PELICULAS DE POLIPEPTIDO Y METODOS CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona a la fabricación de películas y microcápsulas de polipéptido nanodiseñadas , y métodos para hacer y utilizar tales películas y microcápsulas. Más específicamente, la presente invención se relaciona a la encapsulación de biomacromoíéculas funcionales en microcápsulas de polipéptido nanodiseñadas. ANTECEDENTES Las películas multicapa de polielectrolito son películas delgadas (por ejemplo, unos pocos nanómetros a milímetros de grueso) compuestas de capas alternantes de polielectrolitos opuestamente cargados. Tales películas se pueden formar mediante el ensamble de capa por capa sobre un sustrato adecuado. En el au toensamble de capa por capa electrostático ( " ELBL" ) , la base física de asociación de los polielectrolitos es la electrostática. La acumulación de película es posible debido a que el signo de la densidad de carga de superficie de la película se invierte sobre la deposición de capas sucesivas. El principio general de la deposición de ELBL de poliiones opuestamente cargados se ilustra en la Figura 1. La generalidad y simplicidad relativa del proceso de película de ELBL permite la deposición de muchos tipos diferentes de polielectrolitos sobre muchos tipos diferentes de superficie. Las películas multicapa de polipéptido son un subcon unto de películas multicapa de polielectrolito , que comprenden por lo menos una capa que comprende un polipéptido cargado. Una ventaja clave de películas multicapa de polipéptido es el aspecto favorable ambiental. Las películas de ELBL también se pueden utilizar para encapsulación . Aplicaciones de películas y microcápsulas de polipéptido incluyen, por ejemplo, nano-reactores , biosensores, células artificiales y vehículos de suministro de fármacos. Los principios de diseño para la incorporación de polipéptidos en películas multicapa se pusieron en claro primero en la publicación de patente norteamericana No. 20050069950. En breve, la adecuación de un polipéptido para el ELBL se relaciona a la carga neta sobre el polipéptido y la longitud del polipéptido. Un polipéptido adecuado para el ELBL comprende preferiblemente una o más porciones de secuencia de aminoácidos, esto es, secuencias de aminoácidos contiguas que tienen una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 residuos de aminoácidos y que tienen una densidad de carga lineal adecuada para la deposición electrostática. Un polipéptido para el ELBL se puede diseñar de diferentes maneras, por ejemplo, al unir una pluralidad de porciones de secuencia de aminoácidos entre sí, ya sea directamente, o mediante un enlazador . Polipéptidos que tienen la longitud apropiada y propiedades de carga se pueden depositar fácilmente para formar una o más capas de una película multicapa de polipéptido. Proteínas, péptidos y oligonucleótidos pueden ser agentes terapéuticos potentes. Tales biomoléculas , sin embargo, son objetivos de varios mecanismos de degradación in vivo. La encapsulación de biomoléculas y otras moléculas bioactivas dentro de un micro medio ambiente biocompatible , para la conservación prolongada de función o liberación controlada, es una estrategia para mejorar la habilidad de las moléculas bioactivas en sitios objetivo. La deposición de una película de polipéptido sobre un sustrato recubierto con una biomolécula ' podría prolongar similarmente la conservación de la función o controlar la liberación de la biomolécula. Nanoensamble capa por capa electrostático es un medio para preparar películas multicapa de polielectrolito y microcápsulas de estabilidad alta y permeabilidad afinable. Permanece una necesidad por medios alternativos para lograr la retención directa y eficiente de macromoléculas bioactivas funcionales, por ejemplo una proteína, en películas y microcápsulas de polipéptido biodegradables diseñadas. BREVE DESCRIPCIÓN En una modalidad, un método para hacer una película comprende depositar una primera capa de polielectrolito sobre una superficie de un sustrato para formar una primera capa; y depositar una segunda capa de polielectrolito sobre la primera capa de polielectrolito para formar una segunda capa. La primera capa de polielectroli o, la segunda capa de polielectrolito, o ambas, se deposita sobre el sustrato en la presencia de un precipitante polimérico; y la primera capa de polielectrolito y la segunda capa de polielectrolito tienen cargas netas de polaridad opuestas. En otra modalidad, la primera capa de polielectrolito, la segunda capa de polielectrolito, o ambas, comprende un homopolipéptido de lisina, ácido glutámico, u otro tipo de aminoácido que tiene una cadena lateral cargada en pH neutro. En otra modalidad, la primera capa de polielectrolito, la segunda capa de polielectrolito, o ambas, comprenden un polipéptido diseñado, en donde el polipéptido diseñado comprende una o más de las primeras porciones de secuencia de aminoácidos, en donde la una o más primeras porciones de secuencia de aminoácidos consiste de 5 a 15 residuos de aminoácido y tienen una magnitud de carga neta por residuo de mayor que o igual a 0.4, y en donde el polipéptido diseñado no es un homopolipéptido, es por lo menos 15 residuos de aminoácidos de largo, y tiene una magnitud de carga neta por residuo de mayor que o igual a 0.4. En otra modalidad, un método para mejorar la retención de molécula bioactiva durante la fabricación de una película multicapa de polielectrolito comprende depositar una primera capa de polielectroiito sobre una superficie de un sustrato para formar una primera capa; y depositar una segunda capa de polielectroiito sobre la primera capa de polielectroiito para formar una segunda capa. La primera capa de polielectroiito, la segunda capa de polielectroiito, o ambas, se depositan sobre el sustrato en la presencia de un precipitante polimérico; la primera capa de polielectroiito y la segunda capa de polielectroiito tienen cargas netas de polaridad opuesta; y el sustrato comprende una molécula bioactiva. Lo anterior · descrito y otras características se ejemplifican mediante las siguientes figuras y la descripción detallada . DIBUJOS: Con referencia ahora a las figuras, que son modalidades ejemplares: La Figura 1 muestra una representación esquemática del ensamble de polipéptidos opuestamente cargados. La Figura 2 muestra la capacidad de adsorción de glucosa oxidasa (GOx) sobre plantillas de partículas CaC03 o de melamina formaldehído (MF) como una función de la concentración de la enzima y la concentración de NaCl. La Figura 3 muestra la pérdida de GOx adsorbido de las plantillas de CaC03 durante la deposición de una película de poli (L-lisina) /poli (L-ácido glutámico) (PLL/PLGA) de encapsulación como la absorbencia a 280 nm debido a l GOx liberado presente en el lavado, solución reguladora de ensamble de poli (L-lisina ) (PLL), o solución reguladora de ensamble de' poli (L-ácido glutámico) (PLGA) en la ausencia de un precipitante polimérico, en la presencia de PEG 300 al 40% o en la presencia de PEG 300 al 50%. La Figura 4 muestra la retención de GOx sobre plantillas de CaCC>3 durante la deposición de una película (PLL)/ (PLGA) de encapsulación en la presencia o ausencia de PEG 300 al 50% en las soluciones de deposición. La Figura 5 muestra el esquema de reacción para la medición fotométrica de la actividad de GOx en una microcápsula de polipéptido. La Figura 6 muestra la actividad medida del GOx encapsulado como una función de número de capas de polipéptido . La Figura 7 muestra (a) imagen de microscopía Confocal de microcápsulas después de la disolución de la plantilla. Izquierda, fluorescencia; derecha, campo brillante, (b) Perfil de intensidad de fluorescencia de una cápsula. Izquierda, cápsula cargada; derecha, núcleo recubierto previo a la disolución de la plantilla. DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención se dirige a películas multicapa de polielectrolito y en particular, un método novedoso para hacer las películas. En una modalidad, las películas comprenden una molécula bioactiva. En otra modalidad, las películas multicapa de polielectrolito comprenden una o más capas de polipéptido. Como se utiliza en la presente, "capa" significa un incremento grueso, por ejemplo, sobre un sustrato para la formación de película, después de una etapa de adsorción. "Multicapa" significa múltiples incrementos gruesos (es decir dos o más). Una "película multicapa de polielectrolito" es una película que comprende uno o más incrementos gruesos de polielectrolitos . Después de la deposición, las capas de una película multicapa no pueden permanecer como capas discretas. De hecho, es posible que exista intermezclado significante de especies, particularmente en las interfases de los incrementos gruesos . El término "polielectroli o" incluye materiales policatiónicos y polianiónicos que tienen un peso molecular de mayor que 1,000 y por lo menos 5 cargas por molécula. Materiales policatiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, poliaminas. Las poliaminas incluyen, por ejemplo, un polipéptido, polivinilamina , poli (aminoestireno) , poli (aminoacrilato) , poli (N-metil aminoacrilato) , poli (N-etilaminoacrilato) , poli (N, N-dimetil aminoacrilato), poli ( N , N-diet i laminoacrHato) , poli ( aminometacrilato) , poli ( N-metilamino-metacrila to) , poli (N-etil aminometacri-lato), poli (N, -dimetil aminometacrilato) , poli (N, -dietil aminometacri lato ) , poli (etilenimina ) , poli (cloruro de dialil dimetilamonio ) , poli (N, N, N-cloruro de trimetilaminoacrilato), poli (cloruro de metiacrilamidopropiltrimetil amonio), quitosan y combinaciones que comprenden uno o más de los materiales policatiónicos anteriores. Materiales polianiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, un polipéptido, un ácido nucleico, alginato, carrageno, furcelarán, pectina, xantano, ácido hialurónico, heparina, sulfato de heparan, sulfato de condroitin, sulfato de dermatan, sulfato de dextrano, ácido poli (met ) acrilico, celulosa oxidada, carboximetil celulosa, polisacáridos acidicos y croscarmelosa , polímeros y copolímeros sintéticos que contienen grupos carboxilo pendientes y combinaciones que comprenden uno o más de los materiales polianiónicos anteriores . "Aminoácido" significa un bloque de construcción de un polipéptido. Como se utiliza en la presente, "aminoácido" incluyen los 20 L-aminoácidos comunes que ocurren naturalmente, todos de otros aminoácidos naturales, todos los aminoácidos no naturales, y todos las imitaciones de aminoácido, por ejemplo, peptoides. "Aminoácido que ocurre naturalmente" significa los 20 L-aminoácidos que ocurren naturalmente comunes, esto es, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, arginina, lisina, histidina, fenilalanina , tirosina, triptófano y prolina. "Aminoácido no natural" significa un aminoácido diferente a cualquiera de los 20 L-aminoácidos que ocurren naturalmente comunes. Un aminoácido no natural puede tener ya sea L- o D-estereoquimica . "Peptoide" o glicina N-sustituida , significa un análogo del monómero de aminoácido correspondiente, con la misma cadena lateral como el aminoácido correspondiente pero con la cadena lateral unida al átomo de nitrógeno del grupo amino antes que a los alfa-carbonos del residuo.
