MX2008010632A - Secuencias reguladoras quimericas que comprenden intrones de dicotiledoneas para la expresion de genes de plantas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para usar un intrón dicotiledóneo o elementos del mismo para incrementar la expresión de transgenes en plantas;la presente invención también proporciona construcciones, plantas transgénicas y semillas que contienen los polinucléotidosútiles para la expresión de transgenes en plantas.

Description

SECUENCIAS REGULADORAS QUIMERICAS QUE COMPRENDEN INTRONES DE DICOTILEDONEAS PARA LA EXPRESION DE GENES DE PLANTAS REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de E.U.A. No. de Serie 60/774,700, presentada en Febrero 17, 2006.

CAMPO TECNICO La invención se refiere al campo de la biología molecular de plantas y de la ingeniería genética de plantas y moléculas de polinucleótidos útiles para el control de la expresión de genes en plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La ingeniería genética de las plantas ha revolucionado la agricultura y la manera en que se usan los sistemas biológicos para generar productos para nuestro uso. A través de la transformación y la subsiguiente regeneración de plantas transgénicas, se ha introducido una serie de características o atributos agronómicamente importantes en cultivos domesticados. Estas características o atributos incluyen resistencia a insectos, enfermedades fúngicas, y otras pestes y agentes causantes de enfermedades, tolerancia a herbicidas, estabilidad o vida de almacenamiento incrementada, rendimiento incrementado, tolerancias al medio ambiente, y mejoras nutricionales. El éxito de la ingeniería genética de las plantas depende de la manipulación de la expresión de los genes en las plantas. En un acercamiento, la expresión de un gen nuevo que normalmente no se expresa en una planta o tejido de planta particular puede conferir un efecto fenotípico deseado. En otro acercamiento, la transcripción de un gen o parte de un gen en una orientación antisentido puede producir un atributo deseable al evitar o inhibir la expresión de un gen endógeno. Los elementos genéticos recientemente introducidos se refieren colectivamente como transgenes. Un transgen crítico comprende, del extremo de la región 5' al de la región 3', una secuencia reguladora, una región codificadora total o parcial en la orientación de sentido o antisentido, y a menudo una región de terminación. Muchas variables afectan el patrón de expresión final de los transgenes, incluyendo, por ejemplo, el sitio de inserción del transgen en el genoma de la planta, la fuerza y especificidad de la secuencia reguladora, el uso del codón preferido en la especie de la planta objetivo, y la presencia de sitios de empalme crípticos o sitios poli A crípticos. No obstante, se puede lograr un patrón de expresión reproducíble de los transgenes usando tecnologías descritas en la presente y en otros lados. El patrón de expresión de un transgen se refiere al mismo siendo transcribible eficientemente en el momento preciso durante el crecimiento y desarrollo de la planta (patrón de expresión temporal), en la ubicación óptima en la planta (patrón de expresión espacial), y en la cantidad necesaria para producir el efecto deseado. Por ejemplo, la expresión constitutiva de un producto de un gen puede ser benéfica en una ubicación de la planta pero menos benéfica en otra parte de la planta. En otros casos, puede ser benéfico tener un producto de genes producidos en una cierta etapa del desarrollo de la planta o en respuesta a ciertos estímulos ambientales o químicos. El desarrollo comercial del germoplasma mejorado genéticamente también ha avanzado a la etapa de introducir múltiples atributos dentro de los cultivos de las plantas, a menudo referidos como acercamiento de superposición de genes. En este acercamiento, pueden introducirse múltiples genes que confieren diferentes características de interés dentro de una planta. Es importante cuando se introducen múltiples genes dentro de una planta que cada gen sea modulado o controlado para la expresión deseada y que los elementos reguladores sean diversos para reducir el potencial de inactivación del gen. A la luz de estas y otras consideraciones, es aparente que el control óptimo de la expresión de los genes y la diversidad en los elementos reguladores son importantes en la biotecnología de las plantas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la modulación de la expresión de genes de plantas con una secuencia reguladora quimérica que comprende un promotor y un intrón dicotiledóneo seleccionado o motivo de secuencia de un intrón dicotiledóneo que incrementa y/o expande el patrón de expresión de un transgen cuando se compara con aquel que se logra por el promotor sólo. De conformidad, una modalidad de la invención es proporcionar un método para incrementar la expresión de transgenes en una planta dicotiledónea usando una secuencia reguladora de ADN quimérica que comprende un intrón derivado de una especie dicotiledónea y un promotor monocotiledóneo. La secuencia reguladora quimérica se fusiona a un gen estructural dentro de una construcción de expresión de ADN de planta para modular la expresión del gen estructural en una célula de planta. Cuando se compara con un transgen correspondiente que comprende al promotor monocotiledóneo pero que carece del intrón dicotiledóneo, el transgen que comprende la secuencia reguladora quimérica exhibe un patrón de expresión incrementado y ampliado. Otra modalidad de la invención es proporcionar un método para incrementar la expresión de un transgen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de tolerancia a glifosato. Cuando la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de tolerancia a glifosato está ligada operativamente a una secuencia reguladora quimérica de acuerdo con la invención, la expresión del transgen puede proporcionar tanto tolerancia de tejido vegetativo como de reproductivo en las plantas transgénicas. De acuerdo con otra modalidad, se proporcionan secuencias reguladoras de ADN quiméricas que comprenden un promotor monocotiledóneo y un intrón dicotiledóneo. También se proporcionan transgenes que comprenden dichas secuencias reguladoras quiméricas. De acuerdo con una modalidad específica, el transgen es uno que comprende la secuencia reguladora quimérica y una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína de tolerancia a glifosato. De acuerdo con aún otra modalidad, se proporciona un método para identificar los elementos reguladores novedosos para incrementar la expresión de transgenes que comprende las etapas de probar la eficacia de una pluralidad de intrones dicotiledóneos en ampliar el patrón de expresión espacial del transgen, e identificar un motivo único en los intrones dicotiledóneos que confieren dicho defecto amplificador. También se proporciona un método para regular la expresión de genes en plantas que comprende las etapas de construir un mejorador de recombinación que contiene al motivo único y ligado operativamente al mejorador de recombinación con un promotor en un transgen para habilitar un patrón de expresión espacial ampliado del transgen. El mejorador de recombinación puede colocarse dentro de un promotor heterólogo o secuencia en dirección 5' o secuencia en dirección 3' del promotor, y en una dirección hacia adelante o inversa. De acuerdo con aún otra modalidad de la invención, se proporciona un mejorador de recombinación que comprende por lo menos una copia de un motivo identificado (SEQ ID NO: 17), dicho mejorador es capaz de incrementar la expresión de genes en el tejido reproductor masculino de las plantas. También se proporcionan los mejoradores de recombinación que contienen dos, tres, o cuatro copias del motivo único. De acuerdo con otra modalidad de la invención, se proporciona un mejorador de recombinación que comprende SEQ ID NO: 17 y por lo menos otros dos motivos seleccionados del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 18, 19, y 20. De acuerdo con otra modalidad de la invención, se proporcionan construcciones de ADN que comprenden los mejoradores de recombinación descritos antes. Dichas construcciones de ADN pueden ser útiles en la expresión de genes de interés en plantas, incluyendo, pero no limitados a, genes que confieren tolerancia herbicida, control de insectos, resistencia a enfermedades, estabilidad o vida de almacén incrementada, mayor rendimiento, mejoramiento nutricional, expresión de productos farmacéuticos u otros productos de polipéptidos deseados, o un cambio deseable en la fisiología o morfología de la planta, y así sucesivamente.

En otras modalidades de la invención, se proporcionan plantas transgénicas que se transforman con una construcción de ADN que comprende un mejorador de recombinación.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La FIG. 1 es un diagrama de aparición de motivo en intrones At-iEF1a (1 ), At-iANT1 (2), y At-iAct7 (3). Cada recuadro sombreado con la indicación representa un motivo. Los números de base de la secuencia del intrón se indican al fondo de la gráfica. La FIG. 2 es una representación esquemática de la modificación del intrón At-iEF1a. A es el intrón nativo con una copia del motivo SEQ ID NO: 17 (indicada por un recuadro negro con una flecha que muestra la dirección de la secuencia del motivo); B es un At-iEF1a modificado con una copia extra del motivo insertado aproximadamente 100 bp en dirección 3' del motivo original; C es un At-iEF1a modificado con dos motivos extras insertados aproximadamente 100 bp y 200 bp respectivamente, en dirección 3' del motivo original, en donde todos los motivos están en la dirección 5'; D es un At-iEF1a modificado con dos motivos extra insertados aprox. 100 bp y 200 bp, respectivamente, en dirección 3' del motivo original, en donde un motivo insertado está en la dirección inversa.

BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 es un cebador de PCR hacia adelante usado para el aislamiento del promotor TPI del arroz. SEQ ID NO: 2 es un cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor TPI del arroz. SEQ ID NO: 3 es otro cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor TPI del arroz. SEQ ID NO: 4 es otro cebador de PCR hacia adelante usado para el aislamiento del promotor TPI del arroz. SEQ ID NO: 5 es un cebador de PCR hacia adelante usado para el aislamiento del intrón At-iEFi . SEQ ID NO: 6 es un cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del intrón At-iEF1 ß. SEQ ID NO: 7 es un cebador de PCR hacia adelante usado para el aislamiento del intrón At-iANT1 . SEQ ID NO: 8 es un cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del intrón At-iANT1. SEQ ID NO: 9 es un cebador de PCR hacia adelante usado para el aislamiento del intrón At-iEF1a. SEQ ID NO: 10 es un cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del intrón At-iEF1 a.

