MX2008012611A

MX2008012611A - Uso de derivados de colest-4-in-3-in-ona para obtener un farmaco citoprotector.

Info

Publication number: MX2008012611A
Application number: MX2008012611A
Authority: MX
Inventors: Thierry Bordet; Rebecca Pruss; Bruno Buisson
Original assignee: Trophos
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2007-03-28
Publication date: 2008-10-31
Also published as: CA2647501A1; AU2007239395B2; AU2007239395A1; IL194293A0; EP2001483B1; JP2014051525A; JP2009531397A; EP2001483A1; HK1129841A1; DE602007011739D1; CA2647501C; CN101443019B; BRPI0709925A2; RU2008143248A; US9320745B2; CN101443019A; ES2359173T3; RU2428189C2; FR2899108A1; DK2001483T3

Abstract

La presente invención se refiere al uso de derivados de colest-4-in-3-ona para obtener una medicina citoprotectora, excluyendo una medicina neuroprotectora.

Description

USO DE DERIVADOS DE COLEST-4-1N-3-IN-ONA PARA OBTENER UN FARMACO CITOPROTECTOR Descripción de la Invención La presente invención se refiere al uso de derivados de colest-4-en-3-ona para la obtención de un fármaco citoprotector con la excepción de un fármaco neuroprotector. Los procesos degenerativos celulares son caracterizados por la disfunción de células que frecuentemente causan actividades celulares y muerte celular indeseables. Las células han desarrollado mecanismos de adaptación en reacción a la tensión, que prolonga su periodo de vida o retrasa o previene la muerte celular (mecanismos citoprotectores). Sin embargo, estos mecanismos citoprotectores son ocasionalmente escasos, inadecuados o inducen demasiado tarde el beneficio y las células mueren. Por lo tanto se ha mostrado el interés por tener nuevos fármacos citoprotectores, que promuevan la citoprotección. Éste es uno de los objetos de la presente invención. El término "citoprotector" hace referencia a la capacidad de cualquier agente natural o artificial de proteger una célula contra la muerte celular, particularmente la muerte celular patológica, y/o contra las disfunciones celulares que llevan a la muerte celular. Estas disfunciones celulares por ejemplo pueden ser de origen mitocondrial tal como una reducción en la capacidad de generar ATP, una incapacidad de captura y/o retención de calcio, o generación de radicales libres. Entre los mecanismos principales de muerte celular, se hace una distinción esencial entre la necrosis, apoptosis, y necroptosis. La necrosis es la llamada muerte celular "accidental" que ocurre durante daño al tejido. La membrana plásmica de la célula es la que se afecta mayormente, causando una modificación de la homeostasis celular. Las células se sumergen en agua al grado que esto cause la lisis de su membrana plásmica. Esta tisis celular conduce a la liberación del contenido citoplásmico en el medio circundante. La necrosis se encuentra en el origen del proceso inflamatorio. La necrosis puede afectar un conjunto de células o un tejido mientras que otra porciones cercanas permanecen vivas. La transformación resultante es la muerte de las células o tejidos. Es decir la necrosis es definida por las modificaciones morfológicas que ocurren cuando una célula alcanza el final de su vida como resultado de acontecimientos tales como un trauma significativo tal como interrupción o reducción del suministro sanguíneo en un órgano, hipertermia (elevación significativa de la temperatura), intoxicación por un producto químico, coque físico, etc. Una de las necrosis conocidas es la del miocardio durante un infarto (interrupción del suministro de la corriente sanguínea en el músculo cardiaco) debido a la oclusión (obstrucción) de una arteria coronaria. La apoptosis es una parte integral de la fisiología normal de un organismo. Es una forma fisiológica altamente regulada de muerte celular y se requiere para la supervivencia de organismos multicelulares. La apoptosis es un proceso que desempeña una función primordial durante la embriogénesis. Las células en la apoptosis o células apoptóticas se aislarán de las otras células. La apoptosis comúnmente implica las células individuales en un tejido y no causa inflamación. Uno de los puntos morfológicos característicos de la apoptosis es la condensación significativa del núcleo y del citoplasma lo cual induce la reducción significativa del volumen celular. Primero el núcleo y después los fragmentos, cada fragmento es rodeado por una cubierta dual. Los cuerpos de apoptóticos (elementos citoplásmicos y nucleares) entonces son liberados y serán absorbidos a través de la fagocitosis por las células vecinas. La apoptosis se puede inducir de maneras diferentes. Por ejemplo, la radiación, presencia de un producto químico u hormona, son los estímulos que pueden inducir una cascada de acontecimientos apoptóticos en la célula. Las señales intracelulares tales como mitosis incompleta o daño al ADN, también pueden inducir la apoptosis. La apoptosis también ocurre después de la acción de un agente genotóxico o durante una enfermedad. Ciertas patologías son caracterizadas por la apoptosis anormal, causando la pérdida de ciertas poblaciones celulares, como por ejemplo hepatotoxicidad, retinopatías, cardiotoxicidad. Por lo tanto se hace una distinción entre la apoptosis fisiológica y la apoptosis patológica. La invención esencialmente se centra en la apoptosis patológica. Existen otros mecanismos de muerte celular, como por ejemplo la necroptosis, que tiene características de necrosis y apoptosis. Una célula que está muriendo por necroptosis tiene características similares a las de una célula que muere por necrosis, pero las etapas bioquímicas de este mecanismo soh más similares a las del apoptosis. Este mecanismo de muerte celular por ejemplo ocurre en la isquemia. Por consiguiente, uno de los objetos de la presente invención también es fabricar nuevos y disponibles fármacos con los cuales será posible prevenir y/o tratar la necrosis y/o