Consecuentemente, los enlaces químicos entre los monómeros en un polipéptido no son enlaces de péptido, los cuales pueden ser útiles para limitar la digestión proteolítica . "Secuencia de aminoácidos" y "secuencia" significa una longitud contigua de cadena de polipéptido que es por lo menos dos residuos de aminoácidos largos. "Residuo" significa un aminoácido en un polímero u oligómero; este es el residuo del monómero de aminoácido del cual el polímero se formó. La síntesis de polipéptido involucra la deshidratación , esto es, una sola molécula de agua está "perdida" sobre la adición del aminoácido a una cadena de polipéptido. "Una porción de secuencia de aminoácido" significa una secuencia de aminoácido contigua que comprende residuos n, en donde n es 5 a 15. En una modalidad, la magnitud de la carga neta por residuo de una porción de secuencia de aminoácido es mayor que o igual a 0.4. En otra modalidad, la magnitud de la carga neta por residuo de una porción de secuencia de aminoácido es mayor que o igual a 0.5. Como se utiliza en la presente, la magnitud de la carga neta se refiere al valor absoluto de la carga neta, esto es, la carga neta puede ser positiva de negativa. "Polipéptido diseñado" significa un polipéptido que comprende una o más porciones de secuencia de aminoácidos, en donde el polipéptido es por lo menos 15 aminoácidos en longitud y la relación del número de residuos cargados de la misma polaridad menos el número de residuos de la polaridad opuesta al número total de residuos en el polipéptido es mayor que o igual a 0.4 en pH 7.0. En otras palabras, la magnitud de la carga neta por residuo del péptido es mayor que o igual a 0.4. En una modalidad, la relación del número de residuos cargados de la misma polaridad menos el número de residuos de la polaridad opuesta al número total de residuos en el polipéptido es mayor que o igual a 0.5 en pH 7.0. En otras palabras, la magnitud de la carga neta por residuo del polipéptido es mayor que o igual a 0.5. Mientras que no existe limite superior absoluto sobre la longitud del polipéptido, en general, los polipéptidos diseñados adecuados para la deposición de ELBL tienen un limite de longitud superior práctica de 1,000 residuos. "Estructura primaria" significa la secuencia lineal contigua de aminoácidos en una cadena de polipéptido, y "estructura secundaria" significa los tipos más o menos regulares de la estructura en una cadena de polipéptido estabilizada mediante interacciones no covalentes, usualmente enlaces de hidrógeno. Ejemplos de estructura secundaria incluyen hélice a, lámina ß y vuelta ß. "Película multicapa de polipéptido" significa una película que comprende uno o más poiipéptidos tales como los polipéptidos diseñados definidos en lo anterior. Por ejemplo, una película multicapa de polipéptido comprende una primera capa que comprende un polipéptido diseñado y una segunda capa que comprende un polielectroli o que tiene una carga neta de polaridad opuesta al polipéptido diseñado. Por ejemplo, si la primera capa tiene una carga positiva neta, la segunda capa tiene una carga negativa neta; y si la primera capa tiene una carga negativa neta, la segunda capa tiene una carga positiva neta. La segunda capa comprende otro polipéptido diseñado u otro polielectrolito . "Sustrato" significa un material sólido con una superficie adecuada para la adsorción de polielectrolitos de solución acuosa. La superficie de un sustrato puede tener esencialmente cualquier forma, por ejemplo, plana, esférica, en forma de barra y las similares. La superficie de sustrato es regular o irregular. Un sustrato puede ser un cristal. Un sustrato incluye opcionalmente moléculas bioactivas. Los sustratos varían en tamaño de la nanoescala a la macroescala. Por otra parte, un sustrato comprende opcionalmente varias subpartículas pequeñas. Un sustrato puede ser hecho de material orgánico, material inorgánico, material bioactivo o una combinación de los mismos. Ejemplos no limitativos de sustratos incluyen discos de silicio; particular coloidales cargadas, por ejemplo, micropartículas de CaCC>3 o de melamina formaldehído; cristales de proteína; cristales de ácido nucleico; cristales de fármaco; células biológicas tales como eritrocitos, hepatocitos, células bacterianas, o células de levadura; celosías de polímero orgánico, por ejemplo celosías de polímero de poliestireno o estireno; liposomas; organelos; y virus. En una modalidad, un sustrato es un dispositivo médico tal como un marcapaso artificial, un implante de cocía o un stent. Cuando un sustrato se desintegra o de otra manera se remueve durante o después de la formación de la película, es llamado "una plantilla" (para la formación de películas". Las partículas de plantilla se pueden disolver en solventes apropiados o 'remover median Le tratamiento térmico. Si, por ejemplo, las partículas de plantillas de formaldehído de melamina parcialmente reticuladas se utilizan, la plantilla se puede desintegrar mediante métodos químicos leves, por ejemplo, en DMSO, .o mediante un cambio en el valor de pH . Después de la disolución de las partículas de plantilla, cubiertas multicapa huecas permanecen las cuales se componen de capas de polielectrolito alternantes. Una "microcápsula" es una película de polielectrolito en la forma de una cubierta hueca o un recubrimiento que circunda un núcleo. El término núcleo de esta manera significa en el interior de una microcápsula. El núcleo comprende una variedad de encapsulantes diferentes, tal como una proteína, un fármaco, o una combinación de los mismos, en forma líquida o cristalina, por ejemplo. "Molécula bioactiva" significa una molécula, macromolécula , o ensamble molecular que tiene un efecto biológico. El efecto biológico específico se puede medir en un ensayo adecuado y normalizar por peso unitario o por molécula de la molécula bioactiva. Una molécula bioactiva se puede encapsular, retener detrás, o encapsular dentro de una película de polielectrolito. Ejemplos no limitativos de una molécula bioactiva son un fármaco, un cristal de un fármaco, una proteína, un fragmento funcional de una proteína, un complejo de proteínas, una lipoproteína , un oligopéptido , un oligonucleótido, un ácido nucleico, un ribosoma, un agente terapéutico activo, un fosfolípido, un polisacárido, un lipopolisacárido . Como se utiliza en la presente, "molécula bioactiva" además incluye estructuras biológicamente activas, tal como, por ejemplo, un fragmento de membrana funcional, una estructura de membrana, un virus, un patógeno, una célula, un agregado de células, y un organelo. Ejemplos de una proteina que se pueden encapsular o retener detrás de una película de polipéptido son hemoglobina; enzimas, tales como por ejemplo glucosa oxidasa, ureasa, lisozima y los similares; proteínas de matriz extracelular , por ejemplo, fibronectina , laminina, vitronectina y colágeno; y un anticuerpo. Ejemplos de una célula que se pueden encapsular o retener detrás de una película de polielectrolito es una célula de islote transplantada , una célula eucariótica, una célula bacteriana, una célula de planta y una célula de levadura . "Biocompatible" significa que no causa efecto de salud adverso sustancial en la ingestión oral, aplicación tópica, aplicación transdérmica , inyección subcutánea, inyección intramuscular, inhalación, implantación o inyección intravenosa. Por ejemplo, películas biocompatibles incluyen aquellas que no causan una respuesta inmune sustancial cuando están en contacto con el sistema inmune de, por ejemplo, un ser humano. "Respuesta inmune" significa la respuesta del sistema inmune celular o humoral a la presencia de una sustancia en cualquier parte en el cuerpo. Una respuesta inmune se puede caracterizar en un número de manera, por ejemplo, mediante un incremento en la corriente sanguínea del número de anticuerpos gue - reconocen un cierto antígeno. Anticuerpos son proteínas secretadas por células B, y un antígeno es una entidad que induce una respuesta inmune. El cuerpo humano pelea la infección e inhibe la reinfección al incrementar el número de anticuerpos en la corriente sanguínea y en otra parte. La respuesta inmune específica depende una alguna manera sobre el individuo, aunque patrones generales de respuesta son la norma . "Epítope" significa la estructura o secuencia de una proteína que es reconocida por un anticuerpo. Ordinariamente un epítope estará sobre la superficie de una proteína. Un "epítome continuo" es uno que involucra varios residuos de aminoácido contiguo, no uno que involucra residuos de aminoácido que resultan están en contacto o en región limitada de espacio en una proteína plegada. "Precipitante polimérico" significa un químico tal como un polímero soluble que afecta la solubilidad en una molécula bioactiva. En una modalidad, un precipitante