolizado de sauce incrementa el costo de producción de etanol utilizando Escherichia coli por 22% (Von Sivers et al., 1994) . Se prefiere por lo tanto que el microorganismo sea capaz de producir productos de fermentación a partir de hidrolizados de hemicelulosa u holocelulosa no destoxificados , para hacerlo utilizable en un proceso industrial de fermentación basado en lignocelulosa, debido al alto costo del proceso de destoxificación. Es también particularmente ventajoso si el microorganismo potencial es capaz de desarrollarse sobre altas concentraciones de hidrolizados de lignocelulosa, por ejemplo hidrolizados lignocelulósicos con alto contenido de materia seca. Esto es de importancia particular cuando el microorganismo es para la producción de alcohol tal como producción de etanol, ya que los costos de destilación se incrementan conforme disminuyen las concentraciones de alcohol . La Patente de los Estados Unidos No. 6,555,350 describe una cepa de Thermoanaerobacter que es capaz de convertir las pentosas a etanol . No obstante, esta cepa tiene un producto secundario significativo de lactato y ha sido únicamente probado en hidrolizado lignocelulósico que tiene una concentración de materia seca de menos de 6% p/p. Larsen et al., 1997 describe un Thermoanaerobacter mathranii cepa A3 el cual podría únicamente desarrollarse en hidrolizado de paja de trigo con una concentración de 6% de materia seca (60 g/litro de materia seca de la paja de trigo complementada con xilosa) y se reporta que no es capaz de desarrollarse sobre galactosa. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un microorganismo que sea capaz de superar los obstáculos anteriormente mencionados, en particular para la producción de etanol.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En consecuencia, la presente invención pertenece a una cepa bacteriana de Thermoanaerobacter mathranii seleccionada de BG1 (DSMZ Acceso número 18280) y mutantes de la misma. La invención está basada en el aislamiento de la cepa bacteriana BG1 que es capaz de desarrollarse y de producir productos de fermentación sobre concentraciones muy altas de materia seca de hidrolizados lignocelulósicos . Además, BGl tiene una amplia especificidad de sustrato, y es capaz de utilizar pentosas tales como xilosa y arabinosa, y también hexosas . La cepa tiene además la ventaja de ser termofílica y de este modo es capaz de desarrollarse a altas temperaturas, dando como resultado altas productividades y velocidades de conversión del sustrato, bajo riesgo de contaminación y recuperación facilitada del producto. La invención se refiere además a un método para producir un producto de fermentación mediante el cultivo de una cepa de acuerdo a la invención bajo condiciones adecuadas .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se mencionó anteriormente, la presente invención pertenece a una cepa de Thermoanaerobacter mathranii seleccionada de BGl y mutantes de la misma. La invención está basada en la cepa bacteriana BGl la cual ha sido depositada de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest del 17 de mayo del 2006 con DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig , Alemania bajo DSMZ acceso número 18280. Como es aparente a partir de lo siguiente, las bacterias preferidas de la presente invención han sido depositadas. Otras bacterias de la presente invención pueden por lo tanto ser obtenidas mediante la mutación de las bacterias depositadas y seleccionando los mutantes derivados que tengan características mejoradas. Las características deseables incluyen una gama incrementada de azúcares que pueden ser utilizados, velocidad incrementada de crecimiento, habilidad para producir más altas cantidades de productos de fermentación tales como etanol, etc. Los métodos adecuados para la mutación de las bacterias y la selección de los mutantes deseados se describen en el Functional análisis of Bacterial genes: A practical Manual, editado por W. Schumann, S.D. Ehrlich & N. Ogasawara, 2001. La cepa base BG1 es capaz de desarrollarse y producir productos de fermentación sobre concentraciones muy altas de materia seca de hidrolizados lignocelulósicos . En el presente contexto, el término "hidrolizado lignocelulósico o hidrolizado de lignocelulosa" está destinado a designar una biomasa lignocelulósica que ha sido sometida a un paso de pre-tratamiento mediante el cual el material lignocelulósico ha sido al menos parcialmente separado en celulosa, hemicelulosa y lignina, con lo cual se ha incrementado el área superficial del material. El material lignocelulósico puede ser típicamente derivado de material vegetal, tal como paja, heno, desechos de jardín, madera desmenuzada, cascaras de frutas y cascarillas de semillas. El método de pre-tratamiento más frecuentemente utilizado es la hidrólisis ácida, donde el material lignocelulósico es sometido a un ácido tal como ácido sulfúrico, mediante el cual los polímeros de azúcar, celulosa y hemicelulosa son parcial o completamente hidrolizados a sus monómeros de azúcar constituyentes. Otro tipo más de hidrólisis de lignocelulosa es la explosión de vapor, un proceso que comprende calentamiento del material lignocelulósico mediante inyección de vapor a una temperatura de 190 a 230°C. Un tercer método es la oxidación húmeda en donde el material es tratado con oxígeno a 150-185°C. Los pre-tratamientos pueden ser seguidos por hidrólisis enzimática para completar la liberación de los monómeros de azúcar. Este paso de pre-tratamiento da como resultado la hidrólisis de la celulosa en glucosa mientras que la hemicelulosa es transformada en las pentosas xilosa y arabinosa, y las hexosas glucosa, galactosa y mañosa. El paso de pre-tratamiento puede, en ciertas modalidades, ser suplementado con el tratamiento que da como resultado la hidrólisis adicional de la celulosa y la hemicelulosa. El propósito de tal tratamiento de hidrólisis adicional es hidrolizar el oligosacárido y posiblemente las especies de polisacáridos producidas durante la hidrólisis ácida, la oxidación húmeda, o la explosión de vapor de origen de celulosa y/o hemicelulosa para formar azúcares fermentables (por ejemplo, glucosa, xilosa y posiblemente otros monosacáridos) . Tales tratamientos adicionales pueden ser ya sea químicos o enzimáticos. La hidrólisis química es típicamente lograda mediante tratamiento con un ácido, tal como el tratamiento con ácido sulfúrico acuoso, a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 10 a 150°C. La hidrólisis enzimática es típicamente formada mediante tratamiento con una o más enzimas carbohidrasas apropiadas tales como celulasas, glucosidasas y hemicelulasas , incluyendo las xilanasas . Se encontró sorprendentemente que la cepa bacteriana de acuerdo a la invención es capaz de desarrollarse en un medio que comprende un material de biomasa lignocelulósica hidrolizada que tiene un contenido de materia seca (o como es también utilizado en la presente "sólidos totales", TS) de al menos 10% p/p, tal como al menos 15% p/p, incluyendo al menos 20% p/p, e incluso tan alto como de al menos 25% p/p. Como se mencionó previamente, éste tiene la gran ventaja de que puede no ser necesario diluir el hidrolizado antes del proceso de fermentación, y con esto es posible obtener más altas concentraciones de productos de fermentación tales como etanol, y con esto los costos para recuperar subsecuentemente los productos de fermentación, pueden ser disminuidos. Por ejemplo los costos de destilación para el etanol se incrementarán conforme disminuyen las concentraciones de alcohol . La cepa bacteriana de acuerdo a la invención es una bacteria termofílica anaeróbica, y es capaz de desarrollarse a altas temperaturas incluso a o por arriba de 70°C. El hecho de que la cepa sea capaz de operar a esta alta temperatura es de alta importancia en la conversión del material lignocelulósico en productos de fermentación. La velocidad de conversión de los carbohidratos por ejemplo el etanol es mucho más rápida cuando se conduce a altas temperaturas. Por ejemplo, la productividad del etanol en Bacillus termofílico es hasta diez veces más rápida que un proceso convencional de fermentación con levadura, el cual opera a 30°C. En consecuencia, una planta de producción más pequeña es requerida para una productividad volumétrica dada, con lo cual se reducen los costos de construcción de plantas. Como también se mencionó anteriormente, a alta temperatura, existe un riesgo reducido de contaminación de otros microorganismos, dando como resultado menor tiempo perdido, productividad incrementada de la planta y un menor requerimiento de energía para la esterilización del material de alimentación. La alta temperatura de operación puede también facilitar la recuperación subsiguiente de los productos de fermentación resultantes . Numerosos productos de fermentación son artículos valiosos que son utilizados en diversas áreas tecnológicas, incluyendo la industria de los alimentos y la industria química. Actualmente, los requerimientos de energía global cada vez mayores han dado como resultado un enfoque incrementado sobre las alternativas a combustibles fósiles como fuentes de energía, y el etanol derivado de materiales vegetales (bioetanol) ha recibido atención particular como un potente reemplazo para o un suplemento a los productos de hidrocarburo líquidos derivados de petróleo. El ácido láctico, el cual es otro producto de fermentación, es extensamente utilizado en la industria de los cosméticos como un agente químico anti-envej ecimiento, y la industria de los alimentos utiliza el ácido láctico en una variedad de productos alimenticios para actuar como un regulador de la acidez. Actualmente, el ácido láctico ha llamado también mucho la atención por su uso potencial en los poliésteres biodegradables . La cepa de acuerdo a la invención tiene el potencial de ser capaz de producir un número de diferentes productos de fermentación, incluyendo ácidos, alcoholes, cetonas e hidrógeno. En una modalidad, el alcohol es seleccionado de etanol, butanol, propanol, metanol, propanodiol y butanodiol . En una modalidad adicional el ácido es ácido láctico, propionato, acetato, succinato, butirato o formiato y la cetona es acetona.