apoptosis y/o necroptosis patológicas (fármacos anti-necróticos y/o anti-apoptóticos y/o anti-necroptóticos). Los procesos degenerativos celulares pueden resultar entre otras cosas de las situaciones patológicas agrupadas bajo el término de enfermedades o afecciones, traumas degenerativos o de la exposición a varios factores. Estos traumas y factores pueden por ejemplo incluir la exposición a radiaciones (radiaciones UV, gamma), hipoxia o carencia de oxígeno, carencia de nutrientes, carencia de factores de crecimiento, venenos, toxinas celulares, desperdicios, toxinas ambientales, radicales libres, oxigenos reactivos o incluso ciertos acontecimientos y/o procedimientos médicos como por ejemplo traumas quirúrgicos incluyendo trasplantes de células, tejidos y órganos. Los agentes químicos o biológicos también se pueden mencionar, utilizados como agentes terapéuticos dentro del contexto de los tratamientos médicos como por ejemplo agentes citoestáticos o agentes antiinflamatorios. El objeto de la invención no es tratar las causas extracelulares de las patologías o procesos degenerativos que pueden dar lugar a la muerte celular, sino realmente las consecuencias a nivel celular de los procesos patológicos o de las patologías y particularmente proteger la célula contra tales consecuencias. Entre las situaciones patológicas más significativas caracterizadas por un proceso degenerativo, distintas de los trastornos neurológicos o neurodegenerativos a los que la presente invención no se dirige, se encuentran los siguientes: enfermedades de los huesos, articulaciones, tejido conectivo y cartílago, tal como osteoporosis, osteomielitis, artritis incluyendo por ejemplo osteoartritis, artritis reumatoide y artritis psoriásica, necrosis avascular, fibrodisplasia osificante progresiva, raquitismo, síndrome de Cushing; enfermedades musculares tales como distrofia muscular, como por ejemplo distrofia muscular de Duchenne, distrofias miotónicas, miopatías y miastenias; enfermedades de la piel, tales como dermatitis, eczema, psoriasis, envejecimiento o incluso alteraciones de cicatrización; enfermedades cardiovasculares tales como isquemia cardiaca y/o vascular, infarto al miocardio, cardiopatía isquémica, falla cardíaca congestiva crónica o aguda, arritmia cardiaca, fibrilación atrial, fibrilación ventricular, taquicardia paroxítica, falla cardíaca congestiva, cardiopatía hipertrófica, anoxia, hipoxia, efectos secundarios debido a las terapias con agentes anticáncer; enfermedades circulatorias tales como ateroesclerosis, esclerosis arteriales y enfermedades vasculares periféricas, ataques cerebrovasculares, aneurismas; enfermedades hematológicas y vasculares tal como: anemia, amiloidosis vascular, hemorragias, drepanocitosis, síndrome de fragmentación de glóbulos rojos, neutropenia, leucopenia, aplasia medular, pantocitopenia, trombocitopenia, hemofilia; enfermedades pulmonares incluyendo neumonía, asma; enfermedades pulmonares crónicas obstructoras tal como por ejemplo bronquitis crónica y enfisema; enfermedades del tracto gastrointestinal, tales como úlceras; enfermedades hepáticas tal como por ejemplo hepatitis particularmente hepatitis de origen viral o que tienen como agente causante otros agentes infecciosos, hepatitis alcohólica, hepatitis autoinmune, hepatitis fulminante, ciertos trastornos metabólicos hereditarios, enfermedad de Wilson, cirrosis, enfermedad de hígado alcohólico (ALD, por sus siglas en inglés), enfermedades hepáticas debido a toxinas y fármacos; esteatosis tal como por ejemplo: esteatohepatitis sin alcohol (NASH, por sus siglas en inglés), o intoxicación exógena acompañada con alcohol, fármacos, hepatitis viral o tóxica, complicaciones de procedimientos quirúrgicos, enfermedades metabólicas (tales como diabetes, síndrome de intolerancia a la glucosa, obesidad, hiperlipidemias, disfunciones del eje hípotalamo-hipofisiario, abetalipoproteinemia, galactosemias, enfermedades glucogénicas, enfermedad de Wilson, enfermedad de Weber-Christian, síndrome de Refsum, deficiencia de carnitina, complicaciones hepáticas de enfermedades inflamatorias del tracto digestivo, hepatitis autoinmune. Por medio de la acción sobre la esteatosis o acción sobre la apoptosis hepática sin importar la causa, los compuestos pueden tener una acción preventiva sobre el desarrollo de la fibrosis hepática y prevenir la incidencia de la cirrosis. enfermedades pancreáticas tal como por ejemplo pancreatitis aguda o crónica; enfermedades metabólicas tales como diabetes mellitus y diabetes insípida, tiroiditis; enfermedades de los ríñones, tal como por ejemplo trastornos renales agudos o glomerulonefritis; intoxicaciones graves por químicos, toxinas o fármacos; enfermedades degenerativas asociadas al síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA); trastornos asociados al envejecimiento tal como el síndrome de envejecimiento acelerado; trastornos dentales tales como los que resultan de la degradación de tejidos tal como por ejemplo periodontitis; enfermedades o trastornos oftálmicos incluyendo retinopatías diabéticas, glaucoma, ptosis, atrofia óptica, ofthalmoplegia externa progresiva crónica, degeneraciones maculares, degeneración retiniana, retinitis pigmentosa, orificios o rasgamiento retiñíanos, separación retiniana, isquemia retiniana, retinopatías agudas asociadas al trauma, degeneraciones inflamatorias, complicaciones post-quirúrgicas, retinopatías medicinales, catarata; trastornos del tracto auditivo, tales como otosclerosis y sordera inducida por antibióticos; enfermedades asociadas a la mitocondria (patologías mitocondriales), por ejemplo ataxia de Fríedrich, distrofia muscular congénita con anormalidad mitocondrial estructural, ciertas miopatías (síndrome de MELAS, síndrome de MERFF, síndrome de Pearson), síndrome de MIDD (diabetes y sordera mitocondriales), síndrome de Wolfram, distonía.