polimérico significa un polímero soluble en agua que disminuye la solubilidad en agua de una molécula bioactiva adsorbida sobre una plantilla y/o la solubilidad en agua de un polielectrolito utilizado en la fabricación de una película sobre una plantilla. En solución acuosa, el precipitante polimérico atrae las moléculas de agua de solvente lejos de la superficie de una plantilla recubierta con molécula bioactiva, disminuyendo efectivamente la solubilidad de la molécula bioactiva en la solución acuosa a granel, y de esta manera incrementando la cantidad de la molécula bioactiva que se retiene sobre la plantilla durante el proceso de ensamble de la película de polielectrolito . El precipitante polimérico también puede tener una influencia favorable sobre la estabilidad de la cápsula durante la disolución de la plantilla al cambiar el gradiente de presión osmótico a través de la pared de la cápsula . Ejemplos no limitativos de un precipitante polimérico son polietilenglicol ( PEG) , ácido poliacrílico (sal de sodio), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, polipropilenglicol (PPG), dietilaminoetildextrano, polietilenimina (PEI), y combinaciones que comprenden uno o más de los precipitantes poliméricos anteriores. El peso molecular preferido del precipitante polimérico variará de polímero a polímero. Se debe notar que el peso molecular es un determinante fuerte de la solubilidad de un precipitante polimérico, de modo que mientras más alto es el peso molecular, más baja es la solubilidad. Valores prácticos de peso molecular para algunos de los polímeros mencionados para el uso como precipitantes poliméricos de biomacromoléculas son 425 Da para PPG, 5 , 000 Da para ?\/?, y 40 a 60 kDa para PEL. Detalles adicionales sobre la solubilidad de tales polímeros son fácilmente disponibles en la literatura científica. Un aspecto de la invención divulgado en la presente proporciona un método para hacer una película multicapa. El método comprende depositar una pluralidad de capas de polielectrolitos opuestamente cargados sobre un sustrato. La deposición de por lo menos uno de los polielectrolitos opuestamente cagados se realiza en la presencia de un precipitante polimérico. En algunas modalidades, la deposición es mediante el ensamble capa por capa (LBL) . Las capas sucesivamente depositadas tienen señales opuestas de carga neta. En una modalidad, una o más capas comprenden un polipéptido diseñado. En otras modalidades, por lo menos uno de los polipéptidos opuestamente cargados comprende un homopolipéptido tal como poli (L-lisina) o poli(L-ácido glutámico) . Los principios de diseño para los polipéptidos adecuados para la deposición capa por capa electrostática se aclaran en la publicación de patente norteamericana No. 2005/0069950, incorporada en la presente por referencia. Brevemente, los problemas de diseño primarios son la longitud y carga del polipéptido. La electrostática es el problema de diseño mucho más importante debido a que es la base del ELBL . Sin las propiedades de carga adecuadas, un polipéptido no será sustancialmente soluble en solución acuosa en pH 4 a 10 y no puede ser utilizado fácilmente para la fabricación de una película multicapa mediante el ELBL. Otros problemas de diseño incluyen la estructura física de los polipéptidos , la estabilidad física de las películas formadas de los polipéptidos, y la biocompatibilidad y bioactividad de las películas y los polipéptidos constituyentes. Como se define en lo anterior, un polipéptido diseñado significa un polipéptido que comprende una o más porciones de secuencia de aminoácido, en donde el polipéptido es por lo menos 15 residuos de aminoácido en longitud y la magnitud de la carga neta por residuo del polipéptido es mayor que o igual a 0.4 en pH 7.0. "Porción de secuencia de aminoácido" significa una secuencia de aminoácido contigua que comprende residuos de aminoácido n, en donde n es 5 a 15. Aminoácidos que ocurren naturalmente positi amente cargados
(básicos) en pH 7.0 son Arg, His, y Lys . Residuos de aminoácidos que ocurren naturalmente negativamente cargados
(acídicos) en pH 7.0 son Glu y Asp. Una porción de aminoácido que comprende una mezcla de residuos de aminoácido de carga opuesta se puede emplear mientras que la relación completa de la carga cumpla los criterios especificados. En una modalidad, un polipéptido diseñado no es un homopolipéptido . En una modalidad ejemplar, la porción de secuencia de aminoácidos comprende 7 residuos de aminoácido. Cuatro residuos de aminoácidos cargados es un mínimo adecuado para un tamaño de porción de 7, debido a que más pocos que 4 cargas producen solubilidad de péptido disminuida y control disminuido sobre el ELBL. Además, con respecto a al biocompatibilidad, cada porción de secuencia de aminoácido identificada en datos genómicos es suficientemente larga 7 residuos de aminoácido para constituir un epitope continuo, pero no mientras que corresponda sustancialmente a los residuos tanto sobre la superficie de una proteína como su interior. Así, la carga y longitud de la porción de secuencia de aminoácido ayuda a asegurar que una poción de secuencia de aminoácido identificada en los datos genómicos es probablemente que ocurra sobre la superficie de la proteína plegada de la cual la porción de secuencia se deriva. En contraste, una porción muy corta podría parecer al cuerpo que es una secuencia aleatoria, o una no específicamente "misma" y por lo tanto induce una respuesta inmune. En algunos casos, un problema de diseño con respecto a las porciones de secuencia de aminoácidos y los polipéptidos diseñados es su propensidad para formar estructuras secundarias, notablemente hélice a o lámina ß. En algunas modalidades, es deseable ser capaz de controlar, por ejemplo, a minimizar, la formación de estructuras secundaria mediante los polipéptidos diseñados en un medio acuoso a fin de maximizar el control sobre la formación de capa de película delgada. Primero, se prefiere que las porciones de secuencia sean relativamente cortas, esto es aproximadamente 5 a aproximadamente 15 residuos de aminoácido, debido a que las porciones largas son más probablemente a adoptar una estructura tridimensional estable en solución. Segundo, un enlazador, tal como un residuo de glicina o prolina, unidos covalentemente entre las porciones de secuencia de aminoácidos sucesivas en un polipéptido diseñado reducirá la propensidad del polipéptido a adoptar la estructura secundaria en solución. La glicina, por ejemplo, tiene una propensidad de hélice a muy baja y una propensidades de lámina ß muy baja haciéndola energéticamente muy desfavorable para una glicina y sus aminoácidos vecinos para formar la estructura secundaria regular en solución acuosa. Tercero, la propensidad de la hélice a y la lámina ß de los polipéptidos diseñados por sí mismos se puede minimizar al seleccionar las porciones de secuencia de aminoácido para la cual la propensidad de la hélice a asumida es menor que 7.5 y la propensidad de lámina ß asumida es menor que 8. Propensidad "asumida" significa que la suma de las propensidades de la hélice a o la lámina ß de todos los aminoácidos en una porción. Las porciones de secuencia de aminoácidos que tienen una propensidad de hélice a asumida y/o propensidad de lámina ß asumida más alta son adecuadas para la ELBL, particularmente cuando se unen por enlazadores tales como Gly o Pro. En ciertas aplicaciones, la propensidad de un polipéptido para formar la estructura secundaria puede ser relativamente alta como una característica de diseño específica de fabricación de película delgada. Las propensidades de la estructura secundaria para todos los 20 aminoácidos que ocurren naturalmente se puede calcular utilizando el método de Chou y Fasman (ver P. Chou y G. Fasman, Biochemistry, 13:211 (1974) , que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) . Otro problema de diseño es el control de la estabilidad de las películas de ELBL de polipéptido. Enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno, interacciones van der Waals, e interacciones hidrofóbicas contribuyen a la estabilidad de las películas multicapa. Además, los enlaces de disulfuro covalentes formados entre los aminoácidos que contienen sulfhidrilo en los polipéptidos dentro de la misma capa o en capas adyacentes pueden incrementar la resistencia estructural. Los aminoácidos que contienen sulfhidrilo incluyen cisterna y homocisteína . Además, un sulfhidrilo se puede adicionar a los ß-aminoácidos tales como ácido D,L-p-amino-p-ciclohexil-propionico; ácido D, L-3-aminobutanoico; o ácido 5- (metiltio) -3-aminopentanoico . Aminoácido que contienen sulfhidrilo se pueden utilizar para "cerrar" (unir con untamente) y "abrir" capas de una película de polipéptido multicapa mediante un cambio en el potencial de oxidación.
