MX2008005239A - Microcapsulas, recubrimientos y peliculas multicapa que comprenden polipeptidos - Google Patents

Abstract

Se describen aquípelículas multicapa que comprenden dos o más capas de polielectrolitos, donde las capas adyacentes comprenden polielectrolitos con carga opuesta. Un polielectrolito de la primera capa comprende un polipéptido compuesto que comprende una o más regiones de adsorción de superficie enlazadas covalentemente a una o más regiones funcionales que forman una sola cadena polipeptídica. Las regiones de adsorción de superficie comprenden uno o más motivos desecuencia aminoacídica que comprenden 5 a 15 residuos de aminoácidos. Una o más regiones funcionales comprenden de 3 hasta 250 residuos aminoacídicos.

Description

MICROCÁPSULAS , RECUBRIMIENTOS Y PELÍCULAS MULTICAPA QUE COMPRENDEN POLIPÉPTIDOS REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud es una Continuación en Parte de la solicitud de EE.UU. No Provisional No. de Serie 10/652,364 presentada el 29 de agosto de 2003 y también reivindica el beneficio del documento 60/729,828 presentado el 25 de octubre de 2005, que se incorporan aquí por referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la fabricación de películas multicapa ultradelgadas sobre superficies adecuadas mediante un autoensamblaj e electrostático capa a capa ("ELBL", por sus siglas en inglés) . Con mayor especificidad, la presente invención se relaciona con un método para diseñar polipéptidos para la nanofabricación de microcápsulas , recubrimientos y películas delgadas mediante ELBL para aplicaciones en biomedicina y otros campos.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA ELBL es una técnica establecida en donde se ensamblan películas ultradelgadas mediante la alternación de la adsorción de polielectrolitos de carga opuesta. El proceso está basado en la inversión de la carga superficial de la película luego de la deposición de cada capa. La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del proceso general ELBL: se ensamblan películas de poliiones (poliiones 10 catiónicos y poliiones 11 aniónicos) en capas sucesivas sobre una superficie 12 plana con carga negativa; la carga de superficie se invierte luego de la deposición de cada capa. Este proceso se repite hasta que se forma una película del grosor deseado. El fundamento físico de la asociación es la electrostática—las fuerzas nucleares y gravitacionales no tienen ninguna función efectiva—y el aumento en la entropía al liberarse los contraiones en la solución. Debido a la generalidad y relativa simplicidad del proceso, ELBL permite la deposición de varios tipos distintos de materiales sobre varios tipos distintos de superficies. Por lo tanto, existe una amplia cantidad de posibles combinaciones útiles de materiales y superficies. Para un tratado general sobre ELBL, incluyendo su historia, ver Yuri Lvov, "Electrostatic Layer-by-Layer Assembly of Proteins and Polyions" en Proteín Architecture : Interfacial Molecular Assembly and Immóbilization Biotechnology, Y. Lvov & H. Móhwald eds . (New York: Marcel Dekker, 1999), pp. 125-167, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. ELBL se ha convertido recientemente en el área de interés en el campo de la nanotecnología debido a que se puede utilizar para fabricar películas con un grosor sustancialmente menor a una miera. Más aún, ELBL permite un control excepcional sobre el proceso de fabricación de la película, permitiendo el uso de materiales a nanoescala y permitiendo modificaciones estructurales a nanoescala. Debido a que cada capa tiene un grosor en el orden de magnitud de unos cuantos nanómetros o menos, dependiendo del tipo de material utilizado y el proceso de adsorción específico, se pueden formar ensambles multicapa de un grosor repetible con precisión. Se han empleado una variedad de polielectrolitos sintéticos en aplicaciones ELBL, incluyendo poli ( sulfonato de estireno) sódico ("PSS", por sus siglas en inglés), poli ( clorhidrato de alilamina) ("PAH", por sus siglas en inglés), poli (cloruro de dialildimetilamonio) ("PDDA", por sus siglas en inglés), poli (cloruro de acrilamida-co-dialildimetilamonio) , poli (etilenimina) ("PEI", por sus siglas en inglés), poli (ácido acrílico) ("PAA", por sus siglas en inglés), poli (ácido anetolsulfónico) , poli (sulfato vinílico) ("PVS", por sus siglas en inglés) y poli (ácido vinilsulfónico) . Sin embargo, estos materiales no son generalmente útiles para aplicaciones biomédicas debido a que son antigénicos o tóxicos. Las proteínas, siendo polímeros con cadenas laterales que tienen grupos ionizables, se pueden utilizar en ELBL para diversas aplicaciones, incluyendo las biomédicas. Los ejemplos de proteínas que se han utilizado en ELBL incluyen citocromo c, lisozima de clara de huevo de gallina, inmunoglobulina G, mioglobina, hemoglobina y albúmina sérica {ibid.). Sin embargo, existen dificultades con el uso de proteínas para este propósito. Éstas incluyen un control limitado sobre la estructura multicapa (debido a que la superficie de la proteína es altamente irregular y las proteínas comúnmente no se adsorben en una superficie en un patrón regular) , restricciones en el pH debido a la dependencia del pH de la estabilidad estructural y solubilidad proteica, falta de biocompatibilidad cuando se utilizan proteínas exógenas y el costo de comercializar la producción si el gen no ha sido clonado; a menos que la proteína sea idéntica en una fuente fácilmente disponible, por ejemplo, una vaca, la proteína tendría que obtenerse a partir del organismo en el cual se pretendía utilizar, haciendo excesivo el costo de la producción de proteína a gran escala. A diferencia, los polipéptidos , que en términos generales son más pequeños y menos complejos que las proteínas, constituyen una excelente clase de material para el ensamblaje ELBL, las estructuras de película polipeptídica formadas mediante ELBL son útiles en una amplia gama de aplicaciones. La presente invención proporciona un método para diseñar polipéptidos para la nanofabricación de microcápsulas , recubrimientos y películas delgadas mediante ELBL. Los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención deben mostrar varias propiedades útiles, incluyendo, entre otras, una estructura primaria completamente determinada, una estructura secundaria mínima en solución acuosa, monodispersidad, una carga neta completamente controlada por unidad de longitud, habilidad para reticularse en demanda, habilidad para revertir la formación del entrecruzamiento, habilidad para formar más películas delgadas organizadas de lo que es posible con el uso de proteínas y un costo de producción a gran escala relativamente económico (asumiendo el diseño del gen, su síntesis, clonación y expresión en hospedero en E. coli o levadura, o síntesis peptídica) . Los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención son útiles para ELBL de estructuras de película delgada con aplicaciones posibles o como objetivo en tecnología biomédica, tecnología de alimentos y tecnología ambiental. Por ejemplo, estos polipéptidos pueden utilizarse para fabricar eritrocitos artificiales, dispositivos para administración de fármacos y películas antimicrobianas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se describe aquí una película multicapa que comprende dos o más capas de polielectrolitos , en donde las capas adyacentes comprenden polielectrolitos de carga opuesta. Un polielectrolito de una primera capa comprende un polipéptido compuesto que comprende una o más regiones de adsorción de superficie que se enlazan covalentemente a una o más regiones funcionales que forman una sola cadena polipeptídica, donde el polipéptido compuesto y una o más regiones de adsorción de superficie tienen la misma polaridad. Las regiones de adsorción de superficie comprenden uno o más motivos (pequeño elemento estructural reconocible en varias proteínas) de secuencia aminoacídica, uno o más motivos de la secuencia aminoacídica comprenden de 5 a 15 residuos aminoacídicos y tienen una magnitud de carga neta por residuo que es mayor o igual a 0.4. Una o más regiones funcionales comprenden de 3 hasta aproximadamente 250 residuos aminoacídicos. El polipéptido compuesto no es un homopolímero, tiene al menos 15 aminoácidos de longitud y tiene una solubilidad acuosa en pH 4 a 10 mayor a 50 µg/ml . Además, una segunda capa comprende un polielectrolito de segunda capa que comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular mayor a 1, 000 y al menos 5 cargas por molécula, y una carga opuesta a la del polipéptido de la primera capa. Un método para elaborar una película multicapa, la película comprende una primera capa y una segunda capa, donde las capas adyacentes comprenden polielectrolitos de carga opuesta, el método comprende unir covalentemente una o más regiones de adsorción de superficie y una o más regiones funcionales para formar un polipéptido compuesto, donde el polipéptido compuesto y una o más regiones de adsorción de superficie tienen la misma polaridad, y depositar el polipéptido compuesto sobre un sustrato o la segunda capa para formar una primera capa. Cuando el hecho de depositar comprende depositar el polipéptido compuesto sobre un sustrato, el método además comprende depositar el polielectrolito de la segunda capa sobre la primera capa . La presente invención también proporciona un método novedoso para identificar "motivos de secuencia" de una carga neta y longitud definida a un pH neutro en información de secuencia aminoacidica para utilizarse en ELBL y registrar la cantidad deseada de motivos. El método comprende los pasos de: (a) Obtener una secuencia de aminoácidos para un péptido o proteina de un organismo particular; (b) Ubicar un aminoácido iniciador en la secuencia aminoacidica; (c) Examinar el aminoácido iniciador y los siguientes n aminoácidos para determinar la cantidad de aminoácidos cargados que tengan una polaridad opuesta a cierta polaridad; (d) Si la cantidad de aminoácidos cargados con una polaridad opuesta a cierta polaridad es uno o más, continuar el método en el paso g; (e) Examinar el aminoácido iniciador y los siguientes n aminoácidos para determinar la cantidad de aminoácidos cargados que tengan cierta polaridad; (f) Si la cantidad de aminoácidos cargados que tienen cierta polaridad es igual o mayor a x, registrar el motivo de secuencia aminoacidica que comprende el aminoácido iniciador y los siguientes n aminoácidos; (g) Ubicar otro aminoácido iniciador en la secuencia aminoacidica; y (h) Repetir el método comenzado en el paso c hasta que se haya identificado la cantidad deseada de motivos de secuencia aminoacidica o todos los aminoácidos en la secuencia aminoacidica hayan sido utilizados como el aminoácido iniciador en el paso c; donde x es mayor o igual que aproximadamente la mitad de n. La presente invención también proporciona un método novedoso para diseñar un polipéptido para utilizarse en ELBL, que comprende los pasos de: (a) Identificar y registrar uno o más motivos de secuencia aminoacidica que tengan una carga neta de cierta polaridad utilizando los pasos mencionados en el párrafo precedente y (b) Juntar una pluralidad de motivos de secuencia aminoacidica registrados para formar un polipéptido. La presente invención también proporciona un método novedoso para diseñar un polipéptido para utilizarse en ELBL que comprende los siguientes pasos: (a) Diseñar de nuevo una pluralidad de motivos de secuencia aminoacidica, donde los motivos de secuencia aminoacidica comprenden n aminoácidos, al menos x de éstos tienen carga positiva y ninguno tiene carga negativa, o al menos x tienen carga negativa y ninguno tiene carga positiva, donde x es mayor o igual que aproximadamente la mitad de n; y (b) Unir la pluralidad de motivos de secuencia aminoacidica. Los motivos de secuencia aminoacidica pueden comprender los 20 aminoácidos usuales o aminoácidos no naturales y los aminoácidos pueden ser aminoácidos levógiros (L-aminoácidos) o dextrógiros ( D-aminoácidos ) . La presente invención también proporciona una película delgada, la película comprende una pluralidad de capas de polipéptidos, las capas de polipéptidos tienen cargas alternantes, donde los polipéptidos comprenden al menos un motivo de secuencia aminoacídica que comprende n aminoácidos, al menos x tienen carga positiva y ninguno tiene carga negativa, o al menos x tienen carga negativa y ninguno tiene carga positiva, donde x es mayor o igual que aproximadamente la mitad de n. Los motivos en estos polipéptidos se pueden seleccionar utilizando cualquiera de los métodos descritos con anterioridad. La presente invención también proporciona un proceso novedoso para utilizar cisteína y otros tipos de aminoácidos que contienen sulfhidrilo para "estabilizar" y "desestabilizar" las capas de películas de ELBL de polipéptido. Este proceso permite que las películas permanezcan estables a pH extremo, proporcionando un mayor control sobre la estabilidad mecánica y propiedades difusivas de las películas nanofabricadas a partir de polipéptidos diseñados y aumentando su utilidad en una amplia gama de aplicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diagrama esquemático del proceso general ELBL. La Figura 2 es un gráfico de las tendencias estructurales secundarias cumulativas de los motivos de secuencia aminoacídica identificados en la información de secuencia aminoacídica de humano mediante el uso del método de la presente invención, en comparación con la distribución de tendencias estructurales de 105 secuencias aminoacidicas aleatorias. La Figura 3(a) muestra los datos de adsorción como se monitorizan mediante la técnica de microbalance en cristal de cuarzo ("QCM", por sus siglas en inglés) para una combinación de secuencias aminoacidicas diseñadas según la presente invención.

