MX2008010339A

MX2008010339A - Secuencias de control transcripcionales de ovulo de planta.

Info

Publication number: MX2008010339A
Application number: MX2008010339A
Authority: MX
Inventors: Stefanie Sprunck; Birgit Bellman; Thomas Dresselhaus
Original assignee: Adelaide Res & Innovation Pty
Priority date: 2006-02-13
Filing date: 2007-02-13
Publication date: 2009-02-18
Also published as: EP1989306B1; US9139839B2; EP1989306A1; US20120260370A1; AU2007215376B2; US8173864B2; EP1989306A4; CA2638767A1; ATE529521T1; AU2007215376A1; CA2638767C; EP2405010B1; US20090191635A1; WO2007092992A1; ES2381845T3; EP2405010A1

Abstract

La presente invención se relaciona generalmente a secuencias de control transcripcionales. Generalmente, la presente invención se relaciona a secuencias de control transcripcionales que específicamente o preferiblemente dirigen la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés en un óvulo de plata. La presente invención se funda, en parte, sobre la identificación de secuencias de control transcripcionales derivadas de genes ECI que, en modalidades preferidas, dirigen la expresión preferencial en un óvulo de por lo menos una entidad taxonómica de planta.

Description

SECUENCIAS DE CONTROL TRANSCRIPCIONALES DE ÓVULO DE PLANTA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente a secuencias de control transcripcionales . Generalmente, la presente invención se relaciona a secuencias de control transcripcionales que específicamente o preferencialmente dirigen la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés en un óvulo de planta. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El énfasis primario en la modificación genética se ha dirigido a procariotas y células mamíferas. Por una variedad de razones, las plantas se han probado más intransigentes que otras células eucarióticas para manipularse genéticamente. Sin embargo, en muchos casos, es deseable efectuar la transcripción de una secuencia de nucleótidos introducida de interés ya sea específicamente o preferencialmente en una parte de planta particular o en una etapa de desarrollo particular de la planta. Por consiguiente, hay interés sustancial en identificar secuencias de control transcripcionales, tales como promotores o aumentadores , que específicamente o preferencialmente dirigen la transcripción en órganos de plantas particulares, tejidos o tipos de células o en etapas de desarrollo particulares de la planta. La expresión de las secuencias de DNA héterólogas en una planta es dependiente de la presencia de una secuencia de control transcripcional operablemente enlazada, tal como un promotor o aumentador, que es funcional dentro de la planta. La elección de la secuencia de control transcripcional determinará cuando y donde dentro del organismo la secuencia de DNA heteróloga es expresada. Por ejemplo, donde se desea la expresión continua por todas las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. En contraste, donde la expresión de gen en respuesta a un estimulo es deseada, se puede utilizar un promotor inducible. Donde la expresión en tejidos u órganos específicos es deseada, se puede utilizar un promotor específico de tejido. Frecuentemente, es deseable efectuar la expresión de una secuencia de DNA en células, tejidos u órganos particulares de una planta. Por ejemplo, la esterilidad masculina y/o femenina en una planta podría ser realizada mediante manipulación genética en el genoma de la planta con un promotor específico de gameto masculino o femenino operablemente enlazado a una proteina tóxica. Alternativamente, podría ser deseable, inhibir la expresión de una secuencia de DNA nativa dentro de tejidos de planta particulares para lograr un fenotipo deseado. En este caso, tal inhibición podría ser realizada mediante la transformación de la planta con un promotor específico de tejido operablemente enlazado a una secuencia antisentido o de nucleótido de RNAi, tal que la expresión de esta secuencia produce un transcripto de RNA que interfiere con la traducción del mRNA de la secuencia de DNA nativa. Las secuencias de promotor que se pueden utilizar para inducir la expresión especifica al óvulo de una secuencia de nucleótidos de interés en plantas superiores no son actualmente disponibles. Esto puede ser por lo menos en parte atribuido a la dificultad en aislar gametos femeninos de plantas de semilla'. Como ' una consecuencia de esta dificultad, los transcriptos de óvulos de plantas son pobremente representados en bases de datos actuales de etiquetas de secuencias expresadas (ESTs) , -que se han generado principalmente a través de la secuenciación de librerías de cDNA producidas de tejidos complejos, por ejemplo, órganos florales completos. Aunque más de 1.5 millones de ESTs de Poaceae estuvieron presentes en la base de datos de EST públicas, (por Marzo del 2004) el uso de tejidos complejo dio por resultado^ baja representación de genes expresados en bajos niveles y en solamente uno o unos cuantos tipos de células. Sin embargo, el aislamiento y la caracterización de las secuencias de control transcripcionales específicas de óvulo serían deseables para el uso en la manipulación genética de plantas. La referencia a cualquier técnica previa en esta especificación no es, y no debe ser tomada como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica previa forma parte del conocimiento general común en cualquier país. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se predica, en parte, sobre la identificación de secuencias de control transcripcionales derivadas de genes EC1 que, en modalidades preferidas, dirigen la expresión diferencial en un óvulo de por lo menos una entidad taxonómica de planta. Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende : (i) una secuencia de nucleótidos que define una secuencia de control transcripcional , en donde la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido EC1; o (ii) una secuencia de nucleótidos que define un fragmento funcionalmente activo o variante de (i) · De acuerdo con la presente invención, una secuencia consensual para polipéptidos EC1 se ha determinado. Por consiguiente, en una modalidad particularmente preferida, el ácido nucleico aislado del primer aspecto de la invención comprende una secuencia de control transcripcional derivada de un gen que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos : [XN]CWXXXXX[LI]X[SH]C[TS]X[DE] [IL] [ ILV] XFF [ LIV] [XN] [LIJXXXCCX [AS] [ILV] XXXXXXCW [XN] [ ILV] G [ FL] TXXEXXXLXXXC [XN] (SEQ ID NO: 1) en donde X es cualquier residuo de aminoácido; [XN] es uno o más residuos de aminoácido de cualquier tipo; [LI] o [IL] es un residuo de leucina o isoleucina; [SH] es un residuo de serina o histidina; [TS] es un residuo de treonina o serina; [DE] es un residuo de ácido aspártico o ácido glutámico; [ILV] o [LIV] es un residuo de leucina, isoleucina o valina; [AS] es un residuo de alanina o serina; y [FL] es un residuo de fenilalanina o leucina. En modalidades preferidas adicionales el ácido nucleico aislado comprende una o más porciones de secuencia que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 33 y/o SEQ ID NO: 69. En una forma preferida, las secuencias de control transcripcionales de la presente invención, o fragmentos funcionalmente activos o variantes de las mismas, son secuencias de control transcripcionales especificas de óvulo de planta o preferenciales de óvulo de planta. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado seleccionado de la lista que consiste de: (i) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32; (ii) un ácido nucleico que comprende' una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 50% idéntica' a cualquiera de las secuencias de nucleótidos mencionadas en (i); (iii) un ácido nucleico que híbrida cualquiera de los ácidos nucleicos mencionados en (i) bajo condiciones · severas; (iv) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es el complemento o complemento inverso de cualquiera de (i) a (iü) ; y (v) un fragmento de cualquiera de (i), (ii), (iii) o (iv) . En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico aislado del primero y/o segundo aspecto de la invención. En una modalidad preferida, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos que define una secuencia de control transcripcional y además comprende una secuencia de nucleótidos de interés operablemente conectada a la secuencia de control transcripcional. Más de preferencia, la secuencia de nucleótidos de interés es heteróloga con respecto a la secuencia de control transcripcional. En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una célula que comprende: (i) la construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención; y/o (ii) una forma genómicamente integrada de la construcción mencionada en (i). En una modalidad particularmente preferida, la célula es un óvulo de planta. Aun más de preferencia, el nivel, proporción y/o patrón de expresión de por lo menos una secuencia de nucleótidos es alterado en el óvulo de planta con relación a una forma de tipo silvestre del óvulo de planta. En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una estructura multicelular que comprende una o más células del cuarto aspecto de la invención. De preferencia, la estructura multicelular comprende una planta o una parte, órgano o tejido de la misma. En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para expresar específicamente o preferencialmente una secuencia de nucleótidos de interés en un óvulo de planta, el método que comprende efectuar la transcripción de la secuencia de nucleótidos de interés en una planta bajo el control transcripcional del ácido nucleico de cualquiera, del primero, segundo o tercer aspecto de la invención, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de control transcripcional especifica de óvulo de planta o preferencial de óvulo de planta. En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para promover la esterilidad femenina en una planta, el método que comprende expresar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina citotóxica o citostática o un RNA no traducido citotóxico o citostático', específicamente o preferencialmente en un óvulo de la planta; en donde la' secuencia de nucleótidos es operablemente conectada a un ácido nucleico de cualquiera del primero, segundo o tercer aspecto de la invención y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de control transcripcional específica de óvulo de planta o. preferencial de óvulo de planta. En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método para modular el desarrollo del embrión y/o tamaño del embrión en una planta, el método que comprende expresar una secuencia de nucleótidos que codifica un regulador transcripcional que actúa durante el desarrollo del embrión, específicamente o preferencialmente en un óvulo de la planta; en donde la secuencia de nucleótidos que codifica un regulador transcripcional es operablemente conectado a un ácido nucleico de cualquiera del primero, segundo o tercer aspecto de la invención y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de control transcripcional especifica de óvulo de planta o preferencial de óvulo de planta. En un noveno aspecto, la presente invención proporciona un método para promover apomixis en una planta, el método que comprende expresar una secuencia de nucleótidos de promoción de apomixis específicamente o preferencialmente en un óvulo de la planta; en donde la secuencia de nucleótidos de promoción de apomixis es operablemente conectada a un ácido nucleico de cualquiera del primero, segundo o tercer aspecto de la invención y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de control transcripcional específica de óvulo de planta o preferencial de óvulo de planta . Por toda esta especificación, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra "comprende" o variaciones tales como "se comprende" o "que comprende", será entendido que implica la inclusión en un elemento o número entero o grupos de elementos o números enteros establecidos pero no la exclusión de cualquier otro elemento o número entero o grupo de elemento o números enteros. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos son referidas en la presente por un número identificador de secuencia (SEQ ID NO:)-. Un resumen de los identificadores de secuencia se proporciona en la Tabla 1. Un listado de secuencias se proporciona al final de la especificación. TABLA 1 - Resumen de identificadores de secuencia Identi ficador Secuencia Identificador en el de secuencia listado de secuencias SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos consensual del polipéptido ECl N/A SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos del polipéptido AtECl.l <400> 1 SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos del polipéptido AtEC1.2a <400> 2 SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos del polipéptido AtEC1.2b <400> 3 SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos del polipéptido AtEC1.4 <400> 4 SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos del polipéptido AtEC1.5 <400> 5 SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos del polipéptido MtECl .1 <400> 6 SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos del polipéptido OsECl.l <400> 7 SEQ- ID NO: secuencia de aminoácidos del polipéptido OsEC1.2 <400> 8 SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos del polipéptido OsEC1.3 <400> 9 SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos del polipéptido TaECl <400> 10 SEQ ID NO: secuencia de aminoácidos del polipéptido HvECAl <400> 11 SEQ ID NO: secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta AtECl.l <400> 12 SEQ ID NO: 14 secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta AtEC1.2a <400> 13 ' SEQ ID NO: 15 secuencia de . nucleótidos de la estructura de lectura abierta AtEC1.2b <400> 14 SEQ ID NO: 16 secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta AtECl . <400> 15 SEQ ID NO: 17 secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta AtECl.5 <400> 16 SEQ ID NO: 18 secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta MtECl .1 <400> 17 SEQ ID NO: 19 secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta OsECl.l <400> 18 SEQ ID NO: 20 secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta 0sEC1.2 <400> 19 SEQ ID NO: 21 secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta OsEC1.3 <400> 20 SEQ ID NO: 22 secuencia de nucleótidos de cDNA de TaECI <400> 21 SEQ ID NO: 23 secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta HvECA 1 <400> 22 SEQ ID NO: 24 secuencia de nucleótidos pAtECl .1 <400> 23 SEQ ID NO: 25 secuencia de nucleótidos pAtEC1.2a <400> 24 SEQ ID NO: 26 secuencia de nucleótidos pAtEC1.2b <400> 25 SEQ ID NO: 27 secuencia de nucleótidos pAtECl . <400> 26 SEQ ID NO: 28 secuencia de nucleótidos pAtEC1.5 <400> 27 SEQ ID NO: 29 secuencia de nucleótidos pMtECl .1 <400> 28 SEQ ID NO: 30 secuencia de nucleótidos pOsECl .1 <400> 29 SEQ ID NO: 31 secuencia de nucleótidos pOsEC1.2 <400> 30 SEQ ID NO: 32 secuencia de nucleótidos pOsECl .3 <400> 31 SEQ ID NO: 33 porción #1 de la secuencia de nucleótidos del promotor ECl <400> 32 SEQ ID NO: 34 cebador TaGAPl <400> 33 SEQ ID NO: 35 cebador TaGAP2 <400> 34 SEQ ID NO: 36 cebador TaEClfw2 <400> 35 SEQ ID NO: 37 cebador TaEClrev2 <400> 36 SEQ ID NO: 38 cebador Act3fw <400> 37 SEQ ID NO: 39 cebador Act3rev <400> 38 SEQ ID NO: 40 cebador AtECl .1 fw <40.0> 39 SEQ ID NO: 41 cebador AtECl.1 rev <400> 40 SEQ ID NO: 42 cebador AtECl.2a/bfw <400> 41 SEQ ID NO: 43 cebador AtECl .2a/brev <400> 42 SEQ ID NO: 44 cebador AtECl. fw <400> 43 SEQ ID NO: 45 cebador AtECl. rev <400> 44 SEQ ID NO: 46 cebador AtECl.5fw <400> 45 SEQ ID NO: 47 cebador AtECl.5rev <400> 46 SEQ ID NO: 48 cebador pAtECl.l <400> 47 SEQ ID NO: 49 cebador AtECl .1 revi <400> 48 SEQ ID NO: 50 cebador pAtEC1.2a <400> 49 SEQ ID NO: 51 cebador tAtEC1.2a <400> 50 SEQ ID NO: 52 cebador AtECl.1-Pstl <400> 51 SEQ ID NO: 53 cebador AtECl .2a-Bglll <400> 52 SEQ ID NO: 54 cebador de inicio rev GUS <400> 53 SEQ ID NO: 55 cebador El F <400> 54 SEQ ID NO: 56 cebador E1R <400> 55 SEQ ID NO: 57 cebador EC1-PF2 <400> 56 SEQ ID NO: 58 cebador EC1-R <400> 57 SEQ ID NO: 59 cebador GFP-seq <400> 58 SEQ ID NO: 60 cebador LH1 <400> 59 SEQ ID NO: 61 cebador GUS3 <400> 60 SEQ ID NO: 62 cebador GUS4 <400> 61 SEQ ID NO: 63 cebador bar-fw <400> 62 SEQ ID NO: 64 cebador bar-rev <400> 63 SEQ ID NO: 65 cebador 1-1 fwXbal <400> 64 SEQ ID NO: 66 cebador 1-1 revXbal <400> 65 SEQ ID NO: 67 cebador At2a-Bglllfw <400> 66 SEQ ID NO: 68 cebador At2á-Salrev <400> 67 SEQ ID NO: 69 porción #2 de secuencia de nucleótidos del promotor ECl <400> 68 DESCRIPCIÓN DE MODALIDADES PREFERIDAS Se va a entender que la siguiente descripción es para el propósito de describir modalidades particulares solamente y no se propone para ser limitativa con respecto a la descripción anterior. Como se expone en lo anterior, la presente invención se prédica, en parte, sobre la identificación de secuencias de control transcripcionales que se derivan de genes ECl que son preferencialmente expresados en los óvulos de por lo menos algunas plantas. Como se utiliza en la presente, el término "secuencia de control transcripcional" debe ser entendido como cualquier secuencia de nucleótidos que modula por lo menos la transcripción de una secuencia de nucleótidos operablemente conectada. Además, la secuencia de control transcripcional de la presente invención puede comprender cualquiera de uno o más de, por ejemplo, una secuencia de activación de guia, de promotor, aumentadora o corriente arriba . Como se refiere en la presente, el término "secuencia de control transcripcional" de preferencia por lo menos incluye un promotor. Un "promotor" como es referido en la presente, abarca cualquier ácido nucleico que confiere, activa o aumenta la expresión de una secuencia de nucleótidos operablemente conectada en una célula. Como se utiliza en la presente, el término "operablemente conectado" se refiere a la conexión de una secuencia de control transcripcional, tal como un promotor, y una secuencia de nucleótidos de interés de tal manera para llevar la secuencia de nucl.eótidos de interés bajo el control transcripcional de la secuencia de control transcripcional. Por ejemplo, los promotores están generalmente posicionados 5' (corriente arriba) de una secuencia de nucleótidos que es operablemente conectada al promotor. En la construcción de la secuencia de control transcripcional heteróloga/secuencia de nucleótidos de combinaciones de interés, es generalmente preferido posicionar el promotor a una distancia del sitio de inicio de transcripción que es aproximadamente la misma como la distancia entre ese promotor y el gen que lo controla en su ambiente natural, es decir, el gen del cual se deriva el promotor. Como es conocido en la técnica, algo de variación a esta distancia puede ser acomodada sin perdida de la función de promotor. Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado - que comprende : (i) una secuencia de nucleótidos que define una secuencia de control transcripcional , en donde la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido de EC1; o (ii) una secuencia de nucleótidos que define un fragmento funcionalmente activo o variante de (i) · En la presente invención, "aislado" se refiere al material recuperado de su ambiente natural original (por ejemplo, el ambiente . natural si está ocurriendo naturalmente) , y asi es alterado "por la mano del hombre" de su estado natural. Por ejemplo, un polinucleótido aislado podría ser parte de un vector o una composición de materia, o podría ser contenido dentro de una célula, y todavía ser aislado debido a que el vector, composición de materia o célula particular no es el ambiente original del polinucleótido . Una molécula de ácido nucleico "aislada" también se debe entender que incluye una molécula de ácido nucleico sintética, que incluye aquellas producidas por síntesis química utilizando métodos conocidos en la técnica o mediante la amplificación in vitro (por ejemplo reacción en cadena de polimerasa y los similares) . El ácido nucleico aislado de la presente invención puede comprender cualquier polirribonucleótido o polideoxirribonucleótido, que puede ser RNA o DNA no modificado o RNA o DNA modificado. Por ejemplo, los ácidos nucleicos aislados de la invención pueden comprender DNA de una sola y doble hebra, DNA que es una mezcla de regiones de una sola y doble hebra, RNA de una sola y doble hebra, y RNA que es mezcla de regiones de una sola y doble hebra, moléculas híbridas que comprenden DNA y RNA que puede ser de una sola hebra o, más típicamente, de doble hebra o una mezcla de regiones de una sola y doble hebra. Además, los ácidos nucleicos aislados pueden comprender regiones de triple hebra que comprende RNA o DNA o tanto RNA como DNA. Las moléculas de ácido nucleico aisladas también pueden contener una o. más bases modificadas o cadenas principales de DNA o RNA modificadas para estabilidad y por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases no usuales tal como inosina. Una variedad de modificaciones se pueden hacer al DNA y RNA; asi, "polinucleótidos" abarca formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas. Como se expone en lo anterior, la presente invención contempla, entre otras cosas, una secuencia de nucleótidos que define una secuencia del control transcripcional, en donde la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido EC1. Como es referido en la presente, un "polipéptido EC1" se refiere a un polipéptido que es de manera sustancial específicamente expresado en un óvulo de una planta. Generalmente, los polipéptidos EC1 son pequeños (generalmente de menos de aproximadamente 200 residuos de aminoácidos) y son putativamente secretados. En algunas modalidades, los polipéptidos EC1 contemplados en la presente además comprenden aproximadamente seis residuos de cisteína conservados y además pueden comprender un péptido de señal para la localización extracelular . Los ácidos nucleicos de la presente invención comprenden secuencia de nucleótidos que define que es "derivada de un gen que codifica un polipéptido de EC1". El término "derivado de", como se utiliza en la presente, se refiere a una fuente u origen de la secuencia de control transcripcional . Como tal, una secuencia de control transcripcional "derivada de un gen que codifica un polipéptido de EC1" se refiere a una secuencia de control transcripcional que, en su estado nativo, ejerce por lo menos un control transcripcional sobre un gen que codifica un polipéptido de EC1 en un organismo, de preferencia una planta . De acuerdo con la presente invención, una secuencia de polipéptido EC1 consensual de ha determinado. Por consiguiente, en una modalidad particularmente preferida el ácido nucleico al grado del primer aspecto de la invención comprende una secuencia de control transcripcional derivada de un gen que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos: [XN] CWXXXXX [LI] X [SH] C [TS] X [DE] [IL], [ ILV] XFF [LIV] [XN] [LI]XXXCCX [AS] [ILV]XXXXXXCW[XN] [ ILV] G [ FL] TXXEXXXLXXXC [XN] (SEQ ID NO: 1) en donde X es cualquier residuo de aminoácido; [XN] es uno o más residuos de aminoácidos de cualquier tipo; [LI] o [IL] es un residuo de leucina o isoleucina; [SH] es un residuo de serina o histidina; [TS] es un residuo de treonina o serina; [DE] es un residuo de ácido aspártico o ácido glutámico; [ILV] o [LIV] es un residuo de leucina, isoleucina o valina; [AS] es un residuo de alanina o serina; y [FL] es un residuo de fenilalanina o leucina.

Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención proporciona ácido nucleico aislado que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que define una secuencia de control transcripcional , en donde la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta a la SEQ ID NO: 1; o (ii) un fragmente funcionalmente activo o variante de (i) . En modalidades adicionales, la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ. ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID' NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11. En todavía modalidades adicionales, la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que comprende una estructura de lectura abierta que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19,. SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23. En modalidades especificas, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que define una secuencia de control transcripcional, en donde la secuencia de control transcripcional comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquier de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID' NO: 31, SEQ ID NO: 32, o un fragmento funcionalmente activo o variante de la misma. En todavía modalidades adicionales el ácido nucleico aislado comprende una o más porciones de secuencia que comprenden la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 33 y/o SEQ ID NO: 69. Como se expuso en lo anterior, . la presente invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que define un fragmento funcionalmente activo o variante de las secuencias de control transcripcionales presentes. Como es referido en la presente, un "fragmento funcionalmente activo o variante" se refiere a un fragmento variante que retiene la actividad funcional de una secuencia de control transcripcional. "Fragmentos funcionalmente activos", como es contemplada en la presente, puede ser de cualquier longitud en donde la secuencia de control transcripcional retiene la capacidad para afectar la expresión de una secuencia de nucleótidos operablemente conectada. El fragmento puede comprender, por ejemplo, por lo menos 50 nucleótidos (nt), por lo menos 100 nt o por lo menos 200 nt . Por ejemplo, en modalidades especificas, un fragmento de por lo menos 50 nt en longitud comprende fragmentos que incluyen .50 o más base contiguas de, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32. "Variantes funcionalmente activas" de la secuencia de control transcripcional de la invención incluyen ortólogos, mutantes, variantes sintéticas, análogos y los similares que retienen la capacidad para afectar la expresión de una secuencia de nucleótidos operablemente conectada. Por ejemplo, el término "variantes" debe ser considerado para incluir específicamente, por ejemplo, secuencias de control transcripcionales ortólogas de otros organismos; mutantes de la secuencia de control transcripcional; variantes de la secuencia de control transcripcional en donde uno o más de los nucleótidos dentro de la secuencia se ha sustituido, adicionado o suprimido; y análogos que contienen uno o más bases modificadas o cadenas principales de DNA o RNA modificadas para estabilidad o por otras razones. Las "bases modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tal como inosina. En algunas modalidades, el fragmento funcionalmente activo o variante puede comprender, por ejemplo, por lo menos 50% de identidad de secuencia, por lo menos 65% de identidad de secuencia, o por lo menos 80% de identidad de secuencia o por lo menos 95% de identidad de secuencia a la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32. Cuando se comparan secuencia de nucleótidos para calcular un porcentaje de identidad, las secuencias de nucleótidos comparadas deben ser comparadas sobre una ventana de comparación de por lo menos 50 residuos de nucleótido, por lo menos 100 residuos de nucleótido, por lo menos 200 residuos de nucleótido,. por lo menos 500 residuos de nucleótido, o sobre la longitud completa de cualquiera de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:. 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32. La ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir espacios) de aproximadamente 20% menos como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación puede ser conducida mediante implementaciones computarizadas de algoritmos tal como la familia de programas BLAST como, por ejemplo, es divulgado por Altschul y colaboradores {Nucí.

Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Una discusión detallada del análisis de secuencia se puede encontrar en la Unidad 19.3 de Ausubel y colaboradores ("Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15,1998). En algunas modalidades especificas, las secuencias de control transcripcionales proporcionadas por la presente invención^ o fragmentos funcionalmente activos o variantes de los mismos, comprenden secuencias de control transcripcionales especificas de óvulo de planta o preferenciales de óvulo de planta. Como se utiliza en la presente, una secuencia de control transcripcional "especifica de óvulo de planta" se refiere a una secuencia de control tra-nscripcional que dirige la expresión de una secuencia de nucleótidos operablemente conectada de interés de manera sustancial solamente en un óvulo de una planta. Una secuencia de control transcripcional "preferencial de óvulo de planta" se refiere a una secuencia de control transcripcional que dirige la expresión de una secuencia de nucleótidos operablemente conectada en. un nivel más alto en un óvulo de planta que en uno o más de otros tejidos en la planta, por ejemplo, tejido de hoja o tejido de raiz. Generalmente, la expresión preferencial en un óvulo incluye la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés en un óvulo de planta a un nivel de por lo menos dos veces, por lo menos 5 veces o por lo monos 10 veces el nivel de expresión observado en por lo menos otro tejido de una planta, por ejemplo, tejido de hoja o de raíz. Como es referido en la presente, el término "óvulo de planta" debe ser entendido que incluye una célula que es un componente del gametofito femenino en una planta. Por ejemplo, en plantas angiospermas , el término "óvulo de planta" puede incluir un gameto femenino, una sinérgida, una célula central o una célula antipodal del gametofito femenino (saco embriónico) .. En una modalidad, el término "óvulo de planta" debe ser entendido para referirse a un gameto femenino de una planta. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado seleccionado de la lista que consiste de: (i) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos .expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32; (ii) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 50%idéntica a cualquiera de la secuencias de nucleótidos mencionadas en (i); (iii) un ácido nucleico que híbrida a cualquiera de los ácidos nucleicos mencionados en (i) bajo condiciones severas; (iv) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es el complemento o complemento inverso de cualquiera de (i) a (üi) ; y (v) un fragmento de cualquiera de (i), (ii), (üi) o (iv) . En una modalidad, el ácido nucleico aislado definido en (ii) comprende por lo menos 50% de identidad de secuencia, por lo menos 65% de identidad de secuencia, por lo menos 80% de identidad de secuencia o por lo menos 95% de identidad de secuencia a la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:' 31, SEQ ID NO: 32. En otra modalidad, el ácido nucleico aislado del segundo aspecto de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que define una secuencia de control transcripcional o un complemento, complemento inverso o fragmento de la misma. En todavía otra modalidad, el ácido nucleico aislado del segundo aspecto de la invención comprende . una secuencia de nucleótidos que define una secuencia de control transcripcional específica de óvulo o preferencial de óvulo o un complemento, complemento inverso o fragmento de la misma.

Como se expone en (iii) anterior, el segundo aspecto de la invención proporciona ácidos nucleicos aislados que hibridan a cualquiera de los ácidos nucleicos mencionados en (i) . Como se utiliza en la presente, condiciones de hibridación "severas" serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de ión Na, de manera típica aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ión Na (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es por lo menos 30°C. Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tal como formamida. Las condiciones de hibridación severas pueden ser condiciones de baja severidad, condiciones de media severidad o condiciones de alta severidad. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación con' una solución reguladora de formamida al 30 al .35%, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato de sodio), al -1% a 37°C, y un lavado en 1 x a 2xSSC (20xSSC=NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) a 50 a 55°C. Las condiciones de moderada severidad ejemplares incluyen hibridación en formamida al 40 al 45%, NaCl 1.0 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0.5x a. lxSSC a 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado es 0. lxSSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, las soluciones reguladoras de lavado pueden comprender SDS a aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1%. La duración de la hibridación es generalmente menor que aproximadamente 24 horas, de manera usual aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. La especificidad de la hibridación también es afectada por lavados de post-hibridación, con parámetros influyentes que incluyen la intensidad iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de DNA-DNA, la Tm puede ser aproximada de la ecuación de Meinkoth y Wahl (Anal. Biochem. 138: 267-284, 1984), es decir Tm =81 .5°C + 16.6 (log M)+0.41 (% GC)-0.61 (% form) -500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el DNA, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y es de la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo intensidad iónica y pH definido) en la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria híbrida a. una sonda perfectamente igualada. Tm es reducido por aproximadamente 1°C por cada 1% de desigualación; así, Tm, hibridación y/o condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar a secuencias de diferentes grados de complementariedad . Por ejemplo, las secuencias con >90% de identidad se pueden hibridar al disminuir la Tm por aproximadamente 10°C. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento en una intensidad iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones de alta severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado en, por ejemplo, 1, 2, 3, o 4°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones de mediana severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado en, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, o 10°C menor que el punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado en, por ejemplo, 11, 12, 13, 14, 15, o 20°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) . Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y de lavado, y la Tm deseada, aquellos de habilidad ordinaria entenderán que variaciones en la severidad de hibridación y/o soluciones de lavado son inherentemente descritas. Si el grado deseado de desigualación da por resultado un Tm de menor que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) , se prefiere incrementar la concentración SSC de modo que se puede utilizar a una temperatura más alta. Una guia extensiva a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen {Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Pt 1, Chapter 2, Elsevier, New York, 1993), Ausubel y colaboradores, eds . {Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing y Wiley-lnterscience , New York, 1995) y Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ,2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1989) . Como se expone en lo anterior, el segundo aspecto de la presente invención también contempla fragmentos de ácido nucleico. "Fragmentos" de una secuencia de nucleótidos puede ser, por ejemplo, por lo menos 5 nucleótidos (nt) , por lo menos 10 nt, por lo menos 20 nt, por lo menos 50, por lo menos 100, por lo menos 150, por lo menos 200, por lo menos 250, por lo menos 300, por lo menos 350, por lo menos 400, por lo menos 450 o por lo menos 500 nt en longitud. Estos fragmentos tienen numerosos usos que serian evidentes para uno de habilidad ert la técnica e incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores de diagnostico. Por supuesto, fragmentos más grandes, también puede ser útiles, como son los fragmentos correspondientes a la mayoría, si no es que todos, la secuencias de nucleótidos expuestas en cualquiera de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32. Por ejemplo, un fragmento de por lo menos 5 nt en longitud puede referirse a un fragmento que incluye 5 o más bases contiguas de, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de cualquiera de ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32. Los ácidos nucleicos aislados (o fragmentos o variantes de los mismo) de la presente invención - se pueden derivar de cualquier fuente. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser derivados de un organismo, tal como una planta; Las plantas adecuadas incluyen, por ejemplo, angiospermas monocotiledóneas (monocotiledóneas ) , angiospermas dicotiledóneas (dicotiledóneas), gimnospermas y los similares. Dicotiledóneas ejemplares incluyen, por ejemplo, Arabidopsis spp., Medicago spp., Nicotiana spp., soya, cánola, aceite de semilla de colza, betabel, mostaza, girasol, . papa, cártamo, mandioca, batatas, camote, otras Brassicaceae tales como Thellungiella halophila, entre otros. En una modalidad, los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden comprender una secuencia de control transcripcional derivado de un gen que codifica un polipéptido EC1 de una planta Arabidopsis sp. Por ejemplo, las secuencia de control transcripcional definida en la presente como pAtECl.l (SEQ ID NO.: 24), pAtEC1.2a (SEQ ID NO: 25), pAtEC1.2b (SEQ ID NO: 26), pAtECl .4 (SEQ ID NO: 27) y pAtEC1.5 (SEQ ID NO: 28) son derivables de genes que comprenden las secuencias de nucleótidos de estructura de lectura abierta AtECl.l (SEQ ID NO: 13), AtECl 2a (SEQ ID Np: 14), AtECl 2b (SEQ ID NO: 15), AtECl.4 (SEQ ID NO: 16) y AtECl.5 (SEQ ID NO: 17), respectivamente de la Arabidopsis thaliana .

En otra modalidad, el ácido nucleico aislado de la presente invención puede comprender una secuencia de control transcripcional derivada de un gen que codifica un polipéptido de EC1 en una planta Medicago sp. Por ejemplo, la secuencia de control transcripcional definida en la presente como pMtECl (SEQ ID NO: 29) es derivable de un gen que comprende la secuencia de nucleótidos de estructura de lectura abierta MtECl .1 (SEQ ID NO: 18) de Medicago truncatula. En modalidades preferidas adicionales, la planta es una monocotiledónea, más de preferencia una planta de cultivo de cereal. Como se utiliza en la presente, el término "planta de cultivo de cereal" incluye miembros del orden Poales, y más de preferencia la familia Poaceae, que producen grano comestible para alimento humano o animal. Ejemplos de plantas de cultivo de cereal que de ninguna manera limitan la presente invención incluyen cebada, trigo, arroz, maíz, mijos, sorgo, centeno, triticale (cereal híbrido de trigo y centeno), avenas, teff, arroz, espelta y los similares. Sin embargo, el término planta de cultivo de cereal también debe ser entendido que incluye un número de especies no de Poales que también producen grano comestible, que son conocidos como seudocereales , e incluyen, por ejemplo, amaranto, trigo sarraceno y quinua.