La invención también se interesa en proteger a las células, tejidos y/o órganos trasplantados, antes, durante (remoción, trasplante y/o reimplantación) o después de un trasplante. Los compuestos farmacológicamente activos aún se buscan para controlar los procesos degenerativos mencionados anteriormente. La presente invención cumple esta demanda de compuestos citoprotectores. De hecho, el Solicitante ha descubierto que los derivados de colest-4-en-3-one, y notablemente la oxima de colest-4-en-3-one, son proporcionados con características citoprotectoras notables. Esta es la razón por la cual el objeto de la presente invención es el uso de por lo menos un compuesto que adapte la fórmula I en donde X representa el grupo =N-OH, y R representa grupo seleccionado de A representa un átomo de hidrógeno o junto con B un enlace carbono-carbono, B representa un átomo de hidrógeno, grupo hidroxi, o junto con A un enlace carbono-carbono, C representa un átomo de hidrógeno o junto con D un enlace carbono-carbono, D representa un átomo de hidrógeno o junto con C un enlace carbono-carbono, E representa un átomo de hidrógeno o junto con F un enlace carbono-carbono, F representa un átomo de hidrógeno o junto con E un enlace carbono-carbono, o una de sus sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables, o uno de sus ésteres o una de sus sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables de los ésteres, para preparar un fármaco citoprotector, distinto de un fármaco neuroprotector. Se conocen los compuestos de fórmula I según lo definido arriba (W02004/082581 ). Las sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables pueden por ejemplo ser sales formadas con ácidos hidroclóricos, bromhídricos, nítricos, sulfúricos, fosfóricos, acéticos, fórmicos, propiónicos, benzoicos, maleicos, fumáricos, succínicos, tartáricos, cítricos, oxálicos, glioxílicos, aspárticos, alcano-sulfónicos tales como ácidos metan- o etan-sulfónicos, ácidos aril-sulfónicos, tales como ácidos bencen- o paratoluen-sulfónicos o ácidos carboxílicos. De acuerdo a la invención el grupo oxima representa syn y anti-isómeros puros o mezclados, asociados a la orientación del enlace N-O, relativamente al enlace doble C = N. Entre los compuestos descritos arriba, los compuestos anteriores se conservan particularmente, para que: A represente junto con B un enlace carbono-carbono, C, D, representa un átomo de hidrógeno, E, F represente un átomo de hidrógeno o juntos un enlace carbono-carbono y un R tenga el significado R1, A represente junto con B un enlace carbono-carbono, C, D, represente un átomo de hidrógeno, E, F, represente un átomo de hidrógeno y R tenga el significado R2 ó R3 ó R4, A represente junto con B un enlace doble, C represente junto con D un enlace carbono-carbono, E, F, represente un átomo de hidrógeno, y R tenga el el significado R1 ó R6, A represente junto con B un enlace doble, C represente junto con D un enlace carbono-carbono, E represente junto con F, un enlace carbono-carbono, y R tenga el significado R1, E represente junto con F un enlace doble, C, D, A, B represente un átomo de hidrógeno y R tenga el significado R1, así como sus sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables. Ventajosamente, de acuerdo a la invención, por lo menos un compuesto de fórmula I se utiliza, seleccionado de oxima de colestan-3-ona, oxima de colest-4-en-3-ona, oxima de colest-1 ,4-dien-3-ona o una de sus sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables o uno de sus ésteres o una de sus sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables de tales ésteres. Preferiblemente, se utiliza la oxima de colest-4-en-3-ona o oxima colest-1, 4-dien-3-ona o una de sus sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables, o uno de sus ésteres o una de sus sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables de los tales ésteres. Las características citoprotectoras interesantes de los compuestos de fórmula I justifican su uso para preparar una fármaco citoprotector, previsto particularmente para tratar o prevenir la necrosis, y/o apoptosis patológicas, y/o necroptosis (fármacos anti-necróticos y/o anti-apoptóticos y/o anti-necroptóticos) o adicionalmente enfermedades tal como enfermedades de los huesos, articulaciones, tejido conectivo y cartílago, enfermedades musculares, enfermedades de la piel, enfermedades cardiovasculares, enfermedades circulatorias, enfermedades hematológicas y vasculares, enfermedades pulmonares, enfermedades del tracto gastrointestinal, enfermedades hepáticas, enfermedades pancreáticas, enfermedades metabólicas, enfermedades de los ríñones, intoxicaciones graves, enfermedades degenerativas asociadas al síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), trastornos asociados al envejecimiento, trastornos dentales, enfermedades o trastornos oftálmicos, enfermedades de las zonas de la audición, enfermedades asociadas a las mitocondrias (patologías mitocondríales). Ventajosamente, los compuestos de fórmula I se pueden utilizar en la preparación de un fármaco previsto para proteger las células cardiacas (fármaco cardioprotector), proteger las células hepáticas (fármaco hepatoprotector) o un fármaco prevista para tratar o prevenir las enfermedades asociadas a las mitocondrias. De acuerdo a la invención, el compuesto de fórmula I está ventajosamente presente en el fármaco citoprotector a dosis fisiológicamente