SEQ ID NO: 11 es un cebador de PCR hacia adelante usado para el aislamiento del intrón Nt-ielF4A10. SEQ ID NO: 12 es un cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del intrón Nt-ielF4A10. SEQ ID NO: 13 es un cebador de PCR hacia adelante usado para el aislamiento del intrón At-iAct7. SEQ ID NO: 14 es un cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del intrón At-iAct7. SEQ ID NO: 15 es un cebador de PCR hacia adelante usado para el aislamiento del intrón At-iASP. SEQ ID NO: 16 es un cebador de PCR hacia adelante usado para el aislamiento del intrón At-iASP. SEQ ID NO: 17 es la secuencia de ácido nucleico de un motivo identificado de los intrones dicotiledóneos capaces de incrementar la expresión de los transgenes del tejido reproductivo masculino. SEQ ID NO: 18 es la secuencia de ácido nucleico de un motivo Fac109. SEQ ID NO: 19 es la secuencia de ácido nucleico de un motivo Fac029. SEQ ID NO: 20 es la secuencia de ácido nucleico de un motivo PH02. SEQ ID NO: 21 es la secuencia de ácido nucleico de la secuencia reguladora quimérica Os-pTPI-L::At-iEF1a.

SEQ ID NO: 22 es la secuencia de ácido nucleico de la secuencia reguladora quimérica Os-pTPI-L::At-iEF1a. SEQ ID NO: 23 es la secuencia de ácido nucleico de la secuencia reguladora quimérica FMV::At-iEF1a. SEQ ID NO: 24 es la secuencia de ácido nucleico de la secuencia reguladora quimérica FMV::At-iEF1 . SEQ ID NO: 25 es la secuencia de ácido nucleico la secuencia reguladora quimérica FMV::Nt-ielF4A10. SEQ ID NO: 26 es la secuencia de ácido nucleico de la secuencia reguladora quimérica FMV::At-iASP. SEQ ID NO: 27 es la secuencia de ácido nucleico de la secuencia reguladora quimérica FMV::At-iANT1. SEQ ID NO: 28 es la secuencia de ácido nucleico de la secuencia reguladora quimérica FMV::At-iAct7.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La siguiente descripción detallada se proporciona para definir de mejor manera la presente invención y para guiar a aquellos de experiencia ordinaria en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos de que se indique lo contrario, los términos deberán entenderse de acuerdo con el uso convencional por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica relevante.

La invención descrita en la presente proporciona métodos y composiciones para regular la expresión de transgenes en plantas. Específicamente, pueden usarse intrones aislados de una especie dicotiledónea (también referida en lo siguiente como intrón dicotiledóneo) para incrementar la expresión de transgenes en una planta dicotiledónea. Se proporciona una secuencia reguladora de ADN quimérica que comprende un intrón dicotiledóneo y un promotor monocotiledóneo. También se proporcionan métodos para usar dichas secuencias reguladoras para incrementar la expresión transgénica. La presente invención también se refiere a un método para identificar motivos únicos de una clase de intrones que tiene un efecto ampliador similar en el patrón de expresión espacial de un transgen. Se proporciona un mejorador de recombinación que comprende dicho motivo único identificado (SEQ ID NO: 17), el cual puede usarse en una construcción de ADN recombinante para habilitar una expresión de transgenes en el tejido reproductivo masculino de plantas. El diseño, construcción, y uso de mejoradores de recombinación que comprenden elementos de intrones dicotiledóneos son objetos de esta invención. Los intrones son secuencias que intervienen presentes en el ARNpre-m pero ausentes en el ARN maduro que sigue la excisión por un mecanismo de empalme preciso. La habilidad de los intrones naturales para incrementar la expresión de los genes se conoce en diversos organismos, incluyendo mamíferos (Buchman y Berg (1988) Mol Cell Bio 8: 4395-4405; Chung y Perry (1989) Mol Cell Biol 9: 2075-2082), insectos (Meredith y Storti (1993) Dev Biol 159: 500-512), nematodos (Okkema et al. (1993) Genetics 135: 385-404) y plantas (Callis et al. (1987) Genes Dev 1 : 1 183-1200; Luehrsen y Walbot (1991 ) Mol Gen Genet 225: 81-93; Rose y Last (1997) Plant J 1 1 : 455-464; Wang et al. (2004) Plant Cell 16: 2323-2334). No obstante, el mecanismo de dicho incremento mediado por el intrón (IME- por sus siglas en inglés), no se entiende bien. Se ha acumulado evidencia que sugiere que después de las transcripciones, los ¡ntrones monocotiledóneos pueden incrementar el nivel de ARNm al incrementar la maduración y estabilidad de las transcripciones nacientes (Callis et al. (1987) Genes Dev 1 : 1183-1200; Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol Biol 15: 913-920; Clancy et al. (1994) Plant Sci 98: 151-161). En este aspecto, el efecto mejorador de los intrones monocotiledóneos es diferente de los mejoradores de transcripción, que es independiente de la posición y orientación (Callis et al. (1987) Genes Dev 1 : 1 183-1200; Snowden et al. (1996) Plant Mol Biol 31 : 689-692). El IME por los intrones dicotiledóneos puede efectuarse a través de un mecanismo diferente de aquél de los intrones monocotiledóneos. Por ejemplo, se ha demostrado que algunos intrones dicotiledóneos se comportan de manera similar a los mejoradores de transcripción (Vítale et al. (2003) Plant Mol Biol 52: 1 135- 151 ; Wang et al. (2004) Plant Cell 16: 2323-2334). Un mejorador de transcripción, como se usa en la presente, significa un elemento regulador de transcripción que actúa en c/s, lo que confiere a un organismo un aspecto del control total de la expresión del gen. Un mejorador puede funcionar para enlazar factores de transcripción, factores de proteína que actúa en trans que regula la transcripción. Los mejoradores de transcripción pueden incorporarse en una región promotora y pueden identificarse por un número de técnicas, incluyendo análisis de deleción, es decir eliminar uno o más nucleótidos del extremo de la región 5' del interno a un promotor; análisis de proteina que se enlaza a ADN usando impresiones de DNasa I, interferencia de metilación, impresiones genómicas in vivo por PCR mediado por ligadura, y otros ensayos convencionales; o por análisis de similitud de la secuencia de ADN con elementos que actúan en cis conocidos por métodos de comparación de la secuencia de ADN convencionales. Una vez identificado, puede colocarse un mejorador en dirección 5' o en dirección 3' de una secuencia promotora heteróloga para incrementar la expresión de los genes, independientemente de la orientación del mejorador. Una secuencia heteróloga es una secuencia que se origina de una fuente o especies extrañas o, si son de la misma fuente, se modifica de su forma original. Un promotor es una molécula de polinucleótido que está involucrada en el reconocimiento y enlace de la polimerasa II del ARN y otras proteínas (factores de transcripción que actúan en trans) para iniciar la transcripción. Un promotor de planta es un promotor nativo o no nativo que es funcional en las células de las plantas. Un promotor de planta puede usarse como una secuencia reguladora de la región 5' para modular la expresión de un gen o genes ligados operativamente. El efecto de los promotores de plantas en los genes que controlan puede describirse por sus patrones de expresión temporal, espacial o de desarrollo.