En una modalidad, el ácido nucleico aislado de la presente invención puede comprender una secuencia de control transcripcional derivada de un gen que codifica un polipéptido de EC1 en una planta Oryza sp . Por ejemplo, las secuencias de control transcripcionales definidas en la presente como pOsECl .1 (SEQ ID NO: 30), pOsECl .2 (SEQ ID NO: 31) y pOsEC1.3 (SEQ ID NO: 32), son derivables de genes que comprenden las secuencias de nucleótidos de estructura de lectura abierta o OsECl.l (SEQ ID NO: 19), OsEC1.2 (SEQ ID NO: 20) y OsEC1.2b (SEQ ID NO: 21), respectivamente, de Oryza sa tiva . En modalidades adicionales, la presente invención también contempla ácidos nucleicos sintéticos. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico aislado del- primero y/o segundo aspecto de la invención. La construcción de ácido nucleico de la presente invención puede comprender cualquier polirribonucleótido o polideoxirribonucleótido, que puede ser RNA o DNA no modificado o RNA o DNA modificado. Por ejemplo, la construcción de ácido nucleico de la invención puede comprender DNA de una sola y/o doble hebra, el DNA que es una mezcla de regiones de una zona de doble hebra, RNA de una sola y doble hebra, y RNA que es una mezcla de regiones de una sola y doble hebra, moléculas híbridas que comprenden DNA y RNA que pueden ser de una sola hebra o, más típicamente, doble hebra o una mezcla de regiones de una sola y doble hebra. Además, la construcción de ácido nucleico puede comprender regiones de triple hebra que comprende RNA o DNA o tanto RNA como DNA. La construcción de ácido nucleico también puede comprender una o más bases modificadas o cadenas principales de DNA o RNA modificadas para estabilidad o por otras razones. Bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Una variedad de modificaciones se pueden hacer al DNA y RNA; así el término "construcción de ácido nucleico" abarca formas químicamente, enzimáticamente , o metabolitamente modificadas. En una modalidad, la construcción de ácido nucleico comprende de DNA. Por consiguiente, la construcción de ácido nucleico de la presente invención puede comprender, por ejemplo, una molécula de DNA lineal, un plásmido, un transposón, un cósmido, un cromosoma artificial y los similares. Además, la construcción de ácido nucleico de la presente invención puede ser una molécula de ácido nucleico separada o puede ser parte de una molécula de ácido nucleico más grande. En otra modalidad, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos que define una secuencia de control transcripcional y además comprende una secuencia de nucleótidos de interés operablemente conectada a la secuencia de control transcripcional . En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos de interés heteróloga con respecto a la secuencia de control transcripcional . Como se utiliza en la presente, el término "heterólogo con respecto a la secuencia de control transcripcional" se refiere a la secuencia de nucleótidos de interés que es una secuencia de nucleótidos diferente a aquella con la cual la secuencia de control transcripcional es operablemente conectada o en su estado natural. Por ejemplo, en su estado natural, pAtECl.l (SEQ ID NO: 24) o es operablemente conectado a un gen que comprende la estructura de lectura abierta AtECl.l (SEQ ID NO: 13). Por consiguiente, este ejemplo, cualquier secuencia de nucleótidos diferente a una secuencia de nucleótidos que comprenden una estructura de lectura abierta que consiste a la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 13 debe ser considerada heteróloga con respecto a la SEQ ID NO: 24. De manera similar, cualquier secuencia de nucleótidos diferente de una secuencia de nucleótidos que comprende una estructura de lectura abierta que consiste de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 debe ser considerada heteróloga con respecto a la SEQ ID NO: 25; cualquier secuencia de nucleótidos diferente de una secuencia de nucleótidos que comprende una estructura de lectura abierta que consiste de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 15 debe ser considerado heteróloga con respecto a SEQ ID NO: 26; cualquier secuencia de nucleótidos diferente de una secuencia de nucleótidos que comprende una estructura de lectura abierta que consiste de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 16 debe ser considerada heteróloga con respecto a SEQ ID NO: 27; cualquier secuencia de nucleótidos diferente a una secuencia de nucleótidos que comprende una estructura de lectura abierta que consiste de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 17 debe ser considerada heteróloga con respecto a la SEQ ID NO: 28; cualquier secuencia de nucleótidos diferente de una secuencia de nucleótidos que comprende una estructura de lectura abierta que consiste la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 18 debe ser considerada heteróloga con respecto a la SEQ ID NO: 29; cualquier secuencia de nucleótidos diferente a una secuencia de nucleótidos que comprende una estructura de lectura abierta que consiste la secuencia de nucleótidos expuestas en la SEQ ID NO: 19 debe ser considerada heteróloga con respecto a la SEQ ID NO: 30; cualquier secuencia de nucleótidos diferente de una secuencia de nucleótidos que comprende una estructura de lectura abierta que consiste de una secuencia de nucleótidos expuestas en la SEQ ID NO: 20 debe ser considerada heteróloga con respecto a la SEQ ID NO: 31; y cualquier secuencia de nucleótidos diferente de una secuencia de nucleótidos que comprende una estructura de lectura abierta que consiste de la secuencia de nucleótidos expuestas en la SEQ ID NO: 21 debe ser considerada heterologa con respecto a la SEQ ID NO: 32. Por consiguiente, una secuencia que es heterologa con respecto a una secuencia de control transcripcional particular por lo tanto puede incluir, por ejemplo, secuencias EC1 ortólogas, genes reportadores, genes marcadores seleccionabl.es, secuencias de ácido nucleico que codifican proteiná heterologas; secuencias de ácido nucleico que codifican RNA no traducido heterologas y los similares. En una modalidad adicional, la construcción de ácido nucleico además puede comprender una secuencia de nucleótidos que define un terminador de transcripción. El término "terminador de transcripción" o "terminador" se refiere a .una secuencia de DNA al final de una unidad transcripcional que señaliza la terminación de transcripción. Los terminadores son secuencias de DNA 3' -no traducidas que contienen generalmente una señal de poliadenilación, que facilita la adición de secuencias da poliadenilato en el extremo 3' de un transcripto primario. Como con la secuencias de promotor, el terminador puede ser cualquier secuencia terminadora que es operable a las células, tejidos u órganos en las cuales se propone para ser utilizado. Ejemplos de secuencia terminadoras adecuadas que puede ser útiles en células de plantas incluyen: el terminador de nopalina sintasa (nos), el terminator CaMV 35S el ' terminador de octopina sintasa (oes), los terminadores del gen inhibidor de proteinaza de papa (pin) , tal como los terminadores pinll y pinlll y los similares. En una modalidad especifica, la construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención comprende un cásete de expresión que comprende la estructura: ([N]w - TCS - [N]x - Sol - [N]y - TT - [N]z) en donde : [N]w comprende uno o más residuos de nucleótidos, o está ausente ; TCS comprende el ácido nucleico del primero y/o segundo aspecto de la invención, en donde el ácido nucleico define una secuencia de control transcripcional ; [N]x comprende uno o más residuos de nucleótido, o está ausente; Sol comprende una secuencia de nucleótidos de interés que codifica un mRNA o RNA no traducido, en donde la secuencia de nucleótidos, Sol, es operablemente conectada a TCS; [N]y comprende uno o más residuos de nucleótidos, o está ausente; TT comprende una secuencia de nucleótidos que define un terminador de transcripción; [?'] ? comprende uno o más residuos de nucleótidos, o está ausente. Las construcciones de ácido nucleico de la presente invención además pueden comprender secuencias de nucleótidos tal como, un origen de replicación para uno o más hospederos; un gen marcador seleccionable que es activo en uno o más hospederos y los similares. Como se utiliza en la presente, el término "gen marcador seleccionable" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo sobre una célula, en la cual se expresa, para facilitar la identificación y/o selección de células son transfectadas o transformadas con una construcción genética de la invención. "Genes marcadores seleccionables" incluyen cualquiera de la secuencias de nucleótidos que cuando se expresan por una célula, confieren un fenotipo sobre la célula que facilita la identificación y/o selección de células trasformadas . Un intervalo de secuencias de nucleótidos que codifican marcadores seleccionables adecuados es conocido en la técnica. Secuencia de nucleótidos ejemplares que codifican marcadores seleccionables incluyen: genes de resistencia de antibiótico tales como los genes de resistencia a ampicilina, genes de resistencia a tetraciclina, genes de resistencia a kanamicina, el gen AURI-C que confiere resistencia al antibiótico aureobasidina A, los genes neomicina fosfotransferasa (por ejemplo, nptl y nptll) y los genes higromicina fosfotransferasa (por ejemplo hpt); genes de resistencia de herbicida que incluyen genes de resistencia glufosinato, fosfinotricina o bialafos tal como los genes que codifican acetil transferasa de fosfinotricina (por ejemplo bar), genes de resistencia glifosato que incluyen lo genes que codifican 3-enoil piruvil siquimato 5-fosfato sintasa (por ejemplo aroA) , genes de resistencia bromixnilo que incluye genes que codifican bromixnil nitrilasa, genes de resistencia sulfonamida que incluyen genes que codifican dihidropterato sintasa (por ejemplo sul) y genes de resistencia sulfonilurea que incluye genes que codifican acetolactato sintasa; genes reportadores que codifican enzima tal como los genes que codifican GUS y cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) genes reportadores fluorescentes tales como el gen que codifica la proteina fluorescente verde; y genes reportadores basados en luminescencia tal como el gen luciferaza, entre otros. Las construcciones genéticas de la presente invención además pueden incluir secuencias de nucleótidos propuestas para el mantenimiento y/o replicación de la construcción genética en procariotas o eucariotas y/o la integración de la construcción genética o una parte de la misma en el genoma de una célula eucariótica o procariótica. En una modalidad, la construcción de la invención es adapta para ser por lo menos parcialmente transferida en una célula de planta por las vías de la transformación mediada por Agrobactehum. Por consiguiente, una modalidad adicional, la construcción de ácido nucleico de la presente invención comprende secuencias de borde de T-DNA izquierda y/o derecha. Las secuencias de borde de T-DNA adecuadas serian fácilmente averiguadas por habilidad en la técnica. Sin embargo, el término "secuencias de borde de T-DNA" debe ser entendidos que abarcan cualquiera de las secuencias de nucleótidos sustancialmente homologas y de manera sustancial directamente repetidas que delimitan una molécula de ácido nucleico que es transferida de una célula de Agrobactehum sp. En una planta susceptible á la transformación mediada por Agrobacterium . A manera de ejemplo, la referencia se hace el articulo de Peralta y Ream {Proc. Nati. Acad. Sci USA, 82(15): 5112-5116, 1985) y la revisión de Gelvin (Microbiology y Molecular Biology Reviews, 67(1·): 16-37, 2003). La presente invención también contempla cualquiera de las modificaciones adecuadas a la construcción genética que facilita la inserción mediada bacteriana en una célula de planta por la vía de bacterias diferentes a Agrobactehum sp., por ejemplo, como es descrito en Broothaerts y colaboradores (Nature 433: 629-633, 2005).

Aquellos expertos en la técnica estarán conscientes de como producir las construcciones descritas en la presente y de los requerimientos para obtener la expresión de las mismas, cuando es asi deseado, en una célula o tipo de célula especifica bajo las condiciones deseadas. En particular, será conocido para aquellos expertos en la técnica que las manipulaciones genéticas requeridas para realizar la presente invención fue requerida para la preparación de una construcción genética descrita en la presente un derivado de la misma en una célula procariótica tal como una célula de E. coli o una célula de planta o una célula de de animal. Métodos ejemplares para clonar moléculas de ácido nucleico se describes en Sambrook y colaboradores {Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2000) . En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una célula que comprende: (i) la construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención; y/o (ii) una forma genómicamente integrada de la construcción mencionada es (i) . La construcción de ácido nucleico se puede mantener en una célula como una molécula de ácido nucleico, como un elemento genético autónomamente replicante (por ejemplo Un plásmido, cósmido, cromosoma artificial o los similares) o se puede integrar en el DNA de la célula. Como se utiliza en la presente, el término "DNA genómico" debe ser entendido en su contexto más amplio que incluye cualquiera y todo el DNA que constituye el complemento genético de una célula. Como tal, el DNA genómico de una célula debe ser entendido que incluye cromosomas, DNA mitocóndrico, . DNA de plástida, DNA de cloroplasto DNA de plásmido endógeno y los similares. Como tal, el término "genómicamente integrados" contempla la integración cromosómica, integración de DNA mitocóndrica, integración de DNA de plástida, integración de DNA de cloroplasto, integración de plásmido endógeno y los similares. Las células contempladas por el cuarto aspecto de la invención incluyen cualquier célula procariótica o eucariótica . En una modalidad, las células son una célula de planta. Como se utiliza en la presente, el término "plantas" incluye cualquier planta que comprende un óvulo, incluyendo, por ejemplo, angiosperma y gimnospermas dicotiledóneas o monocotiledóneas . En otra modalidad, la célula de planta es una célula de planta dicotiledónea, por ejemplo, una célula de Arabidopsis sp. En todavía otra modalidad la célula es una célula de planta monocotiledónea y/o una célula de planta de cultivo de cereal.