efectivas; tales fármacos contienen notablemente una dosis citoprotectora eficaz de por lo menos uno de los compuestos de fórmula I. Al igual que los fármacos, los compuestos que adaptan la fórmula I, sus ésteres, sus sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables así como las sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables de tales ésteres pueden, formularse para la ruta digestiva o parenteral. Los fármacos de acuerdo a la invención pueden comprender adicionalmente por lo menos otro ingrediente terapéuticamente activo, si está activo en la misma patología, o en una diferente patología, para el uso simultáneo, separado o uso distribuido en tiempo, notablemente al tratar un sujeto afectado por una de las patologías mencionadas anteriormente. De acuerdo a la invención, el compuesto de fórmula I puede utilizarse en el fármaco, mezclado con uno o más inertes, es decir excipientes o portadores farmacéuticamente inactivos y no tóxicos. Se puede hacer mención de por ejemplo soluciones salines, fisiológicas, isotónicas, amortiguadas, etc., compatibles con el uso farmacéutico y conocidas por el experto. Las composiciones pueden contener uno o más agentes o portadores seleccionados de dispersores, solubilizantes, estabilizadores, conservadores, etc. Los agentes o portadores que se pueden utilizar en las formulaciones (formulaciones líquidas e inyectables, y/o sólidas) son notablemente metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, carboximetilcelulosa, ciclodextrinas, polisorbato 80, manitol, gelatina, lactosa, aceites vegetales o animales, acacia, etc. Preferiblemente se usan los aceites vegetales. Las composiciones se pueden formular como una suspensión inyectable, geles, aceites, tabletas, supositorios, polvos, cápsulas de gelatina, cápsulas, etc., posiblemente por medio de formas o dispositivos galénicos que proporcionen la liberación prolongada y/o retrasada. Para este tipo de formulación, un agente tal como celulosa, carbonatos o almidones, se utiliza ventajosamente. La administración se puede realizar por cualquier método conocido por el experto, preferiblemente de manera oral o por inyección, comúnmente vía una ruta intraperitoneal , intracerebral, intratecal, intravenosa, intrarterial o intramuscular. Se prefiere la administración oral. Si este es un tratamiento de largo plazo, la ruta preferida de administración será sublingual, oral o transcutánea. Para las inyecciones, los compuestos se empaquetan generalmente como por ejemplo suspensiones líquidas, que se pueden inyectar por medio de jeringuillas o perfusiones. Se entiende que el caudal y/o dosis inyectada o generalmente la dosis que se administrará, se pueden adaptar por el experto dependiendo del paciente, patología, método de administración, etc. Se entiende que las administraciones repetidas pueden ser realizadas, posiblemente en combinación con otros ingredientes activos o cualquier portador farmacéuticamente aceptable (amortiguadores, solución salina, solución isotónica, en presencia de estabilizadores, etc.). La invención se puede utilizar en mamíferos, notablemente en humanos. Generalmente, la dosis diaria del compuesto será la dosis mínima para obtener el efecto terapéutico deseado. Las dosificaciones de los compuestos descritos arriba y por ejemplo, de oxima de colest-4-en-3-ona serán generalmente comprendidas entre 0.001 a 100 mg por kilogramo diario para los humanos. Si se requiere, la dosis diaria se puede administrar en dos, tres, cuatro, cinco, seis o más veces por día o con dosis secundarias múltiples administradas a intervalos convenientes durante el día. La cantidad seleccionada dependerá de factores múltiples, particularmente de la ruta de administración, duración de la administración, momento de administración, índice de eliminación del compuesto, diferentes productos usados en combinación con el compuesto, edad, peso y condición física del paciente, así como su historial médico y cualquier otra información conocida en la medicina. La prescripción del médico tratante puede comenzar con dosificaciones menores a las usadas generalmente, y estas dosificaciones entonces aumentaran gradualmente para mejorar el control de la incidencia de los efectos secundarios posibles. Ejemplo 1: Efecto anti-apoptóticos de la oxima de colest-4-en-3-ona Las propiedades anti-apoptóticas de la oxima de colest-4-en-3-ona fueron analizadas en cardiomiocitos, por una prueba de disfunción contráctil inducida por doxorubicina. Se utilizó una solución original de oxima de colest-4-en-3-ona a una concentración de 10mM en 100% DMSO. La concentración final en DMSO fue igual para todos los puntos experimentales, independientemente de las concentraciones moleculares usadas. La oxima de colest-4-en-3-ona fue probada a concentraciones de 0.3 , 1 y 3 µ?, diluida en una solución de Tyrode (composición en mmol/l: 135 NaCI, 5.4 KCL, 0.33 NaH2P04) 1.2 CaCI2, 1.0 MgCI2, 10 HEPES; pH ajustado a 7.4 con NaOH). Métodos Contractilidad y apoptosis de los cardiomiocitos ventriculares de conejo A.1 Obtención de células aisladas de los cardiomiocitos ventriculares de conejo Las células ventriculares aisladas se obtienen de corazones del conejo macho de New Zealand según lo descrito en d'Anglemont de Tassigny y col., Fund. Clin. Pharmacol., 18: pp. 531-38, 2004. Brevemente, los conejos (2.0-2.5 kg) anestesiados con una solución de pentobarbital (50 mg/kg) y entonces recibieron