Muchos promotores monocotiledóneos utilizados comúnmente retienen el primer intrón para una actividad promotora máxima. Estos incluyen, por ejemplo, deshidrogenase I de alcohol de maíz (Adh1) (Dennis et al. (1984) Nucleic Acid Res 12: 3983-4000; Callis et al. (1987) Genes Dev 1 : 1 183-1200), poliubiquitina 1 de maiz (ubil) (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18: 675-689; Christensen y Quail (1996) Transgenic Res 5: 213-218), shrunken-1 de maíz (Mass et al. (1991 ) Plant Mol Biol 16: 199-207) y actina de arroz (McEIroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171). Se considera que la función de los intrones para incrementar la expresión de genes en las monocotiledónas facilita el empalme de intrones en los ARN nacientes. Esta teoría se apoya en los siguientes ejemplos. Grandes deleciones internas del primer intrón del gen Adh1 del maíz que reduce fuertemente el empalme también deterioró el efecto mejorador de la expresión de este intrón (Luehrsen y Walbot (1994) Plant Mol Biol 24: 449-463). De manera similar, cuando el intrón Hsp82 del maíz se volvió no empalmable por un punto de mutación en un sitio de empalme de la región 5' o la región 3', también se perdió la habilidad de ese intrón para incrementar la expresión (Siníbaldi y Mettler (1992) In WE Cohn, K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acid Research y Molecular Biology, Vol 42. Academic Press, Nueva York, pp 229-257). Recientemente, los promotores derivados de algunas especies dicotiledóneas también han reportado requerir la retención del primer intrón para una expresión de genes específica de tejido incrementada (Vítale et al. (2003) Plant Mol Biol 52: 135-1 151 ; Wang et al. (2004) Plant Cell 16: 2323-2334; Pat. de E.U.A. No. 6,660,91 1). Ejemplos de intrones dicotiledóneos que incrementan la actividad específica del tejido de su promotor nativo incluyen el primer intrón del algodón GLABARA 1 (GL1) el cual es necesario para la expresión del GL1 en células tricomas (Wang et al. (2004) Plant Cell 1 6: 232-2334), el intrón L de actin 1 de Arabidopsis el cual se requiere para la expresión del polen (Vítale et al. (2003) Plant Mol Biol 52: 1135-1 151 ), y el primer intrón EF1c¡ de Arabidopsis que es necesario para la expresión del tejido reproductivo masculino (Pat. de E.U.A. No. 6,660,91 1 ). La función de los intrones en el incremento de la expresión de genes en plantas dicotiledóneas puede ser diferente de aquel en las plantas monocotiledóneas. En las plantas dicotiledóneas, el empalme del intrón puede no ser necesario para incrementar la expresión de los genes debido a que un intrón dicotiledóneo se puede colocar en cualquiera de la orientación inversa o hacia adelante en la dirección 5' del promotor nativo mientras que retiene el efecto mejorador. El intrón L de actin 1 de Arabidopsis ejemplifica dicho mejorador (Vítale et al. (2003) Plant Mol Biol 52: 1 135-1 151 ). También se ha observado el fenómeno de IME en ciertas situaciones en donde se fusiona un promotor con un intrón heterólogo para impulsar la expresión de un transgen. En las plantas monocotiledóneas, por ejemplo, la inclusión del intrón Adh1 del maíz al promotor HvPht1 ;1 o HvPht1 ;2 de la cebada incrementó la expresión de los genes aproximadamente 20 veces, pero no pareció afectar la especificidad del tejido de la expresión (Schunmann et al. (2004) J Exp Bot 55: 855-865). La expresión transgénica en arroz también se incrementó usando una secuencia reguladora quimérica que comprende al intrón actin 1 del arroz y al promotor pin 2 de la papa (Xu et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 573-5880). En plantas dicotiledóneas, se incrementa la expresión de transgenes, por ejemplo, por una secuencia reguladora quimérica que comprende el primer intrón de EF1a de Arabidopsis y al promotor del virus del mosaico de la hierba de lamparones (FMV- Por sus siglas en inglés) (Pat. de E.U.A. No. 6,660,91 1 ). No obstante, no ha existido un reporte a la fecha acerca de la composición y uso de una secuencia reguladora quimérica que comprende un promotor monocotiledóneo y un intrón dicotiledóneo para incrementar la expresión de transgenes en una planta dicotiledónea. De acuerdo con una modalidad de la invención, se proporciona una secuencia reguladora quimérica que comprende un intrón y un promotor monocotiledóneo. Dicha secuencia reguladora quimérica se usa para impulsar la expresión de transgenes en una planta dicotiledónea en donde se obtiene un nivel incrementado de la expresión de los transgenes. La secuencia reguladora quimérica también habilita la expresión de los transgenes en un tejido en donde hay poca o ninguna expresión del transgén que carece del intrón dicotiledóneo. La secuencia reguladora quimérica proporcionada en la presente se puede usar para modular la expresión de un gen o genes ligados operativamente de interés. Como se usa en la presente, el término "ligado operativamente" o "fusionado" se refiere a una primera molécula de polinucleótido conectada con una segunda molécula de polinucleótido, donde las moléculas de polinucleótido están dispuestas de manera que la primera molécula de polinucleótido afecta una función deseada de la segunda molécula de polinucleótido. El término "quimérica", como se usa en la presente, se refiere a un producto de la fusión de porciones de dos o más diferentes moléculas de polinucleótidos. Como se usa en la presente, el término "secuencia reguladora quimérica" se refiere a una secuencia capaz de modular la expresión de genes en plantas, el cual se produce a través de la manipulación de promotores conocidos u otras moléculas de polinucleótidos tales como un intrón. Entonces, el diseño, construcción, y uso de secuencias reguladoras quiméricas de acuerdo con los métodos descritos en la presente para modular la expresión de secuencias de polinucleótidos ligadas operativamente están comprendidos por la presente invención. Se pueden identificar los motivos de la secuencia de ADN a partir de secuencias de intrón dicotiledóneo y éstos motivos a menudo ejercen funciones significativas en el incremento de la expresión de genes. Por ejemplo, al buscar una base de datos de elementos de ADN reguladores que actúan en cis de plantas (PLACE- por sus siglas en inglés), un motivo enlazante de MYB (por sus siglas en inglés) se identifica de los primeros intrones del algodón GaMYB2, GLABARA , y WEREWOLF, que son reguladores del desarrollo de la tricoma (fibra de algodón). La mutagénesis de este motivo debilita en gran medida a la expresión tricoma del gen afectado y se inhibe la formación de tricoma (Wang et al. (2004) Plant Cell 16: 232-2334). También pueden emplearse otros métodos para identificar los motivos de secuencia importantes para la función del intrón dicotiledóneo para incrementar la expresión de genes, por ejemplo, análisis delecional y un programa de matriz de puntuación dependiente de la posición para búsqueda de motivo. Entonces, de acuerdo con una modalidad de la invención, se proporciona un método para identificar elementos reguladores novedosos a partir de ¡ntrones dicotiledóneos en donde una pluralidad de secuencias quiméricas que comprende intrones dicotiledóneos se prueban en su eficacia de ampliar el patrón de expresión de transgenes en una planta dicotiledónea y se identifica un motivo único a partir de intrones dicotiledóneos capaces de conferir dicho efecto amplificador en el patrón de expresión de transgenes. Se emplea un acercamiento de novo para un motivo previamente desconocido que existe en las secuencias de intrón dicotiledóneo eficaces pero no en las secuencias ineficaces. Cualquier programa diseñado para la búsqueda de motivo puede ser de utilidad en la presente invención. Pueden usarse programas de análisis de secuencias diseñados para la búsqueda de motivo para la identificación de elementos cis. Los programas de cómputo preferidos pueden incluir pero no se limitan a MEME, SIGNAL, SCAN y GENESCAN. MEME es un programa que identifica motivos conservados (cualquiera de ácido nucleico o péptido) en un grupo de secuencias desalineadas. MEME guarda estos motivos como un conjunto de perfiles. Estos perfiles pueden entonces usarse para buscar una base de datos de secuencias objeto. Puede encontrarse un algoritmo MEME (versión 2.2) en la versión 10.0 del paquete GCG (Bailey y Elkan, Machine Learning, 21 (1-2):51 -80,1995). Puede usarse un motivo así identificado y mostrado como importante en la ampliación de patrones de expresión de transgenes para construir mejoradores de transcripción novedosos, altamente eficientes, capaces de impulsar o incrementar la expresión de transgenes en tejidos de plantas. Estos mejoradores, referidos en lo siguiente como mejoradores de recombinación, abarcan moléculas de polinucleótidos recombinantes que comprenden al motivo identificado o ventajosamente menos que la secuencia de longitud completa del intrón dicotiledóneo a partir del cual se identifica el motivo. Un ácido nucleico (recombinante) se forma por una combinación hábil de dos o más segmentos en contrario separados de secuencias de ácido nucleico que existen naturalmente, por ejemplo, mediante síntesis química de una molécula diseñada o por la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos por técnicas de ingeniería genética. Otro acercamiento para identificar motivos importantes para la ampliación del patrón de expresión de transgenes en una planta dicotiledónea es buscar secuencias de intrón dicotiledóneo eficaces para motivos enlazantes del factor de transcripción conocidos que están ausentes en secuencias de intrón dicotiledóneo ineficaces. Puede usarse cualquier paquete de software de búsqueda de motivo, por ejemplo, PromoterScan para buscar una secuencia de ADN de entrada dada para motivos enlazantes del factor de transcripción conocidos. Los motivos así identificados pueden usarse para construir mejoradores de recombinación u otros elementos reguladores quiméricos. Puede usarse cualquier número de métodos bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica para aislar al intrón o fragmentos de un intrón que se va a usar como se describe en la presente. Por ejemplo, puede usarse reacción en cadena de polimerasa (PCR- por sus siglas en inglés) para amplificar la secuencia del intrón usando cebadores diseñados con base en información de secuencias disponible públicamente. Los fragmentos de ácidos nucleicos también pueden obtenerse por otras técnicas tales como por síntesis directa de fragmentos por medios químicos, como se practica comúnmente usando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado. Aquellos expertos en la técnica están familiarizados con los materiales de recursos estándar que describen condiciones y procedimientos específicos para la construcción, manipulación, y aislamiento de macromoléculas (por ejemplo moléculas de polinucleótidos, plásmidos), así como la generación de organismos recombinantes y la selección y aislamiento de moléculas de polinucleótidos. El número de copias y separación de un motivo de intrón identificado en un mejorador de recombinación puede manipularse para alcanzar los niveles deseados de expresión en los tejidos de plantas. Deberá apreciarse que el motivo de intrón identificado puede orientarse en un mejorador de recombinación en cualquiera de la dirección hacia adelante o inversa. Cuando sea deseable, puede usarse una copia del motivo identificado para recombinarse con otro segmento de secuencia de polinucleótidos para formar un mejorador novedoso. Alternativamente, pueden usarse dos o más copias del mismo motivo en un mejorador de recombinación para tener una actividad incrementada de mejoramiento transcripcional. Por ejemplo, pueden colocarse dos, tres, cuatro o cinco copias de un motivo identificado en tándem en un mejorador de recombinación. La distancia entre dos motivos adyacentes puede ser 0, 10, 50, 100, 200, 300, 500, y 1000 bases. De manera óptima, la distancia entre dos motivos adyacentes está entre 10 a 250 bases. Un mejorador de recombinación así construido puede usarse en una construcción de ADN recombinante para impulsar la expresión de transgenes. Como se usa en la presente, el término "construcción de ADN recombinante", "construcción recombinante" o "construcción de expresión" se refiere a cualquier molécula de polinucleótido recombinante tal como un plásmido, cósmido, virus, molécula de polinucleótido replicante autónomamente, fago, o molécula de polinucleótido de ADN o ARN de hebra sencilla o de hebra doble lineal o circular, derivada de cualquier fuente, capaz de integración genómica o replicación autónoma, que comprende una molécula de polinucleótido en donde una o más moléculas de polinucleótido se han ligado de una manera funcionalmente operativa. Se conocen métodos para introducir construcciones dentro de una célula de tal manera que una molécula de polinucleótido transcribible se transcribe en una molécula de ARNm funcional que se traslada y por lo tanto se expresa como un producto de proteína. Las construcciones también pueden formarse para ser capaces de expresar sus moléculas de ARN antisentido, para inhibir la traslación de una molécula de ARN específica de interés. Para la práctica de la presente invención, las composiciones y métodos convencionales para la preparación y uso de construcciones y células hospederas son bien conocidos para un experto en la técnica, ver por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edición Volúmenes 1 , 2, y 3. J.F. Sambrook, D.W. Russell, y N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000. En una modalidad de la invención, el mejorador de recombinación o secuencia reguladora quimérica de la presente invención se liga operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible que es un gen de interés agronómico. Como se usa en la presente, el término "gen de interés agronómico" se refiere a una molécula de polinucleótido transcribible pero no se limita a un gen que proporciona una característica deseable asociada con la morfología, fisiología, crecimiento y desarrollo, producción, mejoramiento nutricional, enfermedad o resistencia a la peste, o tolerancia al medio ambiente o a productos químicos, de las plantas. La expresión de un gen de interés agronómico es deseable para conferir un atributo agronómicamente importante. Por ejemplo, la resistencia al glifosato puede conferirse por genes que incluyen, pero no se limitan, al gen EPSPS resistente al glifosato de la cepa Agrobacterium CP4 (aroA:CP4), glifosato oxidoreductasa, y glifosato acetiltransferasa. Otros atributos agronómicos deseables conferidos por un transgen incluyen, pero no se limitan a, rendimiento incrementado (Patente de E.U.A. No. 5,716,837), control de insectos (Patente de E.U.A. No. 6,063,597; Patente de E.U.A. No. 6,063,756; Patente de E.U.A. No. 6,093,695; Patente de E.U.A. No. 5,942,664; y Patente de E.U.A. No. 6, 110,464), resistencia a enfermedades fúngicas (Patente de E.U.A. No. 5,516,671 ; Patente de E.U.A. No. 5,773,696; Patente de E.U.A.