En una modalidad específica, la célula es un óvulo de planta. En una modalidad adicional,, el nivel, la proporción y/o patrón de expresión de por lo menos una secuencia de nucleótidos es alterada en el óvulo de la planta con relación a la forma de tipo silvestre del óvulo de planta . En todavía otra modalidad, la célula también puede comprender' una célula procariótica . Por ejemplo, la célula procariótica puede incluir una célula, de Agrobactehum sp. que lleva la construcción de ácido nucleico y que puede, por ejemplo, ser utilizada para transformar una planta. En todavía otra modalidad, la célula procariótica puede incluir una célula de E. coli que puede, por ejemplo ser utilizada en la construcción o clonación de una construcción de ácido nucleico . En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una estructura multicelular que comprende una o más células del cuarto aspecto de la invención. En una modalidad, la estructura multicelular comprende una planta o una parte, órgano o tejido de la misma. Como se utiliza en la presente, "una planta o una parte, órgano o tejido de la misma" debe ser entendido que incluye específicamente una planta completa; o un tejido de planta; un órgano de planta; una parte de planta; material reproductor de planta (incluyendo, por ejemplo, cortes, semilla, flores, polen y los similares); y tejido de planta cultivado tal como un cayo o cultivo de suspensión. La estructura multicelular puede comprender uno o más óvulos de planta. Por ejemplo, la estructura multicelular puede comprender una planta, una flor, un carpelo o pistilo, un ovario de planta, un óvulo o un gametofito femenino (saco embriónico) . En una modalidad, el nivel, proporción y/o patrón de expresión de por lo menos una secuencia de nucleótidos es alterada en el uno o más óvulos de planta de la estructura multicelular con relación a la forma de tipo silvestre del óvulo. Como se expone en lo anterior, la presente invención es predicada en parte, sobre la transcripción efectiva de la secuencia de nucleótidos de interés bajo el control transcripcional del ácido nucleico del primero segundo o tercer aspecto de la invención, en donde un ácido nucleico comprende una secuencia de control transcripcional. Por consiguiente, en un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para expresar específicamente o preferencialmente una secuencia de nucleótidos de interés en un óvulo de planta, el método que comprende efectuar la transcripción de la secuencia de nucleótidos de interés en una planta bajo el control transcripcional del ácido nucleico de cualquiera del primero, segundo o tercer aspecto de la invención, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de control transcripcional especifica de óvulo de planta o preferencial de óvulo de planta. Generalmente, la expresión especifica o preferencial de una secuencia de nucleótidos de interés se efectúa al introducir el ácido nucleico en una célula de planta tal que la secuencia de nucleótidos de interés es operablemente conectada a una secuencia de control transcripcional de la presente invención. La presente . invención contempla cualquier método para efectuar la conexión operable de una secuencia de nucleótidos de interés a la secuencia de control transcripcional de la invención. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de interés puede ser incorporada en la molécula de ácido nucleico que . comprende la secuencia de control transcripcional, y ser operablemente conectada a la misma. De esta manera, la secuencia de nucleótidos de interés y la secuencia de control transcripcional ambas son introducidas en la planta. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico de la presente invención puede ser insertada en el genoma de la planta tal que se coloca en conexión operable con una secuencia de control transcripcional EC1 endógena. Como será reconocida por uno de habilidad en la técnica, la inserción de la secuencia de control transcripcional en el genoma de planta puede ser ya sea mediante la inserción no especifica del sitio o mediante la inserción especifica del sitio (para un ejemplo de inserción especifica de sitio ver Terada y colaboradores, Nat Biotechnol 20: 1030-1034, 2002). El ácido nucleico se puede introducir en una planta por la vía de cualquier método adecuado. Por ejemplo, una explanta o tejido de planta cultivado se puede transformar con una molécula de ácido nucleico, y la explanta o tejido de planta cultivado transformado subsecuentemente regenerado a una planta madura que producé semilla que incluye la molécula de ácido nucleico; un ácido nucleico puede ser directamente transformada en una planta, ya sea establemente o transientemente ; un ácido nucleico puede ser introducida en una planta por la vía dé reproducción utilizando una planta parental que lleva la molécula . de ácido nucleico; y los similares . En una modalidad, la molécula de ácido nucleico se introduce en una célula de planta por la via de transformación. Las células de planta pueden ser transformadas utilizando cualquier método conocido en la técnica que es apropiado para la especie de planta particular. Los métodos comunes se incluyen en la transformación mediada por Agrobacterium, los métodos de transformación basados en bombardeo de microproyectiles y los métodos basados en captación de DNA directa. Roa-Rodriguez y colaboradores (Agrobacterium-mediated transformation of plants, 3rd Ed. CAMBIA Intellectual Property Resource, Canberra, Australia, 2003) revisaron un amplio arreglo de métodos de transformación de plantas mediados por Agrobacterium adecuados para un amplia gama de especies de plantas. El bombardeo de microproyectiles también se puede utilizar para transformar tejido de planta en métodos para la transformación de planta, particularmente plantas de cereal, y tales métodos son revisados por Casas y colaboradores (Plant Breeding Rev. 13: 235-264, 1995) . Los protocolos de transformación de captación de DNA directos tal como la transformación de protoplásmico y electroporación descritos en detalle Galbraith y colaboradores (eds.), Methods in Cell Biology Vol. 50, Academic Press, San Diego, 1995). Además de los métodos mencionados en lo anterior, una gama de otros protocolos de transformación también pueden ser utilizados. Estos incluyen infiltración, electroporación de células y tejidos, electroporación de embriones, microinyección, ruta de polen-tubo, transformación mediada por carburo de silicio y liposoma. Los métodos tales como éstos son revisados por Rakoczy-Trojanowska {Cell. Mol. Biol. Lett. 7:849-858, 2002). Una gama de otros métodos de transformación de plantas también son evidentes para aquellos expertos en la técnica y, por consiguiente, la presente invención no debe ser considerada de ninguna manera limitada a los métodos de transformación de plantas particulares ejemplificados en lo anterior . La secuencia de nucleótidos de interés, que se coloca bajo el control regulador de la secuencia de control transcripcional de la presente invención, puede incluir cualquier secuencia de nucleótidos de interés. Las categorías generales de secuencia de nucleótidos de interés pueden incluir, por ejemplo: (i) genes de citotoxina tal como barnasa, RNasa o toxina de difteria que pueden ser utilizados para inducir esterilidad femenina y/o frutos sin embrión en una planta; (ii) genes que codifican reguladores transcrip- cionales que actúan durante las etapas tardías del desarrollo de embrión tal como los factores de transcripción BBM o LEC1/LEC2, AP2 que pueden ser utilizados para modificar el desarrollo del embrión y/o incrementar el tamaño del embrión; (iii) genes que codifican reguladores del ciclo celular tal como reguladores transcripción RB o E2F, que actúan durante las etapas tardías del desarrollo del embrión tal como BBM, LEC1/LEC2 o factores de remodelación de cromatina tal como DNA metiltransferasas , enzimas de modificación de histona y los similares, que pueden ser utilizados para efectuar el desarrollo del embrión apomictico (por ejemplo partenpgénesis ; embriogénesis autónoma) ; (iv) genes reportadores, tales como aquellos que codifican GUS, GFP y los similares; (v) genes involucrados en el metabolismo celular tales como las proteínas de dedo de Zinc, quinasas, proteínas de choque térmico y los similares ; (vi) genes involucrados en atributos agronómicos tal como resistencia a enfermedad o peste o resistencia a herbicida; (vii) genes involucrados en las características del grano tal como la biomasa del grano, valor nutricional, carácter!stica.s de post cosecha y los similares; (viii) genes que codifican proteínas heterólogas, tales como proteína que codifican enzimas heterólogas o proteínas estructurales o proteínas involucradas en las rutas biosintéticas para productos heterólogos; (ix) secuencias de nucleótidos que codifican RNA no traducido, por ejemplo un siRNA, miRNA, RNA antisentido y los similares. Generalmente, la secuencia de nucleótidos de interés es heteróloga con respecto a la secuencia de control transcripcional . En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para promover la esterilidad femenina en una planta, el método que comprende expresar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina citotóxica o' citostática o un RNA no traducido citotóxico o citostático, específicamente o preferencialmente en un óvulo de la plantaren donde la secuencia de nucleótidos es operablemente conectada a una ácido nucleico de cualquiera del primero, segundo o tercer aspecto de la invención y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de control transcripcional específica de óvulo de planta o preferencial de óvulo de planta . Como es referido en la presente, la "proteína citotóxica o citostática" o "RNA no traducido citotóxico o citostático" se refiera a cualquier proteína o RNA no traducido que inhibe o previene el crecimiento, división, función metabólica o fertilización del óvulo. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos codifica una proteína citotóxica seleccionada de la lista que consiste de una barnasa, una RNAsa o una toxina de difteria. En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método para modular el desarrollo del embrión y/o el tamaño del embrión en una planta, el método que comprende expresar una secuencia de nucleótidos que codifica un regulador transcripcional que actúa durante el desarrollo del embrión, específicamente o preferencialmente en un óvulo de la planta; en. donde la secuencia de nucleótidos que codifica ¦ un regulador transcripcional es operablemente conectada a un ácido nucleico de cualquiera del primero, segundo o tercer aspecto de la invención y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de control transcripcional específica de óvulo de planta o preferencial de óvulo de planta. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos que codifica un regulador transcripcional comprende un regulador transcripcional que actúa durante las etapas posteriores del desarrollo del embrión, más de preferencia el regulador transcripcional comprende un BBM, LEC1/LEC2, AP2 u otro factor de transcripción. En un noveno aspecto, la presente invención proporciona un método para promover apomixis en .una planta, el método que comprende expresar una secuencia de nucleótidos de promoción de apomixis específicamente o preferencialmente en un óvulo de la' planta; en donde la secuencia de nucleótidos de promoción de apomixis es operablemente conectado a un ácido nucleico del primero, segundo o tercer aspecto de la invención y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de control transcripcional especifica de óvulo de planta o preferencial de óvulo de planta. Como se utiliza en la presente, el término "secuencia de nucleótidos de promoción de apomixis" incluye cualquier secuencia de nucleótidos que promueve la apomixis cuando se expresa en una planta, y más particularmente, cuando se expresa en un óvulo de planta. La secuencia de nucleótidos de promoción de apomixis puede incluir, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de: (i) un regulador de ciclo celular, tal como RB o E2F; (ii) un regulador transcripcional que actúa durante las etapas posteriores del desarrollo del embrión, tal como BBM, LEC1/LEC2; (iii) un factor de remodelación de cromatina tal como DNA metiltransferasa ; o (iv) una enzima de modificación de histona. Los métodos del sexto, séptimo, octavo y noveno aspecto de la presente invención se pueden realizar utilizando cualquier planta adecuada. Sin embargo, en una modalidad preferida, la planta es una planta dicotiledónea y, en otra modalidad, una planta Arabidopsis sp. Las modalidades adicionales, la planta puede ser una planta monocotiledónea y/o una planta de cultivo de cereal. Finalmente, la referencia se hace a libros de texto estándares de biología molecular que contienen métodos para llevar a cabo técnicas básicas abarcadas por la presente invención, que incluyen la restricción de DNA y la ligación para la generación de las diversas construcciones genéticas descritas en la presente. Ver, por ejemplo, Maniatis y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1982) y Sambrook y colaboradores, (2000, supra) . La presente invención es además descrita por los siguientes ejemplos no limitativos: BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un perfil de expresión de transcriptos C06_3 {TaECl) originalmente derivados de la librería de cDNA de óvulo de trigo. La expresión de TaECl se examinó mediante RT-PCR utilizando RNA total tratado con DNAsa de diferentes tejidos de trigo y cebadores específicos de gen para C06_3. Como controles, el cDNA de óvulos, células centrales y pro-embriones de 2 células se han utilizado. La calidad y cantidad del cDNA ' generado se verificó utilizando cebadores para el GAP-DH ubicuitamente expresado. Franja 1: óvulo, 2: pro-embrión, 3: célula central, 4: coleóptilo, 5: hoja primaria, 6: hoja madura, 7: tallo, 8: raíz sin punta, 9: punta de raíz, 10: antera, 11: pistilo, 12: núcleo 12 dap (días después de la polinización), 13: control negativo. La Figura 2 muestra un perfil de expresión de genes similares de AtECl en Arabidopsis . La expresión se examinó mediante RT-PCR utilizando mRNA tratado con DNAsa de diferentes tejidos de Arabidopsis y cebadores específicos de gen para AtECl.1, AtECl.2a/b, AtECl .4 y AtECl.5. Todos los cinco genes de Arabidopsis son exclusivamente expresados en tejidos que contienen el gametofito femenino. La calidad y cantidad de cDNA generado se verificó utilizando el cebador para el gen Actina 3 ubicuitamente expresado. Franja 1: hoja, 2: tallo, 3: raíz, 4: brote de flor, 5: flor madura, 6: flor 1-3 dap, 7: pistilo, 8: antera, 9: control negativo. La Figura 3 muestra la localización del transcripto de los genes similares a AtECl en óvulos de Arabidopsis . La hibridación in situ se realizó utilizando secciones incrustadas de pistilos maduros hibridados con una sonda antisentido AtECl.2a (A) y sonda antisentido AtECl.1 (B) . Como control, se utilizaron sondas de sentido de AtECl.1 (C) y AtECl.2a. Las flechas apuntan hacia el óvulo, que muestran señales específicas del óvulo, en (A) y (B) . Los transcriptos de los genes similares a AtECl no podrían ser detectados en otras células en el saco embriónico no fertilizado o en embriones jóvenes, temprano después de la fertilización (no mostrado) . La Figura 4 muestra la actividad de promotor de genes similares a AtECl en Arabidopsis . Los promotores pAtEcl.l y pAtEcl.2 se clonaron como funciones traduccionales 5' corriente arriba del gen ß-Glucuronidasa . Las construcciones, clonadas se utilizaron para la transformación estable de Arabidopsis . Las flechas apuntan a los óvulos que muestran el manchado de GUS en pAtEcl .1 : : GUS (A) y óvulos pAtEcl .2a : : GUS antes de la fertilización (B) y un cigoto después de la fertilización (C) . La actividad GUS fue únicamente observada en óvulos de óvulos no fertilizados. Después de la fertilización, la actividad GUS fue todavía visible en el cigoto (C) ; sin embargo, esto fue debido a la alta estabilidad de ß-Glucuronidasa . Una representación esquemática de un óvulo de Arabidopsis no fertilizado se muestra en (D) (Drews y Yadegari, Annu . Rev. Genet . 36: 99-124, 2002). Abreviaciones: (ac) células antipodales ; (ce) célula central; (ch) chalaza; (ec) óvulo; (emb) embrión; (f) funículo; (mp) micrópilo; (se) sinergida; (sn) núcleo secundario; (zyg) cigoto. La Figura 5 muestra la expresión de EGFP (proteína fluorescente verde aumentada) como una fusión C-terminal a la estructura de lectura abierta de AtECl.1, bajo el control de promotor de pAtECl .1. La construcción se utilizó para la transformación de Arabidopsis thaliana. Los óvulos de plantas transgénicas se analizaron microscópicamente para fluorescencia verde utilizando DIC (A, C) y luz UV (B, D) así como luz UV para CLSM (microscopía de exploración de láser confocal) (E-G) . La fluorescencia verde fue visible en el polo de chalazal de los óvulos en óvulos no fertilizados (flecha en B) antes de la fertilización. Después de la fertilización, la proteína fluorescente secretada es visible entre el cigoto (zyg; flecha) y el endosperma vecina (C y D) . CLSM muestra la proteína dentro de vesículas del óvulo no fertilizado, (F) es un agrandamiento de (E) y (G) muestra' la fluorescencia EGFP del .óvulo. La fluorescencia roja fue removida. La Figura 6 muestra una alineación de cDNA de EC1 y secuencias genómicas predichas que codifican estructuras de lectura abierta (ORFs) derivadas de trigo (TaECl) , cebada {HvECA.l), arroz {OsECl) y Arabidopsis (AtECl) . La Figura 7 mue.stra una alineación de ORFs de EC1 derivadas de cDNA de cereal y secuencias genómicas predichas. La Figura 8 muestra una alineación de ORFs predichas de EC1 derivadas de secuencias genómicas de Arabidopsis thaliana. La Figura 9 muestra una alineación de proteína de las proteínas EC1 de trigo (TaECl), cebada (HvECAl), arroz (OsECl), Arabidopsis (AtECl) y Medicago truncatula (MtECl.l). La Figura 10 es una representación gráfica que muestra las porciones sobre representadas noyedosas en la región corriente arriba de los genes expresados específicos de óvulo identificados MotifSampler . El algoritmo de descubrimiento de porción usa el muestreo de Gibbs para encontrar la matriz de probabilidad de posición que representa la porción. EJEMPLO 1 Identificación de genes específicamente expresados en óvulos de planta Con el fin de identificar genes que son específicamente expresados en el óvulo, gametofitos femeninos de trigo inicialmente se microdisectaron para aislar los óvulos. Utilizando el RNA mensajero de 12 óvulos, una librería de cDNA se construyó y la secuenciación parcial de una sola corrida de 960 clones de cDNA aleatoriamente seleccionados se realizó. -Después del rastreo del secuenciador de DNA los datos pasaron a una tubería de limpieza automatizada, un total de 735 ESTs se utilizaron para análisis bioinformático . Los 735 ESTs formaron 404 agrupaciones independientes que incluyen 310 singletones. Las secuencias consensúales de las agrupaciones se utilizaron para búsquedas de BLASTN y BLASTX en la base de datos no redundante de NCBI (nr) , bases de datos de dbEST y SwissProt. Algunas secuencias de cDNA dieron por resultado información de secuencia limitada a partir de las regiones de no codificación. Por lo tanto, las búsquedas se realizaron contra la Liberación de índice de Gen de Trigo 8.0 .TIGR, utilizando el algoritmo BLASTN. Si una igualación con >95% de identidad de secuencia sobre la longitud total de la secuencia interrogante se encontró, la secuencia de igualación se recuperó y se utilizó en búsquedas de BLASTX subsecuentes en lugar del EST original. Las búsquedas BLASTN contra la categoría de base de datos NCBI de ESTs no de ratón y no de humano dio por resultado 629 ESTs de óvulo (333 agrupaciones) que igualan significativamente a los ESTs anotados principalmente generados de diferentes tejidos vegetativos de trigo, cebada o arroz (NCBI dbEST Poaceae) . 106 ESTs de óvulo (71 agrupaciones) no igualaron los ESTs anotados y de esta manera fueron considerados como transcriptos "novedosos" . Se seleccionaron transcriptos que no se igualaron a cualquier EST generado de tejidos de planta vegetativos, y que igualaron a las llamadas proteína "hipotéticas" (estructuras de lectura abierta predichas por computadora de las secue5ncias genómicas de Arabidopsis y/o de arroz). Se supuso que los genes correspondientes de alguno de estos transcriptos podrían ser específicamente expresados en óvulos de plantas de semilla. Similitudes significantes a las proteínas "hipotéticas" de Arabidopsis y/o arroz se identificaron para-98 agrupaciones de óvulos. De estas, 11 agrupaciones no fueron similares a cualquiera del EST publicado sino solamente a los genes "hipotéticos" anotados detectados en genomas de Arabidopsis y/o de arroz y se concluyó que estos podrías ser genes candidatos que son específicamente o preferencialmente expresados en lo gametos femeninos o el gametofito de Arabidopsis y/o arroz. Usando esta estrategia se identificó una agrupación muy grande de transcriptos del óvulo de trigo {TaECl) , que no se igualo a los ESTs de cualquiera de los tejidos vegetativos, pero que exhibió similitud significante a las proteínas hipotéticas de Arabidopsis , Medicago truncatula y arroz. En total, hay cinco genes hipotéticos similares a TaECl en Arabidopsis, que están localizados sobre los cromosomas 1, 2, 4 y 5. Esto se designaron a AtECl.l (SEQ ID NO: 13), AtEC1.2a (SEQ ID NO: 14), AtECl .2b (SEQ ID NO: 15), AtECl.4' (SEQ ID NO: 16) y AtECl.5 (SEQ ID NO: 17). Un gen similar a TaECl hipotético en Medicago truncatula se designó en MtECl.l (SEQ ID NO: 18) y los tres genes similares a TaECl hipotéticos en el arroz se localizaron sobre los cromosomas 3, 11, y 12 y se designaron OsECl.l (SEQ ID NO: 19), OsECl .2 (SEQ ID NO: 20) y OsECl .3 (SEQ ID NO: 21) . La expresión específica de TaECl se investigó mediante RT-PCR utilizando el RNA total tratado con DNAsa de diferentes tejidos de trigo y cebadores específicos de gen para la agrupación de cDNA de óvulo C06_3 {TaECl. SEQ ID NO: 22) . La expresión de TaECl no se detectó en cualquier tejido vegetativo, en las anteras o la cariopsis en desarrollo de 12 días de edad del trigo. Los transcriptos fueron solamente encontrados en el tejido que contiene el óvulo no fertilizado (pistilo), y los óvulos aislados. Después de la fertilización, TaEC-1 es regulado hacia abajo (ver la Figura 1) . Un perfil de expresión similar de observó para los genes similares a AtECl en el Arabidopsis . La expresión se examinó mediante RT-PCR utilizando mRNA tratado con DNAsa de diferentes tejidos de Arabidopsis y cebadores específicos de gen para AtECl.1 AtECl.2a/b, AtECl .4 y AtECl.5. Todos los cincos genes de Arabidopsis son exclusivamente expresados en tejidos que contiene el gametofito femenino (ver la Figura 2) . EJEMPLO 2 Confirmación de la expresión específica de óvulo para transcriptos similares a AtECl La especificidad de óvulo de' los transcriptos similares a AtECl se confirmó mediante la hibridación in situ utilizando secciones incrustadas de pistilos de Arabidopsis maduros hibridados con una zonda antisentido AtECl.2a y AtECl.1, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3, nada de mRNA de los genes similares AtECl podría ser detectado en otras células del saco embriónico no fertilizado o en embriones jóvenes después de la fertilización. EJEMPLO 3 Especificidad de promotores derivados de ECl La especificidad de promotor de los genes similares a AtECl se analizó al clonar una región corriente arriba 5' definida de AtECl.1 (pAtECl.l: SEQ ID NO: 24) y una región corriente arriba 5' definida de AtECl.2 {pAtEC1.2: SEQ ID NO: 25) corriente arriba del gen ß-Glucuronidasa (GUS). Construcciones clonadas se utilizaron para la transformación estable de Arabidopsis . La actividad de GUS se detectó en óvulos de óvulos no fertilizados. Después de la ' fertilización, sin embargo, la actividad GUS fue todavía visible en el cigoto, debido a la alta estabilidad de la ß-Glucuronidasa (ver la Figura 4). Además, EGFP (proteína de fluorescencia verde aumentada) fue fusionada en C-terminal a la estructura de lectura abierta de AtECl .1 (SEQ ID NO: 13), bajo el control del promotor AtECl.1 (SEQ ID NO: 24) . La construcción .se utilizó para la transformación de Arabidopsis . Óvulos de plantas transgénicas se analizaron microscópicamente para la fluorescencia verde bajo DIC y luz -UV. Además, las señales EGFP se observaron mediante la Microscopía de Exploración de Láser Confocal (CLSM) . Como se muestra en la Figura 5, la fluorescencia verde fue visible exclusivamente en óvulos de óvulos no fertilizados. Temprano después de la. fertilización, algo de .proteína fluorescente fue todavía visible en el cigoto así como secretada entre el cigoto y el endosperma vecino. Nada de EGFP podría ser detectado en otras células del saco embriónico o en etapas posteriores del desarrollo del embrión. EJEMPLO 4 Materiales y Métodos - Aislamiento de células del saco embriónico de trigo antes y después de la fertilización Espigas de Thiticum aestivum cv ^Florida' se emascularon 2-4 días antes de la antesis y se cubrieron con bolsas para prevenir la fertilización. Los óvulos se aislaron mecánicamente de los óvulos microdisectados en manitol estéril en 0.55 M utilizando agujas de vidrio de punta fina y un microscopio ^invertido, como es descrito por Kumlehn y colaboradores, ( Protoplasma 208: 156-162, 1999). Células individuales se transfirieron en tubos de reacción de 0.5 mi al utilizar un capilar de vidrio interconectado con un sistema hidráulico a una microbomba. Las células recolectadas inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido. EJEMPLO 5 Materiales y Métodos - Aislamiento de RNA y síntesis de cDNA El mRNA se aisló de 12 óvulos utilizando el Micro Equipo Dynabeads® mRNA DIRECT™ (Dynal) siguiendo las guías del fabricante, pero se escaló a 50 µ? . El mRNA recosido se aisló utilizando un dispositivo de transferencia de partículas magnético (PickPen™, Bio-Nobile) .