la heparina (200IU/kg). Los corazones se extraen y se inundan inmediatamente, durante 10-15 minutos por medio de un aparato de Langendorff sin recirculación con una solución de Tyrode (libre de calcio) isotónica oxigenada (95%, 2-5% C02) (en mM: 135 NaCI, 5.4 KCI, 0.33 Na2P04, 1.0 MgCb, 10 HEPES, pH ajustado a 7.4 con 1 N NaOH a 37°C, 280-300 mOsmol/kgH20). Después, todos los corazones fueron inundados durante 3 minutos en un modo de "recirculación" con la misma solución Tyrode libre de calcio (caudal flujo, 10-15 ml/min) agregada con 1 mg/ml de colagenasa tipo II y 0.28 mg/ml de proteasa tipo XIV. Finalmente todos los corazones se inundaron en un modo sin recirculación con la misma solución Tyrode complementada con 0.3 mM CaCI2 durante 10 min. El ventrículo izquierdo se removió y cortó en pequeñas piezas; la disociación celular se logró por agitación mecánica suave. El calcio extracelular se agregó por incrementos cada 15 minutos, para lograr una concentración fisiológica de 1.0 mM. Los miocitos aislados se mantienen en un medio sin el suero que contiene (en mM) 110 NaCI, 5.4 KCI, 0.33 Na2P04, 25 NaHC03, 5 glucosa, 0.8 MgCb, 1 CaCI2, pH ajustado a 7.4, hasta 1 h 30 min antes de la experimentación. Todas las células son de tipo barra, tienen una estriación cruzada pálida y no tienen ninguna vesícula en su superficie bajo de un microscopio óptico. A.2 Marcado con anexina V Se usó el marcado de fosfatidilserina con anexina V como método cuantitativo para medir la apoptosis usando el kit de aislamiento celular MiniMacs (Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Alemania). Brevemente, las células que exhiben fosfatidilserina se marcan de manera magnética con micro-gránulos de anexina V, y entonces se hacen pasar a una columna colocada en un campo magnético. Las células marcadas (que se han marcado de manera magnética con fosfatidilserina) se conservan en la columna mientras que las no marcadas (células necróticas y células no apoptóticas) no se conservan. La columna se elimina del campo magnético; las células conservadas magnéticamente que exhiben fosfatidilserina se eluyen como una fracción positiva y se cuentan con un contador celular de Mallassez. El porcentaje de células apoptóticas entonces es referido como el número de células inicial. A.3 Medición de la actividad caspasa-3 La actividad de caspasa-3 se utiliza como método cuantitativo para medir la apoptosis. Brevemente, las células sometidas a lisis y el sobrenadante se utiliza para la medición de la actividad de caspasa-3 usando el kit AK-005 (Biomol Reseach Laboratories, Plymouth, PA, USA). El sustrato fluorogénico para medir la actividad de caspasa-3 (DEVD) se marca con fluorocromo, cumarina de 7-am¡no-4-metil (AMC) que produce la fluorescencia de color, verde-amarillo detectable en luz ' UV en 360/460 nm durante 210 min. AMC es liberada del sustrato por la división mediante caspasa-3, la expresión de la enzima se expresa en fmol/min. A.4 Medición de la contractilidad Los miocitos se transfieren a una cámara a 37°C, inundado continuamente y colocándose en la etapa de un microscopio invertido. La cámara se inunda con un amortiguador fisiológico que contiene (en mM): 140NaCI; 5.4 KCI; 1 CaCb; 0.8 MgCI2; 10 HEPES y 5.6 glucosa (pH = 7.4; 290 mOsmol/kgH20). La contracción de los miocitos se induce una vez un segundo (1 Hz) con electrodos del campo de platino colocados en la cámara y conectados a un simulador. Las imágenes se capturan continuamente con un objetivo x 20 y se transmiten a una cámara de CCD a una velocidad de 240 muestras/s. Las imágenes de la cámara de CCD se proyectan en una pantalla de video. Los miocitos fueron seleccionados para el estudio de acuerdo a lo siguiente criterio: un aspecto tipo barra con estriaciones muy evidentes y ningún vacuola intracelular, ninguna contracción espontánea cuando se estimulan con 1 mM Ca2+, y con longitud restante y amplitud de contracción constantes. La longitud de los sarcómeros fue medida por un programa de análisis de imagen de vídeo y los datos fueron capturados a una velocidad de 240 muestras/s. Las imágenes de la cámara son convertidas en medidas de longitud de sarcómero. El porcentaje de contracción se calcula a partir de estos datos con respecto a la longitud del sarcoma. A.5 Análisis de datos Todos los datos se expresan como la desviación estándar promedio ±. Las comparaciones de los datos entre los diferentes grupos fueron realizadas por ANOVA seguido por una prueba Student con un conjunto de diferencia significativa a p < 0.05. ¦ Procedimiento experimental La apoptosis es inducida en los cardiomiocitos aislados exponiéndolos durante 3 a 8 hrs a 1 µ? de doxorubicina agregada en una solución isotónica que contiene (en mM) 110 NaCI, 5.4 KCI, 0.33 Na2P04, 25 NaHC03> 5 glucosa, 0.8 MgCb, 1 CaCb, pH ajustado a 7.4. El marcado con Anexina V fue realizado 3 horas después del principio de la exposición a doxorubicina puesto que este fenómeno aparece muy pronto en la cascada apoptótica. Las mediciones de la actividad de caspasa-3 fueron conducidas 8 horas después de la exposición a doxorubicina puesto que este fenómeno ocurre más adelante en el fenómeno de la apoptosis. La contractilidad de los cardiomiocitas fue medida cada hora durante las 8 horas de la exposición a doxorubicina. Después de todos los tratamientos, las células fueron comparadas con los cardiomiocitos de control no expuestos a la doxorubicina.