No. 6,121 ,436; Patente de E.U.A. No.6,316,407, y Patente de E.U .A. No. 6,506,962), resistencia a virus (Patente de E.U.A. No. 5,304,730 y Patente de E.U.A. No. 6,013,864), resistencia a nematodos (Patente de E.U.A. No. 6,228,992), resistencia a enfermedades bacterianas (Patente de E.U.A. No. 5,516,671 ), producción de almidón (Patente de E.U.A. No. 5,750,876 y Patente No. 6,476,295), producción de aceites modificados (Patente de E.U.A.

No. 6,444,876), producción de aceites superiores (Patente de E.U.A. No. ,608,149 y Patente de E.U.A. No. 6,476,295), contenido de ácidos grasos modificados (Patente de E.U.A. No. 6,537,750), alta producción de proteínas (Patente de E.U.A. No. 6,380,466), maduración de frutas (Patente de E.U.A.

No. 5,512,466), nutrición animal y humana mejorada (Patente de E.U.A. No. ,985,605 y Patente de E.U.A. No. 6,171 ,640), biopolímeros (Patente de E.U.A. No. 5,958,745 y Publicación de Patente de E.U.A. No.

US20030028917), Resistencia a la tensión del medio ambiente (Patente de E.U.A. No. 6,072,103), péptidos farmacéuticos (Patente de E.U.A. No. 6,080,560), atributos de procesamiento mejorados (Patente de E.U.A. No. 6,476,295), digestibilidad mejorada (Patente de E.U.A. No. 6,531 ,648) rafinosa baja (Patente de E.U.A. No. 6,166,292), producción industrial de enzimas (Patente de E.U.A. No. 5,543,576), sabor mejorado (Patente de E.U .A. No. 6,011 , 199), fijación de nitrógeno (Patente de E.U.A. No. 5,229, 1 14), producción de semillas híbridas (Patente de E.U.A. No. 5,689,041), y producción de biocombustible (Patente de E.U.A. No. 5,998,700). Los elementos genéticos, métodos, y transgenes descritos en las patentes listadas antes se incorporan en la presente para referencia. Alternativamente, una molécula de polinucleótido transcribible pueden efectuar los fenotipos antes mencionados al codificar una molécula de ARN que provoca la inhibición dirigida de la expresión de un gen endógeno, por ejemplo a través de ARN inhibidor, antisentido (ARNi), o mecanismos mediados por cosupresión. El ARN puede también ser una molécula de ARN catalítica (es decir, una ribosoma) diseñada para disociar un producto de ARNm endógeno deseado. Entonces, cualquier molécula de polinucleótido que codifica una proteína o ARNm que expresa un fenotipo o cambio de morfología de interés puede ser útil para la práctica de la presente invención. Las construcciones de la presente invención son generalmente construcciones de ADN de frontera del plásmido de doble Ti que tienen las regiones de la frontera derecha (RB o AGRtu.RB) y de la frontera izquierda (LB o AGRtu.LB) del plásmido de Ti aisladas de Agrobacterium tumefaciens que comprende un ADN-T, que junto con moléculas de transferencia proporcionadas por las células de Agrobacterium, permiten la integración del ADN-T dentro del genoma de una célula de planta. La construcción también contiene los segmentos de ADN de la estructura principal del plásmido que proporcionan la función de replicación y selección de antibióticos en células bacterianas, por ejemplo, un origen de replicación de E. coli tal como or/322, un origen de replicación de escala amplia de huéspedes tal como or/V o on'Ri, y una región codificadora para un marcador seleccionable tal como Spec/Strp que codifica para Tn7 aminoglicósido adeniltransferasa (aadA) que confiere resistencia a un gen marcador seleccionable de espectinomicina o estreptomicina, o de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación de plantas, la cepa bacteriana hospedera a menudo es ABI, C58, o LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens, no obstante, pueden funcionar otras cepas conocidas por aquellos expertos en la técnica de la transformación de plantas en la presente invención. Como se usa en la presente, el término "transformada" se refiere a una célula, tejido, órgano, u organismo dentro del cual se ha introducido una molécula de polinucleótido extraña, tal como una construcción. La molécula de polinucleótido introducida puede integrarse dentro del ADN genómico de la célula, tejido, órgano, u organismo recipiente de manera que la molécula de polinucleótido introducida se hereda por la progenie subsiguiente. Una célula u organismo "transgénicos" o "transformado" también incluye progenie de la célula u organismo y la progenie producida de un programa de reproducción que emplea dicha planta transgénica como un padre en una cruza y que exhibe un fenotipo alterado resultante de la presencia de una molécula de polinucleótido extraña. Puede introducirse una construcción de transformación de planta que contiene una secuencia reguladora quimérica de la presente invención dentro de plantas por cualquier método de transformación de plantas. Los métodos y materiales para la transformación de plantas al introducir una construcción de expresión de planta dentro de un genoma de planta en la práctica de esta invención puede incluir cualquiera de los métodos bien conocidos y demostrados incluyendo la electroporación como se ilustra en la Patente de E.U.A. No. 5,384,253; bombardeo de microproyectiles como se ilustra en la Patente de E.U.A. Nos. 5,015,580; Patente de E.U.A. No. 5,550,318; Patente de E.U.A. No. 57538,880; Patente de E.U.A. No. 6, 160,208; Patente de E.U.A. No. 6,399,861 ; y Patente de E.U.A. No. 6,403,865; transformación mediada por Agrobacterium como se ilustra en la Patente de E.U.A. No. 5,824,877; Patente de E.U.A. No. 5,591 ,616; Patente de E.U.A. No. 5,981 ,840; y Patente de E.U.A. No. 6,384,301 ; y transformación de protoplasto como se ilustra en la Patente de E.U.A. No. 5,508,184, todas las cuales se incorporan en la presente para referencia. Los métodos para transformar específicamente dicotiledóneas son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. La transformación y regeneración de plantas usando estos métodos se han descrito para un número de cultivos que incluyen, pero no se limitan a, algodón (Gossypium hirsutum), frijol de soya (Glycine max), cacahuate {Arachis hypogaea), y miembros del género Brassica. Los métodos para transformar monocotiledóneas son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. La transformación y regeneración de plantas que usan estos métodos se han descrito para un número de cultivos, que incluyen, pero no se limitan a cebada (Hordeum vulgarae); maíz (Zea mays); avenas {Avena sativa); hierba de huerto (Dactylis glomerata); arroz (Oryza sativa, incluyendo variedades indica y japónica); sorgo (Sorghum bicolor); caña de azúcar (Saccharum sp); festuca larga (Festuca arundinacea); especies de hierbas para céspedes (por ejemplo las especies: Agrostis stolonifera, Poa pratensis, Stenotaphrum secundatum); trigo ( Triticum aestivum), y alfalfa (Medicago sativa). Es aparente para aquellos expertos en la técnica que pueden usarse un número de metodologías de transformación y modificación para la producción de plantas transgénicas estables a partir de cualquier número de cultivos objetivo de interés. Las plantas transformadas se analizan para la presencia de genes de interés y el nivel de expresión y/o el perfil conferido por los promotores de la presente invención. Aquellos expertos en la técnica están conscientes de los numerosos métodos disponibles para el análisis de las plantas transformadas. Por ejemplo, los métodos para el análisis de plantas incluyen, pero no se limita a transferencias Southern o transferencias Northern, acercamientos a base de PCR, análisis bioquímicos, métodos de selección fenotípica, evaluaciones en campo, y ensayos de inmunodiagnóstico. En una modalidad de la invención, se realizan una evaluación en invernadero o en campo para la tolerancia a glifosato para las plantas transformadas. El término "glifosato" se usa en la presente para referirse colectivamente al herbicida padre N-fosfonometilglicina (de otra manera conocido como ácido de glifosato), a una sal o éster del mismo, o a un compuesto que se convierte a N-fosfonometilglicina en tejidos de planta o del cual de otra manera proporciona N-fosfonometilglicina en forma iónica (de otra manera conocido como ión glifosato). De manera ilustrativa, las sales de glifosato solubles en agua útiles para la presente se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 3,799,758 y 4,405,531 de Franz, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Ejemplos de formulaciones comerciales de glifosato incluyen, sin restricción, aquellos vendidos por Monsanto Company como los herbicidas