MX2008009489A - Composiciones de detergentes - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones de detergentes que comprenden un ingrediente de detergente y una variante de lipasa con un potencial reducido de generación de olor, obtenidas al introducir mutaciones en una o más regiones identificadas en una lipasa madre.

Description

COMPOSICIONES DE DETERGENTES CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a composiciones de detergentes, en particular a detergentes para lavandería que comprenden enzimas lipolíticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La remoción mejorada de suciedades grasosas es un objetivo constante para los fabricantes de detergentes, especialmente en el contexto del lavado de prendas. A pesar de utilizar muchos surfactantes y combinaciones de surfactantes efectivos, especialmente cuando se utilizan con agua a temperaturas bajas, muchos productos en base a surfactantes aún no logran eliminar to-talmente las manchas de grasa o aceite. Las enzimas lipasas se han utilizado en detergentes desde fines de la década de los 80 para eliminar las manchas de grasa al descomponer dichas manchas en triglicéridos. Hasta hace relativamente poco, las enzimas lipasas principales comercialmente disponibles, tales como Lipolase (nombre comercial de No-vozymes) actuaban, particularmente, de manera eficaz en los niveles de humedad más bajos de la fase de secado del procedimiento de lavado. Estas enzimas tendían a producir una limpieza considerable sólo en el segundo paso de lavado al descomponer considerablemente la grasa durante la etapa de secado sólo en las suciedades que quedaban en las prendas de vestir lavadas; las grasas descompuestas se eliminaban luego en el siguiente paso de lavado. Sin embargo, más recientemente, se han desarrollado lipasas de mayor eficiencia que también actúan con eficacia durante la fase de lavado del procedimiento de limpieza, de tal forma que además de la limpieza del segundo paso de lavado, se comprobó una mejora considerable en el efecto de limpieza del primer ciclo de lavado debido a la enzima lipasa. Ejemplos de tales enzimas se describen en la patente de los EE.UU. núm. 6,939,702 B1 , en la patente WO 00/60063 y en la exposición de investigación IP6553D. Tales enzimas se refieren, a continuación, a las lipasas de primer lavado. Además, los consumidores prefieren que esos artículos, tales como prendas, estén lo más limpios posibles. Tales consumidores, por lo general, asocian el olor de un artículo limpio o tratado con el grado de limpieza de ese artículo. De esta manera, desde la perspectiva del consumidor, la eficacia de una composición de limpieza o tratamiento, por lo general, se relaciona en forma directa con el olor que esa composición imparte a un artículo limpiado o tratado con esa composición. Los solicitantes reconocen que algunos materiales, tales como esterasas y lipasas, pueden generar olores de ácidos grasos desagradables, particularmente, olores de ácidos grasos de cadena corta, tales como el olor del ácido butírico. Sin embargo, esos materiales pueden ser, particularmente, agentes limpiadores eficaces. Desafortunadamente, los consumidores, por lo general, asocian los olores generados por el uso de esos agentes con la falta de limpieza. Ejemplos de va- riantes de olor reducido con una extensión C-terminal se mencionan en la patente WO 02/062973, pero estas variantes de lipasa no demuestran el rendimiento sólido de lavado de las lipasas de primer lavado, tales como las de la patente WO 00/60063 que incluye la variante distribuida bajo el nombre comercial Lipex®. De esa manera, persiste una necesidad de contar con composiciones de detergente que comprendan enzimas lipolíticas para la remoción óptima de suciedades grasosas/aceitosas sin generar olores de ácidos grasos desagradables.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a composiciones de detergentes que comprenden un ingrediente detergente y una variante de lipasa con po-tendal reducido de generación de olor, sin la unión de una extensión C-terminal. La variante de lipasa se obtiene al incorporar mutaciones en una o más regiones identificadas en la lipasa madre.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra el alineamiento de lipasas.

LISTADO DE SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de ADN que codifica la lipasa de Thermomyces lanoginosus. La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Thermomyces lanoginosus. La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Absidia reflexa. La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Absidia corymbifera. La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Rhizomucor miehei. La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Rhizopus oryzae. La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus niger. La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus tubingensis. La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Fusarium oxysporum.

La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Fusarium heterosporum. La SEQ ID NO: 1 1 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus oryzae. La SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Penicillium camemberti. La SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus foetidus. La SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus niger. La SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus oryzae. La SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Landerina penisapora.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Variantes de lipasa Lipasa madre La lipasa madre puede ser una lipasa fúngica con una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 50 % de homología, como se define en la sección "Homología y alineamiento", con la secuencia de la lipasa T. la-nuginosus mostrada en la SEQ ID NO: 2. La lipasa madre puede ser un polipéptido de levadura tal como un polipéptido de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizo-saccharomyces, o Yarrowia; o con mayor preferencia un polipéptido de filamento fúngico tal como un polipéptido de Acremonium, Aspergillus, Aureo-basidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penici-llium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, To-lypocladium, o Trichoderma. En un aspecto preferido, la lipasa madre es un polipéptido con actividad lipasa proveniente de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces ce-revisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto preferido, la lipasa madre es un polipéptido de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergí- llus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxyspo-rum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium toru-losum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Thermomyces lanoginosus (sinónimo: Humicola lanuginose), Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride. En otro aspecto preferido, la lipasa madre es una lipasa de Thermomyces. En un aspecto más preferido, la lipasa madre es una lipasa de Thermomyces lanuginosus. En una modalidad aún más preferida, la lipasa madre es la lipasa de SEQ ID NO: 2.

Identificación de regiones y sustituciones. Las posiciones referidas en la Región I a través de la Región IV, a continuación, son las posiciones de los residuos de aminoácido en la SEQ ID NO: 2 Para encontrar las posiciones correspondientes (u homologas) en una lipasa diferente, se usa el procedimiento descrito en "Homología y alineamiento".

Sustituciones en la Región 1 La Región I consiste de residuos de aminoácido que rodean el residuo N-terminal E1. En esta región se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa madre con un aminoácido más positivo. Los residuos de aminoácidos que corresponden a las posiciones siguientes están comprendidos por la Región I: 2 a 1 1 y 223-239. Las posiciones siguientes son de especial interés: 4, 8, 1 1 , 223, 227, 229, 231 , 233, 234, 236. Se han identificado, en particular, las siguientes sustituciones: X4V, X227G, X231 R y X233R. En una modalidad preferida, la lipasa madre tiene por lo menos 80 %, tal como 85 % o 90 %, tal como por lo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO:2. En una modalidad más preferida, la lipasa madre es idéntica a la SEQ ID NO: 2.

Sustituciones en la Región II La Región II consiste de residuos de aminoácidos en contacto con un sustrato en un lado de la cadena acilo y en un lado de la parte alcohólica. En esta región se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa madre con un aminoácido más positivo o con un aminoácido menos hidrófobo. Los residuos de aminoácidos que corresponden a las posiciones siguientes están comprendidos por la Región II: 202 a 211 y 249 a 269. Las siguientes posiciones resultan de especial interés: 202, 210, 211 , 253, 254, 255, 256. Se han identificado, en particular, las siguientes sustituciones: X202G, X2 0K, X255Y/V y X256K7R.

En una modalidad preferida, la lipasa madre tiene, por lo menos, 80 %, tal como 85 % o 90 %, tal como por lo menos 95 %, o 96 %, o 97 %, o 98 % o 99 %, de identidad con la SEQ ID NO:2. En una modalidad más preferida la lipasa madre es idéntica a la SEQ ID NO: 2.