Como se mencionó anteriormente, BGl es una cepa de tipo silvestre aislada de un manantial caliente de Islandia, y esto tiene varias características altamente ventajosas, necesarias para la conversión de material de biomasa lignocelulósica . De este modo, esta cepa base posee toda la maquinaria genética para la conversión de los azúcares pentosa y hexosa a diversos productos de fermentación tales como ácido láctico y etanol. Como será aparente a partir de los siguientes ejemplos, el examen de la secuencia completa de rADN 16S {SEQ ID NO: 14) mostró que la cepa BGl está estrechamente relacionada a Thermoanaerobacter mathranii cepa A3 (Larsen et al., 1997) . Esto coloca a BGl en el grupo V de los Clostridia. Aunque las cepas están estrechamente relacionadas, éstas son muy diferentes cuando entra a la tolerancia a hidrolizados hemicelulósicos . A3 pudo únicamente desarrollarse en hasta 40% de hidrolizado de paja de trigo (de 60 g/litro de peso seco de paja de trigo complementada con xilosa, por ejemplo una concentración de materia seca de 6% p/p) mientras que BGl puede desarrollarse y producir etanol a partir del hidrolizado no diluido a altas concentraciones de materia seca (hasta al menos 25%) sin adición de azúcar o enzimas. Además, se reporta que la cepa A3 no es capaz de desarrollarse sobre galactosa (Larsen et al., 1997), mientras que BGl se desarrolla muy bien y produce principalmente etanol con galactosa como la fuente de carbono única. De este modo, la cepa de acuerdo a la invención es capaz de desarrollarse sobre galactosa como la única fuente de carbono . Como se muestra en los ejemplos anexos las primeras horas del desarrollo de BG1 a pH = 7 y 70°C en medio mínimo de xilosa, son producidos el etanol y el acetato en cantidades equimolares . Cuando el cultivo entra posteriormente a la fase exponencial, la producción específica de etanol excede aquella del acetato, significativamente. El pH después de la fermentación permanece sin cambio, y por lo tanto no se espera que el efecto sea provocado por el pH. De igual modo, se mostró que mediante el reemplazo del espacio superior de N2/C02 con hidrógeno puro o la adición de acetato no tuvo efecto sobre la fermentación, y los mecanismos detrás del cambio a la formación de etanol en la fase exponencial tardía, son por lo tanto todavía elusivos. Los ejemplos también ilustran que el pH del medio tiene un fuerte efecto sobre el perfil del producto de BG1. Por arriba de pH 6.5, el producto de etanol fue dominante, y casi no fue producido lactato. Por debajo de pH 6.0, la producción de lactato se incrementó a expensas del etanol, y a pH 5.0, no se observó crecimiento. El mismo efecto de pH sobre la producción de lactato ha sido observado para la bacteria termofílica estrechamente relacionada Thermoanaerobacter wiegelii. Se encontró que los extractos celulares crudos contienen una lactato-deshidrogenasa (LDH) activada por fructosa-1 , 6 -difosfato (FDP) . La afinidad de FDP fue dependiente del pH extracelular. La activación máxima fue observada a pH 6.2, y no fue observada ninguna activación a pH 8.2 (Cook, 2000) . Ya que este efecto es común en las especies de Thermoanaerobacter, es también probable que ésta sea la causa en BG1 (Lamed y Zeikus, 1980; Carreira et al., 1982; Bryant, 1991) . Los siguientes ejemplos también ilustran el efecto de adición de etanol sobre la velocidad de crecimiento y la distribución de metabolito de BG1. La baja tolerancia del etanol es un obstáculo mayor para la explotación comercial de las bacterias termofílicas y la selección para cepas resistentes en etanol es por lo tanto de gran importancia. No obstante, un mutante resistente al etanol de Clostridium thermohydrosulfuricum, 39EA, podría desarrollarse a concentraciones de etanol de hasta 8% (p/v) a 45 °C, y hasta 3.3% (p/v) a 68 °C (Lovitt et al., 1984), y una cepa mutante de Thermoanaerobacter ethanolicus, 39E-H8, mostró una tolerancia al etanol de 8% a 60°C (Burdette et al., 2002) . BG1 es muy tolerante al etanol a 70 °C, cuando se compara a otras cepas anaeróbicas termofílicas (Herrero y Gómez, 1989; Larsen et al., 1997; Lovitt et al., 1988; iegel y Ljungdahl, 1981; Rani et al., 1996). A 2.8% de etanol exógeno, la velocidad de crecimiento fue todavía de 27% de la velocidad sin el etanol agregado, en un cultivo no adaptado. Se ha reportado que Thermoanaerobacter ethanolicus E39 consume el etanol exógenamente agregado utilizando la alcohol-deshidrogenasa primaria (Burdette et al., 2002) . Esto es el caso incluso en el mutante E39-H8 tolerante al etanol, el cual no tiene (o tiene disminuida) la actividad de alcohol-deshidrogenasa primaria. En contraste, se encontró que BG1 produce etanol incluso a altas concentraciones de etanol exógeno. Se encontró que la producción de lactato se incrementa en BG1 cuando fue agregado el etanol. La producción de etanol a altas concentraciones de etanol es primordial para microorganismos productores de etanol. En oposición a los sustratos almidonados o celulósicos, los cuales son casi exclusivamente desintegrados a glucosa, la biomasa lignocelulósica contiene varios monómeros de azúcar diferentes, incluyendo hexosas y pentosas . Si éstas van a ser convertidas a un producto de fermentación tal como etanol en un proceso continuo, es necesario que todos los azúcares sean recogidos y metabolizados simultáneamente. La co- fermentación ha probado ser problemática en muchos de los microorganismos productores de etanol, tradicionales. Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobillis han sido exitosamente manipulados por ingeniería genética para la co- fermentación de glucosa y xilosa, pero las co- fermentaciones con arabinosa parecen ser más problemáticas (Dien et al., 2000; Lawford y Rousseau, 2002; Ho et al., 1998). En las bacterias gram-positivas en las cuales fue estudiado el metabolismo de carbono al nivel molecular, se mostró que la glucosa inhibe la transcripción del operón xylAB que codifica para las enzimas responsables del metabolismo inicial de xilosa, mediante represión de catabolito (Hueck y Hillen, 1995) . En contraste, la transcripción del operón xylAB de Thermoanaerobacter ethanolicus no es reprimida por la glucosa, y se observa una degradación de la glucosa y la xilosa (Erbeznik et al., 1998). Como se muestra en los Ejemplos, BG1 degradó la mezcla de azúcar de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa simultáneamente, así como la mezcla de glucosa, xilosa, galactosa y mañosa. La hidrólisis de la biomasa lignocelulósica da como resultado la liberación de los inhibidores microbianos (Klinke et al., 2004), y el lavado del hidrolizado puede por lo tanto incrementar la productividad del etanol de BG1. No obstante, en experimentos mostrados en los Ejemplos, el lavado disminuyó significativamente la productividad de etanol de BG1. Es probable que este efecto sea provocado por el lavado de los pentosanos fácilmente fermentables , con lo cual se disminuye la concentración de azúcar inicial. En un estudio similar sobre madera de álamo pretratada, se mostró que el lavado eliminó eficientemente los inhibidores, pero también dio como resultado una pérdida drástica de 75% de los pentosanos disponibles (Saddler y Chan, 1984) . La presencia de los inhibidores en el hidrolizado no parece ser un obstáculo mayor para las fermentaciones de BG1, y BG1 parece tener una gran ventaja sobre los microorganismos tradicionales productores de etanol, en hidrolizados lignocelulósicos no destoxificados , concentrados. Se demuestra en los siguientes ejemplos que la cepa base BG1 en modalidades ventajosas puede ser modificada con el fin de obtener mutantes o derivados de BG1 , con características mejoradas. De este modo, en una modalidad se proporciona una cepa bacteriana de acuerdo a la invención que es una variante o mutante de BG1 donde uno o más genes han sido insertados, suprimidos o sustancialmente inactivados. Los genes pueden ser insertados, suprimidos o sustancialmente inactivados utilizando herramientas de manipulación génica adecuadas y procedimientos de ingeniería genética que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, sistemas de clonación de genes, recombinación homologa y técnicas descritas en Sambrook & Russell "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Tercera Edición) , Cold Spring Harbor Laboratory Press. En particular, se ha encontrado sorprendentemente por parte de los presentes inventores, que la capacidad de producción de etanol de BG1 puede ser significativamente incrementada por la inactivación del gen que codifica para la lactato-deshidrogenasa (LDH) (EC 1.1.1.27). De este modo, se encontró que la producción de etanol, cuando es desarrollada sobre glucosa, fue incrementada desde aproximadamente 51-56% del rendimiento máximo teórico en la cepa BG1 tipo silvestre hasta aproximadamente 84-91% en la cepa BG1L1 deficiente en la lactato-deshidrogenasa. Por lo tanto, se contempla que la cepa de acuerdo con la invención pueda ser una versión modificada de BG1 en donde el gen que codifica para la lactato-deshidrogenasa (LDH) (EC 1.1.1.27) ha sido inactivada por la supresión del gen, o en donde el gen ha sido sustancialmente inactivado por la mutación, supresión o inserción de uno o más aminoácidos en el gen. En una modalidad, se proporciona una cepa mutante BG1L1 deficiente en lactato-deshidrogenasa, que ha sido depositada de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest del 17 de mayo del 2006 con DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Alemania bajo DSMZ acceso número 18283. Como se mencionó anteriormente, el ácido láctico (o lactato) es un producto ampliamente utilizado, por ejemplo en la industria de los alimentos y es por lo tanto un producto de fermentación valioso. Los presentes inventores encontraron que la cepa BG1 de tipo silvestre puede ser modificada para producir cantidades incrementadas de lactato en comparación al tipo silvestre, mediante inactivación del gen que codifica para la piruvato-ferrodoxina-oxidorreductasa (EC 1.2.7.1). De este modo, se encontró que el metabolismo de BG1 de tipo silvestre podría ser completamente desplazado desde la producción de etanol hasta la producción de lactato. Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar una cepa derivada de BG1 en donde un gen que codifica para la piruvato-ferrodoxina-oxidorreductasa (EC 1.2.7.1) ha sido sub-regulado o sustancialmente inactivado, por ejemplo inactivado por la mutación, supresión o inserción de uno o más aminoácidos en el gen. Más específicamente, se proporciona un derivado de BG1 que tiene características incrementadas de producción de lactato, que es designado BG1PF1 y ha sido depositado de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest el 17 de mayo del 2006 con DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Alemania bajo DSMZ acceso número 18282. El hidrógeno es ampliamente utilizado en las industrias del petróleo y química, por ejemplo, para el procesamiento de combustibles fósiles, para la hidroalquilación, hidrodesazuframiento e hidrodesintegración, y se utiliza para la hidrogenación de grasas y aceites (encontrados en artículos tales como margarina) , y en la producción de metanol. Adicionalmente , puede ser utilizado el hidrógeno como una fuente de energía, y puede ser quemado por ejemplo en motores de combustión. El ácido acético es un producto valioso que es ampliamente utilizado en la industria, principalmente para la producción de monómero de acetato de vinilo, producción de éster, vinagre y para el uso como un solvente. La demanda global de ácido acético es alrededor de 6.5 millones de toneladas por año. Los presentes inventores han construido una cepa mutante de BG1 mejorada, la cual es capaz de producir más hidrógeno y ácido acético en la forma de acetato, que la cepa BG1 de tipo silvestre. Esto fue realizado mediante la sub-regulación del gen HydABCD que codifica para la hidrogenasa de BG1. De este modo, de acuerdo con la invención, se proporciona una cepa mutante o derivado de BG1 , en donde un gen que codifica para una hidrogenasa o una subunidad de hidrogenasa ha sido sub-regulado o sustancialmente inactivado. La inactivación del gen puede ser realizada mediante mutación, supresión o inserción de uno o más aminoácidos en el gen. Más específicamente, el gen que codifica para la hidrogenasa o una subunidad de hidrogenasa puede ser seleccionado de las [Fe] -hidrogenasas y [NiFe] -hidrogenasas (EC 1.6.5.3, EC 1.12.7.2., EC 1.12.99.6) tales como NuoE, NuoF, NuoG, EchB, EchC, EchD, EchE y EchF . En consecuencia, en una modalidad se proporciona una cepa de acuerdo a la invención que tiene capacidades mejoradas de producción de hidrógeno y ácido acético, que es designada BG1H1. BG1H1 ha sido depositada de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest el 17 de mayo del 2006 con DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Alemania bajo DSMZ acceso número 18281. Se contempla además que en ciertas modalidades, puede ser útil sub-regular o sustancialmente inactivar un gen que codifica para una acetato-cinasa (EC 2.7.2.1) y/o fosfato-acetiltransferasa (EC 2.3.1.8) en BG1 o mutantes de la misma. La inactivación puede ser realizada mediante mutación, supresión o inserción de uno o más aminoácidos en dichos genes. Como se mencionó anteriormente, BG1 posee la maquinaría genética para hacer posible que convierta los azúcares hexosa y los azúcares pentosa a una gama de productos de fermentación deseados, incluyendo etanol . Sin embargo, para ciertas modalidades puede ser deseado insertar uno más genes adicionales dentro de la cepa de acuerdo a la invención. De este modo, con el fin de mejorar el rendimiento del producto de fermentación específico, puede ser benéfico insertar uno o más genes que codifican para una polisacarasa dentro de la cepa de acuerdo a la invención. Por lo tanto, en modalidades específicas se proporciona una cepa de acuerdo a la invención en donde uno o más genes que codifican para una polisacarasa que se selecciona de celulasas (tal como EC 3.2.1.4); beta-glucanasas, incluyendo glucan-1,3 beta-glucosidasas (exo-1,3-beta-glucanasas , tales como EC 3.2.1.58), 1,4-beta-celobiohidrolasa (tales como EC 3.2.1.91) y endo- 1 , 3 (4 ) -beta-glucanasas (tales como EC 3.2.1.6); xilanasas, incluyendo endo-1, 4 -beta-xilanasas (tales como EC 3.2.1.8) y xilan 1,4-beta-xilosidasa (tales como EC 3.2.1.37); pectinasas (tales como EC 3.2.1.15); alfa-glucuronidasa, alfa-L-arabinofuranosidasa (tales como EC 3.2.1.55), acetilesterasa (tales como EC 3.1.1.-), acetilxilanesterasa (tales como EC 3.1.1.72), alfa amilasa (tales como EC 3.2.1.1), beta-amilasa (tales como EC 3.2.1.2), glucoamilasa (tales como EC 3.2.1.3), pululanasa (tales como EC 3.2.1.41), beta-glucanasa (tales como EC 3.2.1.73), hemicelulasa, arabinosidasa, mananasas incluyendo manan-endo-1 , 4 -beta-manosidasa (tales como EC 3.2.1.78) y manan-endo-1 , 6 -alfa-manosidasa (tales como EC 3.2.1.101), pectina-hidrolasa, poligalacturonasa (tales como EC 3.2.1.15), exopoligalacturonasa (tales como EC 3.2.1.67) y pectato-liasa (tales como EC 4.2.2.10). Dependiendo del producto de fermentación deseado, se contempla que en ciertas modalidades es útil insertar genes heterólogos que codifican para una piruvato-descarboxilasa (tales como EC 4.1.1.1) o insertar un gen heterólogo que codifica para una alcohol-deshidrogenasa (tales como EC 1.1.1.1, EC 1.1.1.2, EC 1.1.1.71, O EC 1.1.99.8) o supra-regular un gen ya existente que codifica para la alcohol-deshidrogenasa. De acuerdo con la invención, un método de producción de un producto de fermentación que comprende el cultivo de una cepa de acuerdo a la invención bajo condiciones adecuadas, es también proporcionada. La cepa de acuerdo a la invención es un microorganismo anaeróbico estricto, y por lo tanto se prefiere que el producto de fermentación sea producido por un proceso de fermentación realizado bajo condiciones anaeróbicas estrictas. Adicionalmente , la cepa de acuerdo a la invención es un microorganismo termofílico, y por lo tanto el proceso puede funcionar óptimamente cuando éste es operado a temperatura en el intervalo de aproximadamente 40-95°C, tal como en el intervalo de aproximadamente 50-90°C, incluyendo el intervalo de aproximadamente 60-85°C, tal como el intervalo de aproximadamente 65-75°C. Para la producción de ciertos productos de fermentación, puede ser útil seleccionar un proceso de fermentación específico, tal como el proceso de fermentación por lotes, incluyendo un proceso de lote alimentado o un proceso de fermentación continua. De acuerdo con la invención, el método es útil para la producción de una gama de productos de fermentación incluyendo ácidos, alcoholes, cetonas e hidrógeno. De este modo, los productos de fermentación tales como etanol, butanol, propanol, metanol, propanodiol, butanodiol, ácido láctico, propionato, acetato, succinato, butirato, formiato y acetona pueden ser producidos de acuerdo con la invención. La invención será además descrita en los siguientes ejemplos no limitantes y en la figuras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Árbol filogenético basado en el análisis de la secuencia de rADN de 16S que muestra la posición de la cepa BG1 entre las cepas de Clostridia termofílicas relacionadas. G. es una especie de Thermoanaerobacter, Tm. es un Thermoanaerobacterium . La barra muestra sustituciones nucleotídicas de 2%. Figura 2. Distribución del producto a partir de una fermentación por lotes de 24 horas de BG1. ?: xilosa (mM) , ?: lactato (mM) , ?: acetato (mM) , ·: etanol (mM) , ?: hidrógeno (mM) , ¦: densidad celular (OD578).