ROUNDUP®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® BIACTIVE, ROUNDUP® BIOFORCE, RODEO®, POLARIS®, SPARK® y ACCORD®, todos de los cuales contienen glifosato como su sal de isopropilamonio; aquellos vendidos por Monsanto Company como los herbicidas ROUNDUP® DRY y RIVAL®, que contienen glifosato como su sal de amonio; aquellos vendidos por Monsanto Company como ROUNDUP® GEOFORCE, que contienen glifosato como su sal de sodio; y aquel vendido por Zeneca Limited como el herbicida TOUCHDOWN®, que contiene glifosato como su sal de trimetilsulfonio. La selección de las proporciones de aplicación para una formulación de glifosato que son biológicamente efectivas está dentro del conocimiento del técnico agrónomo ordinario. Un experto en la técnica de igual manera reconocerá que las condiciones individuales de las plantas, condiciones climáticas y condiciones de cultivo pueden afectar los resultados logrados en la práctica del procedimiento de la presente invención. Cerca de dos décadas de uso del glifosato y estudios publicados relacionados a dicho uso han proporcionado información abundante a partir de la cual un practicante del control de malas hierbas puede seleccionar las proporciones de aplicación de glifosato que son herbicidamente efectivas en especies particulares en etapas particulares del crecimiento en condiciones ambientales particulares. En una modalidad, se aplica un herbicida que contiene glifosato a la planta que comprende las construcciones de ADN de la presente invención, y las plantas se evalúan en su tolerancia al herbicida de glifosato. Puede usarse cualquier formulación de glifosato para probar las plantas que comprenden las construcciones de ADN de la presente invención. Por ejemplo, puede usarse una composición de glifosato tal como Roundup® Ultra. Los parámetros de prueba para una evaluación de la tolerancia a glifosato de la planta variará dependiendo de un número de factores. Los actores pueden incluir, pero no se limitan al tipo de formulación de glifosato, la concentración y cantidad de glifosato usado en la formulación, el tipo de planta, la etapa de desarrollo de la planta durante el tiempo de la aplicación, condiciones ambientales, el método de aplicación, y el número de veces que se aplica una formulación particular. Por ejemplo, las plantas pueden evaluarse en un medio ambiente de invernadero usando un método de aplicación por rociado. La escala de prueba usando Roundup® Ultra puede incluir, pero no se limita a 40 Kg/Km2 (8 oz/acre) a 1 ,280 Kg/Km2 (256 oz/acre). La escala preferida comercialmente efectiva puede ser de 80 Kg/Km2 (16 oz/acre) a 320 Kg/Km2 (64 oz/acre) de Roundup® Ultra, dependiendo del cultivo y etapa del desarrollo de la planta. Un cultivo puede asociarse con por lo menos una aplicación de una formulación de glifosato. Para probar en algodón una aplicación de 160 Kg/Km2 (32 oz/acre) en la etapa de tres hojas puede seguirse por aplicaciones adicionales en etapas posteriores del desarrollo. Para el trigo puede usarse una aplicación de 160 Kg/Km2 (32 oz/acre) de Roundup® Ultra en la etapa de 3-5 hojas y puede seguirse con una aplicación pre o post cosecha, dependiendo del tipo de trigo que se va a probar. Los parámetros de prueba pueden optimizarse para cada cultivo para encontrar la planta particular que comprende las construcciones de la presente invención que confieren el nivel de tolerancia al glifosato comercialmente efectivo deseado. Las semillas de esta invención pueden cosecharse de plantas transgénicas fértiles y usarse para cultivar generaciones de progenie de plantas transformadas de esta invención incluyendo líneas de plantas híbridas que comprenden la construcción de esta invención y expresar un gen de interés agrícola. La presente invención también proporciona partes de las plantas de la presente invención. Las partes de las plantas, sin limitación, incluyen semillas, endosperma, óvulos y polen. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la parte de la planta es una semilla.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Deberá apreciarse por aquellos expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan las técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de esta invención. No obstante, aquellos expertos en la técnica deberán, a la luz de la presente descripción, apreciar que pueden hacerse numerosos cambios en las modalidades específicas que se describen y aún obtener un resultado parecido o similar sin separarse del espíritu y alcance de la invención, por lo tanto toda la materia establecida o mostrada en los dibujos que la acompañan deberá interpretarse como ilustrativa y no en un sentido limitativo.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Este ejemplo ilustra que una secuencia reguladora quimérica que comprende un promotor monocotiledóneo y un intrón dicotiledóneo puede mejorar la expresión de transgenes en una planta dicotiledónea. Específicamente, el promotor de triosefosfato isomerasa cistólico del arroz (TPI) se fusionó con un intrón dicotiledóneo At-iEF1a para formar una secuencia reguladora quimérica. Esta secuencia reguladora quimérica proporcionó una expresión de transgenes incrementada en tejidos vegetativos de una planta dicotiledónea y también la expresión en el tejido reproductivo en donde el promotor TPI sólo no es activo. El ensamble de las secuencias reguladoras quiméricas y las construcciones de expresión de la planta es como sigue. Una versión larga (Os-pTPI-L) y una versión corta (Os-pTPI-S) del promotor TPI del arroz se ampliaron usando cebadores diseñados con base en la secuencia de Genbank Accession Number (Numero de Acceso de Genbank) L04967 como se describe en Xu et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 573-588 y ADN genómico de arroz como molde. La mezcla de reacción para el PCR se ajustó como sigue: 0.5 de molde de ADN, 25 pmoles de cada cebador, Taq polimerasa (BMB, Indianapolis, Ind.) usando perlas de cera para PCR de "arranque en caliente". Las condiciones del termoreciclador del PCR fueron como sigue: 94°C por un minuto; 30 ciclos de: 92°C por 40 segundos, 55°C por un minuto, 72°C por un minuto y 30 segundos; y una extensión de cinco minutos a 72°C. La reacción de PCR se purificó usando GeneClean II (Bio101 Inc., Vista, Calif.), digerida con enzimas de restricción apropiadas y ligada dentro de las construcciones digeridas con las mismas o enzimas de restricción compatibles. El ensamble de las secuencias reguladoras quiméricas y construcciones de expresión de plantas se logró al insertar un promotor TPI de arroz ampliado dentro de pMON71535, un plásmido a base pB1121 de transformación rápida de plantas, que contenía At-iEF1a ligado operativamente a CTP2-aroA:CP4. Como un control, también se insertó un promotor TPI de arroz amplificado dentro de una construcción similar, pMON65322, que carecía de At-iEF1a. La presencia del CTP2-aroA:CP4 permitió la evaluación de la actividad de las secuencias reguladoras por aplicación por rociado del glifosato (Roundup Ultra™). Una descripción más detallada del ensamble de construcción es como sigue: Los productos de PCR del promotor TPI del arroz generados con las SEQ ID NO: 1 y 2 fueron digeridos con Not I y Hind III y ligados a pMON71535 previamente digerido con las mismas enzimas para formar pMON65380. Esta construcción contuvo el Os-pTPI-L ligado operativamente a CTP2-aroA:CP4. Los productos de PCR generados con las SEQ ID NO: 1 y 3 fueron digeridos con Not I y Pci I y ligados a pMON65322 previamente digerido con Not I y Neo I para formar pMON65381. Deberá apreciarse que las enzimas de restricción Pci I y Neo I producen extremos compatibles en sus sustratos de ADN respectivos. La construcción resultante contenida en la secuencia reguladora quimérica (Os-pTPI-L::At-iEF1a; SEQ ID NO:21) ligada operativamente a CTP2-aroA:CP4. De manera similar, los productos de PCR generados con las SEQ ID No: 4 y 2 fueron digeridos con Not I y Hind III y ligados a pMON71535 previamente digerido con las mismas enzimas para formar pMON65382. La construcción resultante contuvo el Os-pTPI-S ligado operativamente a CTP2-aroA:CP4. Finalmente, los productos generados por PCR con las SEQ ID NO: 4 y 3 fueron digeridos con Not I y Pci I y ligados a pMON65322 previamente digerido con Not I y Neo I para formar pMON65383. Esta construcción contuvo la secuencia reguladora quimérica, Os-pTPI-S::At-iEF1c¡ (SEQ ID NO:22), ligada operativamente a CTP2-aroA:CP4.