Sustituciones en la Región III La Región III consiste de residuos de aminoácidos que forman una estructura flexible y, de esa manera, permiten que el sustrato entre en el sitio activo. En esta región se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa ma-dre con un aminoácido más positivo o un aminoácido menos hidrófobo. Los residuos de aminoácidos que corresponden a las posiciones siguientes están comprendidos por la Región III: 82 a 102. Las posiciones siguientes son de especial interés: 83, 86, 87, 90, 91 , 95, 96, 99. Se han identificado, en particular, las siguientes sustituciones: X83T, X86V y X90A/R. En una modalidad preferida, la lipasa madre tiene por lo menos 80 %, tal como 85 % o 90 %, tal como por lo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO:2. En una modalidad más preferida, la lipasa madre es idéntica a la SEQ ID NO: 2.

Sustituciones en la Región IV La Región IV consiste de residuos de aminoácidos que se unen electrostáticamente a una superficie. En esta región se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa madre con un aminoácido más positivo. Los residuos de aminoácidos que corresponden a las posiciones siguientes están comprendidos por la Región IV: 27 y 54 a 62. Las posiciones siguientes son de especial interés: 27, 56, 57, 58, 60. Se han identificado, en particular, las siguientes sustituciones: X27R, X58N/AGH7P y X60V/S/G/N/R/K/A/L. En una modalidad preferida, la lipasa madre tiene por lo menos 80 %, tal como 85 % o 90 %, tal como por lo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO:2. En una modalidad más preferida, la lipasa madre es idéntica a la SEQ ID NO: 2.

Aminoácidos en otras posiciones La lipasa madre puede comprender, opcionalmente, la sustitución de otros aminoácidos, particularmente menos de 10 o menos de 5 de esas sustituciones. Los ejemplos son sustituciones que corresponden a una o más de las posiciones 24, 46, 74, 81 , 83, 127, 131 , 137, 147, 150, 203, 206, 211 , 263, 264, 265, 267 y 269 de la lipasa madre. En una modalidad particular existe una sustitución en por lo menos una de las posiciones que corresponden a la posición 81 , 147, 150, y 249. En una modalidad preferida por lo menos una sustitución se selecciona del grupo formado por X81Q/E, X147M Y, X150G, y X249R/I/L. Amplias sustituciones pueden hacerse, por ejemplo, de confor-midad con los principios conocidos en la industria, por ejemplo, sustituciones como las descritas en las patentes WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.

Variantes de lipasa madre En un aspecto, dicha variante, cuando se compara con dicha lipasa madre, comprende en total por lo menos tres sustituciones; esas sustituciones se seleccionan de uno más de los siguientes grupos de sustituciones: a) por lo menos dos sustituciones en la Región I, b) por lo menos una sustitución en la Región II, c) por lo menos una sustitución en la Región III, o d) por lo menos una sustitución en la Región IV. La variante, comparada con la lipasa madre de la variante, puede comprender sustituciones que corresponden a las sustituciones enunciadas más adelante en el Cuadro 1 .

Cuadro 1 : Algunas variantes específicas.

En una amplia modalidad particular, la lipasa madre es idéntica a la SEQ ID NO:2, y, de esta manera, las variantes del Cuadro 1 serán las siguientes: Nomenclatura de las modificaciones de aminoácidos Al describir las variantes de lipasa de conformidad con la invención, se usa la siguiente nomenclatura para facilitar la referencia: Aminoáci-do(s) original(es):posición(es):aminoácido(s) sustituido(s) De conformidad con esta nomenclatura, por ejemplo, la sustitución de ácido glutámico por glicina en la posición 195 se muestra como G195E. La supresión de glicina en la misma posición se muestra como G195* y la inser-ción de un residuo adicional de aminoácido, tal como lisina, se muestra como G195GK. Cuando una lipasa específica contiene una "supresión" en comparación con otras lipasas y se realiza una inserción en esa posición, esto se indica como *36D para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36. Las muta- dones múltiples se separan con signos más (+), es decir: R170Y+G195E, que representa mutaciones en las posiciones 170 y 195 que sustituyen tirosina y ácido glutámico por arginina y glicina, respectivamente. X231 indica el aminoácido en un polipéptido madre que corres-ponde a la posición 231 , cuando se aplica el procedimiento de alineamiento descrito. X231 R indica que el aminoácido se reemplaza por R. Para la SEQ ID NO: 2 X es T, y de esa manera X231 R indica una sustitución de T por R en la posición 231 . Cuando el aminoácido en una posición (p. ej., 231 ) puede sustituirse con otro aminoácido seleccionado de un grupo de aminoácidos, por ejemplo, el grupo formado por R, P e Y, esto se indicará como X23 R/P/Y. En todos los casos se usa la abreviatura del aminoácido compuesta de una o tres letras aceptada por IUPAC.

Agolpamiento de aminoácidos En esta especificación, los aminoácidos se clasifican como negativamente cargados, positivamente cargados o eléctricamente neutros de conformidad con sus cargas eléctricas a pH 10. De esa manera, los aminoácidos negativos son E, D, C (cisteína) e Y, particularmente E y D. aminoácidos posi-tivos son R, K y H, particularmente R y K. Aminoácidos neutros son G, A, V, L, I, P, F, W, S, T, M, N, Q y C cuando forman parte de un puente de disulfuro. Una sustitución con otro aminoácido en el mismo grupo (negativo, positivo o neutro) se denomina sustitución conservadora.

Los aminoácidos neutros pueden dividirse en hidrófobos o no polares (G, A, V, L, I, P, F, W y C como parte de un puente disulfuro) e hidrófilos o polares (S, T, M, N, Q).

Identidad de los aminoácidos La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por medio del parámetro "identidad". Para propósitos de la presente invención, el alineamiento de dos secuencias de aminoácidos se determina al usar el programa Needle del pa-quete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0. El programa Needle imple-menta el algoritmo de alineamiento global descrito en Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. ( 970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. La matriz de sustitución usada es BLOSUM62, la penalización de apertura de interrupción (gap) es 10, y la penalización de extensión de interrupción (gap) es 0.5. El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención ("secuencia de la invención"; p. ej., aminoácidos 1 a 269 de SEQ ID NO:2) y una secuencia de aminoácidos diferente ("secuencia desconocida") se calcula como el número de concordancias exactas en un alineamiento de las dos secuencias dividido entre la longitud de la "secuencia de invención" o la longitud de la "secuencia desconocida", la que sea más corta. El resultado se expresa en porcentaje de identidad. Una concordancia exacta se produce cuando la "secuencia de invención" y la "secuencia desconocida" tienen residuos idénticos de aminoá- cidos en las mismas posiciones de la superposición. La longitud de una secuencia es el número de residuos de aminoácidos en la secuencia (p. ej., la longitud de SEQ ID NO: 2 es 269). La lipasa madre tiene una identidad de aminoácidos de por lo menos 50 % con la lipasa T. lanuginosus (SEQ ID NO: 2), particularmente, por lo menos 55 %, por lo menos 60 %, por lo menos 75 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, más de 95 % o más de 98 %. En una modalidad particular, la lipasa madre es idéntica a la lipasa T. lanuginosus (SEQ ID NO:2). El procedimiento anterior puede usarse para calcular la identidad y también la homología y el alineamiento. En el contexto de la presente invención, la homología y el alineamiento se han calculado como se describe a continuación.