Figura 3. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de crecimiento específica de la cepa BG1 desarrollada anaeróbicamente en lotes con 5 g/litro de xilosa. Las desviaciones estándares de 3 mediciones independientes son mostradas con barras . Figura 4. Formación de producto a partir de fermentaciones por lotes de BG1 a diferentes H. ?: lactato (mM) , ?: acetato (mM) , ·: etanol (mM) . Figura 5. Las fermentaciones por lotes con la cepa BG1 desarrollada sobre el medio BA con 5 g/litro de xilosa y concentraciones variantes de etanol agregado al medio. El rendimiento del producto en el producto mM por g de xilosa consumida, se muestra como una función de la concentración inicial de etanol en el medio. ?: acetato, ?: lactato, ·: etanol . Figuras 6A-6B. Consumo de azúcar por BG1 en la fermentación por lotes con azúcares mixtos como fuente de carbono. La concentración de azúcar de dos diferentes experimentos con mezcla de azúcar (cada uno por duplicado) se muestra como una función de tiempo después de la inoculación con la cepa BG1. ¦: glucosa, A : xilosa, o: arabinosa, x: galactose, ?: mañosa. Figuras 7A-7B. BG1 (símbolos abiertos) y BG1L1 (símbolos cerrados) desarrollados en lotes a concentraciones variantes de glucosa. Fig. 7A: Etanol (cuadros) , lactato (círculos) y acetato (triángulos) como una función de la concentración de etanol. B: recuperaciones de carbono de los experimentos mostrados en A. Figuras 8A-8B. BG1 (símbolos abiertos) y BG1L1 (símbolos cerrados) desarrollados por lotes a concentraciones variantes de xilosa A: etanol (cuadros) , lactato (círculos) y acetato (triángulos) como una función de la concentración de etanol. B: recuperaciones de carbono de los experimentos mostrados en A. Figuras 9A-9B. BG1 (símbolos abiertos) y BG1L1 (símbolos cerrados) desarrollados en lotes a concentraciones variantes de etanol exógenamente agregado, etanol (cuadros), lactato (círculos) y acetato (triángulos) como una función de la concentración de etanol. B: recuperaciones de carbono de los experimentos mostrados en A. Figura 10. Abreviaturas en la Tabla: HRT: tiempos de retención hidráulica, Glu: glucosa, Xyl : xilosa, Ace : acetato, CGlu: glucosa consumida, CXyl : xilosa consumida, CS : azúcar total consumida, YAce/TS: rendimiento de acetato (g/g de azúcares iniciales), YEtOH/TS: rendimiento de etanol (g/g de azúcares iniciales), YEtOH/TS: rendimiento de etanol de los azúcares iniciales corregido para evaporación del etanol, QEtOH: productividad volumétrica del etanol, CR: recuperación de carbono . Figura 11. Concentraciones de azúcar influente de diversas suspensiones de hidrolizado de paja de trigo. El hidrolizado de paja de trigo no diluido (23% DM; 77 g/litro de azúcares solubles; 57 g/litro de glucosa y 20 g/litro de xilosa) . Figura 12. Rendimientos de producto obtenidos con BG1L1 en un FBR a 70 °C a partir de diversas suspensiones de hidrolizado de paja de trigo. Figuras 13A-13B. Concentraciones de azúcar influente (Fig. 13A) y conversiones de azúcar (Fig. 13B) para diversas suspensiones de hidrolizado de forraje de maíz hidrolizado con ácido, a partir de un reactor de lecho fluidizado continuo con la bacteria anaeróbica termofílica inmovilizada BG1L1 a 70 °C. Figura 14. Concentraciones de producto efluente (acetato y etanol) y concentración del acetato influente para diversas suspensiones de hidrolizado de forraje de maíz hidrolizado con ácido, proveniente de un rector de lecho fluidizado continuo con la bacteria anaeróbica termofílica inmovilizada BG1L1 a 70 °C. ' Figura 15. Rendimiento de etanol y recuperación de carbono para diversas suspensiones de hidrolizado de forraje de maíz hidrolizado con ácido, proveniente de un reactor de lecho fluidizado continuo con la bacteria anaeróbica termofílica inmovilizada BG1L1 a 70°C. Figura 16. Rendimiento de etanol y acetato para diversas suspensiones de hidrolizado de paja de trigo, explotada en húmedo, provenientes de un reactor de lecho fluidizado continuo con la bacteria anaeróbica termofílica inmovilizada BG1L1 a 70 °C. Figura 17. Construcción utilizada para la supresión de una región de 7762 pares de bases, que contiene los genes que codifican para la subunidad de la piruvato- ferredoxina-oxidorreductasa, proveniente del cromosoma de BG1. parte superior: una región con dirección 5' de la piruvato-ferredoxina-oxidorreductasa de BG1. parte inferior: una región en dirección 3' de la piruvato- ferredoxina-oxidorreductasa de BG1. HTK: un gen que codifica para un cásete de resistencia a la kanamicina, altamente termoestable . Figura 18. Distribución del producto final después de la fermentación por lotes a 70°C con cinco clones independientes de BG1PF. Figura 19. Construcción utilizada para la introducción de casetes anti- sentido dentro del cromosoma de BG1. parte superior: una región con dirección 5' de la lactato-deshidrogenasa de BG1. parte inferior: una región en dirección 3' del gen de la lactato-deshidrogenasa. HTK: un gen que codifica para un cásete de resistencia a la kanamicina, altamente termoestable. prom: promotor, ter: terminador . Un fragmento de 335 pares de bases proveniente de hydA fue clonado en la dirección anti-sentido en un sitio de clonación entre el promotor y el terminador. Figura 20. Análisis de transferencia Northern del ARN total aislado de BGl, BG1L1 y BG1H1 desarrollado sobre glucosa o xilosa. El ARN fue aislado de las células provenientes de las células con crecimiento exponencial. Panel superior: se utilizó una sonda dirigida hacia hydA antisentido. Panel inferior: una sonda dirigida hacia la parte hydA del mARN de hyd. Las bandas del marcador de tamaño del ARN son mostradas a la derecha. Figura 21. desarrollo, consumo de xilosa, producción de acetato, lactato, etanol e hidrógeno de BGl (cuadros abiertos y cerrados) , BG1L1 (triángulos) y BG1H1 (círculos abiertos y cerrados), desarrollado en lotes.