La Figura 3(b) muestra una comparación de los datos de adsorción como se monitorizan mediante QCM para diferentes combinaciones de secuencias aminoacidicas diseñadas según la presente invención. La Figura 3(c) muestra un gráfico de masa adsorbida en nanogramos con respecto a la cantidad de capas para secuencias aminoacidicas diseñadas y fabricadas según la presente invención. La Figura 4 (a) ilustra enlaces disulfuro dentro de la capa según el método de estabilización con cisteina de la presente invención . La Figura 4 (b) ilustra enlaces disulfuro dentro de la capa según el método de estabilización con cisteina de la presente invención . La Figura 4 (c) ilustra la oxidación y reducción de los enlaces disulfuro en microcápsulas fabricadas a partir de polipéptidos diseñados según el método de la presente invención. La Figura 5 es un diagrama esquemático del proceso de selección de la presente invención utilizado para identificar en información de secuencias aminoacidicas existentes, los motivos de secuencias de aminoácidos que tengan propiedades electrostáticas adecuadas para ELBL. La Figura 6 muestra una cantidad de motivos de secuencia no redundantes identificados en los datos disponibles de secuencia aminoacidica de humano. La Figura 7 muestra la adsorción ELBL de poli-L-glutamato y poli-L-lisina a partir de un medio acuoso como función de la fuerza iónica. La Figura 8 muestra la adsorción de polipéptidos diseñados según el método de la presente invención para experimentos para probar el efecto de la formación de enlaces disulfuro. La Figura 9 muestra el porcentaje de material restante durante el desmontaje de la película delgada a un pH ácido como se menciona con referencia en la Figura 8. La Figura 10 muestra el porcentaje de material perdido durante el paso de desmontaje a pH ácido de un experimento que involucra los polipéptidos diseñados de nuevo que contienen cisteína. La Figura 11(a) ilustra la función de la estructura de la solución de péptidos en el ensamblaje de la película, donde se muestra cómo es que el comportamiento de ensamblaje de poli-L-glutamato y poli-L-lisina depende del pH . La frecuencia resonante de QCM se gráfica con respecto a una capa de adsorción.

La masa molecular promedio de poli-L-glutamato es de 84,600 Da, mientras que la de poli-L-lisina es de 84,000 Da. Los números se refieren a valores pH. E = Glu, K = Lys . La concentración de péptidos utilizada para el ensamblaje es de 2 mg/ml. La Figura 11 (b) ilustra la función de una estructura de solución de péptidos en el ensamblaje de una película, donde se muestra cómo la estructura de la solución de poli-L-glutamato y poli-L-lisina depende del pH. La elipticidad residual molar promedio se gráfica como una función del pH. La concentración peptídica es de 0.05 mg/ml. La Figura 12 muestra los datos de adsorción para polielectrolitos de diferentes longitudes, donde se ilustra que los polielectrolitos más largos se adsorben mejor que los cortos. La Figura 13 ilustra una modalidad de un polipéptido (4) "compuesto" que comprende dos regiones de adsorción (1,2) de superficie y una región (3) funcional. Cada región (1,2) de adsorción de superficie comprende uno o más motivos. La Figura 14 ilustra la preparación independiente de tres diferentes regiones (1,2,3) de un polipéptido (4) compuesto mediante una síntesis en fase de solución, síntesis en fase sólida o la producción de péptidos recombinantes . La Figura 15 ilustra la unión de tres regiones (1,2,3) del péptido (4) compuesto mediante síntesis peptídica para formar una sola cadena polipeptídica . Son posibles otros métodos para unir las tres regiones de este ejemplo.

La Figura 16 ilustra el grado de proliferación promedio de fibroblastos 3T3 luego de 3 días en cubreobjetos con diferentes recubrimientos de superficie. PLL denota 15 capas de poli (ácido L-glutámico) (PLGA, por sus siglas en inglés) y poli (L-lisina) (PLL, por sus siglas en inglés) . PLL/RGD denota 10 capas de PLGA/PLL seguido de 5 capas de péptidos que contienen RGD y RGD denota 15 capas de péptidos que contienen RGD. Los recubrimientos se prepararon mediante ensamblaje capa a capa, la capa terminal tiene una carga positiva neta en cada caso, los cubreobjetos sin recubrimiento se incluyen como control. Las superficies recubiertas muestran un mayor grado de proliferación celular que las superficies sin recubrir, y las superficies recubiertas con PLL/RGD muestran la mayor proliferación. La Figura 17 ilustra una modalidad de un polipéptido "compuesto" que comprende dos regiones (120 y 130) de adsorción de superficie y una región (110) funcional. La Figura 18 (200) ilustra una modalidad de un polipéptido "compuesto" que comprende dos regiones (120 y 130) de adsorción de superficie y una región (111) funcional, que se fija a la superficie (150) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Explicación de términos Para conveniencia en la descripción resultante, se adaptan las siguientes explicaciones de términos. Sin embargo, estas explicaciones solamente pretenden ser ejemplificantes. No pretenden limitar los términos conforme se describen o a los que se hacen referencia en la especificación. Más bien, estas explicaciones pretenden incluir cualquiera de los aspectos y/o ejemplos adicionales de los términos como se describen y reivindican aquí. Como se utiliza aquí, el término "capa" significa un incremento en el grosor de la película, por ejemplo, la formación de una película o plantilla, luego del paso de adsorción. El término "multicapa" significa múltiples incrementos en el grosor (es decir, dos o más) . Una "película multicapa de polielectrolito" es una película que comprende uno o más incrementos de grosor de polielectrolitos . Luego de la deposición, las capas de una película multicapa pueden no permanecer como capas discretas. De hecho, es posible que exista una entremezcla significativa de especies, particularmente en las interconexiones de los incrementos del grosor. Como se utiliza aquí, "biocompatibilidad" significa que no causa ningún efecto adverso a la salud al ingerirse, ponerse en contacto con la piel o introducirse en el flujo sanguíneo. Como se utiliza aquí, "respuesta inmunitaria" significa la respuesta del sistema inmunitario humano en la presencia de una sustancia en el flujo sanguíneo. Una respuesta inmunitaria puede caracterizarse en una variedad de formas, por ejemplo, mediante un aumento en el flujo sanguíneo de una cantidad de anticuerpos que reconocen a cierto antigeno. (Los anticuerpos son proteínas elaboradas por el sistema inmunitario, y un antígeno es una entidad que genera una respuesta inmunitaria) . El cuerpo humano combate la infección e inhibe la reinfección al aumentar la cantidad de anticuerpos en el flujo sanguíneo. La respuesta inmunitaria específica depende a cierto grado del individuo, aunque la norma son patrones generales de respuesta. Como se utiliza aquí, el término "epitopo" significa la estructura de una proteína que es reconocida por un anticuerpo. Por lo común, un epitopo estará sobre la superficie de una proteína. Un "epitopo continuo" es uno que involucra varios aminoácidos en fila, no uno que involucra residuos aminoacídicos que estaban en contacto en una proteína legada. Como se utiliza aquí, el término "motivo de secuencia" y "motivo" significan una secuencia aminoacídica contigua de una cantidad determinada de residuos identificados utilizando el método de la invención actual. En una modalidad preferida, la cantidad de residuos es 7. Como se utiliza aquí, el término "secuencia aminoacídica" y "secuencia" significan cualquier longitud de cadena polipeptídica que tenga al menos dos residuos amino. Como se utiliza aquí, el término "residuo" significa un aminoácido en un polímero; este residuo del monómero aminoacídico del cual se forma el polímero. La síntesis de polipéptidos involucrará la deshidratación, esto es, que se "pierde" una sola molécula de agua al agregarse el aminoácido en la cadena polipept idica . Como se utiliza aquí, el término "polipéptido diseñado" significa un polipéptido diseñado utilizando el método de la presente invención y los términos "péptido" y "polipéptido" se utilizan indistintamente. Como se utiliza aqui, el término "estructura primaria" significa la secuencia lineal del aminoácido en una cadena polipeptidica y "estructura secundaria" significa los tipos más o menos regulares de estructura estabilizada mediante interacciones no covalentes, normalmente enlaces de hidrógeno, cuyos ejemplos incluyen a-hélice, ß-lámina y ß-giro. Como se utiliza aqui, el término "aminoácido" no se limita a los 20 L-a-aminoácidos que ocurren naturalmente; el término también se refiere a los otros L-aminoácidos, D-aminoácidos y otros aminoácidos no naturales conforme permita el contexto. Como se utiliza aqui, el término "aminoácidos no naturales" significa aminoácidos distintos a los 20 que ocurren naturalmente. Un "peptoide" o glicina N-sustituida, significa un análogo del monómero aminoacidico correspondiente, con la misma cadena lateral que el aminoácido correspondiente pero con la cadena lateral anexada al átomo de nitrógeno del grupo amino en vez de los a-carbonos del residuo. En consecuencia, los enlaces químicos entre los monómeros en un polipeptoide no son enlaces peptidicos, lo que puede ser útil para limitar la digestión proteolitica . El término "sustrato" significa un material sólido con una superficie adecuada para adsorción de polielectrolitos a partir de una solución acuosa. La superficie de un sustrato puede tener esencialmente cualquier forma, por ejemplo, plana, esférica, tubular, etc. Una superficie del sustrato puede ser regular o irregular. Un sustrato puede ser un cristal. Los sustratos abarcan tamaños desde nanoescala a macroescala. Más aún, un sustrato comprende opcionalmente una colección de partículas coloidales. Un sustrato puede elaborarse a partir de material orgánico, material inorgánico, material bioactivo o una combinación de éstos. Los ejemplos no inclusivos de sustratos son las obleas de silicio; partículas coloidales cargadas, por ejemplo, micropartículas de CaC03 o formaldehído de melamina; células biológicas como eritrocitos, hepatocitos, células bacterianas o levaduras; retículos de polímeros orgánicos, por ejemplo, retículos de copolímero de poliestireno o estireno; liposomas; organelos y virus. En una modalidad, un sustrato es un dispositivo médico como un marcapasos artificial, un implante coclear o endoprótesis vascular. Cuando se desintegra el sustrato o se retira durante o después de la formación de la película, éste se llama "plantilla" (para la formación de la película) . Las partículas de la plantilla se pueden disolver en solventes apropiados o eliminarse mediante tratamiento térmico. Por ejemplo, si se utilizan partículas de plantilla de melamina-formaldehído parcialmente reticuladas, la plantilla puede desintegrarse mediante métodos químicos suaves, por ejemplo, en dimetilsulfóxido (DMSO) o mediante, un cambio en el valor del pH . Luego de la disolución de las partículas de la plantilla, permanecen recubrimientos externos huecos multicapa que están compuestos de capas alternantes de polielectrolitos. El término "microcápsula" es una película de polielectrolito en forma de un recubrimiento externo hueco o un recubrimiento que rodea un núcleo. El núcleo comprende una variedad de diferentes encapsulantes, por ejemplo, una proteína, un fármaco o una combinación de éstos. El término "molécula bioactiva" significa una molécula, macromolécula o unidad macromolecular que tiene un efecto biológico. El efecto biológico específico puede cuantificarse en un ensayo adecuado para cuantificar el efecto biológico y normalizar el peso por unidad o por molécula de la molécula bioactiva. Una molécula bioactiva puede encapsularse o retenerse mediante una película de polipéptido. Los ejemplos no limitantes de una molécula bioactiva son una proteína, un fragmento funcional de una proteína, un complejo proteínico, un oligopéptido, un oligonucleótido, un ácido nucleico, un ribosoma, un agente terapéutico activo, un fosfolípido, un polisacárido . Como se utiliza aquí, el término "molécula bioactiva" además abarca las estructuras biológicamente activas, como por ejemplo, un fragmento de membrana funcional, una estructura membranal, un virus, un patógeno, una célula, un agregado celular y un organelo. Los ejemplos de una proteina que se puede encapsular o retener dentro de una película polipeptídica son hemoglobina; enzimas, como por ejemplo glucosa oxidasa, ureasa, lisozima y lo similar; proteínas de matriz extracelular, por ejemplo, fibronectina , laminina, vitronectina y colágeno; y un anticuerpo. Los ejemplos de una célula que puede encapsularse o retenerse dentro de una película polipeptídica es un islote pancreático trasplantado, una célula eucariota, una célula bacteriana, una célula vegetal y una levadura . Como se utiliza aquí, un polipéptido soluble tiene una solubilidad en solución acuosa a un pH 7.0 en más de 50 µ9 p?1. En otra modalidad, un polipéptido soluble tiene una solubilidad acuosa a un pH 7.0 de más de o igual a aproximadamente 1 mg/ml.