Los cardiomiocitos fueron pre-tratados con el compuesto de oxima de colest-4-en-3-ona durante 15 minutos antes de la exposición a doxorubicina. Tres concentraciones de este compuesto fueron probadas durante este estudio: 0.3 µ?, 1 µ? y µ? 3. ¦ Resultados La longitud promedio de los sarcómeros de las células usadas en este estudio no fue significativamente diferente entre los grupos. ? Efecto de doxorubicina sobre la contractilidad de los miocitos y en la apoptosis La exposición a la doxorubicina dio lugar a una reducción durante el transcurso del tiempo del acortamiento de sarcómero. El acortamiento del pico de doxorubicina fue similar al del control durante las primeras tres horas y entonces se redujo significativamente después de 4 horas de exposición (-53.20 ± 7.70% contra -19.49 ± 2.06% relativamente a la línea base de doxorubicina y del control, p<0.05, n = 5, respectivamente). El tratamiento con 1 µ? de doxorubicina indujo la apoptosis con un aumento significativo del marcado con anexina V y de la actividad de caspasa-3. ? Efecto de la oxima de colest-4-en-3-ona sobre la disfunción al nivel de contractilidad inducido por la doxorubicina y la apoptosis. El tratamiento con 1 µ? de doxorubicina dio lugar a una reducción significativa del acortamiento del pico de los cardiomiocitos ventriculares, que se suprime en presencia de la oxima de colest-4-en-3-ona (0.3, 1 y 3 µ?). De heco, después de 4 horas de exposición, el acortamiento del pico bajo doxorubicina (-53.20 ± 7.70%) permaneció significativamente reducido con el compuesto a 0.3 µ? (-25.35 ± 0.18%), en 1 µ? (-15.66 ± 5.72%) y a 3 µ? (-13.95 ± 3.17%) relativamente en la línea base. Además, el marcado con anexina V y los aumentos de la actividad de caspasa-3 debido a la doxorubicina fue bloqueado por la oxima de colest-4-en-3-ona a 0.3, 1 y 3 µ?. La apoptosis fue evaluada como el cambio en el % de marcado con anexina V, 3 horas después de que la doxorubicina proporcionó los siguientes resultados: control: 100%; doxorubicina: 291% ± 32; doxorubicina + 0.3 µ? oximas de colest-4-en-3-ona: 130% ± 12.43; doxorubicina + 1 µ? oxima colest-4-en-3-ona: 121% ± 4.74; doxorubicina + 3 µ? colest-4-en-3-ona: 115.5% ± 16.35. Los resultados referentes a las mediciones de la actividad de caspasa-3 son los siguientes: control: 18 ± 9 fmol/min.; doxorubicina: 120 ± 15 fmol/min; doxorubicina + 0.3 µ oximas de colest-4-en-3-ona: 33 ± 9 fmol/min.; doxorubicina + 1 µ? oxima colest-4-en-3-ona: 18 ± 8 fmol/min.; doxorubicina + 3 µ? oxima de colest-4-en-3-ona: 11 ± 4 fmol/min. ¦ Comentarios y conclusiones El compuesto de oxima de colest-4-en-3-ona muestra un efecto cardioprotector sobre la disfunción de la contractilidad inducida por la doxorubicina y sobre la apoptosis en los cardiomiocitos aislados de conejo. La molécula, cuando se utiliza en las dosis apropiadas puede proteger realmente contra la cardiotoxicidad inducida por la doxorubicina que se conoce como el factor de limitación en el tratamiento de paciente con cáncer con esta antraciclina. Por lo tanto, el compuesto de oxima de colest-4-en-3-ona se puede utilizar para limitar la cardiotoxicidad de doxirubicina en estos pacientes. Ejemplo 2: Efecto de la oxima de colest-4-en-3-ona en un modelo in vivo de hepatotoxicidad aguda. Los hepatocitos al igual que muchas otras células contienen el receptor Fas/CD95 en su membrana citoplásmica. El estímulo de la ruta Fas induce la muerte celular activando una cascada de caspasas. Un modelo de daño hepático agudo se puede inducir por una sola inyección del anticuerpo anti-Fas Jo2 (Ogasawara y col., Nature, agosto 1993), produciendo daños hepáticos graves y asemejándose a la hepatitis viral, autoinmune o inducida por fármaco. La aminotransferasa de alanina (ALAT) también llamada transaminasa pirúvica glutámica de suero (SGPT) es una enzima presente en los hepatocitos. Su actividad aumenta significativamente en el plasma después de la lisis hepática y por lo tanto es un buen marcador para evaluar el daño hepático.

