MX2008012167A

MX2008012167A - Antigenos de grupo sanguineo de diferentes tipos para aplicaciones de diagnostico y terapeuticas.

Info

Publication number: MX2008012167A
Application number: MX2008012167A
Authority: MX
Inventors: Jan Holgerson; Jining Liu; Linda Bjornstrom; Per Grufman
Original assignee: Absorber Ab
Priority date: 2006-03-23
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2009-01-07
Also published as: ATE515700T1; EP2362224A2; IL213523A0; US7897328B2; EP2010920A2; NZ572194A; EP2010920B1; EP2362223A2; US8404456B2; WO2007135571A3; JP2009536150A; US20070224652A1; SG171599A1; WO2007135571A2; AU2007252926A1; SG171598A1; EP2362224A3; JP2013011626A; IL213524A0; EP2362223A3

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para tratar o prevenir el rechazo de injertos producido por anticuerpos y para la tipificación sanguínea.

Description

ANTÍGENOS DE GRUPO SANGUÍNEO DE DIFERENTES TIPOS APLICACIONES DE DIAGNÓSTICO Y TERAPÉUTICAS CAMPO DE LA INVENCIÓN En términos generales la invención se relaciona con composiciones y métodos para tratar o prevenir el rechazo de injertos mediado por anticuerpos y de manera más particular, con composiciones que incluyen determinantes de grupo sanguíneo útiles para eliminar anticuerpos anti-antígeno de grupo sanguíneo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto que los trasplantes renales, ya en los primeros días de la intervención, cruzan la barrera ABO y esto da como resultado una alta incidencia de trasplantes que nunca funcionan y por lo tanto se considera como prerrequisito para un alotrasplante , cumplir con las reglas Landsteiner tradicionales utilizadas en la transfusión sanguínea. Las isoglutininas anti-A/B generadas previamente en el receptor son las responsables del rechazo hiperagudo de injertos con incompatibilidad ABO. Este rechazo hiperagudo es similar al que se observa en pacientes aloinmunizados con anticuerpos HLA (antígenos leucocitarios humanos) de donador reactivo. El primer estudio para cruzar la barrera ABO en trasplantes se inició al principio de los años 70 injertando ríñones procedentes de cadáveres de grupo sanguíneo A2 en receptores O1. En la década de los 80, Alexandre realizó con donadores A: y B, la primera serie de trasplantes renales de donadores vivos (living donors o LD) con incompatibilidad ABO y obtuvo una sobrevivencia de injerto similar a la de los casos compatibles con los ABO. El protocolo inmunosupresor incluyó plasmaféresis preoperatoria para eliminar los anticuerpos anti-A/B, transfusión de plaquetas de donador, esplenectomía y terapia de inducción con globulina anti-linfocitos/timocitos , inyección de sustancias de grupo sanguíneo A ó B extraídas de estómago de porcino e inyecciones de ciclosporina-azatioprina-prednisona . Desde entonces a nivel mundial se han reportado más de 500 casos de trasplantes renales (LD) incompatibles con los ABO, principalmente en Japón (revisados en x) y la importancia de reducir los niveles de anticuerpos anti-A/B antes de hacer el injerto a fin de evitar el rechazo se ha documentado muy bien2,3. En estas series la sobrevivencia del injerto es buena (sobrevivencia del injerto de 1 año en aproximadamente 85% para donadores Ax y B) pero un poco menor a la de los injertos compatibles con los ABO debido a casos aislados de rechazo agudo mediado por anticuerpos anti-A/B4,5. Datos recientes sobre trasplantes renales con incompatibilidad ABO en los que se utiliza un anticuerpo anti-CD20 (Rituximab) en combinación con la eliminación de anticuerpos, mostraron que son aun mejores con respecto a la sobrevivencia del injerto6,7. En tiempos de gran escasez de órganos, el aumento en el uso de injertos a partir de donadores con incompatibilidad ABO permitirá que se hagan más trasplantes renales LD . Por otra parte, la experiencia adquirida en este campo también será aplicable en el manejo pretratamiento y postrasplante de pacientes sensibilizados con HLA8.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En parte, la invención radica en un método y composiciones mejoradas para eliminar del plasma anticuerpos de antígenos de grupo sanguíneo y también radica en un método de tipificación sanguínea. En un aspecto, la invención proporciona una composición que contiene al menos dos antígenos de grupo sanguíneo en donde cada antígeno de grupo sanguíneo se expresa en diferentes tipos de cadena sacárida núcleo. De preferencia, la composición contiene 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o más antígenos de grupo sanguíneo A/B. En otro aspecto, se determina la presencia de anticuerpos de grupo sanguíneo en la muestra de un individuo (por ejemplo, tipificación sanguínea) proporcionando una serie de microesferas de diferentes subtipos, en donde cada subtipo se recubre con un diferente antígeno de grupo sanguíneo y la muestra del individuo se adiciona a la colección de microesferas . La muestra y las microesferas se incuban durante un tiempo suficiente para que los anticuerpos anti -grupo sanguíneo en la muestra se unan a los antígenos de grupo sanguíneo de las microesferas y formen un complejo anticuerpo anti-grupo sanguíneo-microesfera. El complejo se incuba, por ejemplo, se pone en contacto con al menos un ligando marcado que tenga la capacidad de unirse de manera específica con los anticuerpos anti-grupo sanguíneo unidos a los antígenos del grupo sanguíneo y se detecta la presencia de la presencia del ligando unido a los anticuerpos anti-grupo sanguíneo para determinar la presencia o ausencia de los anticuerpos reactivos. El ligando es, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo. El anticuerpo es un fragmento de anticuerpo monovalente como el fragmento Fab o Fab 1. Por ejemplo, el fragmento Fab o Fab' es un fragmento de anticuerpo anti-Fc, un fragmento de anticuerpo de cadena ligera anti-kappa, un fragmento de anticuerpo de cadena ligera anti-lambda y un fragmento de anticuerpo de cadena simple. El marcador es, por ejemplo, un marcador fluorescente. El ligando marcado se detecta por medio de los métodos conocidos en la técnica como citometría de flujo o Luminex. Los anticuerpos reactivos al grupo sanguíneo en una muestra se extraen mediante una serie de microesferas de diferentes subtipos, en donde cada subtipo se recubre con un diferente antígeno de grupo sanguíneo. La muestra se pone en contacto con la colección de microesferas y se incuba durante un tiempo suficiente para que los anticuerpos anti -grupo sanguíneo en la muestra se unan a los antígenos de grupo sanguíneo. La microesferas y la muestra se separan y así se extraen de la muestra los anticuerpos reactivos al grupo sanguíneo. Los antígenos de grupo sanguíneo incluyen el antígeno A, el antígeno B y el antígeno H. Los tipos de cadena sacárida núcleo incluyen el tipo 1, tipo 2, tipo 3 y tipo 4. Los antígenos de grupo sanguíneo son sacáridos libres (denominados aquí oligosacáridos ABO) o de manera opcional los antígenos de grupo sanguíneo se expresan en un polipéptido muciníco. El polipéptido mucínico es parte de una proteína de fusión de inmunoglobulina mucínica (en la presente denominada polipéptidos o proteína de fusión ABO) . De manera opcional, los oligosacáridos ABO o las proteínas de fusión ABO están unidos, por ejemplo, en forma covalente o no covalente a un soporte sólido como las microesferas. Las microesferas son de látex, por ejemplo. Por microesferas de diferente subtipo se entiende que las microesferas se distinguen entre si por el tamaño, el color o ambos . El diámetro se encuentra en el intervalo aproximado de 2 µp? a 15 µp? . De preferencia, la microesfera tiene un diámetro aproximado de 5 µt?. Con la máxima preferencia, las microesferas tienen un diámetro aproximado de 5 µp? . La muestra es, por ejemplo, sangre entera, suero o plasma. En algunos aspectos, las composiciones se formulan como un absorbente para extraer los anticuerpos del grupo sanguíneo de la sangre entera o del plasma. La invención también proporciona una colección de microesferas de diferentes subtipos, en donde cada subtipo se recubre con diferente antígeno de grupo sanguíneo. Por ejemplo, la colección contiene microesferas con al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 ó más diferentes subtipos. A menos que se defina de otro modo, en la presente, los términos técnicos y científicos tienen el mismo significado que tienen para la persona con experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aun cuando se puedan usar métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen aquí para llevar a la práctica o evaluar la presente invención, más adelante se describen los métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente quedan incorporadas aquí en su totalidad, como referencia. En caso de conflicto, la presente descripción incluidas las definiciones, harán la función de control. Por otra parte, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no limitativos. Otras particularidades y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una representación esquemática de los vectores usados para producir las proteínas de fusión que portan los antígenos de grupo sanguíneo. La Figura 2 es una fotografía que muestra la localización celular de la PSGL- l/mIgG2b determinada por inmunofluorescencia indirecta. La proteína PSGL- l/mIgG2b se determinó por medio de un anticuerpo anti-IgG Fe de ratón obtenido en cabra conjugado con FITC (Sigma) diluido 1:200 en amortiguador de bloqueo. Los núcleos celulares se tiñeron con 4 , 6 -diamidino- 2 - fenilindol (DAPI) . La Figura 3 es una fotografía de transferencia Western que muestra determinantes del grupo sanguíneo A incorporados en diferentes cadenas núcleo expuestas. La Figura 4 es una representación esquemática del esquema de transfección ABH para producir los péptidos de fusión ABO en diferentes precursores de glicano. La Figura 5 son gráficas que muestran los resultados de la citometría de flujo con microesferas de 5 diferentes tamaños e intensidades de color que muestran claramente que es posible usar microesferas de muchas combinaciones de tamaño y color. Al usar combinaciones con los tamaños y colores que se muestran sería posible hacer una mezcla de hasta 25 diferentes microesferas y que cada una exprese un solo grupo sanguíneo. La Figura 6 es una representación esquemática de estructuras núcleo expuestas o externas del antígeno de grupo sanguíneo. La Figura 7 es una representación esquemática de antígenos de grupo sanguíneo ABH. La Figura 8 es una representación gráfica de los resultados de citometría de flujo que identifican anticuerpos anti-grupo sanguíneo en suero. La Figura 9 es una serie de gráficas de barrido que muestran anticuerpos IgG e IgM de grupo sanguíneo A en suero de individuos A, B y O.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En parte, la invención radica en el descubrimiento de que los epítopes de grupo sanguíneo se pueden expresar de manera específica con alta densidad y por diferentes cadenas de sacáridos núcleo (por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3 o tipo 4) ya sea como sacáridos libres o en cadenas proteicas tipo mucina. Se ha descubierto que al usar antígenos de grupo sanguíneo incorporados en diferentes cadenas sacáridas núcleo, cuando se usan en combinación, son más eficientes para extraer de la sangre anticuerpos anti- grupo sanguíneo antes de un trasplante. Por otra parte, las composiciones de la invención son útiles en el diagnóstico y pronóstico para determinar la presencia de anticuerpos reactivos al grupo sanguíneo en un individuo. En un aspecto, la invención proporciona una composición que contiene al menos dos diferentes antígenos de grupo sanguíneo (es decir, oligosacáridos ) en donde cada antígeno de grupo sanguíneo se expresa en una diferente cadena sacárida núcleo (es decir, precursores de glicano) . En la presente, estos oligosacáridos se denominan "oligosacáridos ABO" . Los antígenos de grupo sanguíneo son sacáridos libres. Como alternativa, el antígeno de grupo sanguíneo se expresa en un polipéptido mucínico. Por ejemplo, el antígeno de grupo sanguíneo se expresa en proteínas de fusión de inmunoglobulina mucínica (denominadas en la presente "proteínas de fusión ABO") . Las proteínas de fusión ABO tienen un epítope específico para un determinante de grupo sanguíneo. Por ejemplo, la proteína de fusión ABO tiene el epítope A, el epítope B o el epítope H. Como alternativa, la proteína de fusión ABO tiene dos epítopes de antígeno de grupo sanguíneo. Por ejemplo, la proteína de fusión tiene el epítope A y el epítope B. En algunos aspectos, la proteína de fusión ABO tiene los tres epítopes (es decir, A, B y H) . Las proteínas de fusión ABO de la invención expresan el epítope A, B o H en diferentes precursores de glicano, por ejemplo, cadenas precursoras tipo 1, tipo 2 o tipo 3. De manera opcional, los oligosacáridos ABO o las proteínas de fusión ABO están unidas a un soporte sólido que permite la separación de los antígenos de grupo sanguíneo de la sangre . En consecuencia, los oligosacáridos ABO y las proteínas de fusión ABO son útiles para eliminar los anticuerpos anti -grupo sanguíneo ABO de la sangre o suero del receptor, por ejemplo, antes de un trasplante de médula espinal o de un órgano con incompatibilidad ABO, o para hacer universal el plasma del donador. Los oligosacáridos ABO o las proteínas de fusión ABO absorben 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 100% de los anticuerpos anti-grupo sanguíneo ABO, del plasma o sangre del receptor. El oligosacárido ABO es más eficiente sobre una base molar de carbohidrato para extraer los anticuerpos anti-antígeno de grupo sanguíneo en comparación con el oligosacáridos antigénicos grupo sanguíneo expresado en una sola cadena sacárida núcleo. El oligosacárido ABO se une a un número 2, 4, 10, 20, 50, 80, 100 o más veces mayor de anticuerpos anti-antígeno de grupo sanguíneo en comparación con una cantidad equivalente de sacáridos libres expresados en una sola cadena sacárida núcleo. Del mismo modo, el péptido de fusión ABO es más eficiente sobre una base molar de carbohidrato para extraer los anticuerpos anti-antígeno de grupo sanguíneo en comparación con los sacáridos libres de determinantes AB naturales. El péptido de fusión ABO se une a un número 2, 4, 10, 20, 50, 80, 100 o más veces mayor de anticuerpos anti-antígeno de grupo sanguíneo en comparación con una cantidad equivalente de sacáridos libres de determinantes AB naturales. Los oligosacáridos ABO y las proteínas de fusión ABO también son útiles en un método de tipificación sanguínea. Los métodos de la invención son mejores que los métodos de tipificación sanguínea actuales ya que permiten la cuantificación de anticuerpos de grupo sanguíneo de diferentes clases y subclases. En particular, permiten la detección de anticuerpos específicos del tipo de cadena. Esto es importante desde el punto de vista clínico ya que el sistema inmune puede responder específicamente a antígenos de grupo sanguíneo en diferentes cadenas núcleo. Por otra parte, los antígenos de grupo sanguíneo en diferentes cadenas núcleo se expresan de una manera específica en tejido o célula. De este modo, al permitir la detección de anticuerpos específicos de la cadena se propiciará una mejor compatibilidad cruzada donador-receptor en aloinjertos de órganos con incompatibilidad ABO lo que disminuiría el rechazo hiperagudo.