Aquí se utilizan las siguientes abreviaturas en tres letras para los 20 aminoácidos usuales: Ala = alanina Cys = cisteína Asp = ácido aspártico Glu = ácido Phe fenilalanina Gly glicina glutámico His = histidina lie isoleucina Lys lisina Leu = leucina Met metionina Asn asparagina Pro= prolina Gln = glutamina Arg = arginina Ser = serina Thr = treonina Val = valina Trp = triptófano Tyr = tirosina A. Descripción de la invención La presente invención incluye películas multicapa que comprenden capas alternantes de polielectrolitos con carga opuesta, donde una primera capa de las películas comprende un polipéptido diseñado. El término "polipéptido diseñado" significa un polipéptido que comprende uno o más motivos de secuencia aminoacídica, donde el polipéptido tiene al menos 15 aminoácidos de longitud y la proporción de cantidad de residuos cargados del mismo signo menos la cantidad de residuos de signo opuesto con respecto a la cantidad total de residuos en el polipéptido es mayor o igual a 0.4 a un pH 7.0. En otras palabras, la magnitud de la carga neta por residuo es mayor o igual a 0.4. En una modalidad, la proporción de la cantidad de residuos cargados con el mismo signo menos la cantidad de residuos de signo opuesto con respecto a la cantidad total de residuos en el polipéptido es mayor o igual a 0.5 a pH 7.0. En otras palabras, la magnitud de la carga neta por residuo es mayor que o igual a 0.5. En una modalidad, un polipéptido diseñado no es un homopolímero . En una modalidad, un polielectrolito comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular mayor a 1,000 y al menos 5 cargas por molécula. En una modalidad, el material policatiónico comprende poliamina como un polipéptido, amina polivinilica, poli (aminostireno) , poli (aminoacrilato) , poli (N-metilaminoacrilato) , poli (N-etilaminoacrilato) , poli (N, -dimetilaminoacrilato) , poli (dietilaminoacrilato de N, N-crosmarmelosa) , poli (aminometacrilato) , poli (N-metilaminoacrilato) , poli (N-etilaminometacrilato) , poli (N, N-dimetilaminometacrilato) , poli (N, -dietilaminometacrilato) , Poli (etileneimina) , poli (cloruro de dialil dimetilamonio) , poli (cloruro de ?,?,?-trimetilaminoacrilato ) , poli (cloruro de metilacrilamidopropiltrimetilamonio) , quitosán y combinaciones que comprenden uno o más de los materiales policatiónicos anteriores. En otra modalidad, el material polianiónico comprende un polipéptido, un ácido nucleico, un alginato, carragenina, furcelarano, pectina, goma xantana, ácido hialurónico, heparina, sulfato de heparano, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de dextrano, ácido poli (met) acrilico, celulosa oxidada, carboximetilcelulosa, polisacáridos ácidos, croscarmelosa, copolimeros y polímeros sintéticos que contienen grupos carboxilo colgantes y combinaciones que comprenden uno o más de los materiales polianiónicos anteriores. La presente invención también proporciona un método para diseñar polipéptidos para la nanofabricación mediante ELBL de microcápsulas, recubrimientos y películas delgadas para aplicaciones en biomedicina y otros campos. El método involucra 5 principales preocupaciones de diseño: (1) las propiedades electrostáticas de los polipéptidos ; (2) la estructura física de los polipéptidos; (3) la estabilidad física de las películas formadas a partir de los polipéptidos; (4) la biocompatibilidad de los polipéptidos y películas; y (5) la bioactividad de los polipéptidos y películas. La primera preocupación de diseño, la electrostática, es tal vez la más importante ya que es la base del ELBL. Sin propiedades de carga adecuadas, el polipéptido no será soluble en solución acuosa y no podrá utilizarse para la nanofabricación de películas mediante ELBL. Hemos inventado un proceso novedoso para identificar en la información de las secuencias aminoacídicas , los motivos de secuencia aminoacídica que tengan propiedades electrostáticas adecuadas para ELBL. La estructura secundaria de los polipéptidos utilizados para ELBL también es importante, debido a que las propiedades físicas de la película, incluyendo su estabilidad, dependen de cómo se traduce la estructura de solución del péptido en su estructura en la película. La Figura 11 ilustra cómo la estructura en solución de ciertos polipéptidos se relaciona con el ensamblaje de películas. El panel (a) muestra cómo el comportamiento de ensamblaje de poli-L-glutamato y poli-L-lisina depende del pH. Está claro que la conformación de a-hélice se correlaciona con un mayor grado de material depositado que la conformación de ß-lámina. La interpretación molecular precisa de este, comportamiento aún tendrá que elucidarse. El panel (b) muestra cómo la estructura en solución de estos péptidos depende del pH. A un pH 4.2, el poli-L-glutamato es principalmente a-helicoidal, como la poli-L-lisina a pH 10.5. Ambos polipéptidos se encuentran en una conformación similar a hélice principalmente no estructurada a un pH 7.3. Las preocupaciones restantes se relacionan con aplicaciones de las películas polipeptídicas . Al llevar a la práctica la invención, estas preocupaciones y otras más tendrán más o menos importancia dependiendo de los requerimientos de diseño de una aplicación particular. Al utilizar el proceso de selección de la presente invención para identificar en una secuencia aminoacídica la información sobre los motivos de secuencia aminoacídica con características de carga adecuadas, y al utilizar las otras preocupaciones de diseño para seleccionar motivos particulares, se pueden diseñar - polipéptidos adecuados para la fabricación mediante ELBL de películas organizadas a escala nanométrica para aplicaciones en biomedicina y otros campos. Alternativamente, se puede utilizar el método de la presente invención para diseñar polipéptidos de novo para utilizarse en ELBL. El enfoque al diseño de novo es esencialmente el mismo que para identificar motivos en la información existente de secuencias aminoacídicas, excepto que cada residuo en un motivo de secuencia aminoacídica se selecciona por el practicante en vez de que todo el motivo sea identificado en la información proteómica o genómica de un organismo especifico. Deberá enfatizarse que los principios fundamentales del diseño de polipéptidos aducidos en la presente invención son independientes de si los aminoácidos involucrados son los 20 aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales o alguna novedosa combinación de éstos, en el caso del diseño polipeptidico de novo. Además, se pueden utilizar otros L-aminoácidos o D-aminoácidos . A continuación se mencionan con más detalle las preocupaciones de diseño de la presente invención. 1. Electrostática Hemos inventado un novedoso proceso para identificar información en una secuencia aminoacidica sobre motivos de secuencia aminoacidica que tengan propiedades electrostáticas adecuadas para ELBL. Utilizando este proceso, hemos identificado 88,315 motivos no redundantes de secuencia aminoacidica en los datos del proteoma humano—la traducción de la porción del genoma que codifica todas las proteínas conocidas en el cuerpo humano. Esta información está disponible al público en el National Center for Biotechnology Information ' s ("NCBI", por sus siglas en inglés) sitio en Internet: http : / /www . ncbi .nlm.nih.gov, entre otros lugares. Esta información está constantemente actualizándose conforme el genoma humano se analiza aún más. Conforme aumenta la cantidad de esta información, la cantidad de motivos de secuencias aminoacidicas que pueden identificarse información de la secuencia de humano mediante proceso de selección de la presente invención por tener propiedades electrostáticas adecuadas para ELBL también aumentará. Lo mismo es cierto para cualquier organismo. Los principios bioquímicos y físicos aceptados, así como los resultados experimentales descritos a continuación, indican que los motivos de secuencia identificados serán útiles para el diseño de polipéptidos para la nanofabricación de estructuras ELBL. El criterio clave para la selección es la carga promedio por unidad de longitud a pH neutro (pH 7, cercano al pH de sangre humana) . Además, existen varias preferencias estructurales. En primera, se prefiere que cada motivo de secuencia aminoacídica comprenda sólo 7 residuos. a. Cantidad -total de residuos en el motivo • En una modalidad ejemplificante, se seleccionó una longitud de motivo de 7 en un esfuerzo para optimizar la biocompatibilidad, la estructura física y la cantidad de motivos de secuencia no redundantes en los datos disponibles de la secuencia aminoacídica. Como se menciona a continuación, la magnitud de la carga neta en el motivo de secuencia aminoacídica por residuos es igual o mayor a 0.4. En una modalidad, al menos la mitad de los residuos aminoacidicos en cada motivo de secuencia están cargados, de tal forma que la magnitud de la carga neta en el motivo de la secuencia aminoacidica por residuo se mayor o igual a 0.5. Más aún, se prefiere, pero no se requiere, que todos los residuos cargados en cada motivo tengan la misma carga. Estos requerimientos aseguran que cada motivo sea lo suficientemente soluble en un solvente acuoso y tenga una suficiente carga a un pH neutro para ser útiles para ELBL. Debido a que sólo está cargado un porcentaje relativamente pequeño de tipos aminoácidos, conforme aumenta la longitud de una secuencia aminoacidica, disminuyen las probabilidades de que la secuencia tenga un suficiente porcentaje de aminoácidos apropiadamente cargados para ELBL. Cuatro aminoácidos cargados es el mínimo preferido para un motivo de tamaño 7. Debido a que menos de 4 cargas producen una solubilidad peptídica sustancialmente menor y un menor control sobre ELBL.. Con respecto a la biocompatibilidad (mencionada más adelante) , cada motivo de secuencia identificado es lo suficientemente largo en los 7 residuos para constituir un epítopo continuo (relevante para la posible respuesta inmunitaria de un organismo al cual un péptido diseñado podría introducirse) , pero no tan largo como para que corresponda sustancialmente a residuos tanto de la superficie de una proteína como en su interior; los requerimientos de carga ayudan a asegurar que el motivo de secuencia ocurra sobre la superficie de la proteina plegada; un residuo cargado no puede formarse en el núcleo de un proteina plegada. A diferencia, un motivo muy corto puede parecerle al cuerpo como una secuencia aleatoria, o como uno que no es específicamente "suyo", y por lo tanto provocar una respuesta inmunitaria. Aunque la longitud ideal de un péptido para generar anticuerpos es un motivo de argumento, la mayoría de los antígenos peptídicos abarcan una longitud de 12 a 16 residuos. Los motivos que tienen 9 residuos o menos pueden ser antígenos efectivos; los péptidos mayores a 12 a 16 aminoácidos pueden contener múltiples epítopos (Angeletti, R.H. (1999) Design of Useful Peptide Antigens, J. Biomol. Tech. 10:2-10, el cual está incorporado aquí por referencia en su totalidad) . Por lo tanto, para minimizar la antigenicidad, se debe preferir un motivo más corto que 12 e incluso mejor, más corto que 9 residuos. Los motivos preferidos no deberán ser muy largos por otra razón: para minimizar la formación de estructura secundaria. La estructura secundaria disminuye el control de la estructura física de los polipéptidos (ver a continuación) y las películas que se elaboran a partir de ellos. Por lo tanto, un motivo de secuencia aminoacídica deberá contener de 5 a 15 aminoácidos contiguos . Más aún, la cantidad de motivos no redundantes en el genoma humano ocurre cuando la cantidad de residuos en cada motivo es de 7. La Figura 6 muestra la cantidad de motivos de secuencia no redundantes en la información disponible de secuencia aminoacídica de humano. La mayor cantidad de motivos positivos es para una longitud de 5 residuos, mientras que la mayor cantidad de motivos negativos es para una longitud de 7 residuos. La mayor cantidad de motivos positivos y negativos es aproximadamente igual para 5 y 7. Por lo tanto, una longitud de motivo de 7 residuos parecería maximizar la cantidad de motivos no redundantes. Por todas las razones anteriores, 7 residuos es la longitud preferida del motivo para optimizar el diseño polipeptidico para ELBL. No obstante, es posible que en algunos casos funcionen igualmente de bien los motivos ligeramente cortos originalmente más largos. Por ejemplo, se pueden usar motivos de 5 o 6 residuos de longitud y también podrían ser útiles los motivos en el orden de 8 a 15 residuos de longitud. Por lo tanto, un motivo de secuencia aminoacídica se define por tener 5 a 15 residuos aminoacídicos . b. Cantidad de residuos cargados En segundo lugar, se prefiere que al menos 4 aminoácidos positivamente cargados (básicos) (Arg, His o Lys) o al menos 4 aminoácidos con carga negativa (ácidos) (Glu o Asp) estén presentes en cada motivo de 7 residuos a un pH neutro. Se desfavorecen las combinaciones de cargas positivas y negativas en un esfuerzo para asegurar una densidad de carga elevada a un pH neutro. Sin embargo, es posible que un motivo que contenga ambos aminoácidos positivos y negativos pueda ser útil para ELBL. Por ejemplo, un motivo ligeramente más largo, a decir de 9 residuos, podría tener 6 aminoácidos de carga positiva y un aminoácido de carga negativa. Es la magnitud de la carga neta (el valor absoluto de la carga neta) lo que es importante -el péptido en general deberá tener un carga suficientemente negativa o una carga suficientemente negativa a un pH neutro. Sin embargo, las modalidades preferidas de los motivos contienen sólo Glu o Asp o sólo Arg, His o Lys como aminoácidos cargados (aunque normalmente, otros aminoácidos no cargados forman parte de los motivos), a menos que otros aminoácidos no naturales sean admitidos como aminoácidos ácidos o básicos. La Figura 5 es un diagrama de flujo que muestra los pasos involucrados en un proceso de selección ejemplificante para identificar a las secuencias aminoacídicas que tengan propiedades electrostáticas adecuadas. Se asume que sólo se involucran 20 aminoácidos usuales. Si se buscan motivos con carga negativa, el proceso comienza al localizar un aminoácido en los datos de una secuencia. Este aminoácido se ha llamado el "aminoácido iniciador" debido a que es el punto inicial para el análisis de los aminoácidos circundantes (es decir, comenzará en el motivo) . Después, el aminoácido iniciador y los siguientes 6 residuos se examinan para las ocurrencias de Arg, His o Lys. Si uno o más aminoácidos Arg, His o Lys se ubican entre estos 7 aminoácidos, el proceso empieza de nuevo en otro aminoácido iniciador. Si no se encuentra Arg, His o Lys, se examinan los 7 aminoácidos para determinar la cantidad de ocurrencias de Glu y/o Asp. Si hay al menos 4 ocurrencias de Glu y/o Asp en los 7 residuos, se cataloga el motivo de secuencia. El proceso de selección es esencialmente igual para los aminoácidos de carga positiva, excepto que Glu y Asp se reemplazan por Arg, His y Lys, y Arg, His y Lys se reemplazan por Glu y Asp, respectivamente. Obviamente, también se ' podría comenzar el método al inicio de la secuencia aminoacídica (amino terminal) y proceder al final (carboxilo terminal) o alternativamente, se puede comenzar en un punto aleatorio y recorrer todos los aminoácidos de la secuencia, en forma aleatoria o sistemática en cualquier dirección. Más aún, se podría utilizar el método para identificar motivos en la información de secuencia que contiene aminoácidos no naturales. En este caso, se deberá buscar aminoácidos ácidos y básicos no naturales en vez de Glu y Asp, y Arg, Lys y His, respectivamente. En una modalidad, uno o más primeros motivos de secuencia aminoacídica comprende 5 a 15 aminoácidos, donde la magnitud de la carga neta del primer motivo de secuencia aminoacídica por residuo es mayor o igual a 0.4. En otra modalidad, uno o más motivos de secuencia aminoacídica comprende n, donde la magnitud de la carga neta en el primer motivo de secuencia "aminoacídica a pH 7 es mayor o igual que aproximadamente la mitad que n, y donde n es 5 a 15. El resto de las preocupaciones de diseño, a decir, la estructura física, la estabilidad física, biocompatibilidad y biofuncionalidad, conciernen principalmente con la aplicación particular para la cual se utilizarán los polipéptidos diseñados. Como se observa anteriormente, tendrá más o menos importancia estas preocupaciones durante el proceso del diseño, dependiendo de las propiedades deseadas del péptido para una aplicación particular. 2. Estructura física Una preocupación del diseño concerniente a los motivos de secuencia aminoacídica es su tendencia a formar estructuras secundarias, notablemente a-hélice o ß-lámina. Hemos buscado en varias formas para controlar, notablemente minimizar, la formación de estructura secundaria de péptidos diseñados en un medio acuoso a fin de maximizar el control sobre la formación de una capa de película delgada. En primera, se prefiere que los motivos de secuencia sean relativamente cortos, debido a que los motivos largos tienen mayores probabilidades para adoptar una estructura tridimensional estable. En segunda, colocamos un residuo glicina entre cada motivo en modalidades preferidas de los diseños polipeptídicos . La glicina tiene una baja tendencia a a-hélice y una muy baja tendencia a ß-lámina, haciéndolo muy desfavorable para que una glicina y sus aminoácidos adyacentes formen una estructura secundaria regular en una solución acuosa. La prolina tiene propiedades similares en algunos aspectos y podría utilizarse como alternativa a glicina para unir motivos. En tercera, hemos buscado minimizar la tendencia a-hélice y ß-lámina de los polipéptidos diseñados en sí mismos al enfocarnos en motivos para los cuales la tendencia a-hélice sumada sea menor a 7.5 y la tendencia a ß-lámina sumada sea menor que 8. (el término tendencia "sumada" significa la suma de las tendencias a-hélice o ß-lámina de todos los aminoácidos en un motivo.) Sin embargo, es posible que las secuencias aminoacídicas que tengan una mayor tendencia a-hélice sumada y/o tendencia ß-lámina sean adecuados para ELBL bajo ciertas circunstancias, ya que los residuos Gly (o Pro) entre los motivos tienen una función fundamental para inhibir la formación de estructura secundaria estable en el polipéptido diseñado. De hecho, se puede desear en ciertas aplicaciones que la tendencia de un polipéptido a formar estructura secundaria sea relativamente elevada, como una característica de diseño específica de la fabricación de película delgada; aunque aún deberán cumplirse los necesarios requisitos de carga electrostática para ELBL, como se menciona con anterioridad. A fin de poder seleccionar secuencias aminoacídicas con las deseadas tendencias de estructura secundaria, primero calculamos las tendencias de estructuras secundarias para todos los aminoácidos utilizando el método de Chou y Fasman (ver P. Chou y G. Fasman Bioc emistry 13:211 (1974), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) utilizando la información estructural para más de 1,800 estructuras cristalográficas en rayos X de alta resolución (1,334 contienen a-hélices y 1,221 contienen ß-hebras). Se seleccionaron las estructuras a partir del Protein Data Bank (un repositorio de acceso público de estructuras proteinicas) basándose en: a) método de determinación estructural (difracción de rayos X) ; b) resolución (mejor a 2.0 Á) -el término "resolución" se refiere al tamaño mínimo de una estructura que se puede resolver, como en el criterio Rayleigh; c) diversidad estructural (menor al 50% identidad de secuencia entre las estructuras cristalográficas proteinicas usadas para computar las tendencias de hélice y lámina de los diversos aminoácidos). El razonamiento fue seleccionar estructuras de alta resolución determinadas por la metodología más confiable y no basar el cálculo de la tendencia teniendo estructuras similares. Después, para comparar, se produjeron 100,000 secuencias aleatorias no redundantes utilizando un generador de números aleatorios en una computadora personal. Luego calculamos las tendencias de estructura secundaria para las 88,315 secuencias aminoacídicas identificadas utilizando el proceso de selección descrito en la parte (A) (1) anterior (59,385 motivos de secuencia básica no redundante y 28,930 motivos de secuencia ácida no redundante).