La experimentación conducida consistió de la intoxicación de animales con Jo2 seguido por un análisis de ALATs y la prueba de la capacidad de la oxima de colest-4-en-3-ona de proteger a los hepatocitos. Materiales y métodos Animales Se utilizaron ratones macho adultos CD1 del criador "Elevage Janvier", (Le Genest-Saint-lsle, Francia). Los animales fueron identificados individualmente y tuvieron acceso libre a agua y alimento. Las instalaciones se mantuvieron en un ciclo de luz controlado (7:00 am-7:00 pm), y a temperaturas de 20 ± 2°C con humedad de 50 ± 20%. Preparación del anticuerpo Jo2 La solución original del anticuerpo (Fas) monoclonal antiratón CD95 de hámster llamado J02, de Pharmingen (BD Bioscieces, referencia 554254 lote 66081) es a una concentración de 1 mg/ml en agua. Las diluciones usadas se producen en 0.9% cloruro de sodio en agua.

Preparación del compuesto que se probará La cantidad deseada de oxima de colest-4-en-3-ona se pesa y muele en un polvo fino, y entonces se suspende (60 mg/ml) en aceite de maíz. Los compuestos administrados oralmente (por alimentación forzada) a una concentración de 5 ml/kg.

Procedimiento Un tratamiento previo con la oxima de colest-4-en-3-ona se realiza a una dosis de 300 mg/kg por administración oral 4 horas antes de administrar el anticuerpo Jo2. El anticuerpo Jo2 es administrado por inyección intraperitoneal a una dosis de 125 pg/kg a un volumen de 5 ml/kg de peso corporal. Un control es obtenido con los animales que recibieron un tratamiento previo por administración oral 4 horas antes de administrar el anticuerpo con un volumen idéntico de aceite de maíz que es utilizado para preparar el compuesto que se probará, sin el compuesto. Análisis de ALATs La sangre de los ratones anestesiados se muestrea 24 horas después de administrar Jo2. El análisis de ALATs es realizado usando un kit (Roche Diagnostics) con un espectrofotómetro (Hitachi Modular), de acuerdo al método estandardizado por IFCC (International Federation of Chemical Chemestry).

Resultados y conclusiones La administración intraperitoneal de Jo2 a 125 pg/kg indujo la muerte de 3 ratones entre los 19 en el grupo de control en un periodo de 24 horas después de la inyección. La actividad de ALAT se redujo significativamente por el compuesto probado a 300 mg/kg.