Antígenos de grupo histosanguíneo ABH Los antígenos ABH se encuentran en casi todas las células del organismo humano, pero su papel fisiológico es un problema que aún no se ha resuelto. Tienen estructura de carbohidratos y se forman por medio de diferentes glicosiltransferasas , es decir, enzimas que adicionan unidades de monosacáridos de manera secuencial al extremo no reductor de la cadena de oligosacáridos en crecimiento. Los oligosacáridos pueden ser transportados por proteínas o lípidos5 o se pueden encontrar libres en los fluidos corporales (por ejemplo, la leche materna)9. Los antígenos ABH se dividen en subgrupos, dependiendo de la cadena de sacáridos núcleo interna9. Como ejemplo, los antígenos A, B y H se expresan en cadenas tipo 1 (Gaipi, 3GlcNAc) , tipo 2 (Gaipi, 4GlcNAc) , tipo 3 (Galpl, 3GlcNAca) y tipo 4 (Gai i, 3GlcNAcP) . Los antígenos ABH de cadena tipo 4 sólo se encuentran unidos a lípidos. Los antigenos H se producen por adición de una fucosa en un enlace l , 2 a diferentes cadenas núcleo que tienen una galactosa terminal. Los antigenos A y B se producen a partir de los subtipos de H por adición de una N-acetilgalactosamina (A) o una galactosa (B) en un enlace al, 3 a la galactosa terminal. Las glicosiltransferasas responsables de la biosíntesis de los antigenos A y B requieren la presencia de la al,2-fucosa para la adición de la galactosa y la N-acetilgalactosamina terminal, respectivamente . Dos al , 2 - fucosiltransferasas distintas permiten la biosíntesis del antígeno H como inicialmente lo describió Oriol10. Una es codificada por el locus H (FUT-1) y la otra por el locus secretor (Se) (FUT-II) . El producto génico FUT-1 es responsable de la expresión del antígeno H en eritrocitos y actúa principalmente en las cadenas tipo 2, pero también ha mostrado actividad en cadenas tipo 1. Por el contrario, el producto génico FUT-II se expresa en células acinares de la glándula salival y en células epiteliales que revisten las vías gastrointestinales, reproductoras y los tractos pulmonares, y actúa sobre todo en cadenas tipo 1 pero es probable que también en cadenas tipo 3 y 4. Se ha visto que los productos génicos responsables de la expresión de los antígenos A y B tienen un origen común11. Las mutaciones que dan lugar a la sustitución de cuatro residuos de aminoácidos en el producto génico codificado para A en comparación con B producen un cambio en la preferencia del nucleótido por el azúcar donador, de UDP-N-acetilgalactosamina a UDP-galactosa. El fenotipo serológico denominado O carece de la expresión de estos dos productos génicos debido a una mutación de la pauta de lectura en el alelo A original y por lo tanto no expresa las determinantes A ó B11. El grupo sanguíneo A se ha subdividido en grupos serológicamente distintos, los subgrupos más frecuentes son A, y A212. Estos subtipos A son producidos por dos diferentes al,3-N-acetilgalactosaminiltransferasas , una (A con preferencia por antígenos H tipo 3 y 4 y la otra (A,) con preferencia por antígenos H tipo 1 y 2.

La importancia de la multivalencia En general, las interacciones proteína-carbohidrato se caracterizan por una baja afinidad de unión. Aunque pueda parecer irracional, esto proporciona la base para una rápida velocidad on/off esencial en las condiciones fisiológicas ya que permite que se den interacciones rápidas con alta susceptibilidad de cambio entre receptores celulares, anticuerpos y otras proteínas que se unen a carbohidratos y sus ligandos glicosilados . Cuando se necesitan afinidades mayores, éstas se dan naturalmente mediante el uso de multivalencia . La unión de varios receptores en una entidad biológica con varios ligandos de carbohidrato en otra, puede dar como resultado un aumento de 10 a 10000 veces en la afinidad. Los ejemplos de interacciones polivalentes incluyen la unión de microbios (virus, bacterias o toxinas bacterianas) a una superficie celular, la unión célula a célula y la unión de moléculas polivalentes, como los anticuerpos, a una superficie celular13. La inhibición de interacciones polivalentes con inhibidores monovalentes es por lo general ineficaz incluso si la actividad de unión del inhibidor se ha optimizado estructuralmente. Por lo tanto, se han usado varias moléculas diferentes (por ejemplo, poliacrilamida, péptidos, albúmina de suero bovino, dendrímeros y ciclodextrinas ) como cadena base para varias presentaciones de mono y oligosacáridos con la intención de generar la unión multivalente de los receptores correspondientes13. Un enfoque alternativo consiste en la asociación no covalente del ligando con los grupos principales en liposomas, membranas y otras superficies13. El éxito de estos glicoconj ugados varia, pero en general, la afinidad se incrementa de 10 a 1000 veces en comparación con la de las interacciones monovalentes. Las actividades nanomolares que caracterizan más frecuentemente las interacciones fisiológicas proteína-carbohidrato se han logrado en pocos casos13 al optimizar la presentación del ligando (es decir, estructura de ligando, grado de valencia, estructura de la cadena y distancias intra e interligando) , por ejemplo, imitando tanto como sea posible la manera en que la naturaleza presenta al carbohidrato.

Mucinas reco binantes , con sustituciones de glicano hechas a la medida, como absorbedores eficientes de anticuerpos anticarbohidrato Las proteínas tipo mucina normalmente se encuentran en las superficies mucosas y se caracterizan por su abundante sustitución O-glicano (cada dos o tres aminoácidos) . Hasta 50% de su peso molecular se debe a la sustitución de carbohidratos. Al coexpresar varios ADNc de glicosiltransferasa con Ig de mucina se puede determinar la estructura de sus O-glicanos de tal modo que contiene varias copias de determinantes de carbohidratos biológicamente significativos. De este modo, se han hecho mucinas que tienen determinantes de grupo sanguíneo A y se ha demostrado que se unen a anticuerpos anti-grupo sanguíneo A con alta eficacia1. De hecho, se ha visto que los absorbedores basados en mucina de anticuerpos antigrupo sanguíneo A son aproximadamente 100 veces más eficientes (según se calcula por el número de determinantes de grupo sanguíneo A) en unirse a anticuerpos anti-A que el trisacárido de grupo sanguíneo A unido directamente a través de un separador a esferas de agarosa (este es el acomodo de Glucosorb®) . Esto se explica por el hecho de que varias copias del determinante A se expresan para una separación óptima de la unión a Ab (anticuerpo) en una proteína portadora tipo mucina1. Del mismo modo, se ha visto que las mucinas recombinantes que tienen el epítope de carbohidrato, Galccl , 3Gal (a-Gal ) han demostrado ser absorbedores muy eficientes de anticuerpos anti-Gal; el principal obstáculo que impide el éxito en xenotrasplantes , procedentes del cerdo, en el ser humano1''"". De este modo, las mucinas son plataformas muy eficientes para la óptima presentación de carbohidratos bioactivos.

La importancia de los subtipos de antígenos de grupo sanguíneo Como se describió en lo anterior, las determinantes del grupo sanguíneo ABH pueden ser portadas por diferentes cadena sacárida núcleo. Estas tienen una distribución tisular y celular específica en el organismo humano y se desconoce la importancia de los antígenos ABH individuales como moléculas diana para anticuerpos antigrupo sanguíneo ABH. Tampoco se sabe si el repertorio de anticuerpos anti-grupo sanguíneo ABH es heterogéneo, es decir, si las subpoblaciones de estos anticuerpos pueden distinguir entre los diferentes subtipos de antígenos ABH y realmente requieren para unirse más de la cadena de carbohidrato que el trisacárido terminal. Algunos datos sugieren que es suficiente usar sólo el trisacárido A o B para la absorción de todos los anticuerpos específicos para los antígenos de grupo sanguíneo A o B, respectivamente, lo que indica que esto también sería cierto para la detección de estos anticuerpos 19 20. sin embargo, los datos de la presente invención muestran que es posible obtener una absorción y detección de anticuerpos más eficiente si se utilizan diferentes subtipos (es decir, contenidos en diferentes cadenas sacáridas núcleo) de antígenos de grupo sanguíneo ABH.