Homología y alineamiento Para propósitos de la presente invención, el grado de homología puede determinarse adecuadamente por medio de programas informáticos conocidos en la industria, tal como la interrupción (GAP) proporcionada en el paquete del programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package (Manual del programa para el paquete Wisconsin), Versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 ) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biolo-gy (Revista de Biología Molecular), 48, 443-45), configurando la interrupción (GAP) para la comparación de secuencias de polipéptidos de la siguiente manera: penalización de creación de interrupción (GAP) de 3.0 y penalización de extensión de interrupción (GAP) de 0.1. En la presente invención, las posiciones correspondientes (u homologas) en las secuencias de las lipasas de Absidia reflexa, Absidia corym-befera, Rhizmucor miehei, Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus tu-bigensis, Fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Aspergillus oryzae, Penicilium camembertii, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Thermomyces lanoginosus (sinónimo: Humicola lanuginose) y Landerina penisapora están de-finidas por el alineamiento ilustrado en la Figura 1. Para encontrar las posiciones homologas en las secuencias de li-pasa no mostradas en el alineamiento, la secuencia de interés se alinea a las secuencias mostradas en la Figura 1. La nueva secuencia se alinea al alineamiento presente en la Figura 1 al usar el alineamiento de interrupción (GAP) a la se-cuencia más homologa encontrada por el programa de interrupción (GAP). La interrupción (GAP) está proporcionada en el paquete del programa GCG (Pro-gram Manual for the Wisconsin Package (Manual del programa para el paquete Wisconsin), Versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology (Revista de Biología Molecular), 48, 443-45). Para comparar las secuencias de polipéptidos se usan las siguientes configuraciones: penalización de creación de interrupción (GAP) de 3.0 y penalización de extensión de interrupción (GAP) de 0.1.

La lipasa madre tiene una homología de por lo menos 50 % con la lipasa T. lanuginosus (SEQ ID NO: 2), particularmente, por lo menos 55 %, 60 %, 75 %, 85 %, 90 %, más de 95 % o más de 98 %. En una modalidad particular, la lipasa madre es idéntica a la lipasa T. lanuginosus (SEQ ID NO:2).

Hibridación La presente invención se refiere también a polipéptidos aislados que tienen actividad lipasa que están codificados por polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones de restricción muy baja, preferentemente, condiciones de restricción baja, con mayor preferencia, condiciones de restricción media, con mayor preferencia, condiciones de restricción media-alta, todavía con mayor preferencia, condiciones de restricción alta y, con la mayor preferencia, condiciones de restricción muy alta con (i) nucleótidos 178 a 660 de la SEQ ID NO: 1 , (ii) la secuencia del cADN contenida en nucleótidos 178 a 660 de la SEQ ID NO: 1 , (iii) una subsecuencia de (i) o (ii), o (¡v) una cadena complementaria de (i), (ii) o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Clonación molecular, Manual de laboratorio), 2.a edición, Cold Spring Harbor, New York). Una subsecuen-cia de la SEQ ID NO: 1 contiene por lo menos 100 nucleótidos contiguos o preferentemente por lo menos 200 nucleótidos contiguos. Además, la subsecuencia puede codificar un fragmento polipeptídico que tiene actividad lipasa.

Para sondas extensas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia muy baja a muy alta se definen como prehibridación e hibridación a 42 °C en SSPE 5X, 0.3 % de SDS, 200 g/mL de ADN desnaturalizado de esperma de salmón y 25 % de formamida para condiciones de restricción muy baja y baja, 35 % de formamida para condiciones de restricción media y media-alta, o 50 % de formamida para condiciones de restricción alta y muy alta, siguiendo procedimientos estándar de Southern blotting durante 12 a 24 horas, en forma óptima. Para sondas extensas de por lo menos 100 nucleótidos de longi-tud, el matenal portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0.2 % de SDS, preferentemente, por lo menos a 45 °C (restricción muy baja), con mayor preferencia, por lo menos a 50 °C (restricción baja), con mayor preferencia, por lo menos a 55 °C (restricción media), con mayor preferencia, por lo menos a 60 °C (restricción medio-alta), todavía con mayor preferencia, por lo menos a 65 °C (restricción alta) y, con la mayor preferencia, por lo menos a 70 °C (restricción muy alta).

Secuencia de ADN, vector de expresión, célula huésped, producción de lipasa La invención proporciona una secuencia de ADN que codifica la lipasa de la invención, un vector de expresión que contiene la secuencia de ADN y una célula huésped transformada que contiene la secuencia de ADN o el vector de expresión. Éstos pueden obtenerse por métodos conocidos en la industria.

La invención proporciona también un método para producir la lipasa por medio del cultivo de la célula huésped transformada bajo condiciones propicias para la producción de la lipasa y para recuperar la lipasa del caldo obtenido. El método puede practicarse de conformidad con los principios conocidos en la industria.

Actividad de lipasa - Actividad de lipasa en tributirina a pH neutro (LU) Se prepara un sustrato para la lipasa por emulsificación de la tri-butirina (tributirato de glicerina) usando goma arábiga como emulsionante. La hidrólisis de la tributirina a 30 °C, a pH 7 ó 9 es seguida en un experimento de titulación a pH estático. Una unidad de actividad de lipasa (1 LU) es igual a la cantidad de enzima capaz de liberar 1 micro mol de ácido butírico/min a pH 7.

- Riesgo-Beneficio El factor Riesgo-Beneficio que describe el rendimiento comparado con el riesgo reducido de olor se define como: BR = RPprom / R. Las variantes de lipasas descritas en la presente pueden tener un BR mayor que 1 , mayor que 1.1 o incluso mayor que 1 a aproximadamente 1000.

- Rendimiento relativo promedio El procedimiento para calcular el rendimiento relativo promedio (RPavg) se encuentra en el Ejemplo 5 de la presente especificación. Las variantes de lipasas descritas en la presente pueden tener un (RPavg) de por lo menos 0.8, por lo menos 1 .1 , por lo menos 1.5 o incluso de por lo menos 2 a aproximadamente 1000.

Ingredientes de detergentes Como se utilizan en la presente, las composiciones de detergen-tes incluyen artículos y composiciones de tratamiento y limpieza. Como se utiliza en la presente, el término "composición de tratamiento o de limpieza" incluye, a menos que se indique de cualquier otra forma, tabletas, agentes de lavado granulados o en forma de polvo multiuso o "de gran rendimiento", especialmente detergentes para lavandería; agentes de limpieza líquidos, en gel, o en forma de pasta para multiusos, especialmente los llamados líquidos de gran rendimiento; detergentes líquidos para telas finas; agentes para el lavado manual de vajilla, o agentes de bajo rendimiento para el lavado de vajilla, especialmente aquellos del tipo de gran volumen de espuma; agentes para el lavado en lavavajillas, que incluyen los diversos tipos de tabletas, gránulos, ayudantes y líquidos de enjuague, para el uso doméstico e institucional. Las composiciones también pueden estar en envases de dosis unitarias, incluyendo los conocidos en la industria y los que son solubles en agua, insolubles en agua o permeables al agua.