También, la incorporación de un aminoácido que contiene sulfhidrilo en una porción de secuencia de un polipéptido diseñado permite el uso de péptidos relativamente cortos en la fabricación de película delgada, por la virtud de la formación de enlace de disulfuro intermolecular. Las porciones de secuencia de aminoácido que contienen aminoácidos que contienen sulfhidrilo se puede seleccionar de una librería de porciones identificadas utilizando los métodos descritos enseguida, o diseñadas de novo. En una modalidad, los polipéptidos que contienen sulfhidrilo diseñados, ya sea sintetizados químicamente o producidos en un organismo hospedero, se ensamblan por el ELBL en la presencia de un agente reductor para prevenir la formación de enlace de disulfuro prematura. Después del ensamble de la película, el agente reductor se remueve y un agente oxidante se adiciona. En la presencia del agente oxidante los enlaces de disulfuro se forman entre grupos de sulfhidrilos , para de esta manera "cerrar" con untamente los polipéptidos dentro de las capas y entre las capas donde los grupos tiol están presentes. Agentes de reducción adecuados incluyen ditiotreitol ("DTT"), 2-mercaptoetanol (2-ME), glutathiona reducida, clorhidrato de tris (2-carboxietil ) fosfina (TCEP) y combinaciones de más de uno de estos químicos. Agentes oxidantes adecuados incluyen glutationa oxidada, ter-butilhidroperóxido (t-BHP) , timerosal, diamida, 5 , 5 ' -ditio-bis- ( 2-nitro-ácido benzoico) (DTNB) , 4 , 4 ' -ditiodipyridine, borato de sodio, peróxido de hidrógeno, tet ationato de sodio, porpirindina , ortoyodosobenzoato de sodio y combinaciones de más de uno de estos químicos. La biocompatibilidad es un problema de diseño en aplicaciones biomédicas. En tales aplicaciones, la información genómica o proteómica se utiliza como una base para el diseño de polímero para producir, idealmente, polipéptidos "inertes inmunes". El procedimiento será particularmente útil si el objeto fabricado o recubierto hará contacto con la sangre circulante. Debido a que las porciones de secuencia de aminoácido son altamente polares, ocurren típicamente sobre la superficie de la forma plegada nativa de la proteína a partir de la cual se derivan. La "superficie" es aparte de una proteína plegada que está en contacto con el solvente inaccesible al solvente solamente debido a la naturaleza granular del agua. Las porciones de secuencia de aminoácidos identificadas en las proteínas sanguíneas están efectivamente siempre en contacto con célula y moléculas del sistema inmune mientras que la proteína está en la sangre. Por lo tanto, los polipéptidos derivados de la superficie de las proteínas sanguíneas plegadas son menos probables a ser inmunogénicas que las secuencias seleccionadas al azar. Los polipéptidos diseñados serán generalmente biocompat ibles , pero el grado de respuesta inmune o cualquier otro tipo de respuestas biológica puede depender bien de detalles específicos de una porción de secuencia. La bioactividad se puede incorporar en una película, recubrimiento o microcápsula mediante un número de métodos. Por ejemplo, un polipéptido diseñado que comprende la película puede comprender un dominio funcional. Alternativamente, la bioactividad se puede asociar con otra molécula bioactiva encapsulada o recubierta por la película delgada de polipéptido. En una modalidad, la plantilla comprende una molécula bioactiva tal como un cristal de proteína . Un dominio funcional en este contexto es una región independientemente termoestable de una proteína que tiene biofuncionalidad específica (por ejemplo, fosfotirosina de enlace) . En una proteína de múltiple dominio, los dominios funcionales múltiples pueden existir, como por ejemplo en la tensina de proteína, que abarca un dominio de enlace de fosfotirosina y un dominio de tirosina fosfatase de proteína. La inclusión de un dominio funcional en un polipéptido diseñado incorporado en una película multicapa puede proporcionar la película con una funcionalidad deseada, que incluye, por ejemplo, enlace de ligando específico, objetivo vivo, biosensación y biocatálisis . La molécula bioactiva puede ser una proteína, un fragmento funcional de una proteína, un fragmento funcional de una proteína que no es parte de un polipéptido diseñado, un complejo de proteínas, un oligopéptido, un oligonucleótido , un ácido nucleico, un ribosoma, un agente terapéutico activo, un fosfolípido, un polisacárido, un lipopolisacárido, un fragmento de membrana funcional, una estructura de membrana, un virus, un patógeno, una célula, un agregado de células, un organelo, un lípido, un carbohidrato, una sustancia farmacéutica, o un agente antimicrobiano. La molécula bioactiva puede estar en la forma de un cristal bien ordenado o amorfo. La proteína puede ser una enzima o un anticuerpo. El sustrato puede comprender la molécula bioactiva. En una modalidad, el sustrato tiene una molécula bioactiva colocada sobre su superficie previa a la deposición de las capas de polipéptidos opuestamente cargados. En otra modalidad, el sustrato es un cristal que comprende la molécula bioactiva. En una modalidad, las porciones de secuencia de aminoácido son diseñadas de novo. En otras modalidades, las porciones de secuencia de aminoácido se seleccionan de la información genómica o proteómica de un organismo específico, tal como el genoma humano. Por ejemplo, la estructura primaria del complemento C3 (gi 168766) o lactotransferrina (gil 4505043) se puede utilizar para buscar porciones de secuencia de aminoácido en la proteína sanguínea humana.