Luego se compararon las tendencias de las secuencias aleatorias con las tendencias de las secuencias seleccionadas. La Figura 2 muestra la distribución de las tendencias de formación de estructura secundaria en estos motivos de secuencia. El rectángulo en la Figura 2 realza los motivos de secuencia que hemos identificado como los menos probables para formar estructura secundaria en base a las tendencias de estructura secundaria. 3. Estabilidad física Otra preocupación del diseño es el control de la estabilidad de las películas del polipéptido ELBL. Los enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno, interacciones van der aals y las interacciones hidrófobas proporcionan cierto grado de estabilidad, aunque ciertamente limitada, a las películas ELBL. A diferencia, los enlaces covalentes de disulfuro podrían proporcionar una resistencia estructural excepcional. Hemos inventado un novedoso proceso para utilizar cisteína (o algún otro tipo de aminoácido que contenga sulfhidrilo) para "estabilizar" y "desestabilizar" de la película de ELBL de polipéptido. Este proceso permite que una película polipeptidica nanofabricada permanezca estable a pH extremo, proporcionando mayor control sobre su estabilidad mecánica y sus propiedades difusivas (para observaciones sobre la porosidad de películas multicapa elaboradas en polielectrolitos no polipeptídicos , ver Caruso, F. , Niikura, K. , Furlong, N. y Okahata (1997) Langmuir 13:3427 y Caruso, F., Furlong, N., Ariga, K. , Ichinose, I., y Kunitake, T. (1998) Langmuir 14:4559, de las cuales ambas se incorporan aquí por referencia en su totalidad) . También, la incorporación de cisteina (o algún otro tipo de aminoácido que contiene sulfhidrilo) en motivo de secuencia de un polipéptido diseñado permite el uso de péptido relativamente cortos en la fabricación de películas delgadas, por virtud de la formación del enlace disulfuro intermolecular. Sin la cisteina, estos péptidos, generalmente no producirían películas suficientemente estables (ver Figura 12, mencionada a continuación). Por lo tanto, nuestro uso novedoso de cisteina hará redundante la necesidad para producir largas versiones costosas de polipéptidos diseñados en un porcentaje sustancial de posibles aplicaciones. Esto es particularmente ventajoso en situaciones donde se debe fabricar una película delgada sobre el material que se va a encapsular, por ejemplo, un pequeño cristal de un fármaco, un pequeño cristal esférico de hemoglobina o una solución que contenga hemoglobina. Para las aplicaciones en donde la estabilidad física de las películas sea importante, los motivos de secuencia aminoacídica que contenga cisteina (o algún otro tipo de aminoácido que contenga sulfhidrilo) puede seleccionarse a partir de la genoteca de motivos utilizando los métodos mencionados anteriormente o diseñados de novo utilizando los principios descritos anteriormente. Los polipéptidos podrán entonces fabricarse y diseñarse basándose en los motivos seleccionados o diseñados de secuencia aminoacídica . Una vez que se han sintetizado los polipéptidos químicamente o producidos en un organismo hospedero, el ensamblaje ELBL de los péptidos que contienen cisteína siempre acaba en presencia de un agente reductor, para evitar la formación prematura de enlace disulfuro. Luego del ensamblaje, el agente reductor se elimina mediante la agregación de un agente oxidante. En presencia del agente oxidante, los enlaces de sulfuro se forman entre los residuos cisteína, "estabilizando" así las capas polipeptídicas que los contienen. Este método "estabilizador" puede ilustrarse aún más utilizando el siguiente ejemplo específico de fabricación de microcápsulas . Primero, se utilizan los polipéptidos diseñados que contiene cisteína para formar multicapas mediante ELBL en una superficie esférica adecuadamente cargada, normalmente solución acuosa a un pH neutro y en presencia de ditiotreitol ("DTT", por sus siglas en inglés), un agente reductor. Después, se retira mediante filtración, difusión, o algún otro método similarmente conocido en la técnica. El DTT, haciendo que la cisteína se forme a través de pares de cadenas laterales de cisteína y estabilizando así la película. Si se construyen las multicapas peptídicas en una partícula nuclear que contiene los materiales que se desea encapsular, por ejemplo, un material cristalino, el proceso de fabricación está completo y la partícula nuclear puede entonces disolverse en el ambiente encapsulado, por ejemplo mediante un cambio de pH. Sin embargo, si las multicapas se construyen en una partícula nuclear "imitación" se deberá retirar el núcleo. En el caso de las partículas de formaldehido de melamina ("MF"), por ejemplo, por lo común se disuelve el núcleo al disminuir el pH -la disolución es catalizada con ácido. Luego de la disolución del núcleo, el pH se ajusta a 4, donde la carga parcial de los polianiones peptídicos -hace que las microcápsulas sean semipermeables (comparar Lvov et al. (2001) Nano Letters ¦ 1:125, que se incorpora aquí por su totalidad) . Después, se agregan 10 mM DTT a la solución de microcápsulas para reducir cistina en cisteína. Luego las microcápsulas pueden "cargarse" al transferirlas a una solución concentrada del material que se va a encapsular, por ejemplo, una proteína (ibid.) . La proteína entra a las microcápsulas al disminuir su ingrediente de concentración. La proteína encapsulada se "estabiliza" al eliminar el agente reductor y agregar un oxidante, promoviendo así la reformación de enlaces disulfuro. Un método esquemático de la "estabilización" y "desestabilización" de cisteína de la presente invención se encuentra en la Figura 4. La cisteína puede formar enlaces disulfuro intermoleculares como intramoleculares. Además, los enlaces disulfuro pueden formarse entre moléculas en las misma capa o capas adyacentes, dependiendo de la ubicación de los péptidos que contienen cisteina en la película. Refiriéndose a la Figura 4(a), los polipéptidos 2 básicos se enlazan mediante enlaces 3 disulfuro en todas las capas en donde los péptidos básicos contienen cisteina. Los péptidos ácidos de la capa en cuestión (representada en la figura mediante una capa 4 traslúcida) no contienen cisteina. Sin embargo, las capas alternantes continúan atrayéndose entre sí de manera electrostática, si las cadenas laterales ácidas y básicas están al pH del ambiente circundante. Refiriéndose a la Figura 4 (b) , los enlaces disulfuro se muestran entre las capas. Estas estructuras se formarán cuando tanto los polipéptidos ácidos y básicos (es decir, las capas alternantes de polipéptidos) utilizados para ELBL contienen cisteina y el procedimiento utilizado ha sido adecuado para la formación de enlaces disulfuro. Refiriéndose a la Figura 4(c), las reacciones de oxidación y reducción se utilizan para regular la liberación de compuestos 5 encapsulados al romper y formar enlaces 3 disulfuro, respectivamente, y regulando con ello la difusión de partículas a través de la pared de la cápsula. La "estabilización" y "desestabilización" de cisteina es una forma novedosa para regular la integridad y la permeabilidad estructural de las películas ELBL. En la técnica se sabe que se puede utilizar el glutaraldehído para reticular proteínas y por lo tanto, se podría utilizar este compuesto químico para estabilizar las películas polipeptídicas . Sin embargo, la reticulación del glutaraldehido es irreversible. A diferencia, el método de "estabilizar" y "desestabilizar" la cisteína en la presente invención es reversible y por lo tanto, ofrece un mejor control sobre la formación estructural y, con mayor importancia, el uso de las películas y cápsulas que puedan fabricarse utilizando la presente invención. La sangre es un ambiente oxidante. Por lo tanto, en ciertas aplicaciones biomédicas, por ejemplo para eritrocitos artificiales o sistema de administración de fármacos fabricados a partir de polipéptidos diseñados, exponen a la sangre u otro ambiente oxidante una película polipeptídica de cisteína reticulada luego de la formación de enlaces disulfuro, no se esperará que haga que esos enlaces se rompan. Finalmente, también deberá observarse que las aplicaciones que impliquen aminoácidos no naturales reemplazarán a Cys con otros tipos de aminoácidos que contengan sulfhidrilo. Por ejemplo, se puede agregar un sulfhidrilo a los ß-aminoácidos, como ácido D, L-p-amino-p-cilohexilpropiónico; ácido D, L-3-aminobutanoico; o acido 5- (metiltio) -3-aminopentanoico (ver http://synthatex.com). 4. Biocompatibilidad La biocompatibilidad es una preocupación de diseño principal en aplicaciones biomédicas. En estas aplicaciones, el practicante de la presente invención tendrá como objetivo identificar la información proteómica o genómica que producirá los polipéptidos "inmunológicamente inertes", particularmente si el objeto fabricado o recubierto hará contacto con la sangre en circulación. Para el propósito de la presente invención, se prefiere que el proceso de selección mencionado en la parte (A) (1) anterior sea utilizado para analizar las secuencias aminoacidicas de las proteínas sanguíneas. Esto maximizará las oportunidades de minimizar la respuesta inmunitaria de un organismo . Existen algoritmos en computadora para predecir la antigenicidad de una secuencia aminoacídica . Sin embargo, en el mejor de los casos se sabe que estos métodos son semiconfiables . En la presente invención, los motivos de secuencia identificados que utilizan el método de selección mencionado anteriormente en la Parte (A) (1) son altamente polares. Por lo tanto, los motivos deberán existir sobre la superficie del estado natural de las proteínas de las cuales son parte de la secuencia. El término "superficie" es aquella parte de una proteína plegada que se encuentra en contacto con el solvente o que es inaccesible al solvente únicamente debido a la naturaleza granular del agua. El término "interior" es aquella parte de una proteína plegada que es inaccesible al solvente debido a cualquier otra razón. Una proteína globular soluble plegada es como un cristal orgánico, el interior se encuentra densamente empacado como en una retícula cristalina y el exterior está en contacto con el solvente, agua. Debido a sus propiedades de carga, los motivos de la secuencia polipeptidica identificados que utilizan el método de la presente invención deberán ocurrir en su mayoría, sino es que exclusivamente, sobre la superficie de una proteína. Por lo tanto, todos los motivos de secuencia identificados de las proteínas sanguíneas de humano utilizando el proceso de selección de la invención actual siempre estarán efectivamente en contacto con el sistema inmunitario mientras la proteína se encuentre en la sangre. Esto es válido para todas las conformaciones de la proteína que pudieran poblar el flujo sanguíneo, incluyendo los estados desnaturalizados, debido a que es muy desfavorable transferir una carga de un medio acuoso a una con bajo dieléctrico (como ocurre en el interior de una proteína) . Por lo tanto, los principios bioquímicos aceptados indican que los polipéptidos diseñados a partir de proteínas sanguíneas que utilizan el método de la presente invención no provocarán una respuesta inmunitaria ni provocarán una respuesta inmunitaria mínima. Por las mismas razones, los polipéptidos diseñados que utilizan el método de la presente invención deberán ser biocompatibles . Todos los motivos de secuencia identificados a partir de los datos genómicos que utilizan el proceso de selección de la invención actual, no sólo en las proteínas sanguíneas, deberán ser biocompatibles, aunque el grado de la respuesta inmunitaria o de cualquier otro tipo de respuesta biológica puede depender de los detalles específicos de un motivo de secuencia. (Debido a que las secuencias polipeptidicas sobre las cuales los motivos se basan existen en el organismo para el cual se fabrica la película, este enfoque, al menos en principio, funcionará igualmente bien para cualquier tipo de organismo. Por ejemplo, el enfoque puede tener un valor significativo para la ciencia veterinaria.) Tanto la respuesta inmunitaria como la biocompatibilidad son importantes con respecto al uso de los péptidos diseñados en aplicaciones biomédicas, incluyendo, entre otros, la elaboración de eritrocitos artificiales, sistemas de administración de fármacos o polipéptidos para la fabricación de películas biocompatibles para recubrir implantes para la introducción a corto plazo o largo plazo en un organismo.