La composición de detergente de la presente invención puede comprender una o más variantes de lipasa de la presente invención. Además de la(s) variante(s) de lipasa, la composición de detergente comprenderá, también, un ingrediente de detergente. La lista no limitante de ingredientes de detergentes incluida de aquí en adelante es adecuada para utilizarse en las composiciones de la presente y convenientemente puede incorporarse en algunas modalidades de la invención, por ejemplo, para facilitar o mejorar el rendimiento limpiador, para tratar el sustrato que se limpiará o para modificar la estética de la composición limpiadora como en el caso de los colorantes, tintes o lo similar. La naturaleza precisa de estos componentes adicionales y los niveles de su incorporación dependerán de la forma física de la composición y del tipo de operación de limpieza en la que se utilizarán. Los ingredientes de detergentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, surfactantes, aditivos, agentes quelantes, agentes inhibidores de transferencia de tintes, dispersantes, enzimas, y estabilizadores de enzimas, ac-tivadores de blanqueador, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, abrillantadores, supresores de espuma, colorantes, agentes anticorrosión, inhibidores de manchas, perfumes, suavizantes de telas, portadores, hidrótropos, auxiliares de procesamiento, solventes o pigmentos. Los detergentes típicos deben comprender cualquier combinación, en peso, de los siguientes ingredientes: 5-30 % de surfactante, preferentemente surfactantes aniónicos tales como alquilbencenosulfonato lineal y alcohol etoxisulfato; 0.005-0.1 % de proteína de proteasa activa, en donde la proteasa es preferentemente seleccionada de Coronase™, FN4 FNA, o Savi-nase™, 0.001-0.1 % de proteína de amilasa activa, donde la amilasa es preferentemente seleccionada de Termamyl™ Natalase™, Stainzyme™ y Puras-tar™ y 0.1-3 % de quelantes, preferentemente ácido dietilentriaminapentaacé-tico. En el caso de productos granulados y en tableta, dichos detergentes típicos deben comprender, adicionalmente, en peso: 5-20 % de blanqueador, preferentemente percarbonato sódico; 1-4 % de activador de blanqueador, preferentemente TAED o 0-30 % de aditivo, preferentemente 5-30 %, con mayor preferencia menos de 10 % de aditivo, tales como la zeolita A de alu-minosilicato o tripolifosfato. Agentes blanqueadores. Las composiciones de detergentes de la presente invención pueden comprender uno o más agentes blanqueadores. Por lo general, cuando se usa un agente blanqueador, las composiciones de la presente invención pueden comprender de aproximadamen-te 0.1 % a aproximadamente 50 % o incluso de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 25 % del agente blanqueador en peso de la composición limpiadora. Ejemplos de agentes blanqueadores adecuados incluyen: (1 ) Fuentes de peróxido de hidrógeno, por ejemplo, sales inorgánicas de perhidrato que incluyen las sales de metales al- calinos como sales sódicas de perborato (generalmente mono o tetra hidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sales de persilicato y mezclas de éstos. En un aspecto de la invención, las sales inorgánicas de perhidrato se seleccionan del grupo formado por sales sódicas de perborato, percarbonato y mezclas de éstas, jabones; y (2) activadores de blanqueador que tienen R-(C=0)-L, donde R es un grupo alquilo, opcionalmente ramificado, que tiene, cuando el activador de blanqueador es hidrófobo, de 6 a 14 átomos de carbono, o de 8 a 12 átomos de carbono y, cuando el activador de blanqueador es hidrófilo, menos de 6 átomos de carbono o incluso menos de 4 átomos de carbono; y L es el grupo saliente. Los ejemplos de grupos salientes adecuados son ácido benzoico y derivados de éste, en especial el bencenosulfonato. Los activadores de blanqueador adecuados incluyen dodecanoil oxibenceno sulfonato, decanoil oxi- benceno sulfonato, ácido decanoil oxibenzoico o sales de éste, 3,5,5-trimetilhexanoiloxibencenosulfonato, tetraacetiletilen- diamina (TAED, por sus siglas en inglés) y nonanoiloxiben- censulfonato (NOBS, por sus siglas en inglés). Los activadores de blanqueador adecuados se describen también en la patente WO 98/17767. Si bien puede utilizarse cualquier activador de blanqueador, en un aspecto de la invención la composición limpiadora puede comprender NOBS, TAED o mezclas de éstos. (3) Perácidos preformados.

Cuando la composición contiene perácido o activador de blanqueador, su concentración, por lo general, varía de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 60 % en peso, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 % en peso o incluso de aproximadamente 0.6 a aproximadamente 10 % en peso de la composición. Uno o más precursores hidrófobos de éstos pueden usarse, en combinación, con uno o más perácidos hidrófilos o precursores de éstos. Las concentraciones de la fuente de peróxido de hidrógeno y del perácido o activador de blanqueador pueden seleccionarse de tal forma que la proporción molar del oxigeno disponible (de la fuente de peróxido) al perácido sea de 1 : 1 a 35:1 , o incluso de 2:1 a 10:1. Surfactantes - Las composiciones de detergentes de conformidad con la presente invención pueden comprender un surfactante o sistema surfactante, donde el surfactante puede seleccionarse de los surfactantes no iónicos, surfactantes aniónicos, surfactantes catiónicos, surfactantes anfolíticos, surfactantes zwitteriónicos, surfactantes no iónicos semipolares y mezclas de éstos. Cuando se presenta, el surfactante, por lo general, está presente a un nivel de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 40 %, de aproximadamente 0.1 % a aproxi-madamente 12 %, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 50 % o incluso de aproximadamente 5 % a aproximadamente 40 % en peso de la materia de composición.

Cuando se incluye, el detergente usualmente contiene de aproximadamente 1 % a aproximadamente 40 % de un surfactante aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, alquilsulfato (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico de áci-dos grasos alfa-sulfo sustituidos, ácidos alquil o alquenilsuccínico o jabón. El detergente puede contener, opcionalmente, de aproximadamente 0.2 % a aproximadamente 40 % de un surfactante no iónico tal como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, óxido de alquil-dimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amidas de ácidos grasos polihidroxialquilados o N-acil N-alquil derivados de glucosamina ("glucamidas"). Aditivos - Las composiciones de detergentes de la presente invención pueden comprender uno o más aditivos o sistemas de aditivos detergentes. Cuando se usa un aditivo, por lo general, la composición comprenderá por lo menos aproximadamente 1 %, de aproximadamente 5 % a aproximadamente 60 % o incluso de aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 % del aditivo, en peso de la materia de composición. Los aditivos incluyen, pero no se limitan a, las sales de metales alcalinos, amonio y alcanolamonio de polifosfatos, silicatos de metales alcalinos o silicatos estratificados, carbonatos de metales alcalinos y alcalinotérreos, aditivos de aluminosilicato y las diversas sales de metales alcalinos, amonio y amonio sustituido de ácidos poliacéticos, tales como ácido etilen-diaminatetraacético y nitrilotriacético, y tanto como los policarboxilatos, tales como ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, ácido poli- maléico, ácido benceno 1 ,3,5-tricarboxílico, ácido carboximetiloxisuccínico, y sales solubles de éstos. Agentes quelantes - Las composiciones de detergentes de la presente pueden contener un agente quelante. Los agentes quelantes ade-cuados incluyen agentes quelantes de cobre, hierro o manganeso y mezclas de éstos. Cuando se usa un agente quelante, la composición puede comprender de aproximadamente 0.005 % a aproximadamente 15 % o incluso de aproximadamente 3.0 % a aproximadamente 10 % del agente quelante en peso de la composición. Abrillantadores - Las composiciones de detergentes de la presente invención también pueden contener componentes adicionales que pueden modificar la apariencia de los artículos que se están limpiando, tales como abrillantadores fluorescentes. Estos abrillantadores absorben la luz ultravioleta y la emiten como luz visible. Los niveles adecuados de abrillantadores fluorescentes incluyen niveles inferiores de aproximadamente 0.01 , de aproximadamente 0.05, de aproximadamente 0.1 o incluso de aproximadamente 0.2 % en peso a niveles superiores de 0.5 o incluso 0.75 % en peso. Dispersantes - Las composiciones de la presente invención también pueden contener dispersantes. Los materiales orgánicos solubles en agua adecuados incluyen los ácidos homo o copoliméricos o sus sales, en las cuales el ácido policarboxílico comprende por lo menos dos radicales carboxi-lo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono.