Un método para identificar una primera porción de secuencia de aminoácido en un polipéptido comprende seleccionar un residuo de aminoácido iniciador en el polipéptido; examinar una secuencia de aminoácido que comprende el residuo de aminoácido iniciador y los siguientes residuos de aminoácido n—1 en el polipéptido para las ocurrencias de cargas positivas y negativas, en donde n es 5 a 15; determinar los 5 a 15 residuos de aminoácidos como una porción de secuencia de aminoácidos y la carga neta de las cadenas laterales de los 5-15 residuos de aminoácido en pH 7 es mayor que o igual a 0.4*_n o descargar la secuencia si la carga neta de las cadenas laterales de los 5-15 residuos de aminoácido en pH 7 es menor que 0.4*r¡. En una modalidad, el proceso para buscar datos de secuencia de proteína para una porción de secuencia de aminoácido negativamente cargada de longitud n que comprende solo aminoácidos que son neutros o negativamente cargados se describe como sigue. Primero, un primer residuo de aminoácido se selecciona en una secuencia de proteína. Segundo, este residuo de aminoácido y los siguientes residuos de aminoácido n-1 se examinan para ocurrencias de arginina (Arg) , histidina (His), o lisina (Lys) (los tres aminoácidos que ocurren naturalmente que pueden ser cargados positivamente en pH neutro), donde n es 5 a 15. Tercero, si uno o más residuos de Arg, His, o Lys se encuentra en estos residuos de aminoácido n el proceso se inicia nuevamente en un segundo residuo de aminoácido. Si, sin embargo, nada de Arg, His, o Lys se encuentra en estos residuos n, los residuos n se examinan para determinar el número de ocurrencias de glutamato (GIu) y/o aspartato (Asp) (los dos aminoácidos negativamente cargados en pH neutro) . Cuarto, si existe por lo menos ocurrencias de 0.4*n de Glu y/o Asp en los residuos n, la secuencia se cataloga como una porción de secuencia de aminoácido negativamente cargada. Si, sin embargo, pocas que ocurrencia de 0.4*n de residuos de aminoácido negativamente cargados se encuentran, la secuencia que inicia con el primer residuo de aminoácido se descarta y el proceso se inicia nuevamente, por ejemplo, en un segundo residuo de aminoácido inmediatamente adyacente al primer residuo de aminoácido después de catalogar una porción, el proceso puede comenzar nuevamente en un segundo residuo de aminoácido. El proceso para identificar una porción de secuencia positivamente cargada es análogo para buscar los datos de secuencia de proteína para una secuencia de aminoácido larga de residuo n que comprende solo residuos de aminoácido que son neutros o positivamente cargados, y por lo cual la magnitud de la carga neta de las cadenas laterales del residuo de aminoácido en pH neutro es mayor que o igual a 0. También es análogo el proceso para identificar una porción de secuencia de aminoácido negativamente cargada o una porción de secuencia de aminoácido positivamente cargada de longitud n, permitiendo ambos residuos de aminoácido positivamente como negativamente cargados en la porción. Por ejemplo, el procedimiento para identificar una porción de secuencia de aminoácido positivamente cargada de longitud n seria para seleccionar un primer residuo de aminoácido en un polipéptido. Enseguida, examinar este residuo de aminoácido y los siguientes residuos de aminoácido n-1 para ocurrencias de residuos que se cargan positivamente o negativamente en pH 7. Determinar la carga neta de las cadenas laterales de residuo de aminoácido n . Si el valor absoluto de la carga neta es menor que 0.4*n, entonces la secuencia se descarta y una nueva búsqueda se inicia en otro aminoácido, mientras que si el valor absoluto de la carga neta es mayor que o igual a 0.4* n, entonces la secuencia es una porción de secuencia es una porción de secuencia de aminoácido. La porción será positiva si la carga neta es mayor que cero y negativa si la carga neta es menor que cero. El diseño de novo de las porciones de secuencia de aminoácido como se define actualmente sigue reglas esencialmente similares, excepto que las secuencias no se limitan a aquellas encontradas en la naturaleza. Una longitud de porción n y una señal deseada y magnitud de . carga neta se seleccionan. Después, los aminoácidos n se seleccionan para la porción de secuencia de aminoácido que da por resultado la señal deseada y la magnitud de carga, de modo que el valor absoluto de la carga neta de los aminoácidos n es mayor que o igual a 0.4*n Una ventaja potencial del diseño de novo de una porción de secuencia de aminoácido es que el profesional puede seleccionar entre todos los aminoácidos (los 20 que ocurren naturalmente y todos los aminoácido no naturales) para lograr la carga neta deseada, antes que se limite a los aminoácidos encontrados en una secuencia de proteina conocida particular. La acumulación más grande de aminoácidos agranda el intervalo potencial de características físicas químicas y/o biológicas que se pueden seleccionar en diseñar las secuencias de la porción comparada a la identificación de una porción de secuencia de aminoácido en una secuencia genómica. Un polipéptido diseñado como es definido actualmente comprenderá una o más' porciones de secuencia de aminoácido. La misma porción se puede repetir, o porciones diferentes se pueden unir al diseñar un polipéptido para el ELBL . En una modalidad, las porciones de secuencia de aminoácido se unen covalentemente con secuencia de no intervención. En otra modalidad, un polipéptido diseñado comprende dos o más porciones de secuencia de aminoácido covalentemente unidas por un enlazador. El enlazador. El enlazador puede ser aminoácido basado, por ejemplo, uno o más residuos de aminoácido tal como lisina o prolina, o puede ser cualquier otro compuesto adecuado para enlazar covalentemente dos porciones de secuencia de aminoácido. En una modalidad, un enlazador comprende 1-4 residuos de aminoácido, por ejemplo, 1-4 residuos de glicina y/o prolina. El enlazador comprende una longitud adecuada o composición de modo que el polipéptido diseñado se mantiene en una magnitud de carga neta por residuo que es mayor que o igual a 0.4. En una modalidad, un polipéptido diseñado es mayor que o igual a 15 residuos de aminoácido de largo. En otras modalidades, un polipéptido diseñado es mayor que 18, 20, 25, 30, 32 o 35 aminoácidos de largo. 1,000 residuos es un enlace superior práctico sobre la longitud del polipéptido. Una vez que las porciones de secuencia de aminoácido han sido seleccionadas o diseñadas de novo, un polipéptido diseñado con enlazadores basados en aminoácidos se sintetiza utilizando métodos bien conocidos en la técnica, tal como síntesis en fase sólida y química F-moc, o expresión heteróloga en bacterias después de la clonación y transformación de genes. Los polipéptidos diseñados se pueden sintetizar mediante una compañía de síntesis de -péptido, por ejemplo, SynPep Corp. (Dublin, California), producidos en laboratorio utilizando un sintetizador de péptido, o producido mediante métodos de DNA recombinante . Cualquier desarrollo de métodos novedosos de síntesis de péptidos podría aumentar la producción de péptidos pero no cambiaría fundamentalmente el diseño del péptido como se describe en la presente . Un método para hacer una película multicapa de polielectrolito comprende depositar una pluralidad de capas de polielectrolitos opuestamente cargados sobre un sustrato. En una modalidad, por lo menos un polielectrolito comprende un polipéptido tal como un homopolipéptido cargado o un polipéptido diseñado. Polielectrolitos sucesivamente depositados tendrán cargas netas opuestas. La Figura 1 es una representación esquemática que ilustra la deposición de ELBL. En una modalidad, la deposición de un polipéptido diseñado (u otro polielectrolito) comprende exponer el sustrato a una solución acuosa que comprende un polipéptido diseñado (u otro polielectrolito) en un pH en el cual tiene una carga neta adecuada para el ELBL. En otras modalidades, la deposición de un polipéptido diseñado u otro polielectrolito sobre el sustrato se logra mediante el rocío secuencial de soluciones de polipéptidos opuestamente cargados. En todavía otras modalidades, la deposición sobre el sustrato es mediante el rocío simultáneo de soluciones de polielectrolitos opuestamente cargados. En el método de ELBL para formar una película multicapa, las cargas opuestas de las capas adyacentes proporcionan la fuerza conductora para el ensamble. No es crítico que los polielectrolitos en las capas opuestas tengan la misma densidad de carga lineal neta, solo que las capas opuestas tengan cargas opuestas. Un procedimiento de ensamble de película estándar para la deposición incluye formar soluciones acuosas de los polielectrolitos en un pH en el cual se ionizan (es decir, pH de 4-10), proporcionando un sustrato que lleva a una carga de superficie, y alternar la inmersión del sustrato en las soluciones de polielectrolito cargados. El sustrato se lava opcionalmente entre