Oligosacáridos con cadenas de sacáridos núcleo diseñadas a la medida, como absorbedores de anticuerpos anti- carbohidrato Dada la exposición anterior, una mezcla de proteínas de fusión tipo mucina u oligosacáridos que contienen las determinantes ABH en diferentes cadenas de sacáridos núcleo (a fin de obtener heterogeneidad estructural) adsorberán un repertorio más amplio de anticuerpos anti-A/B. Usando diferentes combinaciones de genes de glicosiltransferasa , la proteína de fusión mucina-inmunoglobulina se puede manipular genéticamente para que contenga varias copias de O-glicanos con cadenas definidas de sacáridos de núcleo internas y externas. Estas se pueden alargar después con las determinantes ABH . De este modo, se puede usar la tecnología recombinante para hacer mucinas de grupo sanguíneo A o B con diversas estructuras, las cuales se pueden aplicar para adsorber un amplio repertorio de anticuerpos anti-A o anti-B.

Oligosacáridos antigénicos de grupo sanguíneo En varios aspectos, la invención proporciona oligosacáridos antigénicos de grupo sanguíneo. Los antígenos de grupo sanguíneo incluyen (A, B y 0(H)) . Los antígenos de grupo sanguíneo son específicos para todos los subtipos de grupo sanguíneo. La expresión "subtipos de grupo sanguíneo" se refiere a que los antígenos de grupo sanguíneo se expresan en diferentes tipos de cadenas sacáridas núcleo. Los tipos de cadenas sacáridas núcleo incluyen los precursores de glicano tipo 1, tipo 2, tipo 3 y tipo 4. Los oligosacáridos antigénicos de grupo sanguíneo ej emplif icativos incluyen los siguientes: Antígenos de grupo sanguíneo A en los tipos 1 a 4 A tipo 1 GalNAcal, 3 (Fucal, 2)Gaipi,3GlcNAcpi-R A tipo 2 GalNAcal, 3 (Fucal , 2) Gaipi,4GlcNAcpi-R A tipo 3 GalNAcal, 3 (Fucal, 2) Gai i, 3GlcNAc l-R A tipo 4 GalNAcal, 3 (Fucal, 2) Gaipi, 3GlcNAc| l-R Antígenos de grupo sanguíneo B en los tipos 1 a 4 B tipo 1 Galal, 3 (Fucal, 2) Gal[3l, 3GlcNAc i-R B tipo 2 Galal, 3 (Fucal, 2) Gai i, 4GlcNAcpi-R B tipo 3 Galal, 3 (Fucal, 2) Gai i, 3GalNAcgl-R B tipo 4 Galal, 3 (Fucal, 2) Gaipi, 3GalNAc|3l-R En donde R representa la mucina cuando el antígeno de grupo sanguíneo se encuentra en una proteína de fusión, el punto de unión cuando el oligosacárido se une a un soporte sólido o no existe cuando el oligosacárido es un sacárido libre.

Polipéptidos de fusión En varios aspectos la invención proporciona proteínas de fusión que incluyen un primer polipéptido que contiene al menos una porción de una glicoproteína , por ejemplo, un polipéptido mucínico operativamente unido a un segundo polipéptido. En el sentido que se utiliza en la presente, los términos "proteína de fusión" o "proteína quimérica" incluyen al menos una porción de un polipéptido mucínico operativamente unido a un polipéptido no mucínico. El término "polipéptido mucínico" se refiere a un polipéptido que tiene un dominio mucínico. El polipéptido mucínico tiene uno, dos, tres, cinco, diez, veinte o más dominios mucinicos. El polipéptido mucínico es cualquier glicoproteína caracterizada por una secuencia de aminoácidos sustituida con O-glicanos. Por ejemplo, un polipéptido mucínico tiene cada segundo o tercer aminoácido una serina o una treonina. El polipéptido mucínico es una proteína secretada. Como alternativa, el polipéptido mucínico es una proteína de superficie celular. Los dominios de mucina son ricos en los aminoácidos treonina, serina y prolina, en donde los oligosacáridos se unen a través de la N-acetilgalactosamina a los hidroxi aminoácidos (O-glicanos) . Un dominio de mucina comprende o consiste alternativamente de un sitio de O-glicosilación . Un dominio de mucina tiene 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50, 100 o más sitios de O-glicosilación. Alternativamente, el dominio de mucina comprende o consiste alternativamente de un sitio de N-glicosilación . La masa de un polipéptido mucínico se debe en un 50%, 60%, 80%, 90%, 95% o 100% al glicano. Un polipéptido mucínico es cualquier polipéptido codificado por un gen MUC (es decir, MUC1, MUC2, MUC3 , etc.) . Como alternativa, un polipéptido mucínico es el ligando 1 de la glicoproteína P-selectina (PSGL-1) , CD34, CD43, CD45 , CD96, GlyCAM-1, MAdCAM o glicoforinas de eritrocitos. De preferencia, la mucina es PSGL-1. Mientras que el término "polipéptido no mucínico" se refiere a un polipéptido en el que al menos 40% de su masa se debe a glicanos. En una proteína de fusión ABO de la invención, el polipéptido mucínico puede que corresponda a una proteína mucínica o a una porción de la misma. En una modalidad, una proteína de fusión ABO contiene al menos una porción de una proteína mucínica. La expresión "al menos una porción" se refiere a que el polipéptido mucínico contiene al menos un dominio mucínico (por ejemplo, un sitio de O-glicosilación) . En una modalidad, la proteína mucínica comprende la porción extracelular del polipéptido. Por ejemplo, el polipéptido mucínico comprende la porción extracelular del PSGL-1. El primer polipéptido se glicosila por medio de una o más transferasas de grupo sanguíneo. El primer polipéptido es glicosilado por 2, 3, 5 o más transferasas de grupo sanguíneo. La glicosilación es secuencial o consecutiva. Como alternativa, la glicosilación es concurrente o aleatoria, es decir, no guarda ningún orden particular. Por ejemplo, el primer polipéptido es glicosilado por una al , 2 - fucosiltransferasa, como las al, 2-fucosiltransferasas codificadas por el gen H- ó Se- . Ejemplos de l , 2 - fucosiltransferasas son FUTI (números de acceso de GenBank : Q10984; 010983,· O10981; AT455028 y NM00148) y FUT2 (GenBank Acc . Núms : P19526; BAA11638; D82933 y A56098) . Como alternativa, el primer polipéptido es glicosilado por 1 , 3 -N-acetilgalactosaminiltransferasa o al , 3 -galactosaminiltransferasa . En algunos aspectos, el primer polipéptido es glicosilado por una al, 2-fucosiltransferasa y por una 1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa o una al, 3-galactosaminiltransferasa . Con relación a la proteína de fusión, el término "operativamente unido" indica que el primero y el segundo polipéptidos están unidos químicamente (por lo general a través de un enlace covalente como el enlace peptídico) de tal manera que permitan la O-glicosilación del primer polipéptido. Cuando se usa para referirse a los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de fusión, el término "operativamente unido" significa que un ácido nucleico que codifica para el polipéptido mucínico y el polipéptido no mucínico están fusionados entre sí en la pauta de lectura. El polipéptido no mucínico se puede fusionar a la terminal N o a la terminal C del polipéptido mucínico. En otra modalidad, la proteína de fusión ABO puede unirse a una o más entidades adicionales . Por ejemplo, la proteína de fusión ABO también se puede unir a una proteína de fusión GST, en donde las secuencias de la proteína de fusión ABO se fusionan con la terminal C de las secuencias de la GST (glutatión S- transferasa) . Estas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de la proteína de fusión ABO. Como alternativa, la proteína de fusión ABO también puede estar unida a un soporte sólido. Varios soportes sólidos son conocidos para los expertos en la técnica. Estas composiciones pueden facilitar la extracción de los anticuerpos anti-grupo sanguíneo. Por ejemplo, la proteína de fusión ABO se une a una partícula hecha, por ejemplo, de compuestos metálicos, sílice, látex, material polimérico; una placa de microtitulación ; nitrocelulosa o nailon, o una combinación de los mismos. Las proteínas de fusión ABO unidas a un soporte sólido se utilizan como absorbedor para extraer anticuerpos antigrupo sanguíneo de una muestra biológica como plasma o sangre . En otra modalidad, la proteína de fusión incluye una secuencia señal heterologa (es decir, una secuencia polipeptídica que no está presente en un polipéptido codificado por un ácido nucleico mucínico) en su terminal N. Por ejemplo, la secuencia de señal mucínica natural se puede eliminar y reemplazar con una secuencia de señal de otra proteína. En algunas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero) , la expresión y/o secreción de polipéptido se puede aumentar mediante el uso de una secuencia señal heterologa.

Una proteina quimérica o de fusión de la invención se puede producir mediante técnicas estándar de ADN recombinante . Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias polipeptídicas se ligan en la pauta de lectura conforme a las técnicas convencionales, por ejemplo, empleando terminales con extremos romos o extremos escalonados para la ligación, digestión con enzimas de restricción para obtener terminales adecuadas, relleno de extremos cohesivos si fuera apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables, y ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión se puede sintetizar mediante las técnicas convencionales que incluyen los sintetizadores de ADN automáticos. Como alternativa, se pueden hacer amplificaciones de fragmentos de genes por reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores ancla que producen salientes complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente se pueden hibridar y reamplificar para generar una secuencia génica quimérica (véase por ejemplo, Ausubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992) . Por otra parte, existen en el comercio muchos vectores de expresión que codifican para una entidad de fusión (por ejemplo, una región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina) . Un ácido nucleico que codifica para una glicoproteina Iba se puede clonar en un vector de expresión tal que la entidad de fusión se una por el marco de lectura a la proteína de inmunoglobulina . Los polipéptidos de fusión ABO pueden existir como oligómeros, por ejemplo, dímeros, trímeros o pentámeros . De preferencia, el polipéptido de fusión ABO es un dímero. El primer polipéptido y/o ácidos nucleicos que codifican el primer polipéptido, se pueden construir por medio de secuencias que codifican mucina, conocidas en la técnica. Las fuentes adecuadas de polipéptidos mucínicos y ácidos nucleicos que codifican polipéptidos mucínicos incluyen los números de acceso de GenBank : NP663625 y NM145650, CAD10625 y AJ417815, XP140694 y XM140694, XP006867 y XM006867 y NP00331777 y NM009151 respectivamente, las cuales en su totalidad se consideran parte de la presente, como referencia. En algunas modalidades, la entidad de polipéptido mucínico se proporciona como una variante de polipéptido mucínico que tiene una mutación en la secuencia mucínica natural (tipo silvestre) que da como resultado un mayor contenido de carbohidratos (con relación a la secuencia sin mutación) . Por ejemplo, la variante del polipéptido mucínico contiene sitios adicionales de O-glicosilación en comparación con la mucina tipo silvestre. Como alternativa, la variante de polipéptido mucínico comprende mutaciones de la secuencia de aminoácidos que dan como resultado un mayor número de residuos de serina, treonina o prolina en comparación con el polipéptido mucínico tipo silvestre. Este mayor contenido de carbohidratos se puede evaluar determinando la proporción entre proteína y carbohidratos en la mucina, con los métodos conocidos para los expertos en la técnica. En algunas modalidades, la entidad de polipéptido mucínico se proporciona como una variante de polipéptido mucínico que tiene mutaciones en la secuencia mucínica natural (tipo silvestre) que da como resultado una secuencia mucínica más resistente a la proteólisis (con respecto a la secuencia sin mutación) . En algunas modalidades, el primer polipéptido incluye la PSGL-1 de longitud total. Como alternativa, el primer polipéptido comprende el polipéptido con PSGL-1 de longitud menor que la total, por ejemplo, la porción extracelular de la PSGL-1. Por ejemplo, el primer polipéptido tiene menos de 400 aminoácidos de longitud, por ejemplo, tiene una longitud menor o igual a 300, 250, 150, 100, 50 ó 25 aminoácidos. Las secuencias ej emplificativas de ácido nucleico y polipéptidos de PSGL-1 incluyen los números de acceso de GenBank : XP006867, XM006867; XP140694 y XM140694.