La eficacia de la secuencia reguladora quimérica que comprende un intrón dicotiledóneo (At-iEF1a) y un promotor monocotiledóneo (Os-pTPI) en impulsar la expresión del CTP2-aroA:CP4 se comparó con aquel de las secuencias reguladoras que carecían de un intrón dicotiledóneo en Arabidopsis thaliana transgénica. Las plantas Arabidopsis thaliana transgénicas fueron producidas por el método de infiltración a vacío (Beclitold et al. (1992) C R Acad París Life Sci 316: 1 194-1 199). Las semillas cosechadas se enterraron en tierra en charolas en una cámara de cultivo ajustada para 24°C y un ciclo de fotoperiodo de 16 horas para permitir un crecimiento y desarrollo normal de las plantas. La selección inicial de los brotes de Arabidopsis transgénicos tolerantes al glifosato se realizó por aplicación por rociado del glifosato herbicida (Roundup® Ultra) a una proporción de 120 Kg/km2 (24 onzas/acre). Las plantas sobrevivientes se trasplantaron en macetas individuales. Cada planta sobreviviente representó un evento transgénico distinto. En el florecimiento (aproximadamente 16 días después de la fijación), las plantas se rociaron una segunda vez con glifosato a proporciones de 120 Kg/km2 (24 onzas/acre) y 640 Kg/km2 (128 onzas/acre) para determinar la eficacia de las diferentes construcciones para conferir tolerancia reproductiva. La tolerancia reproductiva al glifosato en Arabidopsisse se midió por el porcentaje de plantas (eventos) que producían silicuas que contenían semillas. La tolerancia vegetativa de las plantas al glifosato también se monitoreo siguiendo la segunda aplicación. La tolerancia vegetativa al glifosato en Arabidopsis se midió por el porcentaje de plantas (eventos) que no mostraron daños de los tejidos vegetales (tolerancia vegetativa completa). Los resultados el efecto de diversas construcciones en la tolerancia vegetativa y reproductiva en Arabidopsis se muestran en el Cuadro 1 .

CUADRO 1 El efecto del intrón EF1a en la actividad del promotor TPI del arroz en Arabidopsis *L = largo, **S = Corto Los datos en el Cuadro 1 indicaron que el intrón dicotiledóneo At-iEFIct estuvo confiriendo tolerancia al glifosato en el tejido reproductivo en Arabidopsis. Las plantas transgénicas conteniendo únicamente al promotor Os-pTPI-L o Os-pTPI-S demostraron diversos grados de tolerancia vegetativa dependiendo de la proporción de aplicación del glifosato. No obstante, estas plantas transgénicas fallaron en producir semillas y no exhibieron tolerancia reproductiva. La introducción del intrón dicotiledóneo At-iEF1a dentro de la secuencia reguladora indujo una tolerancia del tejido reproductivo al glifosato en más de 40% de las plantas transgénicas probadas. El resto de las plantas fallo en producir semillas. También se observó un incremento en la tolerancia vegetativa en las plantas transgénicas que comprenden al promotor TPI del arroz y al intrón At-iEF1a. Este ejemplo ilustra que un intrón dicotiledóneo puede usarse en una secuencia reguladora quimérica para incrementar la expresión de transgenes y ampliar el patrón de expresión espacial de un promotor monocotiledóneo en plantas dicotiledóneas. Específicamente, el intrón dicotiledóneo demostró incrementar la expresión de transgenes en tejidos vegetativos de una planta dicotiledónea y habilitó la expresión del tejido reproductivo de los transgenes. La expresión de transgenes incrementada se manifestó por la tolerancia incrementada al glifosato en los tejidos objeto.

EJEMPLO 2 Este ejemplo ¡lustra que no todos los intrones dicotiledóneos son capaces de ampliar el patrón de expresión espacial de un promotor heterólogo, y que los intrones se pueden seleccionar para uso en secuencias reguladoras quiméricas que comprenden un promotor heterólogo para lograr un patrón de expresión espacial más amplio que aquel del promotor solo. En este ejemplo, se fusionó el promotor del virus del mosaico de la hierba de lamparones 35S (promotor FMV) con diferentes intrones dicotiledóneos para formar diversas secuencias reguladoras quiméricas para probar el efecto mejorador específico de tejido de los intrones. Las diferentes secuencias reguladoras quiméricas y construcciones de expresión que contienen dichas secuencias reguladoras se prepararon como sigue. El promotor FMV como se describió en la Patente de E.U.A. No. 6,018,100 (incorporado en la presente para referencia en su totalidad) se fusionó con el primer intrón nativo del factor de alargamiento 1a de Arabidopsis (At-iEF1a), el primer intrón nativo de la región codificadora del factor de alargamiento 1 ß de Arabidopsis (At-iEF1 ß), el primer intrón del factor de iniciación 4A10 de N. tabaccum (Nt-ielF4A10), el primer intrón nativo y líder de la región 5' de la proteína similar a aspartica proteinasa de Arabidopsis (At-iASP), el primer intrón nativo de proteína traslocadora de adenilato de Arabidopsis (At-iANT1), y el primer intrón nativo de la proteína actin 7 de Arabidopsis (At-iAct7), respectivamente, para formar las secuencias reguladoras quiméricas SEQ ID NO:23-28. pMON81508, un plásmido de transformación rápida de plantas basado en pBI121 , se usó como un control en donde se fusionó el promotor FMV directamente con la región codificadora del CTP2-aroA:CP4 EPSPS. Todos los intrones se clonaron por separado dentro del sitio Bgl II ubicado entre el promotor y la secuencia codificadora. Específicamente, el intrón At-iEFi p se amplió a partir de ADN genómico de Arabidopsis usando SEQ ID NO:5 (cebador hacia adelante) y SEQ ID NO:6 (cebador inverso). Las condiciones del PCR fueron las descritas en el Ejemplo 2. Los productos resultantes del PCR se digirieron con Bgl II para formar pMON81518. El At-¡ANT1 se amplificó a partir de ADN genómico de Arabidopsis usando la SEQ ID NO:7 (cebador hacia adelante) y la SEQ ID NO:8 (cebador inverso), digerido con Sin I (el cual produce extremos compatibles con los productos digeridos con Bgl II), y ligados a un pMON81508 digerido con Bgl II. La construcción resultante se designó pMON81522. El At-iEF1a se amplió de ADN genómico de Arabidopsis usando la SEQ ID NO:9 (cebador hacia adelante) y la SEQ ID NO:10 (cebador inverso), digerido con Bgl II, y ligado a pMON81508 digerido con Bgl II para formar pMON81531. El Nt-ielF4A10 se amplió de ADN genómico de tabaco usando la SEQ ID NO:1 1 (cebador hacia adelante) y la SEQ ID NO:12 (cebador inverso), digerido con Bgl II, y ligado a un pMON81508 digerido con Bgl II para formar pMON81532. El At-iAct7 se amplió de ADN genómico de Arabidopsis usando la SEQ ID NO: 13 (cebador hacia adelante) y la SEQ ID NO:14 (cebador inverso), digerido con Sin I, y ligado a un pMON81508 digerido con Bgl II para formar pMON81533. Finalmente el At-iASP se amplificó a partir de ADN genómico de Arabidopsis usando la SEQ ID NO:15 (cebador hacia adelante) y la SEQ ID NO:16 (cebador inverso), digerido con Bgl II, y ligado a un pMON81508 digerido con Bgl II para formar pMON81534. Las plantas Arabidopsis transgénicas se generaron con las construcciones descritas antes siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 1.