Enzimas - Además de la(s) variante(s) de lipasa de la presente invención, la composición de detergente puede comprender una o más de otras enzimas que proporcionan rendimiento de limpieza o beneficios para el cuidado de las telas, tales como una proteasa, otra lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo, una laccasa, o una peroxidasa. Por lo general, las propiedades de la(s) enzima(s) elegidas deben ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima(s) deben estar presentes en cantidades eficaces. Las proteasas adecuadas incluyen las de origen animal, vegetal o microbial. Se prefiere la de origen microbial. Se incluyen mutantes modificados químicamente o por ingeniería proteica. La proteasa puede ser una proteasa de serina o una metaloproteasa, preferentemente una proteasa microbial alcalina o una proteasa tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente las derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en la patente WO 89/06279), SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 7 en la patente WO 05/103244. Otras serin proteasas adecuadas incluyen aquellas de Micrococcineae spp especialmente Cellulonas spp y variantes de ellas como se expone en la patente WO2005052146. Ejemplos de proteasas tipo tripsina son la tripsina (p. ej., de origen porcino o bovino) y la proteasa Fusarium descrita en la patente WO 89/06270 y WO 94/25583. Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en las patentes WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/201 16 y WO 98/34946, en especial las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 68, 76, 87, 97, 101 , 104, 106, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235, 245, 252 y 274, y entre otras variantes con las siguientes mutaciones: (K27R, V104Y, N123S, T124A), (N76D, S103A, V104I), o (S101G, S103A, V104I, G159D, A232V, Q236H, Q245R, N248D, N252K). Otros ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en la patente WO 05/052146, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 14, 16, 35, 65, 75, 76, 79, 123, 127, 159 y 179 Las enzimas proteasas preferidas que se encuentran comercial-mente disponibles incluyen Alcalase™, Savinase™, Primase™, Duralase™, Esperase™, Coronase™, Polarzyme™ y Kannase™ (Novozymes A/S), Maxa-tase™, Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect™, Purafect Prime™, Purafect OxP™, FN2, FN3 y FN4 (Genencor International Inc.). Las lipasas incluyen las lipasas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o por ingeniería proteica. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo Thermomy-ces), por ejemplo, de H. lanuginosa (sinónimo T. lanuginosus) como se describe en las patentes europeas EP 258 068 y EP 305 216 o de H. insolens como se describe en la patente WO 96/13580, una lipasa Pseudomonas, por ejemplo, de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (patente europea EP 218 272), P. cepacia (patente europea EP 331 376), P. stutzeri (patente GB 1 ,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (patentes WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (patente WO 96/12012), una li-pasa Bacillus, por ejemplo, de B. subtilis (Dartois y col. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1 131 , 253-360), B. stearothermophilus (patente JP 64/744992) o B. pumilus (patente WO 91/16422). Otros ejemplos son las variantes de lipasa tales como las descritas en las patentes WO 92/05249, WO 94/01541 , EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381 , WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202. Otras enzimas de lipasa comercialmente disponibles incluyen L¡-polase™, Lipolase Ultra™ y Lipex™ (Novozymes A/S). Las amilasas adecuadas (a o ß) incluyen las de origen bacteria-no o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o por ingeniería proteica. Las amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de B. Licheniformis, descrita con más detalle en la patente GB 1 ,296,839.296839 Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en las patentes WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181 , 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391 , 408, y 444.

Las amilasas comercialmente disponibles son Duramyl™, Ter-mamyl™, Stainzyme™, Stainzyme Ultra™, Fungamyl™ y BAN™ (Novozymes A/S), Rapidase™ y Purastar™ (de Genencor International Inc.). Las celulasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o por ingeniería proteica. Adecuadas celulasas incluyen celulasas del género Bacillus, Pseudo-monas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas de Humicola ¡nsolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descrita en las patentes de los EE.UU. núms. 4,435,307; 5,648,263; 5,691 ,178; 5,776,757 y la patente WO 89/09259. Las celulasas especialmente adecuadas, son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios para el cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en las patentes europeas EP 0 495 257, EP 0 531 372, las patentes WO 96/1 1262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son las vanantes de celulasa tales como aquellas descritas en la patente WO 94/07998, la patente europea EP 0 531 315, las patentes de los EE.UU. núms. 5,457,046;5,686,593; 5,763,254, las patentes WO 95/24471 , WO 98/12307 y PCT/DK98/00299. Las celulasas comercialmente disponibles incluyen Renozy-me™, Celluclean™, Endolase™, Celluzyme™ y Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ y Puradax HA™ (Genencor International Inc.) y KAC500(B)™ (Kao Corporation).

Peroxidasas/oxidasas. Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen las de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o por ingeniería proteica. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus, y variantes de éstas como se describen en las patentes WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257. Las peroxidasas comercialmente disponibles incluyen Guardzy-me™ (Novozymes A/S). Cuando las enzimas mencionadas anteriormente se incluyen en una composición limpiadora, pueden presentarse a niveles de aproximadamente 0.00001 % a aproximadamente 2 %, de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 1 % o incluso de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.5 % de proteína enzimática en peso de la composición. Estabilizadores de enzimas - las enzimas para detergentes pue-den estabilizarse por diversas técnicas. Las enzimas empleadas en la presente pueden estabilizarse por la presencia de fuentes de iones de magnesio o calcio solubles en agua en las composiciones terminadas que proporcionen los iones a las enzimas. Además pueden usarse agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol sacaroso, ácido láctico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster aromático de borato, o un derivado de ácido fenil borónico tal como ácido 4-formilfenil borónico y la composición se puede formular como se describe, por ejemplo, en las patentes WO 92/19709 y WO 92/19708.

Solventes - Los solventes adecuados incluyen agua y otros disolventes tales como los fluidos lipofílicos. Ejemplos de fluidos lipofílicos adecuados incluyen siloxanos, otras siliconas, hidrocarburos, glicoléteres, derivados de glicerina, tales como éteres de glicerina, aminas perfluoradas, solventes perfluorados y de hidrofluoroéter, solventes orgánicos no fluorados poco volátiles, solventes a base de dioles, otros solventes compatibles con el medio ambiente y mezclas de éstos.

Método de lavado La presente invención incluye un método para limpiar o tratar un sitio, entre otros, una superficie o tela. Estos métodos incluyen los pasos de poner en contacto una modalidad de la composición limpiadora de los solicitantes, en forma pura o diluida en un liquido de lavado, con por lo menos una porción de una superficie o tela para luego, opcionalmente, enjuagar la superficie o tela. La superficie o tela se puede lavar antes del paso de enjuague. Para los propósitos de la presente invención, el lavado incluye, pero no se limita a, restregado y agitación mecánica. Como se apreciará por un experimentado en la industria, las composiciones limpiadoras de la presente invención son ideales para el lavado de prendas. Por consiguiente, la presente invención incluye un método para el lavado de telas. El método comprende los pasos de contactar una tela que se lavará con una solución limpiadora que contiene por lo menos una modalidad de la composición limpiadora o aditivo de limpieza de los solicitantes o una mezcla de éstos. Se puede utilizar cualquier tela que el consumidor sea capaz de lavar en condiciones normales. La solución tiene, preferentemente, un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 10.5. Las composiciones pueden emplearse a concentraciones de aproximadamente 100 ppm, preferentemente 500 ppm a aproximadamente 15,000 ppm en solución. Las temperaturas del agua, por lo general, varían de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 90 °C. La invención puede ser particularmente beneficiosa con el agua a bajas temperaturas, tal como por debajo de 30 °C o por debajo de 25 °C o 20 °C. La proporción del agua a la tela es, por lo general, de aproximadamente1 :1 a aproximadamente 30:1.