De preferencia, el segundo polipéptido es soluble. En algunas modalidades, el segundo polipéptido incluye una secuencia que facilita la asociación del polipéptido de fusión ABO con un segundo polipéptido mucínico. En modalidades preferidas, el segundo polipéptido incluye al menos una región de un polipéptido de inmunoglobulina . La expresión "al menos una región" incluye cualquier porción de una molécula de inmunoglobulina, como la cadena ligera, la cadena pesada, la región PC, la región Fab, la región Fv o cualquier fragmento de las mismas. En la técnica se conocen los polipéptidos de fusión de inmunoglobulina y se describen por ejemplo en las patentes de los Estados Unidos núms . 5,516,964, 5,225,538, 5,428,130, 5,514,582, 5,714,147 y 5,455,165. En algunas modalidades, el segundo polipéptido comprende un polipéptido de inmunoglobulina de longitud total. Como alternativa, el segundo polipéptido comprende un polipéptido de inmunoglobulina con longitud menor a la total, por ejemplo, una cadena pesada, una cadena ligera, Fab, Fab2, Fv o Fe. De preferencia, el segundo polipéptido incluye la cadena pesada de un polipéptido de inmunoglobulina. Con más preferencia, el segundo polipéptido incluye la región Fe de un polipéptido de inmunoglobulina . En otro aspecto de la invención, el segundo polipéptido tiene una función efectora menor que la función efectora de una región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina tipo silvestre. La función efectora de Fe incluye, por ejemplo, unión a receptor de Fe, fijación de complemento y actividad de agotamiento de células T (véase, por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm . 6,136,310) . En la técnica son conocidos los métodos para evaluar la actividad de agotamiento de células T, la función efectora de Fe y la estabilidad del anticuerpo. En una modalidad, el segundo polipéptido tiene poca o ninguna actividad respecto al receptor de Fe. En una modalidad alternativa, el segundo polipéptido tiene poca o ninguna afinidad por la proteína del complemento Clq. Otro aspecto de la invención se relaciona con los vectores, de preferencia los vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica polipéptidos mucínicos o derivados fragmentos, análogos u homólogos de los mismos. En varios aspectos, el vector contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido mucínico operativamente unido a un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de inmunoglobulina o derivados fragmentos, análogos u homólogos de la misma. También, el vector comprende un ácido nucleico que codifica una transferasa de grupo sanguíneo, por ejemplo, una al , 2 - fucosiltransferasa , ina al , 3N-acetilgalactosaminiltransferasa, una al, 3- galactosiltransferasa o alguna combinación de las mismas. La transferasa de grupo sanguíneo facilita la adición de las determinantes de grupo sanguíneo en la cadena peptídica base de la porción mucínica de la proteína de fusión ABO. En el sentido que se utiliza en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se le ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido" , éste se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular al cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es el vector viral, en donde, segmentos de ADN adicionales pueden ligarse al genoma viral. Ciertos vectores tienen capacidad de replicación autónoma en una célula huésped en la cual se han introducido (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen origen bacteriano de vectores de mamíferos episódicos y de replicación) . Otros vectores (por ejemplo, los vectores de mamífero no episódicos) se integran al genoma de una célula huésped al introducirse en la célula huésped y por lo mismo se replican junto con el genoma huésped. Más aún, algunos vectores tienen la capacidad de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos operativamente. En la presente, estos vectores se denominan "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión que son útiles en las técnicas de ADN recombinante se presentan con frecuencia en forma de plásmidos . En la presente especificación, los términos "plásmido" y "vector" se utilizan indistintamente ya que el plásmido es la forma más común de vector que se usa. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de los vectores de expresión como los vectores virales (por ejemplo, retrovirus con replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados ) que cumplen funciones equivalentes. Los vectores de expresión recombinante de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo cual significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en función de las células huésped que se van a usar para la expresión, que están operativamente unidas a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, el término "operativamente unido" significa que la secuencia nucleotidica de interés está unida a la o las secuencias reguladoras en una forma que permite la expresión de la secuencia nucleotidica (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce a la célula huésped) . El término "secuencia reguladora" está enfocado a incluir promotores, activadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) . Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en la publicación de Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZIMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)) . Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia nucleotídica en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de las secuencias nucleotídicas sólo en algunas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras especificas de tejido) . Los expertos en la técnica notarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en las células huésped para producir proteínas o péptidos, incluidas las proteínas o péptidos de fusión, codificadas por ácidos nucleicos según se describe en la presente (por ejemplo, polipéptidos de fusión ABO, formas mutantes de polipéptidos de fusión ABO, etc.) . Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para la expresión de polipéptidos de fusión ABO en células procariontes o eucariontes . Por ejemplo, los polipéptidos de fusión ABO se pueden expresar en células bacterianas como Escherichia coli, células de insectos (utilizando vectores de expresión de baculovirus) , células de levaduras o células de mamíferos. Otras células huésped adecuadas se comentan en la publicación de Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: ETHODS IN ENZIMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif . (1990) . Como alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo, mediante la secuencia reguladora del promotor T7 y la polimerasa T7. La expresión de proteínas en procariontes con más frecuencia se lleva a cabo en Escherichia coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o de no fusión. Los vectores de fusión adicionan varios aminoácidos a una proteína codificada en ellos, por lo general, a la terminal amino de la proteína recombinante. Estos vectores de fusión normalmente tienen tres propósitos: (i) aumentar la expresión de la proteína recombinante; (ii) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y (iii) ayudar en la purificación de la proteína recombinante al actuar como un ligando en la purificación por afinidad. Con frecuencia, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión de la entidad de fusión y la proteína recombinante, que permite la separación de la proteína recombinante a partir de la entidad de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Estas enzimas y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen el factor Xa, trombina y enterocinas . Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc ; Smith y Johnson, 1988. Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan la glutatión S-transferasa (GST) , la proteína de unión a maltosa E o la proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana . Ejemplos de vectores de expresión en E. coli de no fusión e inducibles incluyen el pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315) y pET lid (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89) . Una estrategia para aumentar al máximo la expresión de la proteína recombinante en E. coli consiste en expresar la proteína en una bacteria huésped con capacidad deficiente para escindir proteolíticamente la proteína recombinante. Véase, por ejemplo, Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128) . Otra estrategia es modificar la secuencia de ácido nucleico que se va a insertar en un vector de expresión de manera que los codones individuales para cada aminoácido son los que preferencialmente se utilizan en E. coli (véase, por ejemplo, Wada, et al., 1992. Nucí. Acids Res. 20:2111-2118) . Esta modificación de las secuencias de ácido nucleico de la invención se puede llevar a cabo mediante las técnicas estándar de síntesis de ADN . En otra modalidad, el vector de expresión del polipéptido de fusión ABO es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para la expresión en levaduras Saccharomyces cerevisae incluyen pYepSecl (Baldari et al. 1987. EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif . ) y picZ (InVitrogen Corp., San Diego, Calif.) Como alternativa, el polipéptido de fusión ABO se puede expresar en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus . Los vectores de baculovirus disponibles para expresión en proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células SF9) incluye la serie pAc (Smith, et al., 1983, Mol. Cell. Biol . 3: 2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989. Virology 170 : 31-39) . En otra modalidad, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195) . Cuando se usan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión a menudo son aportadas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores de uso común se derivan de polioma, adenovirs 2, citomegalovirus y virus de simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados para células procarionte y eucarionte, véase, por ejemplo, capítulos 16 y 17 de la obra de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2 nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Otro aspecto de la invención se relaciona con células huésped en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan en la presente de manera indistinta. Se entiende que estos términos no sólo se refieren a la célula como individuo en particular sino también a la descendencia o descendencia potencial de esa célula. Dado que pueden surgir algunas modificaciones en las generaciones siguientes debido a su mutación o influencias del entorno, la descendencia, en caso de haberla, puede no ser idéntica a la célula antecesora, pero queda incluida en el alcance del término tal como se utiliza en la presente.