Tabla 1: Actividad de ALAT medida 24 horas después de la administración de Jo2 **: p = 0.0037, prueba t realizada relativamente al grupo de control Fue posible con la oxima de colest-4-en-3-ona administrada a 300 mg/kg, 4 hrs antes del anticuerpo Jo2: prevenir la muerte de los ratones que recibieron el anticuerpo Jo2 en un periodo de 24 horas después de la inyección; limitar la muerte celular inducida por una dosis sub-letal del anticuerpo; la actividad de ALAT, biomarcador de citólisis hepática en plasma, es significativamente más baja en los ratones tratados con la oxima de colest-4-en-3-ona que en los ratones de control no tratados. Conclusiones Con el modelo de hepatotoxicidad aguda inducida en los ratones por un anticuerpo anti-Fas (Jo2), se pueden demostrar las características hepatoprotectoras de la oxima de colest-4-en-3- ona. Con estos efectos notables, los compuestos de fórmula I pueden contemplarse para el uso en la preparación de un fármaco generalmente citoprotector. Estudio toxicológico La administración en los ratones, particularmente de la oxima de colest-4-en-3-ona, vía oral, rutas subcutáneas, intraperitoneales e intravenosas, a dosis que oscilaron hasta 300 mg/kg/día, por medio de un tratamiento con la administración diaria, que puede oscilar hasta 28 días, no mostró ninguna toxicidad significativa. En monos, la administración oral aumentando las dosis diarias hasta 1.500 mg/kg durante 10 días no reveló ninguna toxicidad.

Claims

REIVINDICACIONES en donde X representa un grupo =N-OH, y R representa grupo seleccionado de
A representa un átomo de hidrógeno o junto con B un enlace carbono-carbono, B representa un átomo de hidrógeno, grupo hidroxi, o junto con A un enlace carbono-carbono, C representa un átomo de hidrógeno o junto con D un enlace carbono-carbono, D representa un átomo de hidrógeno o junto con C un enlace carbono-carbono, E representa un átomo de hidrógeno o junto con F un enlace carbono-carbono, F representa un átomo de hidrógeno o junto con E un enlace carbono-carbono, o una de sus sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables, o uno de sus ésteres o una de sus sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables de los ésteres, para obtener un fármaco citoprotector, distinto de un fármaco neuroprotector. 2. El uso de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizpo porque en la fórmula I, A representa junto con B, un enlace carbono-carbono, C, D, representa un átomo de hidrógeno, E, F representa un átomo de hidrógeno o juntos un enlace carbono- carbono y R tiene el significado de R1.
3. El uso de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque en la fórmula I, A representa junto con B, un enlace carbono-carbono, C, D, representa un átomo de hidrógeno, E, F representa un átomo de hidrógeno y R tiene el significado de R2 o R3 ó R4.
4. El uso de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque en la fórmula I, A representa junto con B, un enlace doble, C representa junto con D, un enlace carbono-carbono, E, F representa un átomo de hidrógeno y R tiene el significado de R1 ó R6.
5. El uso de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque en la fórmula I, A representa junto con B, un enlace doble, C representa junto con C, un enlace carbono-carbono, E representa junto con F, un enlace carbono-carbono y R tiene el significado de R1.
6. El uso de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque en la fórmula I, E representa junto con F, un enlace doble, C, D, A, B representa un átomo de hidrógeno y R tiene el significado de R1.
7. El uso de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de fórmula I se selecciona de oxima de colestan-3-ona, oxima de colest-4-en-3-ona, colest-1, oxima 4-dien-3-ona, una de sus sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables, o uno de sus ésteres o una de las sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables de tales ésteres.
8. El uso de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de fórmula I se selecciona de oxima de colest-4-en-3-ona o oxima de colest-1 ,4-dien-3-ona o una de sus sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables, o uno de sus ésteres o una de las sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables de tales ésteres.
9. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el fármaco se piensa para tratar o prevenir la necrosis y/o apoptosis y/o necroptosis patológicas (fármacos anti-necróticos y/o anti-apoptóticos y/o anti-necroptóticos) u otras enfermedades tal enfermedades de los huesos, articulaciones, tejido conectivo y cartílago, enfermedades musculares, enfermedades de la piel, enfermedades cardiovasculares, enfermedades circulatorias, enfermedades hematológicas y vasculares, enfermedades pulmonares, enfermedades del tracto gastrointestinal, enfermedades hepáticas, enfermedades pancreáticas, enfermedades metabólicas, enfermedades de los ríñones, intoxicaciones graves, enfermedades degenerativas asociadas al síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), trastornos asociados al envejecimiento, trastornos dentales, enfermedades o trastornos oftálmicos, enfermedades de las zonas de la audición, enfermedades asociadas a las mitocondrias (patologías mitocondriales).
10. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el fármaco se piensa para proteger las células cardiacas (fármaco cardioprotector).
11. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el fármaco es pensado para la protección de las células hepáticas (fármaco hepatoprotector).
12. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el fármaco se piensa para tratar o prevenir las enfermedades asociadas a las mitocondrias.
13. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el fármaco se piensa para la protección de las células, tejido o órgano, antes, durante o después de un trasplante.