. Bioactividad En algunas aplicaciones de microcápsulas , recubrimientos o películas delgadas de polipéptidos, es deseable modificar el diseño de los polipéptidos para incluir un dominio funcional para utilizarse en alguna capa de la estructura, por lo común, en la más externa. Un dominio funcional en este contexto, es una región independientemente termoestable de una proteína que tiene una biofuncionalidad específica (por ejemplo, la unión a fosfotirosina) . En la técnica se sabe bien que esta biofuncionalidad puede integrarse con otras funcionalidades -en una proteína de múltiples dominios, por ejemplo en la . proteína tensina, que abarca un dominio de unión a fosfotirosina y un dominio a proteina tirosina fosfatasa. La inclusión de este dominio en un polipéptido diseñado podría funcionar en una variedad de formas, incluyendo sin limitación, las uniones a ligando específico, especificidad de objetivo in vivo, biodetección o biocatálisis . En una modalidad, una película multicapa comprende un polipéptido compuesto de la primera capa que comprende una o más regiones de adsorción de superficie covalentemente unidas a una o más regiones funcionales, donde el polipéptido compuesto de la primera capa y una o más regiones de adsorción de superficie tienen la misma polaridad. Las regiones de adsorción de superficie comprenden uno o más motivos de secuencia aminoacídica . El polipéptido compuesto de la primera capa tiene al menos 15 aminoácidos de longitud y tiene una solubilidad en solución acuosa a un pH 4 a 10 mayor a 50 g/ml. En una modalidad, una o más regiones de adsorción de superficie y una o más regiones funcionales tienen la misma polaridad. En otra modalidad, la solubilidad del polipéptido compuesto de la primera capa a un pH de 4 a 10 es mayor o igual que aproximadamente 1 mg/ml. La solubilidad es una limitación práctica para facilitar la deposición de los polipéptidos a partir de una solución acuosa. El límite superior práctico en el grado de polimerización de un polipéptido compuesto es de aproximadamente 1,000 residuos. Sin embargo, es concebible que pudieran llevarse a cabo polipéptidos compuestos más largos en un método apropiado de síntesis. En una modalidad, un polipéptido compuesto comprende una región funcional y una región de adsorción de superficie, donde la región de adsorción de superficie comprende dos motivos de secuencia aminoacídica . En otra modalidad, un polipéptido (4) compuesto comprende una región (3) funcional y dos regiones (1,2) de adsorción de superficie, una fijada al N-término de la región funcional y la otra fijada en el C-término de la región funcional, donde cada región de adsorción de superficie comprende uno o más motivos de secuencia aminoacídica y las dos regiones de adsorción de superficie son iguales o diferentes y tienen la misma polaridad. (Figura 13) El propósito de las regiones de adsorción de superficie es permitir la adsorción de polipéptido en una superficie de carga opuesta a fin de construir una película multicapa. El propósito de las regiones funcionales es proporcionar una funcionalidad específica a la película, por ejemplo, una función biológica. Son posibles otros tipos de función. Por ejemplo, en una modalidad, la región funcional le confiere a la película multicapa polipeptídica la habilidad de unir cationes divalentes de calcio con un elevado grado de especificidad, como en el caso donde la región funcional es un motivo de unión a calcio conocido de una proteína, por ejemplo, el asa de unión de calcio de la proteína a-lactalbúmina de leche humana. No hay nada fundamentalmente biológico sobre la habilidad de una película multicapa para unir iones de calcio con una elevada especificidad, incluso si algunas macromoléculas biológicas si exhiben esta habilidad y la estructura peptidica que permite esta unión ha sido manipulada genéticamente en una película multicapa. La cantidad de regiones de adsorción de superficie en un polipéptido compuesto en relación con la cantidad y/o longitud de las regiones funcionales. se relaciona con el requerimiento de solubilidad. Por ejemplo, si la región funcional es una corta secuencia aminoacídica , como un "RGD", arginina-glicina-ácido aspártico, sólo un motivo de secuencia aminoacídica de al menos 12 residuos aminoacídicos será requerido para adsorber el polipéptido compuesto en una superficie adecuadamente cargada. Si, a diferencia, la región funcional es un dominio estructural soluble y plegado de una proteína que comprende, por ejemplo, 120 residuos aminoacídicos, normalmente dos motivos de secuencia aminoacídica ' serán suficientes para conferir una suficiente carga para que el polipéptido compuesto sea hidrosoluble y adecuado para la adsorción. Los motivos pueden ser contiguos y ubicarse en el N-término del dominio, estar contiguos y ubicarse en el C-término del dominio, o no estar contiguos y estando uno en el N-término y el otro en el C-término. La longitud combinada de las regiones de adsorción de superficie se relaciona más a la disipación debido a la energía térmica, la cual deberá ser superada para que ocurra espontáneamente la adsorción del péptido compuesto, que a la cantidad de residuos aminoacídicos en la región funcional del péptido compuesto. Por lo tanto, el aumento del grado de polimerización de la región funcional mediante un factor de dos, no necesariamente requiere que las regiones de adsorción de superficie sean dos veces más largas, para unir efectivamente las regiones de adsorción de superficie del péptido compuesto. El fundamento físico de adsorción de un péptido compuesto a una superficie es la atracción electrostática (y la liberación de contraiones a una solución voluminizadora ) , la masa precisa del dominio es de importancia secundaria a la longitud de escala de nanómetros y la "fuerza" principal que contrarresta la adsorción del péptido compuesto es la energía térmica. Considerando esto, el experto en la técnica puede diseñar con facilidad las regiones de adsorción de superficie que sean adecuadas para adsorción física a una superficie de la región funcional particular de interés. Una región funcional comprende de 3 hasta aproximadamente 250 residuos aminoacídicos. El término región funcional incluye tanto motivos funcionales como dominios funcionales. Los motivos funcionales comprenden relativamente pocos residuos aminoacídicos y, en términos generales, no tienen una estructura compacta o tridimensional persistente; no obstante, pueden mostrar una funcionalidad específica, al igual que con algunos neuropépt idos y hormonas peptídicas y pueden comprender elementos de estructura secundaria como a-hélices y ß-láminas.