Una célula huésped puede ser cualquier célula procariote o eucariote. Por ejemplo, los polipéptidos de fusión de glicoproteína Iba se pueden expresar en células bacterianas como E. coli, células de insecto, levaduras o células de mamífero (humanos, células ováricas de hámster chino (CHO) o células COS) . El experto en la técnica tendrá conocimiento de otras células huésped adecuadas. El ADN vector se puede introducir en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se utiliza en la presente, los términos "transformación" y "transfección" se refieren a una diversidad de reconocidos métodos de la técnica para introducir ácido nucleico exógeno (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluido el método de coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada con DEAE-dextrano , lipofección o electroporacion. Métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped se pueden encontrar en Sambrook , et al. (MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, 2 nd . ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) y otros manuales de laboratorio. Para transfección estable de células de mamífero, se sabe que dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección empleada, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN exógeno en su genoma . Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, por lo general, se introduce en las células huésped un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a los antibióticos) junto con el gen de interés. Entre los diversos marcadores seleccionables se incluyen aquellos que confieren resistencia a los medicamentos, por ejemplo, G418, higromicina y metotrexato. Se puede introducir en la célula huésped ácido nucleico que codifique para un marcador seleccionable, en el mismo vector que codifica los polipéptidos de fusión de glicoproteína Iba o se pueden introducir en un vector separado. Las células transíectadas establemente con el ácido nucleico introducido se pueden identificar por selección del medicamento (por ejemplo, las células que tengan incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán) . Una célula huésped de la invención, por ejemplo, una célula huésped procariota o eucariota en cultivo, se puede usar para producir (es decir, expresar) polipéptidos de fusión ABO. Por lo tanto, la invención también proporciona métodos para producir polipéptidos de fusión ABO empleando las células huésped de la invención. En una modalidad, el método incluye cultivar la célula huésped de la invención (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica para polipéptidos de fusión ABO) en un medio adecuado para producir polipéptidos de fusión ABO. En otra modalidad, el método también incluye aislar el polipéptido de fusión del medio o la célula huésped. Los polipéptidos de fusión ABO se pueden aislar y purificar según las condiciones convencionales, como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis o lo similar. Por ejemplo, las proteínas de fusión de inmunoglobulinas se pueden purificar al pasar una solución a través de una columna que contiene proteína A o proteína G inmovilizadas que se unen de manera selectiva a la porción Fe de la proteína de fusión. Véase, por ejemplo, Reís, K.J., et al., J. Immunol . 132: 3098-3102 (1984) ; Publicación de solicitud PCT, núm . WO87/00329. El polipéptido de fusión se puede eluir por tratamiento con una sal caotrópica o por elución con ácido acético acuoso (1M) . Como alternativa, los polipéptidos de fusión ABO según la invención se pueden sintetizar químicamente con los métodos conocidos en la técnica. La síntesis química de polipéptidos se describe, por ejemplo.. [sic] , . Son de uso común en la técnica varios métodos de síntesis de proteínas, que incluyen la síntesis mediante un sintetizador de péptidos. Véase, por ejemplo, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, Bodasnsky, Ed . Springer-Verlag, 1988: Merrifield, Science 232: 241-247 (1986); Barany, et al., Intl. J. Peptide Protein Res. 30: 705-739 (1987); Kent, Ann. Rev. Bioche . 57: 957-989 (1988) y Kaiser, et al., Science 243: 187-198 (1989) . Los polipéptidos se purifican mediante técnicas estándar de purificación para que estén prácticamente libres de precursores químicos u otras sustancias químicas. La expresión "prácticamente libres de precursores químicos u otras sustancias químicas" incluye preparaciones de péptido en las cuales el péptido se separa de precursores químicos o de otras sustancias químicas que participan en la síntesis del péptido. En una modalidad, la expresión "prácticamente libres de precursores químicos u otras sustancias químicas" incluye preparaciones de péptido que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o sustancias químicas no peptídicas, con mayor preferencia menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o sustancias químicas no peptídicas, aun con más preferencia menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o sustancias químicas no peptídicas y con la máxima preferencia menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o sustancias químicas no peptídicas. La síntesis química de polipéptidos facilita la incorporación de aminoácidos modificados o no naturales, que incluyen D-amínoácidos y otras moléculas orgánicas pequeñas. El remplazo en un péptido de uno o más L-aminoácidos con las correspondientes isoformas del D-aminoácido, se puede usar para aumentar la resistencia del péptido a la hidrólisis enzimática y para reforzar una o más propiedades de los péptidos con actividad biológica, es decir, unión a receptor, potencia funcional o duración de la acción. Véase, por ejemplo, Doherty, et al., 1993. J. Med. Chem. 36: 2585-2594; Kirby et al., 1993. J. Med. Chew. 36:3802-3808; Morita, et al., 1994. FEBS Lett . 353: 84-88; Wang, et al.. 1993. Int. J. Pept . Protein Res. 42: 392-399; Fauchere y Thiunieau, 1992. Adv. Drug Res. 23: 127-159. La introducción de enlaces cruzados covalentes en una secuencia peptídica puede constreñir conformacional y topográficamente la cadena del polipéptido. Esta estrategia se puede utilizar para desarrollar análogos peptídicos de los polipéptidos de fusión, que tienen mayor potencia, selectividad y estabilidad. Debido a que la entropía conformacional de un péptido cíclico es menor que su contraparte lineal, la adopción de una conformación específica se puede dar con una disminución más pequeña en entropía para un análogo cíclico que para un análogo acíclico, por lo que se favorece más la energía libre para la unión. La macrociclización con frecuencia se lleva a cabo formando un enlace amida entre las terminales N y C del péptido, entre una cadena lateral y las terminales N o C [por ejemplo, con K3Fe(CN)6 a pH 8.5] (Samson, et al., Endocrinology, 137: 5182-5185 (1996)) o entre dos cadenas laterales de aminoácidos. Véase, por ejemplo, DeGrado, ñdv . Protein Chem. 39: 51-124 (1988) . También se introducen puentes disulfuro en las secuencias lineales para reducir su flexibilidad, Véase, por ejemplo, Rose, et al., Adv . Protein Chem., 37: 1-109 (1985); Mosberg, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 106: 505-512 (1982) . Por otra parte, el reemplazo de residuos de cisteína con penicilamina (Pen, 3 -mercapto- (D) -valina) se ha empleado para aumentar la selectividad de algunas interacciones de receptores de opiáceos. Lipkowski y Carr . , Peptides: SynLhesis, Structures and Applications, Gutte, ed . Academic Press, págs . 287-320 (1995) .

Composición y estuches También se incluyen en la invención composiciones que contienen al menos dos antigenos de grupo sanguíneo (por ejemplo, oligosacáridos ABO) en donde cada antígeno de grupo sanguíneo se expresa en un diferente tipo de cadena de sacáridos núcleo. El antígeno de grupo sanguíneo es una antígeno A, un antígeno B o un antígeno H. El tipo de cadena sacárida núcleo es tipo 1, tipo 2, tipo 3 o tipo 4. La composición contiene 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más antígenos de grupo sanguíneo diferentes. Los antígenos de grupo sanguíneo ej emplificativos incluyen los mencionados anteriormente. Opcionalmente , los oligosacáridos ABO o las proteínas de fusión ABO están unidas a un soporte sólido. La unión es covalente . Como alternativa, la unión es no covalente . El soporte sólido puede ser, por ejemplo, una esfera, resina, membrana o un disco o cualquier material de soporte sólido adecuado para los métodos de la invención. De preferencia, el soporte sólido es una esfera, por ejemplo, una microesfera. El tamaño de la esfera no es crítico. Por lo general, la esfera tiene por lo menos 50 µt? de diámetro y se prefiere con un tamaño de partícula de 1 a 10 µtt? . Con la máxima preferencia, las microesferas tienen un diámetro aproximado de 4 a 10 pm . Por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ó 50 pm . La esfera puede estar hecha de compuestos metálicos, sílice, látex, material polimérico o sílice látex o núcleos poliméricos recubiertos con un metal o un compuesto metálico. El soporte sólido puede tener grupos funcionales como hidroxilo, carboxilo, aldehidos o amino. El soporte puede tener carga positiva, negativa o puede ser hidrofóbico. Los soportes recubiertos que tienen grupos funcionales y que se usan en la presente invención, se pueden preparar por modificación del soporte. Por ejemplo, los soportes sin recubrir se pueden tratar con un polímero que tenga uno de estos grupos funcionales, por ejemplo, poliuretano junto con un poliglicol que aporte grupos hidroxilo o un derivado de celulosa que aporte grupos hidroxilo, un polímero o un copolímero de ácido acrílico o ácido metacrílico que aporte grupos carboxilo o un polímero aminoalquilado que aporte grupos amino. La patente de los Estados Unidos Núm . 4,654,267 describe la introducción de muchos recubrimientos de superficie. De preferencia, cada diferente oligosacárido ABO o proteína de fusión ABO se encuentra sobre una microesfera de diferente subtipo. El término "subtipo" se refiere a que cada microesfera es susceptible de distinguirse porque son de diferentes tamaños o tienen distintos marcadores. De manera que el uso de microesferas de diferentes tamaños o de microesferas con diferentes marcadores, por ejemplo, fluoróforos, permite la identificación y/o separación de las diferentes microesferas mediante citometría de flujo, por ejemplo. La invención también proporciona estuches para la identificación o separación de anticuerpos reactivos de grupo sanguíneo a partir de una muestra conforme a los métodos de la invención. El estuche contiene una serie de microesferas de diferentes subtipos, cada subtipo recubierto con un diferente oligosacárido ABO o una diferente proteína de fusión ABO. Opcionalmente , el estuche contiene al menos un ligando marcado abierto capaz de unirse específicamente a un anticuerpo de antígeno antigrupo sanguíneo. Por ejemplo, el ligando es una anticuerpo o fragmento del mismo. El anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo monoclonal. Como alternativa, el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo policlonal. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante . El anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como los fragmentos Fab, Fab, y F (ab , } 2 . Por "se une específicamente o de manera específica" o "reacción inmunológica con" se entiende que el anticuerpo reacciona con una o más determinantes antigénicas del antígeno deseado y no reacciona (es decir, se une) con otros polipéptidos o se une con mucha menor afinidad (Kd >10"6) con otros polipéptidos. El anticuerpo es monovalente . El marcador, es cualquier sustancia empleada para facilitar la identificación y/o cuantif icación de un blanco. Los marcadores se observan o se miden en forma directa o indirecta. Los marcadores incluyen, entre otros, radiomarcadores que se pueden medir con dispositivos contadores de radiación, pigmentos, colorantes u otros cromógenos que se pueden observar visualmente o medir con un espectrofotómetro , marcadores espín que se pueden medir con un analizador de marcadores espín; y entidades fluorescentes, en donde la señal de salida se genera por la excitación de un aducto molecular adecuado y que se puede visualizar a través de la excitación luminosa que es absorbida por el colorante o que se puede medir con fluorómetros estándar o sistemas de imagen, por ejemplo. El marcador puede ser una sustancia luminiscente como un fósforo o un fluorógeno; una sustancia bioluminiscente ; una sustancia quimioluminiscente en la que la señal se genera por modificación química del compuesto de señal; una sustancia que contenga un metal; o una enzima en la que se presente una generación secundaria de señal dependiente de la enzima, como la formación de un producto colorido a partir de un sustrato incoloro. El marcador también puede ser una sustancia química o bioquímica o una partícula inerte, entre las que se incluyen, oro coloidal, microes feras , puntos cuánticos, o cristales inorgánicos como los nanocristales o fósforos (véase, por ejemplo, Beverloo, et al., Anal. Biochem. 203, 326-34 (1992)) . El término marcador también se refiere a una "etiqueta" o hapteno que se puede unir de manera selectiva a una molécula marcada de modo que la molécula marcada, cuando se adicione posteriormente, se use para generar una señal detectable. Por ejemplo, se puede usar biotina, iminobiotina o destíobiotina como una etiqueta y luego usar un conjugado avidina o estreptavidina de peroxidasa de rábano rusticano o HRP (del inglés horseradish peroxidase) que se una a la etiqueta, y después usar un sustrato cromogénico (por ejemplo, tetrametil bencidina) o un sustrato fluorogénico como Amplex Red o Amplex Gold (Molecular Probes, Inc.) para detectar la presencia de HRP. De igual forma, la etiqueta puede ser un hapteno o un antígeno (por ejemplo, digoxigenina) , y se puede utilizar un anticuerpo marcado enzimática, fluorescente o radiactivamente para unirse a la etiqueta. Los expertos en la técnica tienen conocimiento de varios marcadores e incluyen, entre otros, partículas, colorantes fluorescentes, haptenos, enzimas y sus sustratos cromogénicos , fluorogénicos y quimioluminiscentes y otros marcadores que se describen en el libro Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, de Richard, P. Haugland, 6a Ed . , (1966) y las siguientes ediciones 7a y 8a actualizadas publicadas en CD ROM en noviembre de 1999 y mayo de 2001, respectivamente, cuyos contenidos se consideran parte de la presente, como referencia, y en otras fuentes publicadas. Un fluoróforo es cualquier entidad química que presente un máximo de absorción superior a 280 nm y que cuando se une por covalencia a un reactivo marcador conserva sus propiedades espectrales. Los fluoróforos incluyen, entre otros, un pireno (incluyendo cualquiera de los derivados correspondientes descritos en la patente de los Estados Unidos Núm . 5,132,432), un antraceno, un naftaleno, una acridina, un estilbeno, un indol o bencindol, un oxazol o benzoxazol, un tiazol o un benzotiazol, un -amino- 7 -ni trobenz - 2 -oxa- 1 , 3 -diazol (NBD) , una cianina (que incluye cualquiera de los compuestos derivados correspondientes descritos en los documentos de los Estados Unidos series núms . 09/968,401 y 09/969,853), una carbocianina (que incluye cualquiera de los compuestos derivados correspondientes descritos en los documentos de los Estados Unidos series núms. 09/557,275, 09//969,853 y 09/968,401; Patentes de los Estados Unidos núms. 4,981,977, 5,268,486, 5,569,587, 5,569,766, 5,486,616, 5,627,027, 5,808,044, 5,877,310, 6,002,003, 6,004,536, 6,008,373, 6,043,025, 6,127,134, 6,130,094, 6,133,445; y las publicaciones WO 02/26891, WO 97/40104, O 99/51702, WO 01/21624; EP 1 065 250 Al), un carboestirilo , una porfirina, un salicilato, un antranilato, un azuleno, un perileno, una piridina, una quinolina, un borapoliazaindaceno (que incluye cualquiera de los compuestos correspondientes descritos en las Patentes de los Estados Unidos núms. 4,774,339, 5,187,288, 5,248,782, ,274,113 y 5,433,896), un xanteno (que incluye cualquiera de los compuestos correspondientes descritos en las Patentes de los Estados Unidos núms . 6,162,931, 6,130,101, 6,229,055, 6,339,392, 5,451,343 y el documento de lo Estados Unidos serie núm . 09/922,333), una oxazina (que incluye cualquiera de los compuestos correspondientes descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 4,714,763) o una benzoxazina, una carbazina (que incluye cualquiera de los compuestos correspondientes descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 4,810,636), una fenalenona, una cumarina (que incluye cualquiera de los compuestos correspondientes descritos en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,696,157, 5,459,276, 5,501,980 y 5,830,912), un benzofurano (que incluye cualquiera de los compuestos correspondientes descritos en las patentes de los Estados Unidos núms. 4,603,209 y 4,849,362) y benzfenalenona (que incluye cualquiera de los compuestos correspondientes descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 4,812,409), y derivados de los mismos. En el sentido que se utiliza en la presente, las oxazinas incluyen las resorufinas (que incluyen cualquiera de los compuestos correspondientes descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 5,242,805), aminooxazinonas , diaminooxazinas y sus análogos benzosustituidos. Opcionalmente , estos estuches contienen un control positivo o negativo o ambos, instrucciones de uso (por ejemplo, impresos, cintas, VCR, CD-ROM, etc.) y un medio para toma de muestras. Los medios para toma de muestras son muy conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el medio para la toma de muestra es un tubo vacutainer CPT. Los reactivos se presentan empacados en diferentes envases, por ejemplo, el oligosacárido ABO o la proteína de fusión ABO (ya sea unidas a una matriz sólida o envasados por separado con reactivos para unirlos a la matriz), un reactivo de control (positivo y/o negativo) y/o un ligando marcado.