EJEMPLOS Materiales y Métodos Los siguientes materiales y métodos fueron aplicados a los siguientes Ejemplos: Cepas y condiciones de crecimiento La cepa BGl fue aislada anaeróbicamente a partir de un manantial caliente de Islandia a 70°C. Todas las cepas fueron cultivadas a 70 °C anaeróbicamente en medio mínimo (BA) con 2 g/litro de extracto de levadura como en (Larsen et al., 1997) a no ser que se indique de otro modo. Para el medio sólido, se utilizaron tubos giratorios (Hungate RE, 1969; Bryant MP, 1972) que contenía medio BA con 11 g/litro de fitagel y 3.8 g/litro de MgCl2«6H20 adicional. Para fines de clonación se utilizó Escherichia coli ToplO (Invitrogen, EUA) . ToplO fue rutinariamente cultivada a 37°C en medio Luria-Bertani (Ausubel et al . t _ 1.997 ) suplementario con. 100 µg/ml de ampicilina y 25 pg/ml de kanamicina cuando sea necesario .

Reactores continuos El medio de fermentación utilizado para cultivo continuo fue preparado y suplementado con los mismos minerales, metales en trazas, y extracto de levadura como se describe anteriormente. El pH inicial del medio fue ajustado a 7.4-7.7 y fue calentado en autoclave a 120 °C por 30 minutos. Para asegurar las condiciones anaeróbicas, el medio fue lavado a chorro por 45 minutos con una mezcla de N2/C02 (4:1), y finalmente se inyectó Na2S en la botella para dar una concentración final de 0.25 g/litro. El reactor fue una columna de vidrio forrada con agua con 4.2 cm de diámetro interno y 20 cm de altura. El volumen de trabajo del reactor fue de 200 mi. El influente introducido desde el fondo del reactor y la alimentación fue controlada por una bomba peristáltica (Modelo 503S-10rpm, Watson Marión, Falmout, Reino Unido) . El flujo de recirculación fue logrado mediante el uso de una bomba peristáltica idéntica (Modelo 503-50rpm, Watson Marión, Falmouth, Reino Unido) , con un grado de recirculación para asegurar las velocidades de flujo hacia arriba en el reactor de 1 m/hora. El pH fue mantenido a 7.0 por la adición de NaOH (1-2 M) , a no ser que se indique de otro modo. El reactor fue cargado con 75 mi de material portador y finalmente el sistema reactor completo, incluyendo la tubería y el depósito de recirculación, fue calentado en autoclave a 120°C por 30 minutos. Se tomaron muestras líquidas de las compuertas de muestreo localizadas sobre la parte superior del reactor, cerca de la salida del reactor. Los experimentos fueron realizados a 70°C mediante calentamiento externo y recirculación de agua caliente en el forro de vidrio. Durante los experimentos, siempre que se logró un estado de reposo, fueron cambiadas las concentraciones de HRT o de azúcar. Los criterios para las condiciones de estado de reposo fueron que todos los parámetros debían ser mantenidos constantes por al menos cinco tiempos de residencia. El funcionamiento del reactor a diferente estado de reposo fue monitorizado mediante la medición de las concentraciones de azúcar y producto de fermentación final. Durante el experimento, fueron utilizadas jeringas estériles y agujas estériles para tomar las muestras desde el influente y el efluente, y las muestras fueron almacenadas a -20°C hasta el análisis. Las muestras gaseosas efluentes fueron tomadas para determinar el contenido de dióxido de carbono y de hidrógeno.

Prueba para la contaminación Una muestra de 1 mi fue tomada del reactor y el ADN cromosómico fue purificado utilizando el kit de purificación de ADN proveniente de A&A Biotech (Polonia) . Las reacciones de PCR fueron establecidas utilizando la Pfu polimerasa (MBI Fermentas, Alemania) y los cebadores B-all 27F (SEQ ID NO: 1 ; GAG TTT GAT CCT GGC TCA G) y B-all 1492R (SEQ ID NO : 2 ; ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT) , los cuales se recocen al rADN bacteriano. Los fragmentos fueron purificados utilizando el equipo Qiaex II de Qiagen, tratados con PNK (MBI Fermentas) , clonados dentro de pBluescript SK+ (Stratagene) tratado con CIAP (MBI Fermentas) , y transformados dentro de Escherichia coli ToplO (Invitrogen) . Fueron recogidos 50 clones y los insertos fueron amplificados utilizando los cebadores B-all 27F y B-all 1492R. Los fragmentos resultantes fueron digeridos con las enzimas de restricción AluI y Mbo (MBI Fermentas) y fueron corridos sobre un gel de agarosa al 3%. Únicamente fue encontrado un patrón de digestión. Fueron enviados dos fragmentos para el secuenciamiento (MWG Biotech, Alemania) y fueron identificados como la cepa A10. Las reacciones de PCR fueron también corridas utilizando los cebadores Idhcwl e Idhccw2 que se recocen a las regiones con dirección 5' y en dirección 3' de la lactato-deshidrogenasa respectivamente. De otro modo, las mismas condiciones de reacción que para los cebadores B-all, fueron utilizadas. Los fragmentos obtenidos fueron clonados (como se menciona anteriormente) , 26 fueron analizados mediante polimorfismo de longitud de fragmento de restricción. Nuevamente, esto dio como resultado únicamente un patrón. Fueron secuenciados dos fragmentos .