Un ejemplo de un motivo funcional se proporciona por la secuencia RGD de la matriz extracelular de la proteina fibronectina . Cuando la unidad funcional es un motivo funcional, por lo común comprende de 3 hasta aproximadamente 50 residuos aminoacidicos . Cuando la región funcional es un dominio, por lo común comprende de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 250 residuos aminoacidicos. Un dominio funcional se define aqui como al menos una porción de un polipéptido que, cuando se pliega, forma su propio núcleo hidrofóbico. Por ejemplo, una proteina natural puede contener una pluralidad de dominios estructurales, de los cuales cada uno actúa como una unidad independiente de estructura y función. La función biológica de un dominio puede ser completamente independiente de la función de otro, como en el caso de un dominio catalítico y un dominio de unión en la misma cadena polipeptídica , donde ambos dominios no interactúan entre sí en lo absoluto. Las interacciones estructurales entre los dominios en una proteína natural no sólo son posibles, sino relativamente comunes; en estos casos la interacción entre un dominio estructural y otro dominio estructural puede considerarse como un tipo de estructura cuaternaria. Como se utiliza aquí, un dominio funcional por lo común tiene un mínimo de aproximadamente 50 residuos aminoacidicos y un máximo de aproximadamente 250 residuos aminoacidicos. En principio, cualquier dominio funcional de una proteína puede emplearse en un péptido compuesto como se expone aqui siempre que el polipéptido compuesto tenga la solubilidad acuosa apropiada para la deposición ELBL. En una modalidad, el dominio funcional tiene una solubilidad hidrica a un pH 4 a 10 mayor que 50 µg/ml. En otra modalidad, el dominio funcional tiene una solubilidad hidrica a un pH 4 a 10 mayor que o igual a 1 mg/ml. Incluso en otra modalidad, el polipéptido compuesto de la primera capa comprende al menos dos motivos de secuencia aminoacidica cuando la unidad funcional comprende un dominio funcional. Cuando el polipéptido compuesto comprende un motivo funcional en vez de un dominio funcional, por lo común tendrá una carga neta por residuo mayor que o igual a 0.4. Sin embargo, si el motivo funcional tiene una carga neta por residuo menor a 0.4, una o más regiones de adsorción de superficie tendrán generalmente una carga neta por residuo mayor a 0.4 para compensar y darle al polipéptido compuesto las propiedades de carga apropiadas para la solubilidad y adsorción física. Las regiones funcionales adecuadas para su inclusión en los polipéptidos compuestos incluyen motivos que contienen cisteína o sitios de reconocimiento de proteasa para controlar la estabilidad de la película y/o la liberación de materiales encapsulados a partir de películas/cápsulas; epítopos de células T, epítopos de células B o epítopos de linfocito T citotóxico para el control de la inmunogenicidad; secuencias adecuadas para la fijación de un sacárido o polisacárido mediante catálisis ¦ enzimática, por ejemplo, como en la glucosilación N-ligada u 0- ligada; secuencias de reconocimiento de péptidos en proteínas de matriz extracelular para el control de la funcionalidad de superficie y el diseño de tejidos; secuencias de péptidos antibacteriales para controlar las propiedades antimicrobianas; dominios extracelulares de receptores transmembranales para una especificidad de objetivo in vivo; y motivos de unión catiónica tales como motivos en mano EF para el control de la unión de cationes divalentes. En una modalidad no limitante, la región funcional de un péptido compuesto comprende una secuencia de reconocimiento de proteasa. Las secuencias de reconocimiento de proteasa incluyen, por ejemplo, la secuencia de reconocimiento del factor Xa, Ile- Glu/Asp-Gly-Argi , la secuencia de reconocimiento de enterocinasa, Asp-Asp-Asp-Asp-Lys? , la secuencia de reconocimiento de trombina Leu-Val-Pro-Arg ¿Gly-Ser, la secuencia de reconocimiento de TEV proteasa Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-GlniGly, la secuencia de reconocimiento de PreScission™ Leu-Glu-Val-Leu- Phe-Gln ¿Gly-Pro y lo similar. En otra modalidad no limitante, la región funcional del péptido compuesto comprende un epítopo de célula T, un epítopo de célula B o un epítopo de célula T citotóxica. Como se utiliza aquí, el término "epítopo de célula T" se refiere a cualquier determinante antigénico peptídico que es reconocido por las células T. Como se utiliza aquí el término "epitopo de célula B", se refiere a cualquier determinante antigénica peptidica que es reconocida por los receptores de inmunoglobulina de células B y que es capaz de provocar como respuesta inmunitaria la producción de anticuerpos con la ayuda apropiada de células T cuando se le administra a un animal. Como se utiliza aquí, el término "epitopo de linfocito T citotóxico", se refiere á cualquier determinante antigénica peptidica que es reconocida por los linfocitos T citotóxicos . Los epitopos son polipéptidos producidos por virus, bacterias, hongos o parásitos. En algunos casos, los epitopos pueden ser polipéptidos a los cuales se fijan los sacáridos u oligosacáridos, por ejemplo, mediante la glucosilación N-ligada u O-ligada. La glucosilación es una reacción de modificación proteinica altamente diversa que ocurre en la mayoría de células eucariotas. Estas modificaciones pueden dividirse en dos categorías generales, N-ligada y O-ligada. En la primera, la porción carbohidrato se fija al nitrógeno de amida de la cadena lateral de asparagina, cuando la asparagina es parte de la secuencia de consenso Asn-X-Ser/Thr . Esta señal es necesaria pero no lo suficiente para la glucosilación, por ejemplo, X no puede ser Pro, y si existe Pro poco después en dirección 5' de Ser/Thr, entonces se inhibe la glucosilación. En la glucosilación O-ligada, la porción carbohidrato se fija al oxígeno de hidroxilo de Ser o Thr; también existe como una modificación primaria de tirosina y una modificación secundaria de 5-hidroxilisina y 4-hidroxiprolina . Hay una alta frecuencia de ocurrencia de residuos Pro, Ser, Thr y Ala alrededor de los sitios de glucosilación O-ligada. Los epitopos lineales son segmentos compuestos de una hebra continua de residuos aminoacídicos a lo largo de la cadena polimérica. Los típicos epitopos lineales tienen una longitud de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 30 aminoácidos. A diferencia, los epitopos conformacionales se constituyen por dos o más segmentos secuencialmente discontinuos que se juntan mediante el plegamiento del antígeno en su estructura natural. En términos generales, los epitopos conformacionales corresponden a cadenas peptídicas más largas que los epitopos lineales. Cada tipo de epítopo puede servir como la región funcional de un polipéptido compuesto para LBL. En otra modalidad no limitante, la región funcional de un péptido compuesto comprende una secuencia de un péptido antibacteriano. Los péptidos antimicrobianos incluyen, por ejemplo, péptidos inhibitorios para disminuir el crecimiento de un microbio, péptidos microbiocidas que son efectivos para eliminar' un microbio (por ejemplo, desinfectantes, esterilizadores y fármacos peptídicos bactericidas y viricidas) y péptidos efectivos para interferir con la reproducción microbiana, toxicidad del hospedero o lo similar. Los ejemplos de péptidos antimicrobianos incluyen nisina, carnobacteriocinas B2 y BMl, leucocina A, mesentericina Y105, sakacinas P y A y curvacina A. En otra modalidad no limitante, la región funcional de un péptido compuesto es una secuencia de reconocimiento peptidico para el reconocimiento de la matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) . Una de estas secuencias, RGD, existe en diversas proteínas de matriz extracelular y es una secuencia de reconocimiento clave para las moléculas de integrina de receptores transmembranales . Otra secuencia de reconocimiento ECM es GFOGER, GLOGER o GASGER, donde "O" representa hidroxiprolina . Éstas son secuencias de reconocimiento en colágeno para las integrinas de unión a colágeno. Ambos tipos de secuencias de reconocimiento son adecuadas para la región funcional de un péptido compuesto para LBL. En otra modalidad no limitante, la región funcional de un péptido compuesto es un motivo de señalización para el reconocimiento por un receptor de superficie celular para una especificidad de objetivo específico in vivo. La región extracelular del receptor se une al ligando de señal peptidico o proteínico con una especificidad notable. El ligando peptidico o proteínico puede ser una hormona peptídica (por ejemplo, insulina, vasopresina, oxitocina) , un factor de crecimiento (por ejemplo, VEGF, PDGF, FGF) o lo similar. Estas secuencias de señal son adecuadas para la región funcional de un péptido compuesto para LBL. En estos casos, la región funcional de un péptido compuesto para LBL comúnmente será un motivo funcional. En forma similar, la región extracelular de un receptor membranal es adecuada para la región funcional de un péptido compuesto para LBL. En estos casos, la región funcional de un péptido compuesto para LBL comúnmente será un dominio funcional.

En otra modalidad no limitante, la región funcional de un péptido compuesto para LBL es un motivo de unión al catión tal como un motivo en mano EF para el control de la unión del catión divalente. Otros dominios de unión al catión incluyen el dominio C2, el motivo "VSFASSQQ" y el dominio doquerina. En otra modalidad no limitante, la región funcional de un péptido compuesto es un dominio de reconocimiento a fosfotirosina, como el dominio de proteina tirosina fosfatasa, dominio C2, un dominio CH2 o un dominio de unión a fosfotirosina . Se sabe que estos dominios de diversas proteínas diferentes son unidades independientes de plegamiento. En otra modalidad no limitante, el dominio funcional es un dominio de reconocimiento de poliprolina, como un dominio SH3. Cada una de las regiones independientes (a decir, regiones funcionales y regiones de adsorción de superficie) del polipéptido compuesto se pueden sintetizar por separado mediante síntesis en fase de solución, síntesis en fase sólida o manipulación genética del organismo hospedero adecuado. La síntesis en fase de solución es el método utilizado para la producción de la mayoría de los productos farmacéuticos peptidicos aprobados que se comercializan actualmente. Una región (1) de adsorción de superficie N-terminal, una región (2) de adsorción de superficie C-terminal y una región (3) funcional se pueden sintetizar por separado. (Figura 14). El método de síntesis en fase de solución se puede utilizar para sintetizar péptidos relativamente largos e incluso pequeñas proteínas. Los péptidos más largos que se han elaborado mediante el método de fase de solución son calcitoninas (32 meros) . Más comúnmente, el método se utiliza para producir péptidos de longitud pequeña o mediana en cantidades de hasta cientos de kilogramos. Es posible producir estas grandes cantidades de los péptidos deseados en una instalación que siga buenas prácticas de fabricación. Alternativamente, las diversas regiones independientes se pueden sintetizar conjuntamente como una sola cadena polipeptídica mediante síntesis en fase de solución, síntesis en fase sólida o manipulación genética de un organismo hospedero adecuado. La elección del método en cualquier caso particular es cuestión de conveniencia o economía. Si se sintetizan por separado las diversas regiones funcionales y regiones de adsorción de superficie, una vez purificadas, mediante cromatografía de intercambio iónico seguida de una cromatografía líquida de alto desempeño, se unen mediante una síntesis de unión peptídico. Por ejemplo, la región (1) de adsorción de superficie N-terminal, un motivo (3) funcional, y una región (3) de adsorción de superficie C- terminal se pueden sintetizar por separado y unirse para formar un polipéptido (3) (Figura 15) . El método similar a la llamada síntesis híbrida, donde los segmentos peptídicos con cadenas laterales totalmente protegidas se sintetizan mediante la técnica en fase sólida y luego se unen mediante uniones peptídicas en un procedimiento en fase sólida o en fase de solución. Este método híbrido ha sido aplicado a la síntesis de T20, un péptido residual de 36 aminoácidos pero no se ha explotado ampliamente. La Figura 17 ilustra una modalidad de un polipéptido "compuesto" que comprende dos regiones (120 y 130) de adsorción de superficie y 1 región (110) funcional. 120 es la región de adsorción de superficie N-terminal. 130 es la región absorbente C-terminal. Cada región de adsorción de superficie comprende uno o más motivos. Un polipéptido "compuesto" es una combinación exclusiva de regiones de adsorción de superficie y regiones funcionales en una sola cadena polipeptídica . Las secuencias (140) de péptidos ligadores se pueden utilizar para generar un polipéptido compuesto que comprenda múltiples regiones funcionales en una sola cadena polipeptídica . En una modalidad, la región 110 funcional puede ser una pequeña región funcional que comprende aproximadamente 50 hasta aproximadamente 130 residuos aminoacídicos y que tenga un diámetro de aproximadamente 2 nm. En una modalidad alternativa, la región 110 funcional puede ser una gran región funcional que comprende de aproximadamente 250 residuos aminoacidicos y que tenga un diámetro de aproximadamente 4 nm. La longitud de 16 residuos aminoacidicos en conformación extendida tiene aproximadamente 5.5 nm . La Figura 18 (200 y 300) ilustran las modalidades de un polipéptido "compuesto" -que comprende 2 regiones (120 y 130) de adsorción de superficie y una región (111, 112) funcional, que se une a una superficie (150) . La modalidad 200 de la Figura 18 ilustra un polipéptido "compuesto" que comprende 2 regiones (120 y 130) de adsorción de superficie y 1 región (111) funcional, que se fija a una superficie (150) , donde la región 111 funcional representa una pequeña región funcional que comprende de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 130 residuos aminoacidicos y que tiene un diámetro de aproximadamente 2 nm. La pequeña región 111 funcional puede ser una corta secuencia peptidico, por ejemplo, RGD. 120 es la región de absorción de superficie N-terminal. 130 es la región absorbente C-terminal. La figura 18 (300) ilustra además una modalidad alternativa de un polipéptido "compuesto" que comprende 2 regiones (120 y 130) de adsorción de superficie y 1 región (110) funcional, donde la región 112 funcional representa una región funcional grande que comprende aproximadamente 250 residuos aminoacidicos y que tienen un diámetro de aproximadamente 4 nm. El dominio 112 funcional grande puede ser el dominio de una proteína, por ejemplo, el dominio PTP de tensina. 120 es la región de absorción de superficie N-terminal. 130 es la región absorbente C-terminal . Una ventaja de un método modular para estructurar péptidos compuestos incluye tomar la ventaja de la tecnología previamente descrita para motivos de secuencia aminoacídica , minimizando así el riesgo. Otras ventajas incluyen la generalidad del método para casi cualquier región funcional concebible; y péptidos químicamente distintos que contienen regiones funcionales idénticas o diferentes y regiones de adsorción de superficie idénticas o diferentes del mismo signo de carga electrónica que puede adsorberse simultáneamente, generando una superficie unifuncional o multifuncional según se desee. Las ventajas de sintetizar las regiones de adsorción de superficie y las regiones funcionales como bloques estructurales individuales incluyen: la habilidad para prefabricar y almacenar prácticamente de manera indefinida (mediante liofilización) los bloques estructurales individuales para una fácil disposición; el bajo costo de producción de los péptidos compuestos de funcionalidad específica mediante el uso de bloques estructurales almacenados que se preparan en gran cantidad; una rápida preparación del péptido compuesto en comparación con la síntesis biótica, de fase en solución o fase sólida directa; una rápida respuesta a nuevos desarrollos concernientes a regiones funcionales debido al método sintético modular; y el uso de materiales basados en multicapas de poli.péptidos y péptidos completamente sintéticos como medio para minimizar contaminación por microbios y simplificar la aprobación productos por la Administración de Alimentos y Fármacos EE.UU. (Food and Drug Administration, FDA) .