Métodos para tratar o prevenir el rechazo de injertos producido por anticuerpos También se incluyen en la invención los métodos para tratar o prevenir el rechazo de injertos producido por anticuerpos (AMR o antibody mediated graft rejection) , por ejemplo, rechazo de trasplante de órganos. Estos trasplantes incluyen, entre otros, los trasplantes de riñon, hígado, piel, páncreas, córnea o corazón. El término "AMR" incluye cualquier rechazo de injerto producido por anticuerpos que manifieste el receptor. El método incluye poner en contacto una muestra biológica de un individuo con el oligosacárido ABO o el péptido de fusión ABO de la invención. La muestra biológica es, por ejemplo, sangre entera o plasma. Se sabe o se sospecha que la muestra contiene un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo antigrupo sanguíneo. En ciertos casos, la muestra biológica se extrae del individuo antes de ponerla en contacto con el oligosacárido ABO o el polipéptido de fusión ABO. La muestra biológica se pone en contacto con el oligosacárido ABO o el péptido de fusión ABO en condiciones que permitan la formación de un complejo oligosacárido ABO o péptido de fusión ABO-anticuerpo anti-grupo sanguíneo. El complejo oligosacárido ABO o péptido de fusión ABO, si está presente, se separa de la muestra biológica para eliminar los anticuerpos anti-grupo sanguíneo y la muestra biológica se reinfunde al individuo. El AMR también se trata o se previene al administrarle al individuo un polipéptido de fusión ABO de la invención. El individuo puede ser, por ejemplo, cualquier mamífero, por ejemplo, una persona, un primate, ratón, rata, perro, gato, vaca, caballo, cerdo. El tratamiento se administra antes que el paciente reciba un trasplante con incompatibilidad ABO. Como alternativa, el tratamiento se administra después de que el paciente recibe un trasplante con incompatibilidad ABO. La muestra biológica se pone en contacto con el oligosacárido ABO o la proteína de fusión ABO mediante los métodos que utilizan los expertos en la técnica. Por ejemplo, plasmaféresis o inmunoabsorción extracorporal. En esencia, cualquier trastorno que etiológicamente se relacione con una reacción en la que participen anticuerpos se considera susceptible de prevención o tratamiento. El AMR se trata o se previene con cuando la tasa de sobrevivencia del trasplante de órgano es mayor que un trasplante de órgano no tratado por el método de la invención. La expresión "tasa de sobrevivencia del trasplante de órgano" se refiere al tiempo transcurrido antes de que el trasplante sea rechazado por el receptor. Por ejemplo, el AMR se trata o se previene cuando el trasplante sobrevive al menos 1, 2 4 ú 8 semanas después de la operación de trasplante. De preferencia, el trasplante sobrevive 3, 6, 13 meses. Con mayor preferencia, el trasplante sobrevive 2, 3, 5 ó más años.

Métodos para extraer los anticuerpos anti-grupo sanguíneo de una muestra También están incluidos en la invención los métodos para eliminar o disminuir los anticuerpos antigrupo sanguíneo en una muestra. La muestra es un fluido biológico como el plasma sanguíneo. Como alternativa, la muestra es un tejido biológico, por ejemplo, un tejido de corazón, hígado, piel o riñon. El método incluye poner en contacto una muestra con el oligosacárido ABO o el péptido de fusión ABO de la invención. La muestra se pone en contacto con el péptido de fusión ABO en condiciones que permitan la formación de un complejo oligosacárido ABO o péptido de fusión ABO-anticuerpo anti-grupo sanguíneo. El complejo péptido de fusión ABO-anticuerpo, si está presente, se separa de la muestra biológica para eliminar o disminuir los anticuerpos anti-grupo sanguíneo. Este método es útil para producir plasma de donación universal.

Métodos de tipificación de sangre También están incluidos en la invención los métodos para tipificar la sangre de un individuo. La sangre de un individuo se tipifica al poner en contacto la muestra, por ejemplo, plasma o sangre entera de un individuo con una serie de microesferas de diferentes subtipos. Cada subtipo contiene un antígeno de grupo sanguíneo diferente. Los antígenos de grupo sanguíneo se expresan en diferentes tipos de cadenas de sacáridos núcleo. Las microesferas y la muestra se ponen en contacto, por ejemplo, se incuban durante el tiempo suficiente que permita que los anticuerpos anti-grupo sanguíneo presentes en la muestra se unan, que formen, por ejemplo, un complejo anticuerpo-antígeno de grupo sanguíneo, a los antígenos de grupo sanguíneo de las microesferas . Después de la formación del complejo, la muestra se puede lavar una o más veces para eliminar los componentes del plasma que no se unieron. Como alternativa, los componentes del plasma que no se unieron se separan de las microesferas mediante una etapa de separación en la cual la microesferas se extrae de la muestra. La separación se realiza con los métodos conocidos en la técnica, como la centrifugación. Después, las microesferas se ponen en contacto con un reactivo marcador que se una de manera específica a los anticuerpos anti-grupo sanguíneo que están unidos a la microesfera. Las microesferas se pueden lavar una o más veces para eliminar el reactivo marcador que no se unió. La presencia o ausencia de anticuerpos anti-grupo sanguíneo en la muestra se determina mediante la detección del reactivo marcador. La detección se hace con los métodos conocidos en la técnica, como la citometría de flujo o el sistema Luminex. La invención también proporciona la detección de múltiples anticuerpos anti-grupo sanguíneo en una muestra. La expresión "múltiples anticuerpos anti-grupo sanguíneo" se refiere no sólo a anticuerpos específicos para cada uno de los grupos sanguíneos (es decir, ABH) sino a anticuerpos específicos para antígenos de grupo sanguíneo de diferentes tipos de cadenas de sacáridos núcleo. Con el método anterior se identifican varios blancos al poner en contacto la muestra biológica con reactivos de detección adicionales seguidos del reactivo marcador específico para los reactivos de detección adicionales. Por ejemplo, se preparan series secundarias de microesferas con distintos antígenos de grupo sanguíneo, por ejemplo, antígenos de grupo sanguíneo que se distinguen por el tipo de cadena de oligosacáridos núcleo. La serie secundaria de microesferas se adiciona a la muestra biológica que los contiene, en proporción controlada. En métodos alternos, las series secundarias de reactivo marcador se preparan con distintos marcadores, por ejemplo, fluoróforos que se distinguen por su espectro de emisión, por ejemplo, uno que emita en la zona verde del espectro y uno que emita en la zona roja. Las series secundarias de reactivos marcadores se adicionan entonces a la muestra que contiene los complejos reactivo de detección-blanco, en una proporción controlada, por ejemplo, dos partes de un reactivo marcador (por ejemplo, de emisión verde) y una parte del otro reactivo marcador (por ejemplo, de emisión roja) por anticuerpo de unión al blanco. De esta manera, los complejos inmunomarcados se pueden utilizar para detectar un blanco. Si se adicionara otro complejo inmunomarcado a la muestra, el blanco original se podría distinguir del blanco que se detecte después . De manera opcional, se detectan en una muestra 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más antígenos de grupo sanguíneo. La muestra se define como cualquier material que contenga un antígeno de grupo sanguíneo. Normalmente la muestra es sangre, suero o plasma. Los métodos de la invención proporcionan ventajas significativas en comparación con la tecnología existente para tipificación sanguínea. Específicamente, permiten la detección de subtipos de antígenos de grupo sanguíneo. Además, los métodos permiten la identificación de diferentes subtipos de antígenos de grupo sanguíneo en la muestra que se analiza. El reactivo de detección es un compuesto capaz de unirse específicamente a los anticuerpos de grupo sanguíneo unidos a la microesfera. El reactivo de detección se selecciona con base en el blanco deseado. El reactivo de detección es, por ejemplo, un polipéptido tal como un anticuerpo específico del blanco, o un fragmento del mismo. En el sentido que se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une específicamente ( inmunorreacciona con) a un antígeno. Estos anticuerpos incluyen los policlonales , monoclonales , quiméricos, de cadena simple, los fragmentos Fab, Fab, y F(ab,,2 y una genoteca de expresión de Fab . Los términos "se une específicamente" o "inmunorreacciona con" se refieren a que el anticuerpo reacciona con una o más determinantes antigénicas del antígeno deseado y no reacciona (es decir, se une) con otros polipéptidos o se une con mucha menor afinidad (Kd > 106) con otros polipéptidos. Los anticuerpos monoclonales ofrecen ventajas al llevar a la práctica los métodos de la presente invención. Por lo general, los anticuerpos monoclonales son más sensibles y específicos que los anticuerpos policlonales. Por otra parte, a diferencia de los anticuerpos policlonales que dependen de la longevidad del animal que produce el anticuerpo, el abasto de anticuerpos monoclonales es ilimitado. Sin embargo, los anticuerpos policlonales son útiles cuando es necesario usar anticuerpos con isotipos múltiples, ya que por lo general la mayoría de los anticuerpos monoclonales son de la subclase igGl . En el sentido que se utilizan en la presente, los términos "unión inmunológica " y "propiedades de unión inmunológica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo de las que se dan entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el cual la inmunoglobulina es específica. La potencia o afinidad de las interacciones de unión inmunológica se pueden expresar en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en donde una Kd pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de los polipéptidos seleccionados se cuantifican conforme a los métodos conocidos en la técnica. Uno de estos métodos consiste en medir las velocidades de formación y disociación del complejo antígeno- sitio de unión/antígeno , en donde estas velocidades dependen de las concentraciones de los componentes del complejo, la afinidad de interacción y los parámetros geométricos que influyen de forma equivalente en la velocidad en ambas direcciones. De este modo, tanto la "constante de velocidad on" (inicio o encendido) ( on) como la "constante de velocidad off" (suspensión o apagado) (koíf) se pueden determinar mediante el cálculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociación y disociación. (Véase Nature 361: 186-87 (1993)) . La relación kon/koff permite la cancelación de todos los parámetros que no tienen relación con la afinidad y es igual a la constante de disociación Kd . (Véase, en general, Davies, et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473) . La invención se ilustrará mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLO 1: Construcción de vectores de expresión El vector de expresión que contiene el ADNc del ligando-1 de glicoproteína de P- selectina/ IgG2b de ratón ( PSGL- l/mIgG2b) se modificó para generar un sitio de escisión de enterocinasa (EK) . Este sitio se puede usar para liberar en dirección descendente la parte de la IgG2b de ratón. El gen humano del grupo sanguíneo A fue un ADNc amplificado off por reacción en cadena de polimerasa (PCR), formado por ARN total aislado de la línea celular MKN-45 y el gen del grupo sanguíneo B fue un ADNc amplificado off por reacción en cadena de polimerasa (PCR) , formado por ARN total aislado de la línea celular HuTu80. Los vectores de expresión empleados para generar trans fectantes estables son bidireccionales , véanse las figuras esquemáticas. El vector de expresión PSGL- l/mlgG^ tiene el promotor EFla en dirección ascendente de un poliligando, un sitio donador y receptor de corte y empalme y la señal adicional bidireccional poli (A) de SV40. Opuesta en orientación a esta unidad de transcripción, usando las señales poli (A) de la dirección opuesta, está la segunda unidad de transcripción formada por el promotor HSV TK seguido de la secuencia codificante para puromicin acetiltransferasa (PAC) . Del mismo modo, el vector de expresión pi,GlcNAcT (enzima del núcleo 2) contiene el promotor EFlcx y la secuencia codificante para el gen de resistencia a la neomicina (Neo) . El vector de expresión FUT2 (Se-gen) contiene el mismo esqueleto del vector pero con el promotor CMV y el gen de resistencia a la neomicina. Los vectores de expresión GalNAcT (gen A) y GalT (gen B) contienen el promotor CMV y el gen de resistencia a la blasticidina (Bsd) , el FUTI (gen H) y el pi,GlcNAcT6 (enzima del núcleo 3) contienen el promotor CMV y el gen de resistencia a zeocina y el vector de expresión GalT5 contiene el promotor CMV y el gen de guanosina fosforribosil transferasa (GPT) . Las secuencias de ADN para los vectores de expresión se verificaron por secuenciación automatizada.