Métodos analíticos Las cepas fueron desarrolladas en medio BA sin antibióticos por lotes por 24-48 horas como se establece. Los sobrenadantes de cultivo fueron analizados para la glucosa, xilosa, acetato, lactato y etanol utilizando una columna de análisis de ácido orgánico (columna Aminex HPX-87H (Bio-Rad) ) sobre un aparato de HPLC Hewlett Packard de la serie 1100 a 65 °C con 4 mM H2S0 como eluyente.

Enzimas y reactivos Si no se establece de otro modo, las enzimas fueron suministradas por MBI Fermentas (Alemania) y utilizadas de acuerdo a las recomendaciones del proveedor. Las reacciones de PCR fueron realizadas con una mezcla de 1 unidad: 1 unidad de polimerasa Taq y polimerasa Pfu. Los productos químicos fueron de grado molecular y fueron adquiridos de Sigma-Aldrich Sweden AB.

Análisis del rARN de 16S 200 µ? del cultivo de BG1 de toda la noche fueron cosechados, tratados por 2 minutos con microondas a un efecto máximo, y utilizado como una plantilla de PCR. Un rADN 16S de 1500 pares de bases fue amplificado mediante PCR utilizando cebadores Bl (GAG TTT GAT CCT GGC TCA G) (SEQ ID No. : 3) y B2 (ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT) (SEQ ID No.: 4) . El fragmento PCR de extremo romo fue tratado con la polinucleótido-cinasa y clonado dentro del vector pBluescript SK+ digerido con Smal y tratado con CIP (fosfatasa intestinal de ternera) (Stratagene) . 24 clones de la biblioteca resultante de AND fueron analizados mediante análisis de fragmento de enzimas de restricción utilizando las enzimas de restricción AluI, Mbol y Hin6I. 6 fragmentos fueron enviados para el secuenciamiento en MWG-Biotech (Alemania) . El alineamiento fue realizado utilizando VectorNTi y el árbol fue extraído utilizando el programa MEGA2 (Kumar et al., 2001) .

Técnicas analíticas Los sobrenadantes de cultivo fueron analizados para la celobiosa, glucosa, xilosa, acetato, lactato y etanol utilizando una columna de análisis de ácido orgánico (columna Aminex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, CA Estados Unidos)) sobre HPLC a 65 °C con H2S04 4 mM como eluyente. Las mediciones del etanol y el acetato fueron validadas utilizando cromatografía de gases con detección de ionización por flama. Los azúcares mixtos fueron medidos sobre HPLC utilizando una columna Phenomenex, monosacárido de RCM (00H-0130-KO) a 80°C con agua como eluyente. La mañosa y la arabinosa pudieron ser distinguidos utilizando este ajuste y fueron por lo tanto probados en cultivos separados. El nitrógeno fue medido utilizando un cromatógrafo de gases GC82 (MikroLab Aarhus, Dinamarca .

Construcción del cásete suprimido en el gen Idh La construcción final suprimida en un gen, p3CH contiene 1) un fragmento de AND en dirección 5' del gen I-Idh de BG1, amplificado utilizando los cebadores IdhuplF (SEQ ID No.: 5; 5 ' -TTCCATATCTGTAAGTCCCGCTAAAG) y ldhup2R (SEQ ID No.: 6; 5 ' -ATTAATACAATAGTTTTGACAAATCC) , 2) un gen que codifica para una resistencia a la kanamicina, altamente termoestable , amplificada a partir del plásmido pUC18HTK (Hoseki et al., 1999), y 3) un fragmento de ADN con dirección 3' para el gen 1-Idh de BG1, amplificando utilizando los cebadores Idhdown3F (SEQ ID No.: 7; 5 ' -ATATAAAAAGTCACAGTGTGAA) e Idhdown4R (SEQ ID No.: 8 ; 5 ' -CACCTATTTTGCACTTTTTTTC) . El plásmido p3CH fue linearizado y sometido a electroporesis en BG1.

Elaboración de la construcción antisentido de hidrogenasa El fragmento AND de la SEQ ID No. : 9 que contiene el cásete antisentido de la hidrogenasa A fue insertado dentro de p3CH.

Construcción del cásete suprimido de pfor La construcción final suprimida en un gen, pPF contiene 1) un fragmento de AND en dirección 5' del gen I-Idh de BGl, amplificando utilizando los cebadores pforuplF (SEQ ID No.: 10 ; 5 ' -GAGGATTTAAGAAGGGGAGTTGG) y pforup2R (SEQ ID No.: 11 ; 5 ' -ATTTCATCTCCCCCTGGATAAAG) , 2) un gen que codifica para una resistencia a la kanamicina, altamente termoestable , amplificada a partir del plásmido pUC18HTK (Hoseki et al., 1999), y 3) un fragmento de ADN con dirección 3' del gen I-Idh de BGl, amplificando utilizando los cebadores pfordown3F (SEQ ID No.: 12; 51 -CGAGAGCTGATTCCCACGAAGA) y pfordown4R (SEQ ID No.: 13; 5 ' -CAGACTACTACAACTGGATCTAGC) . El plásmido p3PF fue linearizado y sometido a electroporesis en BGl.

Electroporación de BGl Todo el manejo, excepto por el evento de electroporación fue realizado bajo condiciones anaeróbicas. Para la preparación de las células competentes, 150 mi de BA enmendado con 2 g/1 del extracto de levadura, y 5 g/1 de xilosa fueron inoculados con un cultivo fresco ON de BGl a una densidad óptica OD578 de 0.1 e incubado a 70 °C. A OD578 = 0.5 las células fueron enfriadas sobre hielo, cosechadas (3500 rpra, 35 minutos, 4°C) y resuspendidas en 10 mi de amortiguador EP frío (sucrosa 0.3 M, 10% de glicerol, Na2S 3.20 mM, pH 7, lavado a chorro con gas N2 estéril) . El lavado fue repetido y finalmente el botón fue re-suspendido en 4 mi de amortiguador EP sin Na2S . Las células fueron almacenadas a -80°C en alícuotas. 0.2 mi de células competentes fueron transferidas a cubetas de electroporación (espacio libre del electrodo 0.1 cm) que contenía 2 g de ADN plásmido linearizado, y sometido a un pulso de 25µ¥ , 500 ohmios, y 2.0 kV. Las células fueron transferidas a botellas de suero anaeróbicas que contenían 10 mi de BA con 2 g/1 de extracto de levadura. Las células sometidas a electroporesis se dejaron recuperar a 70°C por 16 horas. Estas fueron luego diluidas 10 veces en medio BA que contenía 35 g/ml de kanamicina. Después de 24 horas, la transferencia en el medio que contenía kanamicina fue repetida y el cultivo fue desarrollado por 24 horas a 70 °C. Utilizando la técnica Hungate (Bryant MP, 1972; Hungate RE, 1969) , se transfirieron 0.5 mi del cultivo a tubos giratorios con 35 µg/ml de kanamicina. Después de 2 días de incubación a 70°C, las colonias fueron recogidas e inoculadas en el medio BA sin antibióticos. El ADN cromosómico fue purificado a partir de 4 clones recombinantes individuales y a partir de BG1 de tipo silvestre. Un fragmento de 2.1 kb fue amplificado a partir del AND cromosómico utilizando los cebadores Idhcwl e Idhccw2 recociendo justo con dirección hacia arriba y justo con dirección hacia abajo del gen Idh respectivamente. Estos fragmentos fueron analizados mediante digestiones con enzimas de restricción y fueron secuenciados . Las reacciones de PCR utilizando los cebadores internos I-Idh únicamente, produjeron productos cuando BG1 de tipo silvestre fue utilizado como plantilla.

Análisis de transferencia Northern El ARN fue purificado a partir de 50 mi de células de Thermoanaerobacter que se desarrollan exponencialmente , utilizando el kit de ARN Total de A&A Biotechnology (Polonia) como es recomendado por el proveedor. 5 g de ARN total fueron corridos en geles de 1% de agarosa que contenían tiocianato de guanidina 80 mM (transferencias de mARN) o geles de acrilamida desnaturalizante al 5% (transferencias antisentido) . La transferencia fue realizada utilizando el sistema TurboBlotter (Scleicher & Schuell BioScience GmbH, Alemania) como es recomendado por el proveedor. La hibridación fue realizada utilizando la solución Ultrahyb de Ambion, Inc. (TX, Estados Unidos) y el lavado fue de acuerdo al procedimiénto estándar (Ausubel et al., 1997) . Las sondas en sentido y antisentido fueron transcritas a partir de pSKPhydD (el mismo fragmento de hydD utilizado en la construcción antisentido, pero sin las secuencias promotora y terminadora, insertado dentro del MCS de pBluescript SK+ ( Invitrogen) ) utilizando a-P32CTP marcado.