las deposiciones de capas alternantes. La concentración de polielectrolito adecuado para la deposición de polielectrolito puede ser determinado fácilmente por uno de habilidad ordinaria en la técnica. Una concentración ejemplar es 0.1 a 10 mg/mL. Típicamente, el espesor de la capa producida es sus tancialmente independiente de la concentración de solución de polielectrolito durante la deposición en el intervalo establecido. Para los polielectrolitos no de polipéptido típicos tales como poli (ácido acrílico) y poli ( clorhidrato de alilamina), los espesores de la capa son de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 Á, dependiendo de la resistencia iónica de la solución. Polielectrolitos cortos forman frecuentemente capas más delgadas que los polielectrolitos largos. Con respecto al espesor de la película, los espesores de película de polielectrolito dependen sobe la humedad así como el número de capas y composición de Ja película. Por ejemplo, las películas de PLL/PLGA de 50 nra de grueso se encogen a 1.6 nm en el secado con nitrógeno. En general, las películas de 1 nm a 100 nm o más en espesor se pueden formar dependiendo sobre el estado de hidratación de la película y el peso molecular de los polielectrolitos empleados en el ensamble. Además, el número de capas requerido para formar una película de multicapa de polielectrolito estable dependerá de los polielectrolitos en la película. Para las películas que comprenden solo capas de polipéptido de peso molecular bajo, una película tendrá típicamente 4 o más bicapas de polipéptidos supuestamente cargados. Para las películas que comprenden polielectrolitos de peso molecular alto tal como poli (ácido acrílico) y poli (clorhidrato de alilamina) , las películas que comprenden una sola bicapa de polielectrolito opuestamente cargado pueden ser estables. Como se divulga en la presente, uno o más polielectrolitos se depositan sobre el sustrato en la presencia de un precipitante poiimérico, típicamente en solución acuosa en pH de 4 a 10. El uso de un precipitante poiimérico, por ejemplo, minimiza ventajosamente la pérdida de moléculas bioactivas contenidas dentro de la película multicapa . Para un conjunto dado de condiciones de deposición, la cantidad de un precipitante poiimérico de un peso molecular particular se puede seleccionar para minimizar la pérdida de moléculas bioactivas adsorbidas a una plantilla sin marcar la viscosidad de la solución de deposición inadecuada para el proceso de deposición particular. En general, una concentración adecuada de precipitante polimérico dependerá de la estructura molecular del precipitante y su peso molecular. En general, mientras má s alta es la concentración de precipitante polimérico, má s alta es la insolubilidad de la macromolécula . Valores prácticos representativos de concentración de precipitante polimérico se pueden dar como sigue: para PEG de peso molecular de 3500 a 4000 Da o PPG de peso molecular de 425 Da o PVA de peso molecular 5000 Da o PEI de peso molecular de 40 a 60 kDa, 5-15% en peso. PEG de 300 Da es considerablemente más soluble que PEG de 3500-4000 Da; el primero puede ser soluble en solución acuosa hasta aproximadamente 50% en peso. La concentración útil máxima de un precipitante particular disminuirá en la relación a un incremento en la concentración de un coprecipitante ; por ejemplo, una concentración útil de PEG 300 será más baja si el PVA está presente. Si el precipitante polimérico y la solución de péptido son muy viscosos, no será posible controlar que también se rocía. Con respecto a los métodos de LBL , la viscosidad puede afectar la velocidad de difusión de los polielectrolitos en las soluciones de deposición, disminuyendo el proceso de ensamble de película. El balance bajo cualquier conjunta particular de condiciones de deposición entre el efecto sobre la retención de la molécula bioactiva adsorbida y sobre la viscosidad de las soluciones de deposición se puede pesar para determinar la concentración y peso molecular de otros polímeros útiles como un precipitante polimérico. Para el ejemplo de PEG como un precipitante polimérico, las concentraciones de solución de hasta aproximadamente 50% (v/v) de PEG 300 se pueden utilizar por todo el intervalo de temperatura donde la solución permanecen en el estado líquido, nominalmente de manera aproximadamente 0 a aproximadamente 100°C para agua pura a aproximadamente 1 atm de presión. Un intervalo de temperatura de alguna manera más amplio se puede emplear cuando el precipitante está presente en solución y la actividad funcional de la molécula bioactiva no se inactiva irreversiblemente. La concentración de un peso molecular particular de PEG que puede ser efectivo en estos métodos en un conjunto dado de condiciones de deposición se determina por lo menos en parte mediante el mantenimiento de una viscosidad de solución apropiada. En una modalidad, la película multicapa o microcápsula comprende una molécula bioactiva. En una modalidad, la molécula bioactiva se co-deposita con una o más capas de polielectrolito . En otra modalidad, el sustrato comprende la molécula bioactiva. Por ejemplo, el sustrato puede ser una plantilla que comprende moléculas bioactivas líquidas o cristalinas, tal como fármacos ó proteínas. En otra modalidad, el sustrato se recubre con la molécula bioactiva. Por ejemplo, un núcleo inerte tal como una partícula de CaCÜ3 se puede recubrir con la molécula bioactiva previo a la deposición de las capas de polielectrolito . La partícula de CaCo3 se puede remover después de la deposición por el electrolito para formar una microcápsula hueca que comprende la molécula bioactiva. En una modalidad, el precipitante polimérico tiene un efecto favorable sobre la deposición del polielectrolito en hacer la película, así como disminuir la solubilidad de una molécula bioactiva adsorbida, para de esta manera incrementar la cantidad de material encapsulado. Un ensayo adecuado para medir la pérdida de las moléculas bioactivas de la plantilla se puede utilizar en hacer una determinación empírica de la ¦ concentración apropiada de un precipitante polimérico dado. Por ejemplo, la molécula bioactiva se puede marcar con un grupo fluorescente tal como fluoresceína o CY3, un compuesto de cianina fluorescente (Amersham BioSciences ) , o con un grupo con un espectro de adsorbencia de característica tal como tirosina. Los ensayos para determinar la fluorescencia o absorción retenida con la plantilla se pueden formar para evaluar la retención de la molécula bioactiva en la presencia o ausencia de una concentración particular de un precipitante polimérico dado.
La invención demás incluye la película hecha mediante este método. Es posible que algún precipitante poliméricos llegue a ser incorporado en el proceso de fabricación de la película. En algunos casos, tal incorporación podría ser deseable o útil. En otro aspecto, se proporcionan métodos para mejorar la retención de la molécula bioactiva durante la fabricación de una película multicapa de polielectrolitos . En algunas modalidades, el método comprende depositar una pluralidad de capas de polielectrolito supuestamente cargados sobre un sustrato que comprende una molécula bioactiva, en donde la deposición de uno o más de los polielectrolitos opuestamente cargados se realiza en la presencia de un precipitante polimérico. En una modalidad, uno o más de los polielectrolitos comprende un polipéptido. En otras modalidades, el método comprende adsorber una molécula bioactiva sobre un sustrato; y depositar una pluralidad de capas de polielectrolitos opuestamente cargados sobre el sustrato recubierto con molécula bioactiva. La deposición de uno o más polielectrolitos opuestamente cargados y/o o la adsorción de la molécula bioactiva se realiza en la presencia de un precipitante polimérico. La cantidad de la molécula bioactiva retenida durante la deposición de una capa de un polielectrolito en la presencia de un precipitante polimérico relativo a la cantidad retenida en la ausencia del precipitante polimérico se mejora mediante por lo menos 15%, por lo menos 30%, por lo menos 50%, por lo menos 67%, por lo menos 100%, o por lo menos 200%. En algunas modalidades, la deposición de los polielectrolitos opuestamente cargados es mediante la deposición de LBL de solución acuosa. En otras modalidades, la deposición de los polielectrolitos opuestamente cargados sobre el sustrato es mediante el rocío simultáneo de soluciones de los polielectrolitos opuestamente cargados. En algunas modalidades, un polielectroli o opuestamente cargado depositado sobre la plantilla comprende una porción de secuencia de aminoácido en donde la porción de secuencia de aminoácido comprende aminoácidos n y el resto de cargas de la misma carga en la porción de aminoácido en mayor que o igual a 0.4*n. En otras modalidades, por lo menos uno de los polipéptidos opuestamente cargados comprende PLL o PLGA. La molécula bioactiva es, por ejemplo, una proteína, un