Ejemplos de variantes de lipasa Los químicos usados como amortiguadores y sustratos eran productos comerciales de por lo menos un grado reactivo. Medios y soluciones: LAS (Surfac PS™) y Zeolita A (Wes- salith P™). Otros ingredientes usados son reactivos estándar de laboratorio. - Materiales: EMPA221 de EMPA St. Gallen, Lerchfeldstrasse 5, CH-9014 St. Gallen, Suiza EJEMPLO 1 Producción de enzima Se forma un plásmido que contiene el gen que codifica la lipasa y se transforma en una célula huésped adecuada utilizando métodos estándar de la industria. La fermentación se realiza como una fermentación por alimentación discontinua utilizando un medio de temperatura constante de 34 °C y un volumen inicial de 1 .2 litros. El pH inicial del medio se fija a 6.5. Una vez que el pH ha aumentado a 7.0 este índice se mantiene a través de la adición de 10 % de H3P04. El nivel de oxígeno disuelto en el medio se controla variando la velocidad de agitación y usando una velocidad de aireación fija de 1.0 litros de aire por litro del medio por minuto. La velocidad de adición de la alimentación se mantiene a un nivel constante durante toda la fase de alimentación discontinua. El medio discontinuo contiene jarabe de maltosa como fuente de carbono, urea y extracto de levadura como fuente de nitrógeno y una mezcla de metales de traza y sales. La alimentación añadida continuamente durante la fase de alimentación discontinua contiene jarabe de maltosa como fuente de carbono mientras que el extracto de levadura y la urea se añaden con el fin de asegurar un suministro suficiente de nitrógeno. La lipasa puede purificarse usando métodos estándar conocidos en la industria, por ejemplo, la filtración del sobrenadante de fermentación y la posterior cromatografía hidrófoba e intercambio aniónico, por ejemplo, como se describe en la patente europea EP 0 851 913, Ejemplo 3.

EJEMPLO 2 Ensayo automático de esfuerzo mecánico- (AMSA, por sus siglas en inglés)- para calcular el rendimiento relativo (RP, por sus siglas en inglés).

Las variantes enzimáticas de la presente solicitud se prueban usando el Ensayo de esfuerzo mecánico automatizado (AMSA). Con la prueba AMSA se puede analizar el rendimiento de lavado de una gran cantidad de soluciones de detergentes que tienen enzimas de volumen reducido. La placa del AMSA tiene una cantidad de ranuras para soluciones de prueba y una tapa que aprieta firmemente la muestra de tela que se va a lavar con respecto a todas las aberturas de la ranura. Durante el lavado, se agitan vigorosamente la placa, las soluciones de prueba, la tela y la tapa para poner la solución de prueba en contacto con la tela y aplicar esfuerzo mecánico. Para una descripción más amplia ver la patente WO 02/42740, especialmente el párrafo "Special method embo-diments" (Modalidades del método especial) en las páginas 23-24. Los recipientes, que contienen la solución de prueba de detergente, consisten de agujeros cilindricos (6 mm de diámetro, 10 mm de profundidad) en una placa metálica. La tela manchada (material de prueba) se coloca en la parte superior de la placa metálica y se usa en los recipientes como tapa y sello. Para evitar derrames, se coloca otra placa metálica en la parte superior de la tela manchada de cada recipiente. Se aplica vibración arriba y abajo de las dos placas metálicas junto con la tela manchada a una frecuencia de 30 Hz con una amplitud de 2 mm. El ensayo se realiza bajo las condiciones experimentales especificadas a continuación: Cuadro 3 Pedazos de tejido de muestra de crema de cúrcuma se prepararon mezclando 5 g de cúrcuma (Santa María, Denmark) con 100 g de crema (38 % de grasa, Arla, Denmark) a 50 °C, la mezcla se dejó a esta temperatura por aproximadamente 20 minutos y se filtró (50 °C) para remover cualquier partícula no disuelta. La mezcla se enfría a 20 °C, los pedazos de tejido de muestra de algodón, EMPA221 , se sumergieron en la mezcla de crema de cúrcuma y luego se dejaron secar a temperatura ambiente durante la noche y se congelaron hasta el momento de utilizarlos. La preparación de pedazos de tejido de muestra de crema de cúrcuma se describe en la patente PA 2005 00775, presentada el 27 de Mayo de 2005. El rendimiento de la variante enzimática se mide como el brillo del color de las muestras de tela lavadas con esa variante enzimática específica. El brillo se puede expresar también como la intensidad de la luz reflejada por la muestra de tela cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la tela está manchada, la intensidad de la luz reflejada es menor que la de una tela limpia. Por ello, la intensidad de la luz reflejada puede usarse para medir el rendimiento de lavado de una variante enzimática. Las mediciones del color se realizan con un escáner de cama plana profesional (PFU DL2400pro) que se usa para capturar una imagen de las muestras de tela lavadas. Las exploraciones se realizan con una resolu-ción de 200 dpi y con una profundidad de salida de color de 24 bits. Con el fin de obtener resultados precisos, el escáner se calibra, frecuentemente, con un objetivo reflectante IT 8 de Kodak. Para extraer un valor para la intensidad de la luz a partir de las imágenes exploradas se usa una aplicación de software especialmente dise-ñada (Novozymes Color Vector Analyzer). El programa recupera los valores de 24 bits por píxel de la imagen y los convierte en valores para rojo, verde y azul (RGB, por sus siglas en inglés). El valor de la intensidad (Int) se calcula sumando los valores RGB juntos como vectores y tomando luego la longitud del vector resultante: Iní =^¡r2 + g2 + b2 El rendimiento de lavado (P) de las variantes se calcula de acuerdo con la fórmula: P = lnt(v) - lnt(r) donde lnt(v) es el valor de la intensidad de la luz de una superficie de tela lavada con la enzima probada e lnt(r) es el valor de la intensidad de la luz de la superficie de la tela lavada sin la enzima probada. El puntaje del rendimiento relativo se proporciona como el resultado del lavado AMSA de conformidad con la definición: Los puntajes de rendimiento relativo (RP, por sus siglas en inglés) se obtienen sumando los rendimientos (P, por su sigla en inglés) de las variantes enzimáticas probadas con respecto a la enzima de referencia: RP = P(enzima de prueba)/P(enzima de referencia). RPavg indica el rendimiento relativo promedio comparado con la enzima de referencia en las cuatro concentraciones de enzimas (0.125, 0.25, 0.5, 1.0 mg ep/l) RPavg = avg(RP(0.125), RP(0.25) RP(0.5), RP(1.0)) Se considera que el rendimiento de lavado de una variante es mejor si su rendimiento es mejor que el de la referencia. En el contexto de la presente invención la enzima de referencia es la lipasa de SEQ ID NO: 2 con las sustituciones T231 R + N233R.