Rendimiento y recuperación del carbono Los rendimientos máximos teóricos y las recuperaciones de carbono fueron calculadas con base en las siguientes reacciones (no son incluidas las conversiones de ATP y NAD(P) +) : glucosa 1 M —> lactato 2 M, glucosa 1 ? acetato 2 M + C02 2 M, glucosa 1 M ? etanol 2 M + C02 2 M, xilosa 3 M ? lactato 5 M, xilosa 3 M ? acetato 5 M + C02 5 M, xilosa 3 ? etanol 5 M + C02 5 M Los rendimientos máximos teóricos del etanol a partir de glucosa y xilosa son por lo tanto 2 y 1.67 moles por mol, respectivamente. Las recuperaciones de carbono fueron calculadas como : 3 x (raM de lactato + mM de acetato + mM de etanol producido) x 100% n x (mM de sustrato consumido) donde n es 5 para la xilosa y 6 para la glucosa EJEMPLO 1 Análisis 16S de BG1 Una biblioteca de fragmentos de rADN 16S de 1500 pares de bases proveniente de la cepa BG1 fue construida y analizada mediante el análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, para diferentes secuencias. Únicamente fue encontrado un patrón de digestión y fueron secuenciados 6 clones. Las seis secuencias fueron idénticas y la búsqueda de homología de ADN en www.ncbi.nlm.nih.gov colocó a la cepa BG1 en el grupo de Thermoanaerobacter mathranii, el cual consiste ahora de las cepas A3 y BG1. La secuencia de rADN 16S de BG1 es mostrado en el listado de secuencias como SEQ ID No. : 14. Excepto por siete posiciones no secuenciadas del GenBank (Benson et al., 2005), la secuencia de la cepa A3 , las dos cepas tienen secuencias idénticas de rADN 16S. Como lo muestra la figura 1, los otros parientes más cercanos son Thermoanaerobacter thermocopriae (98% de identidad) , Thermoanaerobacter acetoethylicus (95%) y Thermoanaerobacter italicus (95%) . BG1 está estrechamente relacionada a Thermoanaerobacter mathranii cepa A3 (Larsen et al., 1997) . Esto coloca a BG1 en el grupo V de Clostridia como se describió previamente (Collins et al., 1994) . Aunque las cepas están estrechamente relacionadas, éstas son muy diferentes cuando se involucra la tolerancia a los hidrolizados hemicelulósicos . A3 puede únicamente desarrollarse en hasta 40% de hidrolizados de paja de trigo (de 60 g/1 de peso seco de paja de trigo complementada con xilosa) mientras que BG1 puede desarrollarse y producir etanol a partir del hidrolizado no diluido sin la adición de azúcar o enzimas. Además, se reporta que la cepa A3 no es capaz de desarrollarse sobre galactosa (Larsen et al., 1997), mientras que BG1 se desarrolla muy bien y produce principalmente etanol con galactosa como la única fuente de carbono (datos no mostrados) .

EJEMPLO 2 Productos de fermentación de BG1 BG1 fue desarrollado anaeróbicamente por lotes por 24 horas con xilosa 27 mM como la única fuente de carbono (figura 2) . En las primeras cuatro horas de la fermentación, fueron producidas cantidades cada vez más iguales de acetato y etanol. Entre 4 y 6 horas de desarrollo, la producción de etanol se incrementó con relación al acetato, y en la última fase exponencial o en la fase estacionaria, se produjo casi exclusivamente etanol. Únicamente fue producida una cantidad menor de lactato a todo lo largo del experimento. La producción de hidrógeno pareció seguir la producción del acetato con cantidades aproximadamente equimolares de los dos compuestos producidos .

EJEMPLO 3 Tolerancia de BG1 a la temperatura , al pH y al etanol Como se puede observar a partir de la figura 3, la temperatura óptima de la cepa BG1 es alrededor de 70 °C, la cual es la misma que la temperatura del manantial caliente del que fue aislada BG1. Se encontró que BG1 se desarrolla en el intervalo pH de pH = 5.0 a 7.5. La formación y producto diferente de los valores de pH del medio de cultivo fue probada en experimentos por lotes. Como lo muestra la figura 4, la producción de etanol fue favorecida en el intervalo de pH de 6.5 a 7.5, mientras que la producción de lactato fue predominante a un pH menor. El rendimiento óptimo del etanol fue de 1.15 mM de etanol/mM de xilosa a pH = 6.5 y pH = 7.5. A pH 5.5, el rendimiento de etanol fue de 0.44 mM/mM. Esto corresponde a 69% y 26% del rendimiento máximo teórico respectivamente . La tolerancia al etanol es de importancia mayor para la producción de etanol. La formación de producto fue investigada a concentraciones de etanol exógeno. Como se muestra en la figura 5, los rendimientos de etanol cayeron dramáticamente a concentraciones incrementadas de etanol. A 0% del etanol inicial en el medio, el rendimiento fue de 1.05 mM de etanol/mM de xilosa consumida, mientras que, a 2.8% de etanol ésta fue de 0.31 mM/mM. Esta disminución en la producción de etanol fue principalmente debida a la producción incrementada de lactato (incremento de 6.4 veces), pero la producción de acetato también se incrementó por 40%. Aparentemente, no son formados otros productos mayores, ya que las recuperaciones de carbono calculadas a partir de los rendimientos de acetato, etanol y lactato, están en el intervalo de 92-99% a todas las concentraciones (datos no mostrados) .

EJEMPLO 4 Co-fermentación de BG1 de azúcar de hemicelulosa La captación simultánea y el metabolismo de diferentes azúcares es un rasgo deseado pero no muy común para los microorganismos utilizados para la producción de etanol. BG1 fue probada en lotes sobre dos diferentes mezclas de azúcar, cada una conteniendo cuatro diferentes monómeros de azúcar de hemicelulosa, para estudiar si los monómeros mixtos pueden ser metabolizados simultáneamente (figura 6A-6B) . La mañosa y la arabinosa no pudieron ser distinguidos en un ajuste de HPLC y fueron por lo tanto probados en mezclas separadas. Como se puede observar a partir de las figuras 6A-6B, una degradación simultánea de todos los azúcares agregados observados entre 6 y 8 horas de crecimiento. La velocidad de degradación de la xilosa fue tan alta como aquella de la glucosa, aunque el inicio de la degradación de la xilosa fue ligeramente retardado. La galactosa y la arabinosa fueron los últimos en ser degradados, y la velocidad de degradación fue más lenta que las velocidades de glucosa y de xilosa. La velocidad de degradación de la mañosa fue la más rápida observada, pero nuevamente, el inicio de la degradación fue retardado en comparación a la glucosa.

EJEMPLO 5 BG1L1 y BGL2 : supresión del gen I-Idh del BGl Para prevenir la formación de lactato, fue suprimido L-LDH de BGl. El plásmido pKHFr3rev purificado, que contenía el gen de resistencia a la kanamicina, termoestable, flanqueado por las regiones en dirección 5' y con dirección 3 ' de Idh, fue linearizado y sometido a electroporesis dentro de BGl, y fueron seleccionados los recombinantes positivos utilizando el gen de resistencia a la kanamicina, termoestable. Varios clones independientes fueron aislados y verificados mediante PCR. Los productos de PCR provenientes de dos clones fueron subsecuentemente secuenciados y se encontró que contienen el cásete de resistencia a la kanamicina en vez de el gen de la lactato-deshidrogenasa como se esperaba. Las dos cepas mutantes fueron nombradas BG1L1 y BG1L2. La cepa BGl de tipo silvestre y las dos cepas BG1L1 y BG1L2 fue desarrollada sobre diferentes concentraciones de glucosa y xilosa para probar su funcionamiento de producción de etanol (figuras 7A-7B y 8A-8B) . Por simplicidad, únicamente se muestra BG1L1, pero la cepa paralela, BG1L2, mostró resultados muy similares e incluso tuvo un rendimiento máximo ligeramente mayor sobre la xilosa que BG1L1. Como se puede observar a partir de las figuras 7A-7B y 8A-8B, la distribución de producto es cambiada en gran medida en el mutante. No se produce lactato detectable utilizando ya sea glucosa o xilosa como sustrato, confirmando la supresión del gen de la lactato-deshidrogenasa . Esto muestra también que el gen Idh descrito aquí, es ya sea el único gen Idh en BG1 o el principal. La cepa BG1 de tipo silvestre, responde a la concentración incrementada de sustrato, por el incremento de producción de lactato, especialmente cuando se desarrolla sobre xilosa. Se observa una producción correspondiente menor de etanol y acetato. La producción de acetato es constante o menor a mayores concentraciones de azúcar y, ya que no puede producir lactato, es observada una producción de etanol alta constante o cada vez mayor. Los rendimientos de etanol son significativamente mejorados en el mutante: sobre glucosa, son observados rendimientos de 84-91% del máximo teórico en BG1L1 en comparación a 51-56% en la cepa de tipo silvestre. Sobre xilosa, los rendimientos de etanol de BG1L1 y BG1 de tipo silvestre son de 76-80% y 40-63% respectivamente. La recuperación del carbono estuvieron entre 91 y 106% (figuras 7B y 8B) . La recuperación es por arriba del 100% probablemente surgen del metabolismo de los componentes del extracto de levadura. Las figuras 9A-9B muestran la producción de etanol de BGl en comparación a BG1L a concentraciones cada vez mayores de etanol en el medio. La cepa BGl de tipo silvestre responde a las concentraciones incrementadas de etanol en el medio, por el incremento de la producción de lactato dramáticamente. La producción de acetato se incrementa alrededor de dos veces. El rendimiento de etanol disminuye únicamente a 20% del rendimiento teórico máximo cuando es agregado 2.8% (v/v) . En BG1L, no existe producción de lactato, y la producción de acetato no se incrementa significativamente a concentraciones mayores de etanol. Como resultado, el rendimiento de etanol es alto a todas las concentraciones de etanol en el medio. De hecho, el rendimiento más alto medido es de 84% del máximo teórico a 1.95% del etanol agregado y a 2.8% del etanol, el rendimiento es todavía del 72%. Las recuperaciones de carbono estuvieron entre 84 y 99% (figura 9B) . El experimento fue repetido con el clon independiente BG1L2 , con resultados similares.