oligopéptido, un ácido nucleico, un oligonucleótido , un lipido, un carbohidrato, una sustancia farmacéutica, un agente antimicrobiano, una estructura de membrana, una célula, un virus, un tejido o una combinación de los mismos. La proteína puede ser una enzima. En algunas modalidades, la enzima es glucosa oxidasa. En algunas modalidades, la molécula bioactiva se deposita sobre una plantilla. Las plantillas adecuadas incluyen un sustrato orgánico y/o un sustrato inorgánico. La plantilla puede comprender un material que se puede disolver o desintegrar al cargar una propiedad química o física del sustrato o la solución que o contiene la plantilla. Por ejemplo, en algunas modalidades, la plantilla comprende una micropartícula de CaCC>3, que se puede disolver al mezclar con EDTA. En otras modalidades, la plantilla es una molécula bioactiva cristalina tal como una proteína o un fármaco. Este aspecto de la invención además proporciona una película de polipéptido que retiene una molécula bioactiva hecha mediante estos métodos. La invención se ilustra adiciona Imente mediante los siguientes ejemplos no limitativos. Ejemplo 1. Adsorción de glucosa oxidasa (GOx) sobre partículas de CaC03 y MF. La proteína modelo fue GOx, seleccionada por sus propiedades enzimáticas útiles. Para los experimentos de adsorción de GOx, 5 mg de partículas de CaC03 (PlasmChem GmbH, Alemania) o partículas de elamina formaldehído (MF) se mezclaron con 100 µ?, de 37,300 unidades/g de Gox de tipo II-S de (SIGMA, USA) en solución reguladora de Tris 10 mM, pH 7.4. La adsorción de GOx se puede realizar en una temperatura donde la solución de GOx permanece en estado líquido, nominalmente de manera aproximada 0 a aproximadamente 100°C para agua pura en aproximadamente 1 atm de presión, y la actividad enzimática de GOx no se inactiva irreversiblemente. La concentración de partícula final fue 5% (w/v) . La adsorción de enzima sobre las micropartículas se cuantificó mediante la disminución en la absorbencia de la fase líquida a 280 nm utilizando un espectrofotómetro V-430 Jasco (Japón) . Micropartículas cargadas con GOx se separaron de la solución de adsorción de polipéptido mediante centrifugación. La adsorción a las partículas como adsorción de la concentración de GOx y la concentración de sal en la solución de alimentación se muestra en la Figura 2. La cantidad máxima de GOx cargada sobre las partículas de CaC03 fue de aproximadamente 76 de partículas, o aproximadamente 9.4
~12 x 10 gramos de enzima por partícula, asumiendo un volumen de partícula de 4.6 x 1011 era3. La Figura 2 muestra que la adsorción máxima a cualquier plantilla se logró en la ausencia de sal monovalente adicionada bajo estas condiciones de deposición. Ejemplo 2. Encapsulación de una enzima en microcápsulas de polipéptido. La poli (L-lisina ) ( PLL ) (MW aproximadamente 14.6 kDa) y poli (L-ácido glutámico) (PLGA) (MW aproximadamente 13.6 kDa) se seleccionaron como el polipéptido opuestamente cargado para la deposición de capas en este estudio piloto de encapsulación debido a que son fácilmente disponibles de una fuente comercial. La encapsulación que involucra polipéptidos diseñado en lugar de PLL y/o PLGA seria análogo. Un ejemplo de un par de péptidos opues amente cargados que han utilizado para este propósito se da en Li y Haynie (2004) Biomacromolecules 5:1667-1670. GOx se adsorbió a micropartículas de CaC03 al adicionar 0.10 mL de 5 mg/mL de solución de GOx a 5 mg de micropartículas de CaCC>3, mezclando completamente durante 2 horas, y centrifugando durante 5 minutos a 1000 x g para la remoción de la fase de fluido. La deposición de cada multicapa de polipéptido de micropartículas de CaC03 adsorbidas con GOx involucraron el autoensamble durante 10 minutos bajo agitación leve a 4°C, seguido por la centrifugación para separar las partículas del péptido no enlazado en la fase de fluido. Un volumen de 0.1 mL de ya sea una solución de 1 mg/mL de PLL (MW aproximadamente 14.6 kDa) o de PLGA (MW aproximadamente 13.6 kDa) en Tris 10 mM, NaCl 0.5 M, pH 7.4 se adicionó a las microcápsulas a 4°C y se mezcló completamente. Las capas alternantes de PLL y PLGA se depositaron sobre las micropartículas. Hasta 50% (v/v) de PEG 300 (Fluka) estuvo presente en las soluciones de polipéptido; la masa molecular promedio más alta de PEG tendió a dar una solución demasiado viscosa para el propósito. Después de la separación de la fase de fluido de las partículas después de cada etapa de adsorción del polipéptido, los sobrenadantes de la solución de ensamble se analizaron para adsorbencia aromática. El PLL y PLGA contienen residuos no aromáticos y por lo tanto no adsorben a 280 nm; GOx no absorbe en esta longitud de onda. Dos etapas de lavado intermediarias se llevaron a cabo con agua desionizada a 4°C entre los ciclos de ensamble del polipéptido. Este proceso se repitió hasta que el número deseado de capas se depositó (típicamente 6 bicapas) . Después del ensamble de la capa final del polipéptido, las partículas recubiertas se enjuagaron y se recolectaron por centrifugación. Los núcleos de partículas luego se disolvieron mediante tratamiento con EDTA 0.2 M, pH 7.4. El proceso de disolución tomó 10-20 minutos. Las microcápsulas se recolectaron mediante centrifugación a 2000 x g durante 5 minutos, se enjuagaron con agua desionizada, y se resuspendieron en 0.25 mL de solución reguladora Tris 10 mM. Las alícuotas de la muestra se analizaron para la actividad de enzima como se describe enseguida. La concentración de la muestra utilizada para experimentos adicionales se estimó que sea 1.5 x 10 cápsula s /mL . El mismo procedimiento se siguió para los experimentos de fluorescencia confocales mostrados en la Figura 7, excepto que el GOx marcado con Cy3 reemplazó el GOx. La Figura 3- muestra la pérdida de GOx adsorbido de plantillas de CaC03 durante la deposición de una película de PLL/PLGA de encapsulación como absorbencia a 280 nm debido al GOx liberado presente en el lavado, solución reguladora de ensamble de PLL, y solución reguladora de ensamble de PLGA para el ensamble en la solución reguladora en la ausencia de un precipitante polimérico, ensamble en la solución reguladora en la presencia de 40% de PEG 300, y para el ensamble en la solución reguladora en la presencia de 50% de PEG 300. La magnitud de la absorbencia a 280 nra liberado durante la deposición de la primera capa de PLGA en la presencia de 40% o 50% de PEG 300 es significantemente menor que aquella observada en la ausencia de PEG 300. El incremento de la concentración de PEG 300 de 10% hasta 50% en las soluciones reguladoras de deposición se encontró que disminuye la desabsorción del GOx de la plantilla durante el ensamble de la película . Concentraciones de PEG 8000 comparables a aquellas investigadas para PEG 300 produjeron viscosidades de solución en las cuales el autoensamble de las capas de polipéptido no fue efectivas de tiempo. Los pesos moleculares de PEG que son líquidos a temperatura ambiente, como es PEG 300, son adecuados para el uso a 4°C como el precipitante polimérico. La Figura 4 muestra la retención de GOx sobre las plantillas de CaC03 durante la deposición de la película de PLL/PLGA de encapsulación . Los primeros puntos representan "la carga" de GOx inicial sobre las plantillas. Puntos sucesivos muestran el GOx restante sobre las plantillas en el ensamble de péptidos subsecuente y las etapas de enjuague de partícula. Solo dos ciclos de deposición se muestran. Al principio, los datos complementarios que muestran la liberación de GOx de las partículas de la plantilla cargadas con GOx como es medido en el sobrenadante de las soluciones de lavado y ensamble. Un ensayo acoplado con enzima colorimétrica que involucra Amplex Red como sustrato se utilizó para cuantificar la actividad de GOx. La Figura 5 muestra un esquema de reacción para el ensayo. La glucosa y el oxígeno se difunden dentro de la cápsula para el uso por el GOx para producir ácido glucorónico y H202. El H202 se difunde de la cápsula y se detecta, indirectamente, por el Amplex Red. Inicialmente incoloro, este agente se oxida por H202 en la presencia de rábano picante de peroxidasa (HRP) (250-330 unidades/mg sólido), formando resorufina, que se puede detectar mediante la absorbencia a ?= 563 nra . Las siguientes soluciones de extracto se prepararon: reactivo Amplex Red 10 mM (Molecular Probes, USA) en DMSO, 10 U/mL de HRP en solución reguladora de fosfato 50 mM y NaCl 0.15 M (PBS), glucosa 400 mM en PBS 50 mM, y 100 U/mL de GOx en PBS 50 mM . Una solución de trabajo se preparó al mezclar tres soluciones: 30 µ?, de Amplex Red, 75 µ?. de HRP, y 450 µ?, de glucosa. Las soluciones estándares de GOx, cada una 500 y que contienen 0 a 10 mU/mL, se prepararon al diluir los 100 U/mL de solución de extracto de GOx . Las muestras de cápsula y las muestras de control sin GOx cada una se diluyó a 500 µ?