La tolerancia reproductiva de las plantas transgénicas al glifosato se midió por el porcentaje de plantas (eventos) que producían silicuas que contenían semillas. Los resultados se muestran en el Cuadro 2.

CUADRO 2 Desempeño de las plantas transformadas con vectores que contienen diferentes intrones insertados dentro del cásete de expresión FMV:CP4 EPSPS Los datos en el Cuadro 2 indican que no todos los intrones dicotiledóneos pueden expandir el patrón de expresión espacial del promotor F V al tejido reproductivo masculino. Por ejemplo, At-iEF1 ß, Nt-ielF4A10, y At-iASP fallaron en conferir tolerancia reproductiva a la Arabidopsis transgénica. El intrón dicotiledóneo At-iANT1 demostró la mayor eficacia en conferir la tolerancia reproductiva a la Arabidopsis transgénica tanto en las aplicaciones de glifosato de 120 Kg/km2 (24 onzas/acre) como de 640 Kg/km2 (128 onzas/acre). El intrón dicotiledóneo At-iAct7 demostró una eficacia ligeramente menor y el At-iEF1a tuvo la eficacia más baja entre los tres intrones que habilitaron la Arabidopsis transgénica para producir semillas. Este ejemplo demostró que los intrones dicotiledóneos se pueden seleccionar como mejoradores específicos de tejido, que pueden ampliar el patrón de expresión espacial de un transgen que comprende al intrón seleccionado y un promotor heterólogo.

EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra la identificación de motivos únicos a una clase de mejoradores específicos de tejido. Específicamente, los motivos de secuencia únicos se identificaron a partir de los tres intrones dicotiledóneos que confieren expresión de tejido reproductivo masculino en la Arabidopsis transgénica descrita en el Ejemplo 2. Se desarrolló un análisis computacional para identificar los motivos únicos que estuvieron presentes únicamente en los intrones identificados que ejercieron un incremento específico de tejido de expresión de genes. La MEME es una herramienta para descubrir uno o más motivos en una colección de secuencias de ADN (Bailey y Elkon (1994) En: Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, Standford, CA, AAAI Press, Bethesda, MD, pp 28-36). El MEME toma ventaja de maximizar la expectativa de ajustar un modelo de mezcla finito de dos componentes al conjunto de secuencias seleccionado. Como se describió, los procedimientos para la identificación del motivo son ajustar un modelo de mezcla a los datos de secuencia, para borrar probabilísticamente las apariciones del motivo así encontrado, y para repetir el procedimiento para identificar motivos sucesivos. Se aplicó el análisis MEME a las secuencias de los tres ¡ntrones (At-iEF1a de pMON81531 , At-iANT1 de pMON8 522, y At-iAct7 de pMON81533). El motivo T/CAGATCTG (SEQ ID NO:17) de las secuencias se identificó en los tres intrones. La aparición del motivo identificado en la secuencia del intrón se ilustra en un diagrama en la Figura 1. Los resultados de los Ejemplos 2 y 3 indican que el número de copias del motivo identificado en cada intrón está correlacionado con el grado de eficacia del intrón para habilitar la expresión de genes específicos de tejido. El At-iEF1 a tuvo la eficacia más baja y tuvo únicamente una copia del motivo identificado. El At-iAct7 tuvo cinco copias del motivo identificado y tuvo una eficacia ligeramente menor que aquel del At-iANT1 , que tuvo 9 copias de este motivo. Los resultados demostraron un incremento significativo en la eficacia cuando el número de copias de este motivo se incrementó de 1 (como en At-¡EF1a) a 5 (como en At-iAct7). Un incremento adicional en el número de copias de 5 (como en At-iAct7) a 9 (como en At-iANT1 ) demostró únicamente un ligero incremento en la eficacia, indicando que el efecto acumulativo de las múltiples copias del motivo comenzaba a no variar cuando el número de copias se aproximaba a 9 y el efecto de cada copia adicional podría declinar en números de copias mayores. El motivo identificado (SEQ ID NO: 17) estuvo ausente en los tres intrones que demostraron ser inefectivos para introducir la expresión del gen de tejido reproductivo masculino en el Ejemplo 2. La ausencia o presencia del motivo identificado se reflejó en el valor E asociado con cada intrón. El valor E de una secuencia fue el número esperado de secuencias en una base de datos aleatoria del mismo tamaño que podría coincidir con los motivos así como lo hizo la secuencia y fue igual al valor p combinado de las veces de secuencia el número de secuencias en la base de datos. El valor p de una secuencia midió la fuerza de la coincidencia de la secuencia con todos los motivos. Para derivar el valor E, se generó una matriz de puntuación dependiente de la posición a partir de los 15 motivos de los tres intrones efectivos y la matriz de puntuación entonces se aplicó a los tres intrones efectivos y a los tres intrones inefectivos. La matriz de puntuación fue como sigue: "ALPHABET= ACGT (ALFABETO=ACGT) log-odds matrix: alength= 4 w= 8 0.000218 0.199982 0.0001 15 0.799685 0.333329 0.399849 0.066738 0.200084 0.000218 0.0001 15 0.999449 0.000218 0.999551 0.0001 15 0.0001 15 0.000218 0.000218 0.0001 15 0.0001 15 0.999551 0.000218 0.999449 0.0001 15 0.000218 0.000218 0.066738 0.0001 15 0.932929 0.000218 0.0001 15 0.999449 0.000218" Los valores E para At-iANT1 , At-iAct7 y At-iEF1a fueron 0.0161 , 0.0147, y 0.14, respectivamente. En comparación, los valores E para At-iASP, Nt-ielF4A10, y At-¡EF1 p fueron 0.663, 0.863, y 0.71 , respectivamente. Estos valores E significativamente mayores fueron indicativos de la ausencia del motivo identificado en el último grupo de intrones.

EJEMPLO 4 La significancia del motivo identificado en los intrones y secuencias promotoras que confieren expresión específica de tejido reproductivo masculino se confirmó con el promotor y el intrón L de actin 1 de Arabidopsis. El intrón L y un dominio conservado de 55-bp dentro del promotor demostraron ser efectivos para la expresión del gen específico de polen en Arabidopsis (Vítale et al. (2003) Plant Mol Biol 52: 1 135-1 151 ). La misma matriz de puntuación en el Ejemplo 3 se empleó en el programa MEME para buscar la presencia del motivo en las secuencias. Se encontraron dos motivos correspondientes al motivo identificado previamente (SEQ ID NO: 17) entre los nucleótidos 89 y 1 17 del intrón L. El valor E calculado del intrón L fue 0.01 1 indicando la presencia del motivo (SEQ ID NO:17). Adicionalmente, el motivo identificado estuvo presente en tándem en el centro de la hebra inversa del dominio conservado de 55-bp del promotor actl . La presencia del motivo identificado en los elementos esenciales para la expresión específica de polen significa la importancia del motivo identificado para conferir expresión específica de tejido. EJEMPLO 5 Este ejemplo ilustra el uso del motivo identificado en construir mejoradores de recombinación para la expresión de transgenes. Para incrementar la expresión de CP4 EPSPS en Arabidopsis y específicamente en el tejido reproductivo masculino, puede construirse un mejorador de recombinación que comprende al intrón At-iEF1a y por lo menos una copia más del motivo identificado (SEQ ID NO: 17). Los métodos técnicos para introducir el motivo en sitios designados en la secuencia de nucleótidos del intrón se conocen por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, puede desarrollarse la mutagénesis dirigida al sitio para añadir o eliminar uno solo o estirar nucleótidos para alterar la secuencia de nucleótidos de un intrón nativo. El intrón At-iEF1a es un mejorador relativamente ineficiente porque contiene únicamente una copia sola del motivo (SEQ ID NO:17). Como se muestra en la Figura 2, el intrón nativo (A) puede modificarse para tener dos (B) o tres (C y D) copias del motivo. El motivo introducido puede colocarse en una dirección inversa (D) dentro del mejorador de recombinación. Los mejoradores de recombinación así construidos pueden probarse en construcciones de expresión al ligarse operativamente a un promotor tal como el promotor FMV y a una región codificadora tal como la CTP2.CP4 EPSPS. Las construcciones de expresión pueden entonces introducirse dentro de Arabidopsis por transformación y las plantas transformadas se rocían con glifosato en la etapa de desarrollo apropiada. Las plantas transgénicas pueden calificarse por la tolerancia reproductiva al glifosato. Un mejorador de recombinación con un número de copias incrementada del motivo identificado puede mostrar una mayor eficacia en incrementar la expresión del gen específica de tejido, lo cual puede evidenciarse por la producción de silicuas que contienen semillas sin considerar la aplicación por rociado del glifosato.

EJEMPLO 6 Este ejemplo ilustra la identificación de motivos adicionales que pueden afectar la actividad mejoradora de un intrón dicotiledóneo. Específicamente, los elementos de ADN reguladores que actúan en cis se identifican a partir de los tres intrones dicotiledóneos que confieren expresión de tejido reproductivo masculino en Arabidopsis transgénica descrita en el Ejemplo 2. Las secuencias de intrón dicotiledóneo del Ejemplo 2 se buscaron en contra de una colección de motivos enlazantes de factor de transcripción conocidos compilados de la base de datos de PLACE, PlantCARE, y Transfac. Esta colección de motivos conocidos contiene únicamente motivos identificados de fuentes de plantas, levaduras, y hongos.