EJEMPLO 6 Fermentación continua de azúcares utilizando BG1L1. El potencial de utilizar bacterias anaeróbicas termofílicas inmovilizadas para la fermentación continua de etanol, fue investigado en un reactor de lecho fluidizado a escala de laboratorio operado a 70 °C (Figura 10) . El efecto del tiempo de retención hidráulico (HRT) sobre la producción y productividad del etanol, fue examinado a una corriente de alimentación con 10 g/1 de xilosa. Las concentraciones de producto y la conversión de xilosa casi no fueron afectadas por la disminución gradual de HRT desde 8 a 1 hora. La conversión de azúcar fue más alta de 97.8% de rendimiento de 0.33 g de etanol/g de azúcares iniciales, y la productividad del etanol se incrementó gradualmente de 0.43 a 3.34 g/l/h. El segundo experimento fue realizado para investigar la co-fermentación de la glucosa y la xilosa. Ambos azúcares fueron simultáneamente y efectivamente convertidos a etanol con utilización de azúcar mayor de 90.6% a mezclas de azúcar hasta de 54 g/1. A estas concentraciones de azúcar, la producción de etanol se incrementó gradualmente y la concentración máxima de etanol alcanzada fue de 15.35 g/1. Los rendimientos de etanol fueron de 0.28-0.40 g de etanol/g de azúcares iniciales. La productividad máxima de etanol fue de 1.1 g/l/h a HRT de 8 horas y 30 g/1 de azúcares. Este estudio demostró que el cultivo celular inmovilizado activo de bacterias anaeróbicas termofílicas , fue posible. El reactor fue operado continuamente por 140 días sin contaminación y mostró buen funcionamiento a largo plazo.

EJEMPLO 7 Fermentación continua de la paja de trigo explotada por vapor utilizando BG1L1 Los hidrolizados de paja de trigo desfibrados por vapor (SEWS) fue preparado mediante explosión de vapor seguida por hidrólisis enzimática (utilizando Celluclast y Novozymel88 proporcionadas por Novozymes A/S) para liberar los azúcares constituyentes, glucosa y xilosa. SEWS fue proporcionado por ELSAM, DK. El hidrolizado tuvo contenido de materia seca de 23% (DM) , y la glucosa y la xilosa fueron de 57 g/1 y 30 g/1, respectivamente. Para contrarrestar la contaminación bacteriana, el medio hidrolizado de SEWS fue calentado hasta 121°C por 1 minuto. Dos suspensiones de SEWS fueron preparadas mediante la adición del volumen respectivo de agua dada las concentraciones descritas de 7.5% y 15% de DM correspondiente a las mezclas de glucosa-xilosa de 12 y 43 g/1, respectivamente (Figura 11) . A pesar de esto, el medio SEWS fue esterilizado y no destoxificado, la cepa BG1L1 fue capaz también de co- fermentar la glucosa y la xilosa eficientemente con rendimiento de etanol relativamente alto de 0.39-0.4 g/g (Figura 12) . La glucosa fue completamente utilizada (> 98%) para ambas suspensiones de SEWS probadas, mientras que en la conversión de xilosa la disminución de 99% a 80% a 15% (DM) SEWS, no obstante, de conversión de azúcar total fue mayor de 90%. El acetato fue el sub-producto principal y permaneció relativamente bajo durante la fragmentación completa (0.07-0.08 g /g) (Figura 12). En todas estas fermentaciones, únicamente fueron producidas cantidades menores de lactato, como se esperaba ya que la cepa es un mutante deficiente en lactato-deshidrogenasa . Durante ambos experimentos que duran por aproximadamente 140 días, el reactor fue verificado regularmente para la contaminación mediante purificación del ADN cromosómico a partir de muestras de reactor, y no se encontraron ningunas otras especies aparte de BG1L1. La supresión de lactato-deshidrogenasa fue también encontrada como estable, como es mostrado por el secuenciamiento de la región de la lactato-deshidrogenasa.

EJEMPLO 8 Fermentación continua de forraje de maíz pre-tratado con ácido utilizando BG1L1 El hidrolizado de forraje de maíz (PCS) , preparado por la hidrólisis del ácido sulfúrico diluido, fue proporcionada por National Rene able Energy Laboratory (Golden, CO, Estados Unidos) . El hidrolizado tuvo un contenido total de sólidos (TS) del 30% (tipo silvestre) , y las concentraciones de xilosa, de glucosa y ácido acético fueron de 67 g/1, 15 g/1 y 14 g/1, respectivamente. El hidrolizado de forraje de maíz en concentraciones de 2.5%-15% de TS fue utilizado. Debido a la baja concentración de azúcar total en las suspensiones de hidrolizado de 2.5% y 5% de TS, se agregó 5 g/1 de xilosa extra a estas suspensiones para prevenir los problemas eventuales del proceso provocados por el contenido de azúcar relativamente bajo. Con las concentraciones del hidrolizado de PCS de intervalos de 2.5-10% de TS, la producción de etanol se incrementó gradualmente relativamente alto y se obtuvieron rendimientos de etanol estables en un intervalo de 0.41-0.43 Sr/g (Figura 15) . Se logró la utilización de azúcar casi completa (más de 95%) para PCS de 2.5-7.5% de TS, mientras que a 10% (TS) , la conversión de azúcar disminuyó hasta aproximadamente 85% (Figura 16) . A una concentración de PCS de 15% de TS, la conversión de azúcar fue de 70% y se obtuvieron rendimientos de etanol relativamente altos cercanos a 0.35 g/g. La menor conversión de azúcar a 15% (TS) PCS (Figuras 13A-13B) en comparación a otras concentraciones de hidrolizado puede ser atribuida a la inhibición del crecimiento y del producto provocada por el efecto de combinación negativa de altas concentraciones de acetato otros inhibidores presentes en el hidrolizado y la acumulación resultante de la base agregada para controlar el pH (Lynd et al, 2001; Palmqvist and Hahn-Hágerdal 2000; Zalvidar et al. 2001). No obstante, el bajo rendimiento del etanol a PCS del 15% de TS (Figura 15) fue probablemente debido a la mayor evaporación del etanol que la esperaba, ya que la recuperación de carbono fue baja (CR < 0.9) . La producción de acetato se incrementó desde aproximadamente 1 a 3.5 g/1 (Figura 14) . No obstante, debido a las concentraciones iniciales altas de acetato (aproximadamente 1-7 g/1) en la corriente de alimentación, estuvo presente una concentración más bien alta. Casi de 10 g/1 de acetato en el efluente, lo cual es significativo con respecto al efecto inhibitorio del ácido acético hacia la fermentación. Estos resultados muestran claramente la alta tolerancia de los organismos hacia los inhibidores metabólicos presentes en el PCS no destoxificado .

EJEMPLO 9 BG1PF: un mutante productor de lactato de la cepa BG1 Una cepa derivada de BG1 fue elaborada mediante la integración de fragmento de ADN mostrada en la figura 20 dentro del cromosoma de BG1. El plásmido ppta32K purificado, que contiene el gen de resistencia a la kanamicina, termoestable , fue flanqueado por las regiones en dirección 5' y con dirección 3' provenientes de pfor, fue linearizado y sometido a electroporesis dentro BG1 , y los recombinantes positivos fueron seleccionados utilizando el gen termoestable de resistencia a la kanamicina. Varios clones independientes fueron aislados y purificados mediante PCR. Los productos de PCR provenientes de dos clones fueron subsecuentemente secuenciados y se encontró que contenían el cásete de resistencia a la kanamicina en ve,z de los genes pfor como se esperaba. Cinco clones independientes de BG1PF fueron desarrollados en lote por dos días en 5 g/1 de xilosa como fuente de carbono. Como se puede observar a partir de la figura 21, es observado un desplazamiento completo en el metabolismo, y la producción de lactato es ahora el producto principal de la fermentación.