Subsecuentemente, el equipo de síntesis de PCR cDNA SMART™ (BD Biosciences) se utilizó para la síntesis de DNA. El cDNA de primera hebra, PCR de Larga distancia, y la determinación de los números de ciclo óptimos para generar una población de cDNA y representativa se realizó de acuerdo con las guías del fabricante,, pero utilizando un fragmento marcado con digoxigenina-ll-dUTP (Roche de Applied Science) de GAPDH de trigo como una sonda. EJEMPLO 6 Materiales y métodos - Construcción de la librería y secuenciación 150 µg de cDNA se utilizó para refinamiento de acuerdo con las instrucciones del equipo de síntesis de PCR cDNA SMART™ (BD Biosciences) . Subsecuentemente, 3 g de adaptadores EcoRI (Notl) (Invitrogen) se ligaron al cDNA de extremo despuntado, utilizando T4 ligasa (New Engly Biolabs) . Los adaptadores restantes y los fragmentos por debajo de 0.3 kb se removieron, mediante electroforesis en agarosa de bajo punto de fusión al 0.8% (Seaplaque GTG) . Después, el cDNA se extrajo utilizando ß-agarasa I (New Engly Biolabs) . Después de la fosforilación de los extremos cohesivos EcoRI (10 U/µ? de T4 polinucleótido quinasa, New Engly Biolabs), se realizó una segunda etapa de purificación utilizando las columnas Chromaspin™ (BD Biosciences) . El cDNA luego se ligo en el vector ZAP® II lambda/EcoRI /CIAP predigeridos (Stratagene) . El título de la librería no amplificada fue 1.43 x 106 pfu/ml. Después de la amplificación y la excisión in vivo los clones se recolectaron aleatoriamente y se utilizaron para generar ESTs. Los tamaños de , inserto variaron de 300 a 3000 bp, con un' promedio de 900 bp . La longitud de secuencia leíble promedio de los ESTs fue de aproximadamente 500 bp.' Los datos del rastreador del secuenciador DNA subsecuentemente pasaron a una tubería de limpieza automatizada que incluye PHRED a las llamadas bases y asignan valores de calidad, seguido por CROSS_MATCH para alinear la secuencia y para eliminar las secuencias de vector. EJEMPLO 7 Materiales y Métodos - Bioinformática Las secuencia se agruparon utilizando blastclust (NCBI) y se ensamblaron en contiguos utilizando el Vector NTI 8 (paquete de software Invitrogen) . La secuencia consensual del contiguo o el representativo más largo se utilizó para las búsquedas de BLASTN contra la base de datos no redundantes (nr). NCBI y la base de datos de EST, y para búsqueda de BLASTX contra la base de datos NCBI y SWISSPROT (Marzo 2004) . Un número de cDNAs dio por resultado información de secuencia limitada (100 - 250 bp) de las regiones de no codificación. Por lo tanto, la búsquedas de BLASTN Contra la Liberación del índice de Gen de Trigo TIGR de 8.0 (Quackenbush y colaboradores, Nucleic Acids Res 29: 159-164, 2001) se utilizaron, utilizando el algoritmo BLASTN.