EJEMPLO 3 GC -(Cromatografía de gases) -para calcular el factor de riesgo.

La liberación de ácido butírico de los pedazos de tejido de muestra lavados con lipasa, se midieron por medio de Microextracción en fase sólida -Cromatografía de gases (SPME-GC, por sus siglas en inglés) usando el siguiente método. Se transfirieron cuatro pedazos de tela (5 mm de diámetro) lavados en la solución especificada en el Cuadro 3 que contienel mg/L de lipasa a un frasco de Cromatografía de gases (GC). Las muestras se analizaron en un Vahan 3800 GC equipado con una columna Stabilwax- DA w/Integra-Guard (30 m, 0.32 mm ID y 0.25 micro-m df) y una fibra Carboxen PDMS SPME (75 micro-m). Cada muestra se preincuba por 10 min a 40 °C seguida por un muestreo de 20 minutos con la fibra SPME en el espacio vacío sobre los pedazos de tela. La muestra, luego, se inyecta en la columna (temperatura del inyector = 250 °C). Flujo de la columna = 2 mL Helio/min. Gradiente de temperatura del horno de la columna: 0 min = 40 °C, 2 min = 40 °C, 22 min = 240 °C, 32 min = 240 °C. El ácido butírico se detecta por medio de detección FID y la cantidad de ácido butírico se calcula en base a una curva estándar de ácido butírico.

El Riesgo de intensidad de olor, R, de una variante de lipasa es la relación entre la cantidad de ácido butírico liberado del pedazo de tejido de muestra lavado con la variante de lipasa y la cantidad de ácido butírico liberado de un pedazo de tejido de muestra lavada con la lipasa de la SEQ ID NO: 2 con las sustituciones T231 R + N233R (enzima de referencia), después de que ambos índices se hayan corregido para la cantidad de ácido butírico liberado a partir de un pedazo de tejido de muestra lavado sin la lipasa. El riesgo (R) de las variantes se calcula de conformidad con la siguiente fórmula: Olor = medido en micro g de ácido butírico producido por 1 mg de enzima protéica/l corregido para la preforma Qenzima de prueba= ???G enzima de prueba — ?Gß??GG?3 Qenzima de referencia — ???G enzima de referencia — Preforma R — Qenzima de prueba I Qenzima de referencia Se considera que el olor de una variante es reducido en compa-ración con la referencia, si el factor R es menor que 1.

EJEMPLO 4 Actividad (LU) relativa a la absorbancia a 280 nm La actividad de una lipasa relativa a la absorbancia a 280 nm se determina mediante la siguiente prueba LU/A280: La actividad de la lipasa se determina como se describió anteriormente en la sección de la actividad lipasa. Se mide la absorbancia de la lipasa a 280 nm (A280)y se calcula la relación LU/A280. Se calcula la relación LU/A280 relativa como la relación LU/A280 de la variante dividida por la reíación LU/A280 de una enzima de referencia. En el contexto de la presente invención la enzima de referencia es la lipasa de la SEQ ID NO: 2 con las sustituciones T23 R + N233R.

EJEMPLO 5 Factor Riesgo-Beneficio - BR (por sus siglas en inglés).

El factor Riesgo-Beneficio que describe el rendimiento comparado con el riesgo reducido de olor se define, de esa manera, como: BR = RPaVg / R Se considera que el rendimiento de lavado de una variante es mejor y el olor se reduce, si el factor BR es mayor que 1. Al aplicar los métodos anteriores se obtuvieron los siguientes resultados: Cuadro 4 La lipasa de referencia y las variantes 7 y 8 del Cuadro 4 se describen en la patente WO 2000/060063.

Ejemplos de detergentes Las identificaciones abreviadas de los componentes pa ejemplos son las siguientes: LAS Alquilbencensulfonato de Cn de sodio lineal CxyAS Alquil sulfato de sodio de Cix - Ciy. CxyEzS Alquil sulfato de sodio de Cix - Ciy condensado con un promedio de z moles de óxido de etíleno. CxyEy Alcohol de C - Ciy con un promedio de etoxilación de z QAS R2.N+(CH3)2(C2H4OH) con R2 = Ci0-C12 Silicato Silicato de sodio amorfo (Si02:Na20 relación = 1.6-3.2:1). Zeolita A Aluminosilicato de sodio hidratado con fórmula Nai2(A102S¡02)i2. 27H20 con un tamaño de partícula primario que varia de 0.1 a 10 micrómetros (peso expresado en base anhidra). (Na-)SKS-6 Silicato cristalino estratificado de fórmula5 - Na2Si20s C ¡trato Citrato trisódico dihidratado Cítrico Ácido cítrico anhidro Carbonato Carbonato de sodio anhidro Sulfato Sulfato de sodio anhidro MA/AA Copolimero al azar (random) de 4:1 acrilato/maleato, con peso molecular promedio de aproximadamente 70,000-80,000. Polímero AA Polímero de poliacrilato de sodio con peso molecular promedio de 4500.

PB1 / PB4 Perborato de sodio anhidro monohídratado/tetrahidratado. PC3 Percarbonato de sodio anhidro [2.74 Na2CC 3H202] TAED Tetraacetiletilendiamina. NOBS Nonanoiloxibencensulfonato en forma de sal sódica. DTPA Ácido dietilentriaminapentaacético HEDP Hidroxietano dífosfonato EDDS Sal sódica del isómero (S,S) del ácido etilendiamina-N.N'-disuccínico STPP Tripolifosfato de sodio Proteasa Enzima proteolitica distribuida bajo los nombres comerciales de Savinase®, Alcalase®, Everlase®, Coronase®, Polarzyme®, de Novozymes A/S, Properase®, Purafect®, Purafect MA® y Purafect Ox® distribuida por Genencor y proteasas descritas en las patentes WO 91/06637 o WO 95/10591 o las patentes europeas EP 0 251 446 tales como FNA, FN3 o FN4. Amilasa Enzima amilolítica distribuida bajo los nombres comerciales de Purastar® Purafect Oxam® distribuida por Genencor; Termamyl®, Fungamyl® Duramyl®, Stainzyme® y Natalase® distribuidas por Novozymes A/S. Lipasa Cualquier variante de lipasa 1 a 5 descrita en el Ejemplo 5, Cuadro 4, y combinaciones de éstas. Mananasa Mannaway® distribuida por Novozymes CMC o HEC Carboximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa o celulosa modificada con éster. Aglom. SS Aglomerado supresor de espuma: 12 % de silícona/silice, 18 % de alcohol estearilíco, 70 % de almidón en forma granulada. TEPAE Tetraetílenpentamina etoxilato. pH Medida como una solución al 1 % en agua destilada a 20 °C.

EJEMPLO A Las siguientes formulaciones ejemplifican composiciones de detergentes blanqueadoras que tienen la forma de detergentes para lavandería granulados.

Cualquiera de las composiciones del Ejemplo A se usa para lavar telas a una concentración de 600 - 10,000 ppm en agua, con condiciones medias típicas de 2500 ppm, 25 °C y una relación de aguaítela de 25:1. El pH típico es aproximadamente 10, pero puede ajustarse alterando la proporción de ácido a la forma de sal de sodio del alquilbencenosulfonato.

EJEMPLO B Las siguientes formulaciones ejemplifican composiciones de detergentes blanqueadoras que tienen la forma de detergentes para lavandería granulados.