EJEMPLO 10 BG1H1: un mutante BG1 con producción incrementada de hidrógeno construido mediante la sub-regulación de captación de hidrogenasa Las hidrogenasas pueden ser involucradas en la producción y en la captación de hidrógeno. En BG1 , fueron encontradas dos secuencias con hidrogenasas de similitud conocida. Una (hydA BG1) fue 80.4% idéntica al nivel de ADN al gen hydA de Ther oanaerobacter tengcongensis y 91.8% idéntica al nivel de aminoácidos a la proteína HydA correspondiente. La proteína HydA es una de las 4 sub-unidades de una hidrogenasa de Ta únicamente dependiente de NAD(H) citosólico. Tengcongensis (1015) . La actividad de hidrogenasa dependiente de NADH es inhibida por la alta presión parcial de hidrógeno, mientras que las actividades de aldehído-deshidrogenasa y alcohol -deshidrogenasa son más altas en T. tengcongensis desarrollada a elevada p(H2) . Similarmente, la producción de etanol es casi abolida en los cultivos de fermentador con baja p(H2) . La segunda secuencia de BG1 con similitud de las hidrogenasas fue encontrada como 73% idéntica al gen echE de Thermoanaerobacter tengcongensis y 76% idéntica a la sub-unidad de la proteína EchE de la hidrogenasa Ech de Thermoanaerobacter tengcongensis . La hidrogenasa Ech es una hidrogenasa dependiente de ferredoxina [NiFe] encontrada en la fracción membranal de los extractos de Thermoanaerobacter tengcongensis . Las hidrogenasas de Thermoanaerobacter tengcongensis son principalmente enzimas de desprendimiento de hidrógeno . En Thermoanaerobacter BG1, el producto principal es el etanol bajo p(H2) alta y baja. Es por lo tanto probable que ésta emplee una estrategia diferente para la producción de hidrógeno y etanol. El efecto de la subregulación de las dos hidrogenasas fue estudiada mediante la introducción de casetes para la subregulación de la expresión de echE y hydA dentro del cromosoma de BG1. La construcción básica de los casetes es mostrada en la figura 22. Cuando el cásete es introducido dentro de BG1, el gen de la lactato-deshidrogenasa es removido, y el promotor es activado. Esto da como resultado la expresión de un transcrito pequeño complementario al mARN que contiene hydA y echE, respectivamente. Esta expresión en la mayoría de los casos da como resultado menores niveles de mARN debido a la digestión del ARN de doble hebra. La expresión del ARN antisentido de hydA y la subregulación correspondiente de mARN de hydA fue validada por transferencias Northern (figura 23). El ARN total fue purificado a partir de BG1 , transferido a una membrana y sondeado con sondas complementarias al ARN antisentido de hydA y al mARN, respectivamente. El promotor utilizado para expresar el ARN antisentido ha mostrado que es reprimido por la glucosa e inducido en presencia de xilosa. De acuerdo con esto, el antisentido es únicamente observado durante el crecimiento sobre xilosa. La cepa BG1 de tipo silvestre y la cepa BG1L1, en la cual ha sido suprimido ldh, pero no está insertado antisentido, son también mostradas como controles. Como se esperaba, no es observado ningún ARN antisentido de hydA en estas cepas. El transcrito proveniente del operón de hydA se espera que sea alrededor de 500 bases de longitud. Cuando es utilizada una sonda dirigida contra el mARN que contiene hydA es observada una banda que migra aproximadamente 6000-7000 bases. Una a dos bandas más pequeñas y más intensas de aproximadamente 3000-4000 bases son también observadas, en particular cuando las células son desarrolladas con xilosa como la fuente de carbono. La banda más pequeña es probablemente una hibridación cruzada al rARN de 16S. El ARN correspondiente al ARN de 3-4000 bases varía en gran medida en intensidad. El nivel de esta especie es mucho más alto durante el crecimiento sobre xilosa en comparación a la glucosa y más alta en la cepa suprimida para la lactato-deshidrogenasa en comparación al tipo silvestre. Cuando se desarrolla sobre glucosa, los niveles de esta banda son iguales en BG1L1 y BG1H1, mientras que durante el crecimiento de xilosa éste es mucho más intenso en la cepa donde no se expresa el antisentido. Esto corresponde muy bien a la expresión del ARN antisentido en el panel superior. Como lo muestra la figura 24, el BG1H1 produce más acetato, más hidrógeno, y menos etanol que las cepas control. Esto indica que la hidrogenasa HydABCD de BG1 está involucrada en la captación de hidrógeno, en vez de la producción como fue mostrado para Ta. tengcongensis . Ya que es necesario NAD(P)H para la reducción de la acetilCoA a la acetaldehído y el acetaldehído al etanol, es probable que la hidrogenasa HydABCD esté involucrada en la reducción de esos co- factores utilizando hidrógeno. El acetato y el hidrógeno son productos valiosos y la cepa BG1H1 puede por lo tanto ser preferida si es un objetivo una producción mayor de hidrógeno y de acetato.

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Arch Microbiol 128, 343-348. 1981 Se hace constar que con relación a esta fecha mejor método conocido por la solicitante para llevar a práctica la citada invención, es el que resulta claro de presente descripción de la invención.

Claims (9)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una cepa de Thermoanaerobacter mathranii, caracterizada porque se selecciona de BG1 (DSMZ número de acceso 18280) y mutantes de la misma. 2. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es capaz de desarrollarse en un medio que comprende un material de biomasa lignocelulósica hidrolizada que tiene un contenido de materia seca de al menos de 10% p/p. 3. La cepa de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el contenido de materia seca es al menos de 15% p/p. 4. La cepa de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el contenido de materia seca es al menos 20% p/p. 5. La cepa de conformidad con la reivindicación

2, caracterizada porque el contenido de materia seca es al menos 25% p/p. 6. La cepa de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el material de biomasa lignocelulósica hidrolizada es seleccionado del grupo que consiste de desperdicios de jardín, madera desmenuzada, paja, heno, cascaras de fruta y cascarillas de semilla. 7. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es capaz de desarrollarse en o por arriba de 70° C. 8. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es capaz de desarrollarse sobre galactosa como la única fuente de carbono. 9. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es capaz de producir un producto de fermentación seleccionado del grupo que consiste de un ácido, un alcohol, una cetona e hidrógeno. 10. La cepa de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el alcohol se selecciona del grupo que consiste de etanol, butanol, propanol, metanol, propanodiol y butanodiol 11. La cepa de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el ácido se selecciona del grupo que consiste de ácido láctico, propionato, acetato, succinato, butirato y formiato. 12. La cepa de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la cetona es acetona. 13. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque uno o más genes han sido insertados, suprimidos o sustancialmente inactivados . 14. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un gen que codifica para la lactato-deshidrogenasa (LDH) (EC 1.1.1.27) ha sido subregulado o sustancialmente inactivado. 15. La cepa de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el gen que codifica para lactato-deshidrogenasa (LDH) (EC 1.1.1.27) ha sido inactivado por la supresión del gen. 16. La cepa de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el gen que codifica para lactato-deshidrogenasa (LDH) (EC 1.1.1.27) ha sido substancialmente inactivado por la mutación, supresión o inserción de uno o más aminoácidos en el gen. 17. La cepa de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque es BG1L1 (DSMZ número de acceso 18283) . 18. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un gen que codifica para la piruvato-ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1) ha sido subregulado o sustancialmente inactivado. 19. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un gen que codifica para la piruvato-ferredoxina oxidoreductasa (EC 1.2.7.1) ha sido sustancialmente inactivado mediante mutación, supresión o inserción de uno o más aminoácidos en el gen. 20. La cepa de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque es BG1PF1 (DSMZ número de acceso 18282) . 21. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un gen que codifica para una hidrogenasa o una sub-unidad hidrogenasa ha sido sub-regulado o sustancialmente inactivado. 22. La cepa de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el gen que codifica para la hidrogenasa o una sub-unidad hidrogenasa ha sido sustancialmente inactivado por la mutación, supresión o inserción de uno o más aminoácidos en el gen. 23. La cepa de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque un gen que codifica para la hidrogenasa o una sub-unidad hidrogenasa se selecciona del grupo que consiste de [Fe] -hidrogenasas y [NiFe] -hidrogenasas (EC 1.6.5.3, EC 1.12.7.2, 1.12.99.6) tales como NuoE, NuoF, NuoG, EchB, EchC, EchD, EchE, EchF. 24. La cepa de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque es BG1H1 (DSMZ número de acceso 18281) . 25. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un gen que codifica para una acetato-cinasa (EC 2.7.2.1) ha sido sustancialmente inactivado por la mutación, supresión o inserción de uno o más aminoácidos en el gen. 26. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un gen que codifica para una fosfato-acetiltransferasa (EC 2.3.1.8) ha sido sustancialraente inactivado por la mutación, supresión o inserción de uno o más aminoácidos en el gen. 27. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque uno o más genes han sido insertados. 28. La cepa de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque uno o más genes que codifican para una polisacarasa han sido insertados. 29. La cepa de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la polisacarasa que se selecciona de celulasas (EC 3.2.1.4); beta-glucanasas , incluyendo glucan-1,3 beta-glucosidasas (exo-1 , 3 -beta-glucanasas , (EC

3.2.1.58), 1, 4-beta-celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) y endo-1 , 3 (4 ) -beta-glucanasas (EC 3.2.1.6); xilanasas, incluyendo endo-1, 4 -beta-xilanasas (EC 3.2.1.8) y xilan 1,4-beta-xilosidasa (EC 3.2.1.37); pectinasas (EC 3.2.1.15); alfa-glucuronidasa, alfa-L-arabinof ranosidasa (EC 3.2.1.55), acetilesterasa (EC 3.1.1.-), acetilxilanesterasa (EC 3.1.1.72), alfa amilasa (EC 3.2.1.1), beta-amilasa (EC 3.2.1.2), glucoamilasa (EC 3.2.1.3), pululanasa (EC 3.2.1.41), beta-glucanasa (EC 3.2.1.73), hemicelulasa, arabinosidasa, mananasas incluyendo manan-endo- 1 , 4 -beta- manosidasa (EC 3.2.1.78) y manan-endo- 1 , 6 -alfa-manosidasa (EC 3.2.1.101), pectina-hidrolasa, poligalacturonasa (EC 3.2.1.15), exopoligalacturonasa (EC 3.2.1.67) y pectato-liasa (EC

4.2.2.10) . 30. La cepa de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque uno o más genes que codifican para una piruvato-descarboxilasa (EC 4.1.1.1) han sido insertados. 31. La cepa de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque uno o más genes que codifican para un alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1, EC 1.1.1.2, EC 1.1.1.71, EC 1.1.99.8) ha sido insertados. 32. La cepa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la expresión de uno o más genes que codifican para un alcohol deshidrogenasa ha sido incrementada. 33. Un método para producir un producto de fermentación, caracterizado porque comprende el cultivo de una cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32 bajo condiciones adecuadas. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque es un proceso de fermentación formado bajo condiciones anaeróbicas estrictas. 3

5. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque es operado a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 40-95°C, tal como en el intervalo de aproximadamente 50-90°C, incluyendo el intervalo de aproximadamente 60-85°C, tal como en el intervalo de aproximadamente 65-75 °C. 3

6. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el proceso de fermentación es un proceso de fermentación por lotes. 3

7. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el proceso de fermentación es un proceso de fermentación continua. 3

8. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el producto de fermentación se selecciona del grupo que consiste de un ácido, un alcohol, una cetona e hidrógeno. 3

9. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el alcohol es selecciona del grupo que consiste de etanol, butanol, propanol, metanol, propanodiol y butanodiol 40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el ácido se selecciona del grupo que consiste de ácido láctico, propionato, acetato, succinato, butirato y formiato. 41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la cetona es acetona.