Si una igualación con >95% de identidad de secuencia sobre la longitud total de la secuencia interrogante se encontró la secuencias de igualación se recuperó y se utilizó en la búsquedas de BLASTX subsecuentes en lugar de EST original. Una secuencia se consideró novedosa si no mostró una igualación significante con una decencia de las bases de datos de . NCBI (nr, EST) o al TIGR de las secuencias consensúales de trigo ensambladas utilizando el algoritmo BLASTN (Altschul y colaboradores, 1997, supra) . El lumbral de significado utilizado para las búsquedas de BLASTN fueron: Registro > 115, Valor esperado < e~25. Para búsquedas de BLASTX, el corte para una igualación significante para todos excepto . las secuencias cortas fue un valor e de < e"15, Registro > =. 80. Las igualaciones para secuencias interrogantes cortas (por debajo de 260 bp) se inspeccionaron y se clasificaron en categoría manualmente. Las agrupaciones que codifican proteínas de funció conocida se clasificaron en categoría manualmente en grupos funcionales amplios utilizando la clasificación MIPS (Centro de Información de Munich para Secuencias de Proteínas) como guía. EJEMPLO 8 Materiales y Métodos - Análisis de expresión mediante RT-PCR El RNA de trigo se aisló de tejidos vegetativos y generativos utilizando el reactivo TRIzol® ( Invitrogen ) , siguiendo esencialmente el protocolo del fabricante. Los tejidos que contienen almidón tal como cariópside se extrajeron dos veces, utilizando 3 mi de reactivo de TRIzol® por 100 mg de tejido. La cantidad de la preparación de RNA total se analizó al desnaturalizar con electroforesis de gel de agarosa. Antes de RT-PCR, 1 µ? del RNA total' se digirió con DNAsa (RNAsa libre; Invitrogen) y subsecuentemente se utilizó para la síntesis de cDNA de primera hebra utilizando 01igo(dT) 23 (Sigma) y transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen), siguiendo el protocolo del fabricante pero adicionando RNAseOUT™ (Invitrogen) . La calidad y la cantidad de cDNAs generado se analizaron mediante PCR con los siguientes cebadores que abarcan el intrón dirigidos contra el GAPDH de trigo: TaGAPl 5' -AGGGTGGTGCCAAGAAGGTCA-3' ( SEQ ID NO: 34) TaGAP2 5' -TATCCCCACTCGTTGTCGTA-3 ' (SEQ ID NO: 35) La expresión de TaECl se analizó utilizando el par de cebadores: TaECl fw2 5' -CCGAGCGGCTGCAGGGAGTGG-3 ' (SEQ ID NO: 36) TaECl rev2 5 ' -GCGTCGGAGTAGCCCTTGAGCA-3 ' (SEQ ID NO: 37) Las reacciones de PCR se llevaron acabo para 30 ciclos {GAPDH) y 38 ciclos (TaECl) respectivamente, utilizando 2.5 µ? de. cDNA como plantilla. El mRNA de Arabidopsis se aisló de hasta 5mg de tejido utilizando el micro equipo Dynabeads® mRNA DIRECT™ (Dynal) siguiendo las guias del fabricante. El mRNA recocido se aisló utilizando un dispositivo de transferencia de partículas magnético ( PickPen™, Bio-Nobile) . Antes de RT-PCR, el mRNA recocido se trato con\ DNAsa (RNAsa libre; Invitrogen) en un volumen de ??µ?. La síntesis de cDNA de primera hebra se llevo a cabo utilizando 01igo(dT)2o (Invitrogen) y la transcriptas inversa Superscript II (Invitrogen), siguiendo el protocolo del fabricante pero adicionando RNAseOUT™ (Invitrogen). La calidad y cantidad de los cDNAs generados se realizó mediante PCR con los siguientes cebadores que abarcan intrón dirigidos contra lactina de Arabidopsis (At2g37620) : Act3fw 5' -GATTTGGCATCACACTTTCTACAATG-3' (SEQ ID NO: 38) Act3rev 5' -GTTCCACCACTGAGCACAATG-3 ' (SEQ ID NO: 39) cDNAs similares AtECl se amplificaron utilizando los siguientes pares de cebadores específicos de gen para cada uno de AtECl.1, AtECl.2a/b, AtECl .4 y AtECl.5: AtECl. lfw 5' -ACAGTGACAGCTCGCCCTCTC-3 ' (SEQ ID NO: 40) AtECl . lrev 5 ' -AGTCATTGCCATCATAGTAACCTT-3 ' (SEQ ID O:41) AtECl.2a/bfw 5 ' -AGTTTCCTCTTTGCCACCATC-3 ' (SEQ ID NO: 42) AtECl .2a/brev 5 ' -CACCGTTGAGGAAGAAGAGAA-3 ' SEQ ID NO: 43) AtECl.4fw 5' -CCAGCGGAGTCATCAACCAACATA-3 ' (SEQ ID NO: 44) AtECl.4rev 5 ' -GGAGACGGAGCCGGAGAAGAGT-3 ' ' (SEQ ID NO: 45) AtECl.5fw 5 ' -GCGCCGGAAACTTGATGGACT- 3 ' (SEQ ID NO: 46) AtECl.5rev 5 ' -GGCGCCGGTGAAGGAGATAAT-3 ' (SEQ ID NO: 47) 2µ1 de cDNA se utilizó como plantilla para cada reacción de PCR. EJEMPLO 9 Materiales y Métodos - Clonación de las construcciones de fusión de promotor-GUS DNA genómico de A. thaliana (ecotipo Columbia-0) se aisló de acuerdo con Li y Chory, en Methods in Molecular Biology (Vol. 82) Eds . Martinez-Zapater , y Salinas, pp55-60, 1997) . Fragmentos genómicos de AtECl.l y AtECÍ.2a se amplificaron del DNA genómico mediante PCR, utilizando Taq DNA Polimerasa "de lectura de prueba" (MBI Fermentas) . Cebador de promotor: pAtECl.l 5' -TGCCTTATGATTTCTTCGGTTTC-3 ' (SEQ ID NO: 48) y cebador especifico de gen: AtECl.l revi 5 ' -TCAGAGTCATTGCCATCACAGTAACCTT-3 ' (SEQ ID NO: 49) se utilizaron para la amplificación de la región de promotor y parte del gen AtECl.l (837bp). Cebador de promotor: pAtEC1.2a 5 ' -AAGCATTTGCGTTTGGTTTATC-3 ' (SEQ ID NO: 50) y cebador de terminador: tAtEC1.2a 5' -AATGCGGTTTTAGTCACACG-3' (SEQ ID NO: 51) se utilizaron para la amplificación de AtEC1.2a (1371 bp) . Los productos de amplificación genómicos se clonaron en pCR®2.1-TOPO® ( Invitrogen) , después de adicionar 3'adeninas (TOPO-gAtECl .1 y TOPO-gAtECl .2a ) . La 3'A-adición, ligación y transformación de células TOP10F' competentes se realizó de acuerdo con las guías del fabricante. Los cebadores específicos del gen que contienen sitios de restricción se diseñaron para clonar los promotores enfrente de gen ß-Glucuronidasa (uidA; Jefferson y colaboradores, EMBO J 6: 3901-3907, 1987) . 457bp 5' corriente arriba del codón de inicio AtECl.l se amplificó del TOPO-gAtECl .1 utilizando los cebadores M13rev (cebador de vector) y: AtECl.l-Pstl 5' -CCATTTCTCTGCAGATTGATAA-3 ' (SEQ ID NO: 52) 893bp 5 corriente arriba del codón de inicio AtEC1.2a se amplificó del TOPO-gAtECl .2a utilizando los cebadores M13rev (cebador de vector) y: AtECl .2a-BgIII 5 ' -CCATAGATCTTTCTTTTTGGGG-3 ' (SEQ ID NO: 53) Después de la precipitación de las reacciones de PCR (1/10 vol. 3M NaAc , pH 5.2/1 vol. de Isopropanol) , los fragmentos purificados se restringieron con PstI (promotor AtECl.l) y BamHI/BglII (promotor AtECl.2a), respectivamente. Las mismas enzimas se utilizaron para la restricción del vector que contiene GUS pMG2002 (Manfred Gahrtz, no publicado) , para de esta manera remover el promotor de ubicuitina de maíz enfrente del gen GUS. · Los fragmentos restringidos y vectores se purificaron utilizando el equipo de purificación de DNA "Easy Puré" (Biozym) . Antes De la ligación, los plásmidos digeridos con PstI y BamHI/BglII se desfosforilaron utilizando CIAP (Fosfatasa alcalina de intestino de ternero; MBI Fermentas) , siguiendo las guías del fabricante. Los promotores se ligaron en vectores digeridos y desfosforilados utilizando T4 ligasa (1 U/µ?; Invitrogen) , siguiendo el protocolo del fabricante. Las reacciones de ligación se utilizaron para transformar células Top 10F' competentes a (Invitrogen). Los clones positivos se seleccionaron mediante la PCR de colonia, utilizando cebadores específicos de gen: GUS start rev 5' -ATCCAGACTGAATGCCCACA-3' (SEQ ID NO: 54), pAtECl.l (SEQ ID NO: 48) y pAtEC1.2a (SEQ ID No: 50) . ¦ Todas las preparaciones de plásmidos se realizaron ya se utilizando el equipo II Miniprep de plásmido E.Z.N.A. (Peqlab) o el equipo 100 Midi de plásmido QIAGEN (Qiagen) . Todos los fragmento clonados y las construcciones se verificaron al secuenciar, utilizando ya sea cebadores flanqueantes M13fw y M13rev (TOPO-gAtECl .1 y TOPO-gAtECl .2a ) , o los cebadores específicos de gen GUS Start rev (SEQ ID NO: 54), pAtECl.l (SEQ ID NO: 48) y pAtEC1.2a (SEQ ID NO: 50). EJEMPLO 10 Materiales y Métodos - Clonación 'de la proteína de fusión de GFP EGFP (proteína de fluorescencia verde aumentada; Pang y colaboradores, Plant Physiol 112: 893-900, 1996) se fusionó C-terminal a la estructura de lectura abierta de AtECl.l, bajo control del promotor AtECl.l. El promotor y' la estructura de lectura abierta de AtECl.l se amplificó del DNA genómico utilizando la Taq polimerasa de "lectura de prueba" (MBI Fermentas) y los cebadores: E1F 5' -GCCTTATGATTTCTTCGGTT-3 ' (SEQ ID NO: 55) E1R 5' -GCAGGAGTGTAAAGATGAAT-3 ' (SEQ ID NO: 56) Una segunda amplificación de AtECl.l se realizó utilizando los cebadores modificados: EC1-PF2 5' -CCCCGAATTCCTTATGATTTCTTCGGT-3 ' (SEQ ID NO: 57) EC1-R 5' -CTCGGATCCGGGTTAGAAGGAGAA-3 (SEQ ID NO: 58). Después dé la restricción con EcoRI y BamHI, el fragmento se clonó en los sitios EcoRI-BamHI del vector p7U-GFP (DNA Cloning Service) . La fusión C.-terminal de EGFP y la secuencia del fragmento clonado se verificó al secuenciar utilizando los cebadores: GFP-seq 5 ' -CCAGTTCCACCAGGATTG-3 ' (SEQ ID NO: 59) LH1 5' -CCCAAGATCTGGCCCTT-3 ' (SEQ ID NO: 60). EJEMPLO 11 Materiales y Métodos - Transformación estable de Arabidopsis Para transformación de planta los vectores se transfirieron en la cepa GV3101 de Agrobacterium turnefaciens (Koncz y Schell, Mol Gen Genet 204: 383-396, 1986). Las transformaciones se realizaron en el ecotipo Columbia-0 mediante un procedimiento de "inmersión floral" de acuerdo con Clough y Bent {Plant J 16: 735-743, 1998). Las semillas de los transformantes- TO se germinaron en el suelo después de un tratamiento frío de 2 días a 2°C. Tres días después de la germinación, los transgénicos se seleccionaron al rosear 200 mg/1 de BASTA® (Bayer Crop Science) suplementado con Tween al 0.1%. El tratamiento con BASTA® se repitió dos veces después de tres días, cada uno. Las plántulas sobrevivientes se transfirieron a macetas individuales. Las plantas resistentes a BASTA® de la generación TI y T2 se analizaron para la presencia del T-DNA mediante PCR utilizando cebadores GUS: GUS3 5' -GCGTGGTGATGTGGAGTATTG-3 ' (SEQ ID NO: 61) GUS4 5' -TCACCGAAGTTCATGCCAGTC-3 ' (SEQ ID NO: 62) o cebadores: bar-fw 5' -CCGTACCGAGCCGCAGGAAC-3 ' (SEQ ID NO: 63) bar-rev 5' -CAGATCTCGGTGACGGGCAGGAC-3 ' (SEQ ID NO: 64) EJEMPLO 12 Materiales. y Métodos - manchado de GUS La actividad de de ß-glucuronidasa (GUS; Jefferson y colaboradores, 1987, supra) se realizó de acuerdo con un protocolo.de Vielle-Calzada y colaboradores, (Nature 404: 91-94, 2000) . Las inflorescencias, silicuas, hojas y tallos de las plantas cultivadas en el suelo de transfirieron a cavidades de microtitulo que contienen 500µ1 de la solución reguladora de manchado de GUS . Los pistilos y silicuas se cortaron longitudinalmente con una aguja hipodérmica (0.4 x 20mm, Braun) antes de la transferencia en la solución reguladora de manchado de GUS. Las cajas de microtitulo se colocaron bajo vacio durante 5 min. Después . de la liberación del vacio, las placas se cubrieron con una tapa y se incubaron a 37°C en la obscuridad durante 6 horas, o hasta 3 días. Después, la solución se removió y los tejidos se despejaron en etanol al 70%. Los óvulos se aislaron sobre una platina de vidrio al disectar los pistilos con una jeringa en una gota de solución reguladora de fosfato de sodio, pH 7.0. Los óvulos se despejaron utilizando ya sea solución de Hoyers (Liu y Meinke, Plant J 16: 21-31, 1998) o solución reguladora de aclaramiento de hidrato Cloral (80g de hidrato doral, 20ml H20, 10ml glicerol) y se analizaron bajo un microscopio Zeiss Axioskop bajo la óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC). Las imágenes se capturaron sobre una cámara Axiocam (Zeiss) utilizando el programa Axiovision AC Reléase 4.1 (Zeiss). EJEMPLO 13 Materiales y Métodos - manchado de GUS Los óvulos de plantas de Arabidopsis transgénicas se disectaron en platinas de vidrio en solución salina regulada de fosfato, pH 7.4 (8g NaCl, 0.2g KC1, l.,44g Na2HP04, 0.24g KH2P04) . La fluorescencia se observo utilizando un Microscopio de Exploración de Láser Confocal (CLSM) , como es descrito por Knebel y colaboradores. (Eur J Cell Biol 52: 328-340, 1990) . EJEMPLO 14 Materiales y Métodos - Hibridación In situ La hibridación in situ no radioactiva con sondas de RNA marcadas con DIG de AtECl .1 y AtEC1.2a se realizó como es descrito por Vielle-Calzada (Genes Dev 13: 2971 -2982, 1999). Para generar sondas de RNA mediante la transcripción in vitro, la estructura de lectura abierta y 3'-UTR de AtECl.1 y AtECl.2a se amplificó del DNA genómico mediante PCR y subsecuentemente se clonó en pCR®II-TOPO® ( Invitrogen) . Los cebadores utilizados para la amplificación de AtECl.1 fueron: 1-1 fwXbal 5' -ATCTGTCTAGAAATGGCTTC-3 ' (SEQ ID NO: 65) 1-1 revXbal 5 ' -TTTATTCTAGAAAGTAATAACAG-3 ' (SEQ ID NO: 66) Los observadores utilizados para las amplificación de AtECl.2a fueron: At2a-Bglllfw 5 ' -AAAGAAAGATCTATGGCTTCTAAC-3 ' (SEQ ID NO: 67) At2a-Salrev 5 ' -TCATTAGTCGACTTTGCATACATC-3 ' (SEQ ID NO: 68) La ligación de los productos de PCR en pCR®II-TOPO® y la transformación de células competentes se realizó de acuerdo con las guias del fabricante.