Cualquiera de las composiciones anteriores del Ejemplo B se usa para lavar telas con una concentración de 10,000 ppm en agua, 20-90 °C, y una relación 5:1 de agua:tela. El pH típico es aproximadamente 10, pero puede ajustarse alterando la proporción de ácido a la forma de sal de sodio del alquilbencenosulfonato.

EJEMPLO C * Los números son mencionados en mg de enzima/100 g 1 Como se describe en la patente de los EE.UU. Núm. 4,597,898. 2 distribuida bajo el nombre comercial de LUTENSIT® de BASF y como los descritos en la patente WO 01/05874 Todos los documentos mencionados en la descripción detallada de la invención se incorporan en la presente, en su parte relevante, como referencia: La mención de cualquier documento no deberá interpretarse como una admisión de que éste corresponde a una industria anterior con respecto a la presente invención. En la medida que cualquier significado o definición de un término en este documento contradiga cualquier significado o definición del término en un documento incorporado como referencia, el significado o definición asignado al término en este documento deberá regir. Si bien se han ¡lustrado y descrito modalidades particulares de la presente invención, será evidente para aquellos con experiencia en la indus- tria que pueden hacerse diversos cambios y modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Por ello, se ha pretendido abarcar en las reivindicaciones anexas todos los cambios y modificaciones que se encuentran dentro del alcance de la invención.

Claims (37)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un ingrediente detergente y una variante de una lipasa madre; la variante, cuando se compara con la lipasa madre, comprende por lo menos tres sustituciones en total; la sustituciones se seleccionan de uno o más de los siguientes grupos de sustituciones: a) por lo menos dos sustituciones en la Región I, b) por lo menos una sustitución en la Región II, c) por lo menos una sustitución en la Región III, y/o d) por lo menos una sustitución en la Región IV.

2. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque las sustituciones en la Región I comprenden sustituciones en las posiciones que corresponden a las posiciones 231 y 233.

3. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque las sustituciones en las posiciones 231 y 233 están sustituidas por una R.

4. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la variante comprende una sustitución en la posición que corresponde a la posición 4 de la SEO. ID NO: 2.

5. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la sustitución en la posición que corresponde a la posición 4 de la SEQ ID NO: 2 es V.

6. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la variante comprende una sustitución en la posición que corresponde a la posición 227 de la SEQ ID NO: 2.

7. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la sustitución en la posición que corresponde a la posición 227 de la SEQ ID NO: 2 es G.

8. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque por lo menos una sustitución en la Región II comprende una sustitución seleccionada del grupo formado por sustituciones en las posiciones que corresponden a las posiciones 202, 21 1 , 255 y 256.

9. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque por lo menos una sustitución en la Región II comprende una sustitución seleccionada del grupo formado por X202G, X211 L, X255Y/V y X256K.

10. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque por lo menos una sustitución en la Región II comprende una sustitución en la posición que corresponde a la posición 210.

1 1. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la sustitución que corresponde a la posición 210 comprende X210K.

12. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque por lo menos una sustitución en la Región III comprende una sustitución seleccionada del grupo formado por sustituciones en las posiciones que corresponden a las posiciones 83, 86 y 90.

13. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque por lo menos una sustitución en la Región III comprende una sustitución seleccionada del grupo formado por X83T, X86V y X90A/R.

14. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque por lo menos una sustitución en la Región III comprende una sustitución en la posición que corresponde a la posición 83.

15. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque la sustitución que corresponde a la posición 83 comprende X83T.

16. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque por lo menos una sustitución en la Región IV comprende una sustitución seleccionada del grupo formado por sustituciones en las posiciones que corresponden a las posiciones 27, 58 y 60.

17. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque por lo menos una sustitución en la Región IV comprende una sustitución seleccionada del grupo formado por X27R, X58N/A/G/P T y X60S/V/G/N/R/K/A/L

18. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende por lo menos dos sustituciones en la Región IV que corresponden a las posiciones 27, 58 y 60.

19. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende por lo menos dos sustituciones en la Región IV seleccionadas del grupo formado por X27R, X58N/A/G/P T y X60S/V/G/N/R/K/A/L.

20. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la variante comprende por lo menos una sustitución fuera de las Regiones I a IV definidas.

21 . La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque por lo menos una sustitución fuera de las Regiones I a IV definidas se selecciona del grupo formado por sustituciones en las posiciones que corresponden a las posiciones 81 , 147, 150 y 249.

22. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque por lo menos una sustitución fuera de las Regiones I a IV definidas se selecciona del grupo formado por X81 Q/E, X147M/Y, X150G y X249R/I/L.

23. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la lipasa madre es por lo menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 2. 24. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la lipasa madre es idéntica a la

SEQ ID NO: 2 y la variante comprende uno de los siguientes grupos de sustituciones: a) T231 R + N233R + I255Y b) I202G + T231 R + N233R c) I86V + L227G + T231 R + N233R + P256K d) Q4V + S58N + V60S + T231 R + N233R e) S58N + V60S + I90R + T231 R + N233R f) I90A + T231 R + N231 R + I255V g) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T231 R + N233R + P256K h) S58N + V60S + L147M + F21 1 L + T231 R + N233R i) Q4V + S58A + V60S + S83T + I86V + A150G + E210K + L227G + T231 R + N233R + P256K j) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T231 R + N233R + P256K. 25. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la lipasa madre es idéntica a la

SEQ ID NO: 2 y la variante comprende uno de los siguientes grupos de sustituciones: a) Q4V + S58A + V60S + S83T + I86V + A150G + E210K + L227G + T231 R + N233R + P256K b) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T231 R + N233R + P256K.

26. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la variante de lipasa se identifica porque el Riesgo-Beneficio (BR) es mayor que 1 cuando se mide según lo establecido en la especificación.

27. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente 0.1 a 40 % de surfactante aniónico, preferentemente de 0.1 a 12 %.

28. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque el surfactante aniónico es un alquilsulfato alcoxilado.

29. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente de 5 a 30 % de aditivo de aluminosilicato o fosfato.

30. La composición de detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente una fuente de peróxido y un activador de blanqueador, preferentemente tetraacetiletilendiamina.

31 . Un detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el detergente es una composición de detergente líquida o sólida.

32. El detergente de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el detergente es un detergente granulado.

33. El detergente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el detergente es una composición de dosis unitaria que es una tableta sólida o un líquido encapsulado en una película soluble.

34. Un procedimiento de lavado que comprende el lavado de artículos de tela en una solución acuosa, que comprende la composición detergente de conformidad con la reivindicación 1.

35. El procedimiento de lavado de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el procedimiento es adecuado para remover suciedades y manchas de una superficie, y comprende los pasos de: a) pretratar, opcionalmente, las suciedades y manchas con las composiciones de la reivindicación 1 para formar una superficie, opcionalmente, pretratada; b) añadir una cantidad eficaz de las composiciones de la reivindicación 1 en agua para formar una solución acuosa de lavado que comprende de aproximadamente 500 a aproximadamente 10,000 ppm de la composición; c) poner la solución acuosa de lavado en contacto con la superficie, opcionalmente, pretratada, y d) agitar, opcionalmente, la solución acuosa de lavado y la superficie, opcionalmente, pretratada.

36. El procedimiento de lavado de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque la solución acuosa está a una temperatura inferior a 30 °C.

37. Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la variante de lipasa es una variante de la SEQ ID NO: 2 que comprende por lo menos una de las mutaciones Q4V, S58N/A/G/P/T, I90R o Q249I/L.