EJEMPLO 2: Determinación de la expresión de PSGL- l/mIgG2b mediante transferencia Western e inmunof luorescencia indirecta La expresión de PSGL- l/mIgG2b en sobrenadantes de cultivos celulares se determinó por medio de SDS-PAGE y transferencia Western. La muestras se corrieron en geles de gradiente 4 a 12% (Invitrogen) en amortiguador MES (Invitrogen) y las proteínas separadas se transfirieron por electroforesis a membranas de nitrocelulosa (Invitrogen) . Después de bloqueo durante 1 hora en albúmina sérica de bovino (BSA) al 3% en solución salina de fosfato (PBS) con Tween 20 al 0.2%, las membranas se hibridaron durante 1 hora con anticuerpo anti-IgGFc de ratón obtenido en cabra conjugado con peroxidasa (Sigma) diluido 1:4000 en amortiguador de bloqueo. Las membranas se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0.2% y los anticuerpos unidos se visualizaron por quimioluminiscencia utilizando el estuche ECL (American Biosciences) conforme a las instrucciones del fabricante. La localización celular del PSGL- l/mIgG2b se determinó por inmunof luorescencia indirecta. Se sembraron células CHO-K1 en cubreobjetos y se transfectaron transitoriamente en placas de seis pozos con el vector de expresión PSGL- l/mIgG,b usando Lipofectamina 2000 ( Invi trogen) , conforme a las instrucciones del fabricante.

Después de 48 horas las células de transfección se lavaron con PBS y se fijaron en acetona 30%/ eOH. Después de un bloqueo de 30 minutos en BSA 1% en PBS, se detectó la proteína PSGL- l/mIgG7b utilizando un anticuerpo anti-IgGFc de ratón obtenido en cabra conjugado con FITC (Sigma) diluido 1:200 en amortiguador de bloqueo. Los núcleos celulares se tiñeron con 4 , 6 -diamidino- 2 - fenilindol (DAPI) . Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos con un Medio de Montaje Vectashield (Vector Laboratories) . Los portaobjetos se observaron con un microscopio DMRXA (Leica Corp.) y la imagen se digitalizó con una cámara Hamamatsu C4880-40 CCD (Hamamatsu Photonics Norden AB) , el software Openlab ( Improvision) y el Adobe Photoshop (véase la figura) .

Ejemplo 3: Adaptación de células CH0-K1 a un medio libre de suero La linea celular CH0-K1 (ATCC CCL-61) se adaptó a un medio libre de suero Excell 302 (JHR Bioscience, Inc.), conforme a las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 4: Transfección de ADN y selección clonal Las células CHO-K1 adaptadas al medio libre de suero se sembraron en matraces de 75 cm^ y se transíectaron con el vector de expresión PSGL- l/mIgG2b y Lipofectamina 200 CD (Invitrogen) , una formulación que no es de origen animal, conforme a las instrucciones del fabricante. 48 horas después de la transfección, las células se incubaron en medio de selección que contenia puromicina (6 ng/mL) . El medio de selección se cambió cada tercer día. Después de 2 semanas aproximadamente, las células muertas se eliminaron con Dead Cell Removal MicroBeads (Miltenyi Biotech) , conforme a las instrucciones del fabricante. Las células vivas se clonaron de manera individual en placas de 96 pozos y se expandieron en un medio de selección durante aproximadamente 2 semanas. Los sobrenadantes del cultivo celular se recolectaron y la concentración de la expresión de hPSGL- l/mIgG2b se determinó mediante análisis con inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) , véase más adelante el protocolo, en el que se utiliza un anticuerpo obtenido en cabra anti-IgG Fe de ratón (Sigma) . Los clones celulares con la expresión de hPSGL- l/mIgG2b más alta se eligieron para la expansión.

EJEMPLO 5: Cuantificación de la concentración de PSGL-l/mIgG2b en sobrenadantes mediante ELISA Las células se sembraron en matraces de 25 cm2 (~ 1 x 106 células/mL) . Los sobrenadantes del cultivo celular se recolectaron después de 4 días. La concentración de PSGL-l/mlgGjb producido por los clones celulares se determinó mediante análisis con inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) . Placas ELISA de 96 pozos (Costar 3590, Corning) se recubrieron durante 2 horas con un anticuerpo obtenido en cabra anti-mlgG Fe (Sigma) purificado por afinidad a un concentración de 10 Las placas se bloquearon con BSA al 1% en PBS durante 2 horas. Los sobrenadantes que contenían PSGL- l/mIgG2b se diluyeron en serie en amortiguador de bloqueo y se incubaron durante 2 horas. Después de lavarlas, las placas se incubaron durante 2 horas con un anticuerpo obtenido en cabra anti-IgG Fe de ratón conjugado con peroxidasa (Sigma) diluido 1:4000 en amortiguador de bloqueo. El anticuerpo unido conjugado con peroxidasa se visualizó con diclorhidrato de 3, 3 ',5,5'-tetrametilbencidina (Sigma) . La reacción se detuvo con HjSO, 2M y las placas se volvieron a leer a 450 nm en un lector de placas automatizado (Bio-Tek Instruments) . La concentración de PSGL- l/mIgG2b se determinó utilizando como estándar una serie de diluciones de fragmentos mlgG Fe purificados (Sigma) . El clon celular de producción más alta (-25 pg/mL) se eligió para transíecciones posteriores, como se describe más adelante.

EJEMPLO 6: Generación de PSGL- l/mIgG2b sustituido con antígenos tipo 3 de grupo sanguíneo A/B La línea celular estable CHO-K1 con la expresión más alta de PSGL- 1/mIgG2b se transfectó con el vector de expresión FUT2 (gen Se) , tal como se describió anteriormente, y se seleccionó en un medio que contenía G418 (400 pg/mL) . El clon celular con el número relativo más alto de antígenos tipo 3 del grupo sanguíneo H en PSGL-l/mIgG2b se transfectará con los vectores de expresión GalNAcT (gen A) o GalT (gen B) y se seleccionará en un medio que contiene blasticidina para generar líneas celulares que producen antígenos tipo 3 del grupo sanguíneo A y grupo sanguíneo B, respectivamente, en PSGL- l/mIgGzb (véase el esquema de transíección) .

EJEMPLO 7: Generación de PSGL- l/mIgG2b sustituido con antígenos tipo 2 de grupo sanguíneo A/B La línea celular estable CH0-K1 con la expresión más alta de PSGL-l/mIgG2b se transfectó con los vectores de expresión ß? , 6GlcNAcTl (enzima del núcleo 2) y FUTI (gen H) , y se seleccionó en un medio que contenía G418 (400 pg/mL) . El clon celular con el número relativo más alto de antígenos tipo 2 del grupo sanguíneo H en PSGL- l/mIgG2b se transfectará con los vectores de expresión al, 3 GalNAcT (gen A) o al, 3 GalT (gen B) y se seleccionará en un medio que contiene blasticidina para generar líneas celulares que producen antígenos tipo 2 del grupo sanguíneo A y grupo sanguíneo B, respectivamente, en PSGL- l/mIgG2b (véase el esquema de transíección) .

EJEMPLO 8: Generación de PSGL- l/mIgG2b sustituido con antígenos tipo 1 de grupo sanguíneo A/B El clon celular con el número relativo más alto de antígenos tipo 3 del grupo sanguíneo H en PSGL- l/mIgG2b se transfecta con los vectores de expresión pi,6GlcNAcT (enzima del núcleo 3) y GalT5 , y se selecciona en un medio que contiene zeocina. El clon con el número relativo más alto de antígenos tipo 1 del grupo sanguíneo H en PSGL- l/mlgG^, se transfecta ya sea con el vector de expresión al , 3 GalNAcT (gen A) o al, 3 GalT (gen B) y se selecciona en un medio que contiene blasticidina para generar líneas celulares que producen antígenos tipo 1 del grupo sanguíneo A y grupo sanguíneo B, respectivamente, en PSGL- l/mIgG?b (véase el esquema de transíección) .