> con solución reguladora de PBS 50 mM . Una reacción se inició al adicionar 40 µ?, de solución de trabajo de Amplex Red/HRP/glucosa a tubos que representan estándares, controles, y muestras de cápsula. Las mezclas de reacción se incubaron durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave. La absorbencia de resorufina se midió a 563 nm. La actividad enzimática medida se convirtió a cantidad de GOx activo al calibrar la medición de la actividad relativa a aquella de una cantidad conocida de GOx. La Figura 6 muestra la cantidad de GOx encapsulado activo como una función de número de capas de polipéptido determinada utilizando el ensayo enzimático. La cantidad de material retenido en la cápsula después de la disolución de la plantilla se muestra, con y sin adición de PEG en las soluciones de ensamble de polipéptido. Las cápsulas de pocas que 6 capas fueron inestables en solución. Como se muestra en la Figura 6, cuando el ensamble de polipéptido se llevó a cabo en la ausencia de PEG, la actividad de GOx asociada con las microparticulas disminuyó marcadamente sobre la deposición de PLL/PLGA hasta 2 bicapas. La actividad medida tendió a alcanzar un valor constante (por ejemplo, aproximadamente 11% del valor previo a la deposición del polipéptido) independiente del número de capas en el intervalo de 3-6 bicapas. La adición de PEG a PLL y las soluciones de ensamble de PLGA sustancialmente mejoraron la "carga" de la "células artificiales" basada en polipéptido con GOx . Aproximadamente 70% de la actividad de enzima se retuvo en las células después de la deposición de 6 bicapas pero previo a la separación de fase. La sonicación por 20 min de las células de 6 bicapas ensambladas utilizando PEG dio por resultado ninguna disminución en la actividad de la enzima. Esto sugiere que la encapsulación de GOx por una película multicapa de polipéptido inhibió la actividad de enzima tan poco previno la difusión de moléculas pequeñas. Por ejemplo glucosa (sustrato de enzima) y productos de reacción) a través de la barrera. El grado de migración de GOx en la pared celular artificial no se determinó. La confirmación de que la actividad de enzima medida estuvo de hecho asociada con las células artificiales se obtuvo como sigue. La actividad de GOx en solución se cuantificó después de la separación de las células de 6 bicapas de la fase de fluido utilizando un filtro de 0.22 µt?. ninguna actividad de GOx se detectó en el filtrado en la ausencia del PEG; la actividad de enzima estuvo en las células artificiales. Algunas enzimas (aproximadamente 1.5 x 10"12 g/cápsulas) se detectó en el filtrado cuando el protocolo de PEG se utilizó. Presumiblemente esto fue debido al colapso parcial de las plantillas/células recubiertas durante centrifugación repetida y lavado. Ninguna actividad adicional se detectó en el filtrado después de la resuspensión de las células, indicando que el GOx cargado no se lixivió. El mismo procedimiento se utilizó para cuantificar la retención de GOx en las células. El GOx se marcó con un tinte fluorescente, NHS-éster monoreactivo de Cy3 (Amersham Biosciences, UK) para visualizar las microcápsulas cargadas con GOx. La encapsulación de Cy3-GOx dentro de una película de PLL/PLGA después de la adsorción sobre micropa rtícula de CaCÜ3. El estudio de la influencia del número de capas sobre la estabilidad celular artificial por la microscopía de fluorescencia reveló que los recubrimientos con pocos que 3 bicapas tendieron a disasociarse después de la disolución de la partícula del núcleo, mientras que las cápsulas con 3 o más bicapas usualmente fueron estables en solución acuosa sobre una escala de tiempo de semanas. Esto es consistente con las mediciones de actividad de GOx reportadas en la presente. El espesor de la película se relaciona directamente al número de capas. La evidencia adicional de la carga del GOx marcado con Cy3 en las microcápsulas de 6 bicapas PLL/PLGA se obtuvo mediante la microscopía de fluorescencia de láser confocal (Figura 7a, panel izquierdo) . El panel derecho, obtenido mediante la iluminación de campo brillante, muestra que las plantillas de micropartículas se disolvieron completamente mediante tratamiento con EDTA. Los perfiles de sección transversal de densidades de fluorescencia de una cápsula de 6 bicapas reveló que interior de la microcápsula se llenó con una cantidad sustancial de GOx marcado con Cy3 no enlazado (Figura 7b, izquierda). El diámetro de la célula fue aproximadamente aquel de la plantilla original (Figura 7b, derecha) . La apariencia de dos picos en el perfil de intensidad indica que algún GOx se enlazó a las "membranas" de la célula, probablemente debido a la atracción y disipación electrostática. Evidencia adicional de la encapsulacion de GOx en las células de polipéptido se obtuvo mediante la espectroscopia de dicroismo circular (datos no mostrados ) . Ejemplo 3. Encapsulacion de una enzima en una microcápsula de polielectrolito . En otro ejemplo, la hemoglobina de proteina se carga sobre partículas de carbonato de calcio en solución salina regulada con fosfato (pH 7.4) y se encapsula con polielectrolitos no de péptido. La eficiencia de carga de proteína se incrementa por la adición de un precipitante polimérico a la solución de proteína, por ejemplo, 40% de PEG 300. La proteína absorbida se encapsula por el LBL con dos polielectrolitos opuestamente cargados. Los polímeros adecuados para el propósito son poli ( sul fonato de estireno) , un polianión y poli ( alilamina ) , un policatión. La prueba de la carga de proteina se puede obtener mediante la espectrofotometria en el intervalo visible: Hemoglobina tiene una banda de absorción grande cerca de 410 nm, debido a la presencia de hemo. Esta invención presenta un medio de retención de alta eficiencia en películas y microcápsulas de polielectroli o nanodiseñadas mediante la inclusión de un precipitante polimérico en las soluciones reguladoras de ensamble. La película multicapa de polielectrolito fue semipermeable, previniendo la fuga del modelo biológico sin impedir la permeabilidad de las moléculas pequeñas. La biocompatibilidad inherente de los polipéptidos de encapsulación presenta ventajas para las aplicaciones biomédicas sobre los polielectrolitos sintéticos no biodegradables más comúnmente utilizados en la formación de películas delgadas por el LBL. El uso de los términos "un" y "uno" y "el" y referentes similares (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) van a ser considerados para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que de otra manera se indique en la presente o claramente se contradiga por el contexto. Los términos primero, segundo, etc. como se utilizan en la presente no se proponen denotar cualquier orden particular, sino simplemente para conveniencia de denotar una pluralidad de, por ejemplo, capas. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye", y "que contiene" van a ser considerados como términos indefinidos (es decir, dando a entender "que incluye, pero no se limita a") a menos que de otra manera se note. La recitación de intervalos de valores son meramente propuestos para servir como un método de abreviatura para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del intervalo, a menos que de otra manera se indique en la presente, y cada valor separado se incorpora en especificación como si se recitaron individualmente en la presente. Los puntos finales de todos los intervalos incluyen dentro del intervalo e independientemente combinables. Todos los métodos descritos en la presente se pueden realizar en un orden adecuado a menos que de otra manera se indique en la presente o de otra manera se contradiga claramente por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como", se propone meramente para ilustrar mejor la invención y no posee una limitación sobre el alcance de la invención a menos que de otra manera se reclame. Ningún lenguaje en la especificación debe ser considerado como que indica cualquier elemento no reclamado como esencial a la práctica de la invención como se utiliza en la presente. Mientras que la invención ha sido descrita con referencia a una modalidad ejemplar, será entendido por aquellos de habilidad en la técnica que varios cambios se pueden hacer y equivalentes se pueden sustituir por elementos de los mismos sin apartarse del alcance de la invención. Además, muchas modificaciones se pueden hacer para adaptar una situación o material particular a las enseñanzas- de la invención sin apartarse del alcance esencial de la misma. Por lo tanto, se propone que la invención no se limita a la modalidad particular divulgada como el mejor modo contemplado para llevar a cabo esta invención, sino que la invención incluirá todas las modalidades que caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Cualquier combinación de los elementos descritos en lo anterior y en todas las variaciones posibles de la misma se incluyen por la invención a menos que de otra manera se indique en la presente o de otra manera se contradiga claramente por el contexto.