C. Usos para Polipéptidos diseñados utilizando el Método de la presente Invención Como se indica anteriormente, los polipéptidos con un diseño adecuado son excelentes materiales para ELBL y las estructuras de película polipeptídica que se forman utilizando ELBL serán útiles en una amplia cantidad de diferentes tipos de aplicaciones. Los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención han demostrado ser útiles para ELBL de estructuras peliculares para posibles aplicaciones en tecnología biomédica, tecnología de alimentos y tecnología ambiental. Por ejemplo, estos polipéptidos podrían utilizarse para fabricar eritrocitos artificiales. 6. Eritrocitos artificiales Se han considerado una amplia variedad de diferentes métodos para el desarrollo de eritrocitos sustitutos. Un método involucra el uso de perfluorocarburos . Las emulsiones de perfluorocarburo contienen hidrocarburos fluorados sintéticos capaces de unirse a oxígeno y suministrarlo a los tejidos. Sin embargo, este método aumenta el bloqueo de células del retículo endotelial. Los perfluorocarburos pueden quedar atrapados en el sistema de retículo endotelial, lo cual puede dar como resultado consecuencias adversas. Otro método se enfoca en el camuflaje antigénico, que involucra recubrir' los eritrocitos con un polímero biocompatible llamado polietilenglicol (PEG). Las moléculas PEG forman uniones covalentes permanentes sobre la superficie de la célula. El recubrimiento oculta de manera efectiva las moléculas antigénicas sobre la superficie de los eritrocitos, de tal forma que los anticuerpos del receptor de la sangre no reconocen las células como extrañas. Por ejemplo, el sistema inmunitario de una persona normal que tiene sangre tipo A tendrá en forma natural anticuerpos que reconocen antígenos sobre la superficie de los eritrocitos tipo B, lo que conlleva a la destrucción celular. La fijación de PEG sobre la superficie de un eritrocito tipo B "camufla" la superficie de la célula, de tal forma que sus antígenos de superficie ya no puedan ser reconocidos por el sistema inmunitario y los eritrocitos antigénicamente extraños no serán destruidos tan rápidamente (ver Pargaonkar, N.A., G. Sharma y K.K. Vistakula. (2001) "Artificial Blood: Current Research Report", que se incorpora aquí por referencia en su totalidad . Existe una variedad de enfermedades, incluyendo talasemia, que requieren de transfusiones sanguíneas constantes y tienden a complicarse por el desarrollo de anticuerpos a los antígenos "menores" en los eritrocitos. Esta "alosensibilización" puede hacer que sea casi imposible de trasfundir sangre a estos pacientes, haciendo que esta situación sea capaz de ocasionar la muerte. En pruebas in Vitro, los eritrocitos modificados con PEG parecen no desencadenar la alosensibilización y también pueden ser útiles en situaciones clínicas donde ha ya ocurrido la alosensibilización (ver Scout, M.D. et al. (1997) "Chemical camouflage of antigenic determinants : Stealth erythrocytes , " Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94 (14) : 7566-7571, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . Otros métodos implican hemoglobina purificada. La hemoglobina libre de células sin modificar tiene limitaciones conocidas. Estas incluyen afinidad al oxígeno la cual es demasiado alta para una efectiva oxigenación tisular, una vida media dentro del espacio intravascular demasiado corta para que sea clínicamente útil y una tendencia a experimentar disociación en dímeros con una resultante toxicidad y daño tubular renal. Debido a estas limitaciones, se debe modificar la hemoglobina utilizada para elaborar un sustituto de eritrocitos libre de células. Se han desarrollado una variedad de técnicas de modificación. La hemoglobina puede entrecruzarse (un enlace covalente entre dos moléculas que se lleva a cabo mediante modificación química) y polimerizarse utilizando reactivos como el glutaraldehído . Estas modificaciones dan como resultado un producto que tiene un mayor P50 (presión parcial de oxígeno en el cual se ocupan el 50% de todos los sitios de unión al oxigeno) que el de la hemoglobina normal, y un aumento en la vida media plasmática de hasta 30 horas. La fuente de hemoglobina para este propósito puede ser humana (sangre donada caducada) , bovina o recombinante de humano. La solución de hemoglobina modificada se prepara a partir de hemoglobina muy purificada y se lleva a través de diversos procesos bioquímicos para eliminar los fosfolípidos , endotoxinas y contaminantes virales (ver Nester, T. y Simpson, M. (2000) "Transfusión medicine update," Blood Substitutes, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Biopure Corporation (Cambridge, MA) ha estado utilizando hemoglobina modificada para su producto, Hemopure. El principal efecto adverso potencial de las soluciones de hemoglobina modificada es un aumento en la resistencia vascular pulmonar y sistémica que puede conllevar a una disminución del índice cardiaco. La disminución del índica cardiaco puede deteriorar el suministro óptimo de oxígeno y preponderar la ventaja de una solución que transporta oxígeno (ver Kasper S.M. et al. (1998) "The effects of increased doses of bovine hemoglobin on hemodynamics and oxygen transport in patients undergoing preoperative hemodilution for elective abdominal aortic surgery, " Anesth. Analg. 87: 284-91, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Un estudio ha examinado la utilidad de estas soluciones en la fase de resucitación aguda en pacientes con trauma inestable. Sin embargo, el diseño del estudio era inadecuado y cualquier función de las soluciones va a influir en el resultado final del paciente era imprecisa (ver Koenigsberg F. et al. (1999) "The efficacy trial of diaspitin cross-linked hemoglobin in the treatment of severe traumatic hemorrhagic shock, " Acad. Emerg. Med. 6: 379-80, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . Varios de los problemas de la hemoglobina libre de células pueden resolverse al encapsularla con una membrana artificial. Se están utilizando liposomas para encapsular la hemoglobina para utilizarse como un sustituto de sangre. Este método tiene desafios técnicos ya que no solo deberá prepararse la hemoglobina, si no que deberá encapsularse a una concentración y producción relativamente elevadas. Los productos finales deberán ser estériles y los liposomas deberán tener un tamaño relativamente uniforme. La hemoglobina encapsulada tiene varias ventajas con respecto a la hemoglobina libre de células. En primera, la membrana celular artificial protege de hemoglobina de las fuerzas degradantes y oxidativas en el plasma. En segunda, la membrana protege el endotelio vascular de los efectos tóxicos de la hemoglobina. Estos se relacionan con pérdida de heme, la producción de radicales libres de 02 y los efectos vasoconstrictores de la unión de NO. En tercera, la encapsulación aumenta en gran medida la persistencia en circulación de hemoglobina. Más aún, la hemoglobina encapsulada puede liofilizarse para su almacenamiento conveniente. La encapsulación liposomal involucra fosfolipidos , como en las membranas celulares. Un problema principal asociado con la encapsulación liposomal es que es muy difícil regular el tamaño promedio y la distribución de los liposomas. Otra desventaja es que a diferencia de los eritrocitos, los liposomas comúnmente no son muy estables, ya que comúnmente carecen de un citoesqueleto organizado. Incluso otro problema es que los liposomas normalmente comprenden capas múltiples de fosfolípido. (Se presenta un repaso reciente del desarrollo de sustitutos de sangre en Stowell et al. (2001) . Progress in the development of TBC sustitutes, Transfusión 41: 287-299, que es incorporado aquí por referencia en su totalidad. Ver también Chang, T. 1998 "Modified hemoglobin-based blood substitutes: cross linked, recombinant and encapsulated hemoglobin," Artificial Cell 74 Suppl 2: 233-41, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . Los sustitutos de eritrocitos que emplean polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención debería de ofrecer varias ventajas con respecto a los métodos para el desarrollo de eritrocitos conocidos en la técnica, incluyendo, entre otros, una superior funcionalidad de unión al dióxido de carbono y oxígeno, un menor costo de producción (a gran escala y por lo tanto posible una producción a bajo costo debido a que las bacterias se pueden utilizar para producir en masa y debido a que se pueda automatizar el ELBL peptidico) , la posibilidad de utilizar preparaciones adecuadas de hemoglobina como plantilla para ELBL, biodegradabilidad del polipéptido, la "inactividad" inmunitaria de los polipéptidos diseñados basándose en la estructura de la proteina sanguínea y la estabilidad estructural mostrada por las películas de polipéptidos diseñados, que supera la de los liposomas. El ensamblaje ELBL de polipéptidos produce películas semiporosas, lo que minimiza la cantidad de material requerido para fabricar un medio de encapsulación y permite que se difundan la glucosa, oxígeno, dióxido de carbono y diversos metabolitos tan libremente a través de las películas como una bicapa lipídica. A diferencia, los polímeros potencialmente adecuados para este propósito tienen efectos secundarios indeseables - por ejemplo, el poliláctido se degrada en ácido láctico, la sustancia que causa calambres musculares y el poli ( sulfonato de estireno) no es biocompatible . Las microcápsulas pueden formarse a partir de polipéptidos diseñados para encapsular la hemoglobina y funcionar como un sustituto de eritrocitos. Las microcápsulas polipeptídicas de hemoglobina también pueden manipularse genéticamente para incorporar enzimas, incluyendo superóxido dismutasa, catalasa y metemoglobina reductasa, que son comúnmente importantes para la función de eritrocitos. Más aún, las microcápsulas nanofabricadas pueden deshidratarse en forma pronosticada, lo que sugiere que los eritrocitos artificiales elaborados como se describe aquí podrían deshidratarse, sin pérdida de la función, particularmente debido a que la hemoglobina se puede liofilizar (es decir, secarse mediante congelamiento) y reconstituirse sin pérdida de la función y las películas polianiónicas son estables a la deshidratación . Esto es importante para el almacenamiento a largo plazo, el transporte de sustitutos sanguíneos, aplicaciones en el campo de batalla (particularmente en ubicaciones lejanas) y exploración espacial. Los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención también podrían utilizarse para la administración de fármacos. 7. Administración de fármacos Se pueden encapsular mediante polipéptidos diseñados los "núcleos" de tamaño a microescala de un material terapéuticamente adecuado en forma "cristalina" y las microcápsulas resultantes pueden utilizarse para la administración de fármacos. El núcleo debe ser insolu-ble en ciertas condiciones, por ejemplo, a un pH elevado o baja temperatura y se solubles en condiciones donde ocurrirá la liberación controlada. La carga de superficie en los cristales puede determinarse mediante las mediciones del potencial ? (utilizado para determinar la carga en unidades electrostáticas sobre partículas coloidales en un medio líquido) . La velocidad a la cual se libera el contenido de la microcápsula a partir del interior de la microcápsula hacia el ambiente circundante dependerá de una variedad de factores, incluyendo el grosor de recubrimiento encapsulante, los polipéptidos utilizados en el recubrimiento, la presencia de uniones disulfuro, el grado de entrecruzamiento de los péptidos, temperatura, fuerza iónica y el método utilizado para el ensamblaje de los péptidos. En términos generales, mientras más gruesa es la cápsula, más largo será el tiempo de liberación - el principio representa al de la cromatografía por filtración en gel. Se han llevado a cabo ciertos experimentos sobre la liberación prolongada de microcápsulas ELBL (ver Antipov, A., Sukhorukov, G.B., Donath, E . , y Móhwald, H. (2001). J. Phys . Chem. B, 105: 2281-2284 y Freemantle, M . (2002). Polyelectrolyte multilayers, Chem. Eng. News, 80: 44-48, de los cuales ambas se incorporan aquí por referencia en su totalidad) . Los polielectrolitos que se han utilizado son PSS, PAH, PAA,PVS, PEI y PDDA. Los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención deberán ofrecer una variedad de ventajas en el contexto del suministro de fármacos, incluyendo entre otros, el control con respecto a las características físicas, químicas y biológicas de la misma cápsula; la habilidad para elaborar cápsulas con un diámetro menor a 1 mm, elaborar las cápsulas adecuadas para su inyección; baja probabilidad de provocar una respuesta inmunitaria; una biocompatibilidad generalmente elevada de las cápsulas; control sobre las propiedades difusivas de las microcápsulas al variar el grosor de las capas y al utilizar cisteina, como se menciona a continuación; la habilidad para una especificidad de objetivo en ubicaciones mediante la modificación de la superficie de la misma cápsula utilizando los grupos sulfhidrilo altamente reactivos en cisteina (como se conoce en la técnica, los grupos sulfhidrilo libres, grupos amino libres y grupos carboxilo libres son sitios en las cuales las moléculas para un objetivo especifico podrán unirse) mediante la incorporación de un dominio funcional especifico en el diseño del polipéptido; y la habilidad de las microestructura para ser absorbidas por células ya sea mediante endocitosis o pinocitosis . Los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención también pueden utilizarse para recubrimientos antimicrobianos . 8. Recubrimientos Antimicrobianos El método de la presente invención podría utilizarse para elaborar películas que abarcan péptidos antimicrobianos. Por ejemplo, una secuencia adecuada podría ser histatina 5, que existe en humanos: Asp Ser His Ala Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg Lys His Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr (SEQ ID NO: 8) La preponderancia de carga positiva a un pH ligeramente básico hace que esta secuencia sea bastante adecuada para ELBL. Podría anexarse a un péptido diseñado utilizando el método de la presente invención, dando como resultado un péptido antimicrobiano adecuado para utilizarse en ELBL. Este péptido podría utilizarse como un recubrimiento para evitar la corrosión biológica. Por ejemplo, el péptido puede utilizarse para formar un recubrimiento sobre dispositivos utilizados para implantes. También existe una variedad de otras áreas en las cuales los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención podrían ser útiles. 9. Otros usos Otros posibles usos para los péptidos diseñados utilizando el método de la presente invención incluyen, entre otros, recubrimientos para alimentos, envolturas y capas de separación; envases para alimentos, sacos, bolsas y marbetes; cubiertas para alimentos; microcápsulas para ingredientes alimenticios; recubrimientos para fármacos, cápsulas y microcápsulas; artículos desechables para expendios de alimentos (platos, tazas, cubiertos); bolsas para basura; bolsas hidrosolubles para fertilizantes y pesticidas; microcápsulas para fertilizantes y pesticidas; estiércol agrícola; recubrimientos para papel; envases de relleno; productos médicos desechables (por ejemplo, guantes y cofias); y pañales desechables.