EJEMPLO 9: Purificación de hPSGL- l/EK/mIgG2b recom inante Los sobrenadantes del cultivo celular se depuraron eliminando los residuos por centrifugación y se pasaron por una columna que contenía agarosa con anticuerpo obtenido en cabra anti-IgG (molécula completa) de ratón (Sigma) . Después de lavar con PBS, el hPSGL- l/EK/mIgG2b que se unió se eluye con NaSCN 3M y se dializa con agua destilada. Para eliminar los contaminantes de bajo peso molecular, el hPSGL-l/EK/mIgG2b se somete a otra purificación por filtración en gel en una columna HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR (Amersham Bioscience) .

Unión covalente a Sepharose y empacado de la columna Las mucinas purificadas de los grupos sanguíneos A y B se unen por covalencia a las miniesferas de flujo rápido de Sepahrose por medio de técnicas estándar de bioconj ugación . Después de la unión, la Sepahrose se empaca en el recipiente plástico que constituye la columna real.

Prueba de eficacia de adsorción y_ biocompatibilidad de la columna prototipo Los títulos de anticuerpos anti-grupo sanguíneo ABO antes y después de la absorción de plasma sanguíneo combinado de grupo O, se determinan mediante las técnicas estándar utilizadas en los bancos de sangre, incluidas la hemoaglutinación y la prueba indirecta de anti-globulina . Las proteínas plasmáticas, que incluyen las inmunoglobulinas (IgG, IgM e IgA) , los factores/fragmentos del complemento (C3, C3a, C3d, C,, y sC5b-9) , complejos inmunes y factores de coagulación (FVIII, protrombina, fibrinógeno, productos de degradación de la fibrina) , se determinan conforme a las técnicas estándar. Las especificidades de anticuerpos ABO adsorbidos y eluidos y no adsorbidos se determinarán mediante la prueba ELISA usando mucinas recombinantes que contienen antígenos del grupo A/B en cadenas de sacárido núcleo definidas o mediante una prueba con base en cromatografía en capa fina, en la que se usan glicolípidos de grupos sanguíneos A y B, definidos .

EJEMPLO 10: Producción de esferas de diferentes tamaños y colores para la determinación de títulos de anticuerpos Se produjeron esferas de diferentes tamaños y colores (Micromod Partikeltechnologie GMBH en Rostock, Alemania) y se conjugaron con antígenos de grupo sanguíneo de diferentes tipos. Las esferas se analizaron por citometría de flujo y mostraron buena resolución considerando el tamaño y el color (véase la Figura 5) . Con este método es posible usar una mezcla de un gran número de esferas conjugadas en las que cada combinación de intensidad de color y tamaño representen un antígeno de grupo sanguíneo específico expresado en una estructura nuclear específica.

EJEMPLO 11: Detección de anticuerpos de grupo sanguíneo Las muestras de suero se diluyen 1.10 en PBS con 0.5% de albúmina humana y se mezclan con microesferas de látex (4.6 µs?; 18 en peso seco) que contienen oligosacáridos antigénicos de grupo sanguíneo. El suero y las microesferas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se lavan con HAS/PBS 0.5%. El anticuerpo anti-IgM humana marcada con FITC y la IgG marcada con PE se adicionan a las microesferas y se analizan por citometría de flujo.

REFERENCIAS 1) L Rydberg Transfus Med 2001; 11: 325- 342 2) KI elsh, ? van Dam, CG Koffman Transplant Proc 1987; 19:4565-4567 3) K Tanabe, K Takahashi , T Agishi, H Toma, K Ota Transfus Sci 1996; 17: 455-462 4) K Takahashi Acomodation in ABO - incompatible kidney transplantation: Elsevier, Amsterdam; 2004. 5) MD Stegall, PG Dean, JM Gloor Transplantation 2004; 78: 635-640 6) CJ Sonnenday, DS Warren, M Cooper, et al Am J Transplant 2004; 4: 1315-1322 7) G Tyden, G umlien, H Genberg, J Sandberg, T Lundgren, I Fehrman Am J Transplant 2005; 5: 145-148 8) DS Warren, AA Zachary, CJ Sonnenday, et al Am J Transplant 2004; 4: 561-568 9) H Clausen, S Hakomori Vox Sang 1989; 56: 1- 20 10) R Oriol, J Danilovs, HR Hawkins A J Hu Genet 1981; 33 11) F Yamamoto Immunohematol 2004; 20: 3-22 12) K Furukawa, MJ Mattes, KO Lloyd J Immunol 1995; 135: 4090-4094 13) M Mammen, S Choi, G Whitesides Angew Che Int Ed 1998; 37: 2754-2794 14) JC Lófling, e Hauzenberger , J Holgersson Glycobiology 2002; 12:173-182 ) J Liu, A Gustafsson, ME Breimer, A Kussak, J Holgersson Glycobiology 2005; 15:571-583 16) J Liu, A Weintraub, J Holgersson Xenotransplantation 2003; 10:149-163 17) J Liu, Y Qian, J Holgersson Transplantation 1997 ; 63 : 1673-1682 18) L Rydberg, A Bengtsson, O Samuelsson, K Nilsson, ME Breimer Transpl Int 2005; 17:666-672 19) G Tyden, G Kumlien, I Fehrman Transplantation 2003; 76: 730-1 20) G Tyden, G Kumlien, H Genberg, J Sandberg, T Lundgren, I Fehrman Am J Transplant. 2005; 5: 145-8 MODALIDADES ALTERNATIVAS DE LA INVENCIÓN Aun cuando la invención se haya descrito conjuntamente con la descripción detallada de la misma, ésta tiene como fin ilustrar y no limitar el alcance de la invención la cual se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones quedan comprendidas dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES : 1. Una composición que comprende al menos dos antígenos de grupo sanguíneo, en donde cada antígeno de grupo sanguíneo se expresa en diferentes tipos de cadenas sacáridas núcleo.
2. La composición según la reivindicación 1, en donde el antígeno de grupo sanguíneo es un antígeno A, un antígeno B o un antígeno H.
3. La composición según la reivindicación 1, en donde los antígenos de grupo sanguíneo están unidos a un soporte sólido. 4. La composición según la reivindicación 1, en donde el tipo de cadena sacárida núcleo es de tipo 1, tipo 2 , tipo 3 o tipo
4.
5. Un adsorbente que comprende la composición según la reivindicación 3.
6. Un método para determinar la presencia de anticuerpos reactivos del grupo sanguíneo en el suero de un individuo, el método consiste en: a) proporcionar una serie de microesferas de diferentes subtipos, en donde cada subtipo está recubierto con diferente antígeno de grupo sanguíneo; b) adicionar el suero de individuo a la serie de microesferas; c) incubar el suero y las microesferas durante un tiempo suficiente para que los anticuerpos anti-grupo sanguíneo del suero se unan a los antígenos del grupo sanguíneo ; d) incubar las microesferas con al menos un ligando marcado que tenga capacidad de unirse específicamente a los anticuerpos anti-grupo sanguíneo unidos a los antígenos de grupo sanguíneo; e) detectar la presencia de ligando marcado unido a los anticuerpos anti-grupo sanguíneo para determinar la presencia o ausencia de los anticuerpos reactivos .
7. El método según la reivindicación 6, en donde el antígeno de grupo sanguíneo es transportado por un diferente tipos de cadena sacárida núcleo.
8. El método según la reivindicación 7, en donde la detección se hace por citometría de flujo o luminex .
9. El método según la reivindicación 7, en donde la serie comprende 8 diferentes antígenos de grupo sanguíneo A/B.
10. El método según la reivindicación 7, en donde las microesferas son látex.
11. El método según la reivindicación 7, en donde las microesferas de al menos un subtipo de antígeno de grupo sanguíneo se distinguen de al menos otro subtipo de grupo sanguíneo se seleccionan en función de diámetros diferentes o colores diferentes.
12. El método según la reivindicación 7, en donde las microesferas de al menos un subtipo de antígeno de grupo sanguíneo se distinguen de al menos otro subtipo de grupo sanguíneo al marcarse con diferentes marcadores.
13. El método según la reivindicación 11, en donde los marcadores son marcadores fluorescentes.
14. El método según la reivindicación 7, en donde las microesferas tienen aproximadamente 5 pm de diámetro .
15. El método según la reivindicación 7, en donde el diámetro de las microesferas fluctúa entre aproximadamente 2 y 15 pm .
16. El método según la reivindicación 7, que también incluye la etapa de eliminar los componentes del suero que no se unen específicamente con los antígenos de grupo sanguíneo presentados en las microesferas antes de la etapa (d) .
17. El método según la reivindicación 7, que también incluye la etapa de eliminar el ligando marcado que no está unido a los anticuerpos anti-grupo sanguíneo antes de la etapa (e) .
18. El método según la reivindicación 7, en donde el ligando es un anticuerpo o un fragmento del mismo.
19. El método según la reivindicación 18, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo monovalente .
20. El método según la reivindicación 19, en donde el fragmento de anticuerpo monovalente es un fragmento Fab o Fa ' .
21. El método según la reivindicación 19, en donde el fragmento Fab o Fab' se selecciona a partir del grupo formado por un fragmento de anticuerpo anti-Fc, un fragmento de anticuerpo de cadena ligera anti-kappa, un fragmento de anticuerpo de cadena ligera anti-lambda y un fragmento de anticuerpo de cadena simple.
22. La composición según la reivindicación 7, en donde el tipo de cadena es un precursor tipo 1, tipo 2 o tipo 3.
23. Una serie de microesferas de diferentes subtipos, en donde cada subtipo está recubierto con diferente antígeno de grupo sanguíneo.
24. La serie según la reivindicación 23, en donde el antígeno de grupo sanguíneo es transportado por diferente tipo de cadena sacárida núcleo.
25. La serie según la reivindicación 23, en donde los antígenos de grupo sanguíneo se expresan en una mucina recombinante .
26. La serie según la reivindicación 25, en donde la expresión del antígeno de grupo sanguíneo es multivalente .
27. La composición según la reivindicación 24, en donde el tipo de cadena sacárida núcleo es un precursor tipo 1, tipo 2, tipo 3 o tipo 4.
28. Un método para eliminar los anticuerpos reactivos del grupo sanguíneo presentes en el suero, el método consiste en: a) proporcionar una serie de microesferas de diferentes subtipos, en donde cada subtipo está recubierto con un diferente antígeno de grupo sanguíneo; b) poner en contacto el suero con la serie de microesferas ; c) incubar el suero y las microesferas durante un tiempo suficiente para que los anticuerpos anti-grupo sanguíneo presentes en el suero se unan a los antígenos de grupo sanguíneo; d) separar las microesferas del suero eliminando así los anticuerpos reactivos del suero .
29. El método según la reivindicación 28, en donde el antígeno de grupo sanguíneo se expresa en diferentes tipos de cadena de sacáridos de núcleo.
30. El método según la reivindicación 29, en donde el tipo de cadena sacárida núcleo es el tipo 1, tipo 2 , tipo 3 o tipo 4.
31. El método según la reivindicación 28, en donde el antígeno de grupo sanguíneo se expresa en una mucina recombinante .
32. El método según la reivindicación 28, en donde la expresión del antígeno de grupo sanguíneo es multivalente .