Las colonias positivas se seleccionaron mediante PCR de colonia, utilizando los cebadores de vector 13-20 y M13rev. Los plásmidos se prepararon utilizando el equipo Midi de plásmido QIAGEN 100 (Qiagen) . Los fragmentos clonados se verificaron mediante secuenciación, utilizando los cebadores de vector M13fw y M13rev. Los plásmidos se- linealizaron utilizando BamHI (sentido) y Xhol (antisentido) y se purificaron por dos veces de extracciones de fenol/cloroformo seguido por precipitación. Los transcriptos de corrimiento de los plásmidos linealizados (0.5µ?/µ1 en agua tratada con DEPC) se generaron al utilizar T7 y SP6. polimerasas para la transcripción in vitro. La hibridación in situ en óvulos de Arabidopsis con sondas de sentido y antisentido se realizó utilizando secciones de 8µ?? de pistilos no fertilizados y fertilizados, maduros, incrustados, esencialmente- siguiendo un protocolo de Jackson, D. (in: Molecular Plant Pathology, A Practical Approach. (Bowles, DJ. , Gurr, SJ. y McPhereson, M. , eds.), Oxford University Press, U.K., 163-174, 1991) . Las secuencias de DNA y de proteínas se alinearon utilizando el software ClustalW (Higgins y colaboradores, Nucí. Acíds Res. 22: 4673-4680, 1994) y las alineaciones trazadas por GeneDoc versión 2.6.02 (Nicholas y colaboradores, Embnew. News 4: 14, 1997). EJEMPLO 15 Detección de porciones conservadas en secuencias transcripcionales derivadas de ECl Cada una de las secuencias de control transcripcionales derivadas de ECl definidas en la presente (es decir. SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: '32) se inspeccionaron para elementos cis-reguladores conocidos mediante PLACEdb 26.0 (http : //www . dna . affre . go . ip/ PLACE/ ) ,· una base de .datos de porciones encontradas en elementos de DNA reguladores de acción cis de planta. La identificación de porciones de secuencia novedosa se realizó computacionalmente utilizando el software de análisis de secuencia Lasergene/MegAlign (DNASTAR, Inc., 1228 South Park Street, Madison, WI 53715, USA) . Todas las secuencias de control transcripcionales se alinearon por pares entre si utilizando dos algoritmos, Alineación de DNA de Martínez Needleman-Wunsch (Igualación Mínima: 9; Sanción de Espacio: 1.10; Sanción de Longitud- de Espacio: 0.33) y Alineación de DNA de Wilbur-Lipman (Ktuple: 3; Sanción de Espacio: 3; Ventana: 20). Además, las porciones sobre-representadas en todas las regiones corriente arriba de' las secuencias de control transcripcionales se analizaron mediante algoritmos de descubrimiento de porción MotifSampler (Thijs y colaboradores, Journal of Computational Biology, 9(2), 447-464, 2002) a http : / /homes . esat . kuleuven . be/~thij s/Work/MotifSampler . html (ver la Figura 10) . Dos porciones se identificaron las regiones corriente arriba de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31. Las secuencias consensúales de dos porciones de secuencia novedosas identificadas fueron como sigue: Porción #1 de secuencia de nucleótidos de promotor ECl: 5' -CCACTAAT-3' (SEQ ID NO: 33) Porción #2 de secuencia de nucleótidos de promotor ECl: 5 ' -kTAATTAm-3 ' (SEQ ID NO: 69) Como la expresión de los genes ECl presentes es regulada de una manera similar, las porciones identificadas representan elementos cis-reguladores putativos para -la especificidad de óvulo de las secuencias de control transcripcionales . Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en la presente es susceptible a variaciones y modificaciones diferentes de aquellas específicamente descritas. Se va a entender que la invención incluye todas de tales variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos referidos, o indicados en esta especificación, individualmente o colectivamente, y cualquiera de todas las combinaciones de cualquiera de dos o más de las etapas o características. También, se debe observar que, como se utiliza en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen aspectos plurales a menos que el contexto ya lo dicte de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "una secuencia de nucleótidos de interés" incluye una secuencia de un solo nucleótido así como secuencias de dos o más nucleótidos; "un óvulo" incluye un solo óvulo así como dos o más óvulos; y así sucesivamente. Solicitudes de patente futuras pueden ser presentadas en Australia o en el extranjero sobre la base de la presente solicitud, por ejemplo al reclamar la prioridad de la presente solicitud, al reclamar un estado divisional y/o al reclamar un estado de continuación. Se va a entender que las siguientes reivindicaciones se proporcionan a manera de ejemplo solamente, y no se proponen para limitar el alcance de lo que puede ser reclamado en cualquier tal solicitud futura. Tampoco deben las reivindicaciones ser consideradas para limitar el entendimiento de (o excluir otros entendimientos de) la invención o invenciones inherentes en la presente descripción. Características se pueden adicionar a u omitir de las reivindicaciones de ejemplo en una fecha posterior, para definir adicionalmente la invención o invenciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende : (i) una secuencia de nucleótidos que define una secuencia de control transcripcional especifica de gameto femenino de planta, en donde la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido EC1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; o (ii) una secuencia de nucleótidos que define un fragmento funcionalmente activo o variante de (i) · 2. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. 3. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el gen que codifica un polipéptido de EC1 comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23. 4. . El ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la secuencia- de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido ECl en una planta dicotiledónea. 5. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido ECl en una planta de Arabidopsis sp. 6. El ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 24, o un fragmento funcionalmente activo o variante del mismo. 7. El ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 25, o un fragmento funcionalmente activo o variante del mismo. 8. El ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 26, o un fragmento funcionalmente activo o variante del mismo. 9. El ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 27, ¦ o un fragmento funcionalmente activo o variante del mismo. 10. El ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 28, o un fragmento funcionalmente activo o variante del mismo. 11. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido EC1 en la planta Medícago sp. 12. El ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 11, caracterizado porque el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 29, o un fragmento funcionalmente activo o variante del mismo. 13. El ácido nucleico aislado de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido EC1 en una planta monocotiledónea . 14. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido EC1 en una planta de cultivo de cereal. 15. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 13 o 14, caracterizado porque la secuencia de control transcripcional se deriva de un gen que codifica un polipéptido EC1 en la planta Oryza sp. 16. El ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 13 a 15, caracterizado porque el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 30, o un fragmento funcionalmente activo o variante del mismo. 1.7. El ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 13 a 15, caracterizado porque el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ - ID NO: 31, o un fragmento funcionalmente activo o variante del mismo. 18. El ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 13 a 15, caracterizado porque el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de . nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 32, o un fragmento funcionalmente activo o variante del mismo. 19. El ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el ácido nucleico aislado comprende una o más porciones de secuencia que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 33 y/o SEQ ID NO: 69. 20. Una construcción de ácido nucleico, caracterizada porque comprende el ácido nucleico aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19. 21. La construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos que define una secuencia de control transcripcional y la construcción de ácido nucleico además comprende una secuencia de nucleótidos de interés operablemente conectada a la secuencia de control transcripcional. 22. La construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de interés es heteróloga con respecto a la secuencia de control transcripcional. 23. La construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizada porque la construcción de ácido nucleico además comprende una secuencia de nucleótidos que define un terminador de transcripción.' 24. La construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizada porque la construcción de ácido nucleico comprende un cásete de expresión que comprende la estructura: ([N]„ - TCS - [N]x - Sol - [N]y - TT - [N]z) en donde: [N]w comprende uno o más residuos de nucleótido, o está ausente; TCS comprende un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19; [N]x comprende uno o más residuos de nucleótido, o está ausente; Sol comprende una secuencia de nucleótidos de interés que codifica un mRNA o RNA no traducido, en donde la secuencia de nucleótidos, Sol, es operablemente conectada a TCS; [N]y comprende uno o más residuos de nucleótido, o está ausente; TT comprende una secuencia de nucleótidos que define un terminador de transcripción; [N]z comprende uno o más residuos de nucleótido, o está ausente. 25. Una célula, caracterizada porque comprende: (i) la construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24; y/o (ii) una forma genómicamente integrada de la construcción mencionada en (i) . 26. La célula de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la célula es una célula de planta. 27. La célula de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la célula es una célula de planta dicotiledónea . 28. La célula de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la célula es una célula de Arabidopsis sp. 29. La célula de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la célula es una célula de planta monocotiledónea . 30. La célula de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la célula es una célula de planta de cultivo de cereal. 31. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, caracterizada porque la célula es un óvulo de planta. 32. El óvulo de planta de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el nivel, proporción y/o patrón de expresión de por lo menos una secuencia de nucleótidos es alterado en el óvulo de planta con relación a una forma de tipo silvestre del óvulo de planta. 33. Una estructura multicelular, caracterizada porque comprende una o más células de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32. 34. La estructura multicelular de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la estructura multicelular comprende una planta o una parte, órgano o tejido de la misma. 35. La estructura multicelular de conformidad con la reivindicación 33 o 34, caracterizada porque la estructura multicelular comprende uno o más óvulos de planta de la reivindicación 31 o 32. 36. Un método para específicamente o preferencialmente expresar una secuencia de nucleótidos de interés en un óvulo de planta, el método caracterizado porque comprende efectuar la transcripción de la 'secuencia de nucleótidos de interés en una planta bajo el control transcripcional del ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos de interés es heteróloga con respecto a la secuencia de control transcripcional . 38. Un método para promover la esterilidad femenina en una planta, el método caracterizado porque comprende expresar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína citotóxica y citostática o un RNA no traducido citotóxico o citostático, específicamente o preferencialmente en un óvulo de la planta; en donde la secuencia de nucleótidos es operablemente conectada a un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos codifica una proteina citotóxica seleccionada de la lista que consiste de una barnasa, un RNAsa o una toxina de difteria. 40. Un método para modular el desarrollo y/o tamaño del embrión en una planta, el método caracterizado porque comprende expresar una secuencia de nucleótidos que codifica un regulador transcripcional que actúa durante el desarrollo del embrión, específicamente o preferencialmente en un óvulo de la planta; en donde la secuencia de nucleótidos que codifica un regulador transcripcional es operablemente conectado al ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos que codifica un regulador transcripcional comprende un regulador transcripcional que actúa durante las etapas posteriores del desarrollo del embrión. 42. El ' método de conformidad con la reivindicación 40 o 41, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos que codifica un regulador transcripcional comprende un BBM, LEC1/LEC2, AP2 u otro factor de transcripción. 43. Un método para promover apomixis en una planta, el método caracterizado porque comprende expresar una secuencia de nucleótidos de promoción de apomixis específicamente o preferencialmente en un óvulo de la planta; en donde la secuencia de nucleótidos de promoción de apomixis es operablemente conectada a un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19. 44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos de promoción de apomixis comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de: un regulador del ciclo celular, un regulador transcripcional que actúa durante las etapas posteriores del desarrollo del embrión, un factor de remodelación de cromatina, o una enzima de modificación de histona . 45. El método de conformidad con la reivindicación 43 o 44, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos de promoción · de apomixis comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de RB, E2F, BBM, LEC1/LEC2 o una DNA metiltransíerasa . 46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a .45, caracterizado porque la planta es una planta de dicotiledónea. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la planta es una planta de Arabidopsis sp . 48. ·, El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 45, caracterizado porque la célula es una planta monocotiledónea . 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la célula es una planta de cultivo de cereal. 50. El ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque es sustancialmente como es descrito en la presente con referencia a cualquiera de los ejemplos. 51. La construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, caracterizada porque es sustancialmente como es descrito en la presente con referencia a cualquiera de los ejemplos. 52. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, caracterizada porque es sustancialmente como es descrito en la presente con referencia a cualquiera de los ejemplos. 53. La estructura multicelular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, caracterizada porque es sustancialmente como es descrito en la presente con referencia a cualquiera de los ejemplos. 54. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 49, caracterizado porque es sustancialmente como es descrito en la presente referencia cualquiera de los ejemplos.