Se usó el programa PromoterScan para la búsqueda y se identificaron tres motivos, Fací 09, Fac029, y PH02, de las secuencias de intrones At-iANT1 , At-iEF1a, y At-iAct7. El motivo FAC109 se reportó originalmente como un motivo que actúa en cis del promotor histone H4 de Arabidopsis thaliana (Chaubet et al. (1996) Plant J 10: 425-35) y se encontró en At-iANT1 con 3 copias y en At-iAct7 con 2 copias. Se reportó que el motivo Fac029 era un elemento del promotor PAL2 de frijol responsable de la expresión del gen específica vascular (Hatton et al. (1995) Plant J 7: 859-76). Se encontró una copia de Fac029 en At-iAct7 y At-iEF1a, respectivamente. El motivo PH02 fue un elemento que actúa en cis del promotor HIS4 de levadura PH02 (Brazas y Stillman (1993) Mol Cell Biol 13: 5524-37) y se encontró aquí en dos copias en cada uno de los intrones At-iEF1a, y At-iANT1. Ninguno de los motivos Fací 09, Fac029 y PH02 se encontró en los tres intrones que fueron inefectivos en conferir expresión de genes de tejido reproductivo masculino en el Ejemplo 2. El número y posición relativa de estos elementos puede ejercer una función en la actividad mejoradora de los intrones At-iAct7, At-iANT1 , y At-iEF1 a. Adicionalmente, estos elementos (SEQ ID NO: 18-20) pueden actuar sinérgicamente con el motivo SEQ ID NO: 17 en un mejorador de recombinación para lograr niveles óptimos de expresión de genes en tejidos de plantas. Una persona experta en la técnica apreciará que, al modificar el orden de los motivos, el número de los motivos, y/o la longitud de separación entre los motivos (SEQ ID NO: 17-20), se puede construir un mejorador de recombinación con la actividad mejoradora deseada. No obstante, en este caso, el mejorador de recombinación retendrá la actividad de impulsar la expresión de genes en el tejido reproductivo masculino de plantas. Habiendo ilustrado y descrito los principios de la presente invención, será aparente para las personas expertas en la técnica que la invención puede modificarse en arreglo y detalles sin separarse de dichos principios. Entonces en la presente se reclaman todas las modificaciones que están dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones y documentos publicados de patentes citados en la especificación se incorporan en la presente para referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada para referencia.

Claims (31)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 - Un método para mejorar la expresión de transgenes en una planta dicotiledónea que comprende: i) ligar operativamente un intrón dicotiledóneo a un promotor monocotiledóneo para formar una secuencia reguladora de ADN quimérica; ii) ensamblar una construcción de expresión que comprende dicha secuencia reguladora quimérica en un transgen; iii) transformar dicho transgen dentro del genoma de una célula de planta dicotiledónea; y iv) regenerar dicha célula dentro de una planta fértil, en donde dicha secuencia reguladora quimérica proporciona una expresión de transgen incrementada cuando se compara con aquella de un transgen correspondiente que comprende el mismo promotor monocotiledóneo sin el intrón dicotiledóneo ligado.
2. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la expresión de transgen incrementada comprende ampliar el patrón de expresión espacial de un transgen en plantas dicotiledóneas.
3. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho intrón dicotiledóneo se selecciona del grupo que consiste de los primeros intrones de At-EF1a, At-ANT1 , y At-Act7 y dicho promotor monocotiledóneo es el promotor TPI del arroz.
4. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha secuencia reguladora quimérica que comprende un intrón dicotiledóneo y un promotor monocotiledóneo que habilita la expresión de transgenes en tejido reproductivo masculino de una planta dicotiledónea.
5. 5 - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho transgen comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína de tolerancia a glifosato.
6. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas proteínas de tolerancia a glifosato se seleccionan del grupo que consiste de glifosato oxidoreductasa, glifosato acetiltransferasa, y 5-enolpiruvil-3-fosfoshikimate sintasa.
7. 7. - Una secuencia reguladora de ADN quimérica que comprende un promotor monocotiledóneo ligado operativamente a un intrón dicotiledóneo, en donde dicha secuencia reguladora de ADN quimérica proporciona una expresión de transgenes incrementada en plantas dicotiledóneas.
8. 8. - La secuencia reguladora de ADN quimérica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicho intrón dicotiledóneo se selecciona del grupo que consiste de los primeros intrones de At-EF1a, At-ANT1 , y At-Act7 y dicho promotor monocotiledóneo es el promotor TPI del arroz.
9. 9. - Un transgen que comprende la secuencia reguladora de ADN quimérica de la reivindicación 8, que comprende adicionalmente una secuencia que codifica una proteína de tolerancia a glifosato.
10. 10. - El transgen de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la proteína de tolerancia a glifosato se selecciona del grupo que consiste de glifosato oxidoreductasa, glifosato acetiltransferasa, y 5-enolpiruvil-3-fosfoshikimate sintasa.
11. 11 - Un método para identificar moléculas reguladoras novedosas para incrementar la expresión de transgenes en plantas que comprende: i) ligar operativamente una pluralidad de intrones dicotiledóneos al promotor de un transgen para formar una pluralidad de transgenes que comprende un intrón dicotiledóneo; ii) introducir cada transgen que comprende un intrón dicotiledóneo y un transgen correspondiente sin un intrón dicotiledóneo dentro de plantas; iii) evaluar el efecto amplificador en el patrón de expresión espacial del transgen por cada uno de los intrones dicotiledóneos, e iv) identificar un motivo único a los intrones dicotiledóneos que tienen un efecto amplificador similar en el patrón de expresión espacial del transgen.
12. 12.- Un método para regular una expresión de genes en plantas que comprende: i) construir un mejorador de recombinación que comprende al motivo identificado de la reivindicación 11 ; ii) ligar operativamente el mejorador de recombinación de la reivindicación 11 con un promotor en un transgen; y iii) expresar dicho transgen en una planta en donde se obtiene un patrón de expresión espacial amplificado cuando se compara con aquel del mismo transgen que carece del mejorador de recombinación.
13. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la identificación del motivo se desarrolla al someter información de secuencia de ADN de una pluralidad de intrones dicotiledóneos que muestran un efecto amplificador deseado para buscar con un programa MEME o programas de matriz de puntuación dependientes de la posición similares para la búsqueda de motivo.
14. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho promotor se selecciona del grupo que consiste de promotores dicotiledóneos, monocotiledóneos, y virales.
15. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho mejorador de recombinación está en dirección 5' de dicho promotor en el transgen.
16. 16 - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho mejorador de recombinación se coloca en el transgen en una dirección seleccionada del grupo que consiste de direcciones hacia adelante e inversa.
17. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho mejorador de recombinación está en la dirección 3' de dicho promotor en el transgen.
18. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho mejorador de recombinación se coloca en el transgen en una dirección seleccionada de un grupo que consiste de direcciones hacia adelante e inversa.
19. 19 - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho motivo identificado es SEQ ID NO: 17, y en donde dicho motivo confiere expresión de transgenes en el tejido reproductivo masculino en plantas dicotiledóneas.
20. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho transgen comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de tolerancia a glifosato.
21. 21 - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dichas proteínas de tolerancia a glifosato se seleccionan del grupo que consiste de glifosato oxidoreductasa, glifosato acetiltransferasa, y 5-enolpiruvil-3-fosfoshikimate sintasa.
22. 22. - Un mejorador de recombinación que comprende un motivo de secuencia (SEQ ID NO: 17), en donde dicho mejorador de recombinación es capaz de incrementar la expresión de transgenes en el tejido reproductivo masculino de plantas.
23. 23. - El mejorador de recombinación de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho mejorador de recombinación contiene dos copias de dicho motivo.
24. 24 - El mejorador de recombinación de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho mejorador de recombinación contiene tres copias de dicho motivo.
25. 25. - El mejorador de recombinación de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho mejorador de recombinación contiene cuatro copias de dicho motivo. 26. - El mejorador de recombinación de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la distancia entre dos motivos adyacentes está entre 0-1000 pares de bases. 27. - El mejorador de recombinación de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque la distancia entre dos motivos adyacentes está entre 10-250 pares de bases. 28. - El mejorador de recombinación de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho mejorador de recombinación comprende adicionalmente por lo menos dos elementos seleccionados del grupo que consiste de motivos Fací 09 (SEQ ID NO:18), Fac029 (SEQ ID NO:19), y PHO2 (SEQ ID NO:20). 29. - Una secuencia reguladora quimérica que comprende al mejorador de recombinación de la reivindicación 22 ligado operativamente a un promotor seleccionado del grupo que consiste de promotores monocotiledóneos, dicotiledóneos, y virales. 30. - Una construcción de ADN recombinante que comprende la secuencia reguladora quimérica de la reivindicación 29. 31. - Una planta transgénica transformada de manera estable con la construcción de ADN recombinante de la reivindicación 30. 32 - Una semilla, flor, raíz, brote, polen, tallo, o progenie de la planta transgénica de la reivindicación 31.