B . Fabricación Una vez que se han seleccionado los motivos de la secuencia aminoacidica a partir de aquéllos identificados utilizando el método mencionado en la Parte (A) (1) anterior o diseñados de novo, el polipéptido diseñado se sintetiza utilizando los métodos que se conocen bien en la técnica, como la síntesis en fase sólida y química F-moc o la expresión heteróloga luego de la transformación y clonación génica. Los polipéptidos diseñados pueden sintetizarse por una compañía de síntesis peptídica, por ejemplo, SynPep Corp. (Dublín, California) , producirse en el laboratorio utilizando un sintetizador de péptidos o producirse mediante métodos recombinantes . En una modalidad, un polipéptido diseñado, por ejemplo, un polipéptido de la primera capa, comprende una pluralidad de motivos individuales de secuencias aminoacídicas unidos en tándem para formar una sola cadena polipeptídica . Se puede repetir el mismo motivo o se pueden unir diferentes motivos al diseñar un polipéptido para ELBL. Más aún, se pueden incluir dominios funcionales, como se menciona anteriormente. Los aminoácidos como glicina o prolina pueden utilizarse para ligar los motivos de secuencia, siempre que las propiedades de carga general del polipéptido se mantengan, esto es, que la magnitud de la carga neta en el polipéptido por residuo sea de 0.4. En una modalidad, el ligador comprende 1-4 residuos aminoacídicos, por ejemplo, 1-4 residuos de glicina o prolina. Además, los aminoácidos distintos a los 20 usuales también pueden incluirse en los motivos en si mismos, dependiendo de las propiedades deseadas del polipéptido. Asimismo, se pueden especificar otras propiedades mediante los requerimientos del diseño, utilizando los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede incluir prolina para la formación de vuelta, glicina para la flexibilidad de cadena e histidina para propiedades de carga sensibles al pH cerca de un pH neutro. También pueden incluirse aminoácidos "hidrofóbicos"—el contenido del residuo hidrofóbico puede tener una función importante en el comportamiento de ensamblaje y contribuir a la estabilidad de la capa en una forma que se asemeja a la estabilización hidrofóbica de las proteínas globulares . En una modalidad, un polipéptido de la primera capa comprende uno o más motivos de secuencia aminoacídica , donde el polipéptido tiene al menos 15 aminoácidos de longitud y la proporción de la cantidad de residuos cargados del mismo signo menos la cantidad de residuos del signo opuesto con respecto a la cantidad total de residuos en el polipéptido es mayor o igual a 0.4 a un pH 7.0. En otras palabras, la magnitud de la carga neta en el polipéptido por residuo es mayor o igual a 0.4. En otra modalidad, la proporción de la cantidad de residuos cargados del mismo signo menos la cantidad de residuos del signo opuesto con respecto a la cantidad total de residuos en el polipéptido es mayor o igual a 0.5 a pH 7.0. En otras palabras, la magnitud de la carga neta en el polipéptido por residuo es mayor o igual a 0.5. En una modalidad, un polipéptido diseñado es mayor o igual a 15 residuos aminoacidicos de longitud. En otras modalidades, el polipéptido diseñado es mayor a 18, 20, 25, 30, 32 o 35 aminoácidos de longitud. La razón de esto es que la pérdida entrópica por molécula es tan termodinámicamente desfavorable para los polímeros cortos, que se inhibe la adsorción a una superficie de carga opuesta, incluso si el polipéptido tiene una carga por longitud unitaria de 1; los polielectrolitos largos se adsorben mejor que los cortos. Esto se ilustra en la Figura 12. Las masas moleculares promedio de los péptidos utilizados para los estudios dependientes de la longitud son de 1,500-3,000 Da (poli-L-glutamato, "pequeño"), 3,800 Da (poli-L-lisina, "pequeño"), 17,000 Da (poli-L-glutamato, "mediano"), .48,100 Da (poli-L-lisina, "mediano"), 50,300 Da (poli-L-glutamato, "grande") y 222,400 Da (poli-L-lisina, "grande"). Los datos que se muestran en la Figura 12 indican claramente que el ELBL depende de la longitud del péptido. La inclusión de Cys permite el uso de péptidos relativamente pequeños para ELBL, debido a que . el grupo sulfhidrilo puede utilizarse para formar entrecruzamientos disulfuro entre los polipéptidos .

C. Ensamblaje de la película Un método para elaborar una película multicapa de polipéptido diseñado comprende depositar una pluralidad de capas con especies químicas de carga opuesta sobre una plantilla, donde al menos una capa comprende un polipéptido diseñado. Los polielectrolitos que se depositan sucesivamente tendrán cargas netas opuestas. En una modalidad, la deposición de un polipéptido diseñado (u otro polielectrolito) comprende exponer el sustrato a una solución acuosa que comprende un polipéptido diseñado (u otro polielectrolito) a un pH al cual tenga una carga neta adecuada para ELBL . En otras modalidades, la deposición de un polipéptido diseñado u otro polielectrolito sobre el sustrato se logra mediante la aspersión secuencial de soluciones con polipéptidos de carga opuesta. Incluso en otras modalidades, la deposición sobre el sustrato se lleva a cabo mediante la aspersión simultánea de soluciones con polielectrolitos de carga opuesta. En el método ELBL para formar una película multicapa, las cargas opuestas de las capas adyacentes y la ganancia de entropía con respecto a la liberación de contraiones a la solución conjuntamente, proporcionan la fuerza impulsora para el ensamblaje. No es crítico que los polielectrolitos en las capas opuestas tengan la misma densidad de carga lineal neta, sólo que las capas opuestas tengan cargas opuestas. El procedimiento convencional del ensamblaje de la película incluye la formación de soluciones acuosas de los poliiones a un pH en el cual se ionicen (es decir, pH 4-10) , proporcionando un sustrato que lleve una carga de superficie, y alternar la inmersión del sustrato en las soluciones con polielectrolito cargado. El sustrato se lava opcionalmente entre la deposición de capas alternantes . La concentración del poliión adecuada para la deposición del poliión puede ser determinada con facilidad por el experto en la técnica. Una concentración ejemplificante es de 0.1 a 10 mg/ml. Por lo común, el grosor de la capa producida es sustancialmente independiente de la concentración de la solución del poliión durante la deposición en el intervalo mencionado. Para los polielectrolitos no polipeptidicos comunes como el poli (ácido acrilico) y poli ( clorhidrato de alilamina) , el grosor típico de la capa es de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 5 Á, dependiendo de la fuerza iónica de la solución. Por lo común, los polielectrolitos cortos forman capas más delgadas que los polielectrolitos largos. Con respecto al grosor de la película, el grosor de la película de polielectrolito depende de la humedad así como de la cantidad de capas y la composición de la película. Por ejemplo, las películas PLL/PLGA de 50 nm de grosor se encogen a 1.6 nm al secarse con nitrógeno. En términos generales, las películas de 1-2 nm a 100 nm o más de grosor pueden formarse dependiendo del estado de hidratación de la película y el peso molecular de los polielectrolitos empleados en el ensamblaje. Además, la cantidad de capas requeridas para formar una película multicapa de polielectrolito estable dependerá de los polielectrolitos en la película. Para las películas que sólo comprenden capas de polipéptidos de bajo peso molecular, una película normalmente tendrá 4 o más bicapas de polipéptidos de carga opuesta. Para las películas que comprenden polielectrolitos de elevado peso molecular, como el poli (ácido acrílico) y poli (clorhidrato de alilamina) , las películas que comprenden una sola bicapa de polielectrolito de carga opuesta pueden ser estables.

D . Experimentos Ejemplo 1—Diseño de Polipéptidos Basándose en Secuencias de Proteína de Sangre Humana y su Uso en la Fabricación de Películas Polipeptxdicas . Para este experimento, se seleccionan secuencias aminoacídicas utilizando el proceso descrito en la Parte (A) (1) anterior para identificar los motivos de secuencia en la estructura primaria de proteínas de sangre humana: Complemento C3 (gi| 68766) fue la fuente de los motivos de la secuencia aniónica, y lactotransferrina (gi | 4505043) fue la fuente de los motivos de secuencia catiónica. Como se menciona anteriormente, se utilizan las secuencias de proteína sanguínea para minimizar la respuesta inmunitaria a pacientes en los cuales se deberán introducir los dispositivos que implican los polipéptidos (incluyendo, por ejemplo, eritrocitos artificiales) . En principio, este método deberá ser aplicable para cualquier organismo que tenga un sistema inmunitario, no está limitado a humanos. Los polipéptidos se sintetizan por SynPep Corp. (Dublin, California) . Las secuencias polipeptidicas son: Tyr Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp (SEQ ID NO : 2) Tyr Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln (SEQ ID NO Tyr Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Gys Gln Asp (SEQ ID NO: 4) Tyr Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln (SEQ ID NO: 3) Los residuos aminoacidicos son representados por el código de tres letras que se proporciona anteriormente. Se introduce una glicina entre cada motivo de 7 residuos para inhibir la formación de estructura secundaria. Se seleccionó glicina para este propósito debido a que permite la mayor variabilidad en combinación con ángulos dihédricos (ver Ramachandran, G.N. y Saisekharan, V. (1968), Adv. Prot.ein Chem . istry, 23:283, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) y tiene una baja tendencia a formar hélice (0.677) y una baja tendencia a formar lámina (0.766) . Alternativamente, podría sustituirse la prolina por glicina entre motivos con el fundamento de la tendencia estructural calculada. Además, se incluyó una sola tirosina en el N-término de cada péptido para la determinación de la concentración mediante absorción por luz ultravioleta (UV) a 280 nm. SEQ ID NO: 2 tiene una magnitud de la carga neta de 20/32 (0.625) a pH 7; SEQ ID NO:l tiene una magnitud de la carga neta de 16/32 (0.5); SEQ ID NO: 4 tiene una magnitud de la carga neta de 30/48 (0.625) a pH 7; y SEQ ID NO: 3 tiene una magnitud de la carga neta de 24/48 (0.5) a pH 7. En todos los casos, la magnitud de la carga neta es mayor o igual que aproximadamente la mitad de la longitud total del polipéptido de la primera capa a pH 7. Los polipéptidos se nombraron SN1 (SEQ ID NO: 2), SP2 (SEQ ID NO: 1), LN3 (SEQ ID NO: 4) y LP4 (SEQ ID NO: 3), respectivamente, lo que significa negativo corto, positivo corto, negativo largo y positivo largo. Estas secuencias son bastante distintas de polilisina (comúnmente utilizado en la técnica como un policatión) y poliglutamato (comúnmente utilizado en la técnica como un polianión) que, aunque comercialmente disponible y económica, tiene una elevada tendencia a formar a-hélice en condiciones de pH suave y, crucialmente, es inmunorreactiva . La carga calculada por unidad de longitud en los péptidos diseñados a un pH neutro es de 0.5 unidades electrostáticas para SP y LP y 0.6 unidades electrostáticas para SN y LN . Los péptidos positivos son algo más hidrofóbicos que los negativos, debido a la presencia de valina y la larga cadena lateral de hidrocarburo en arginina. (Como se menciona anteriormente, las interacciones hidrofóbicas entre las capas polipeptidicas pueden estabilizar las películas hasta cierto grado.) Las longitudes son consistentes con los estudios publicados que muestran que los poliiónes deberán tener más de 20 grupos cargados (es decir, ácido aspártico y ácido glutámico; lisina, arginina e histidina) para ser adecuados para ELBL (ver Kabanov, V. y Zezin, A. (1984) Puré Appl. Chem. 56:343 y Kabanov, V. (1994) Polym. Sci. 36:143, de las cuales ambas se incorporan aquí por referencia en su totalidad) . a. Demostración experimental i . Materiales Los electrodos QCM (USI-System, Japón) recubiertos con plata evaporada tienen un área superficial de 0.16 ± 0.01 cm2 en cada lado, una frecuencia de resonancia de 9 Hz (AT-corte) y una estabilidad a largo plazo de ± 2 Hz. El peso molecular del polipéptido se verificó mediante espectrometría de masas por electroaspersión . La pureza del péptido fue mayor a 70%. El amortiguador del polipéptido es 10 mM fosfato de sodio o 10 mM Tris-HCL, 1 mM DTT, 0.1 mM azida de sodio, pM 7.4. Todos los productos químicos distintos a los polipéptidos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (EUA) . ii . Procedimientos Se llevaron a cabo experimentos utilizando pares de polipéptidos diseñados, uno negativo y otro positivo. Se depositaron las películas multicapa que comprenden al menos 5 bicapas del SP2, SN1, LP4 y LN3 anteriormente identificados sobre resonadores QCM utilizando técnicas ELBL convencionales (una bicapa comprende una capa de policatión y una capa de polianión) . La concentración polipeptídica utilizada para la adsorción . de la capa fue de 2 mg-ml-1. Se sabe que la dependencia del grosor de la capa poliión en la concentración del polielectrolito no es fuerte (ver Lvov, Y. y Decaer, G. (1994) Crystallog. Rep. 39:628, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) ; en el intervalo de concentración de 0.1 a 5 mg/ml"1, el grosor de la bicapa es aproximadamente independiente de la concentración para PSS/PAH. A diferencia, las películas delgadas de polipéptido son sus tancialmente menos gruesas que aquéllas fabricadas utilizando PSS/PAH de elevado peso molecular (la masa se calculó utilizando datos ?/ utilizando la conocida ecuación de Sauerbrey) ; ver Lvov. Y. y Decaer, G. (1994) Crystallog. Rep . 39:628. Esto se deriva del cálculo del grosor de la película en base a la masa depositada, como normalmente se lleva a cabo en la técnica para las proteínas. El grosor calculado del ensamblaje del polipéptido diseñado que se muestra en la Figura 3(c) es mayor que la longitud de extremo a extremo de los péptidos utilizados para elaborar la película. Se incluyó DTT a 1 mM para inhibir la formación de uniones disulfuro. El tiempo de adsorción fue de 20 minutos. Se enjuagaron los resonadores durante 1 minuto en agua pura entre los subsiguientes ciclos de adsorción (lo que eliminó tal vez 10-15% del material poco adsorbido) y se secaron en un flujo de 2 gaseoso. Luego la masa del péptido depositado se cuantifica indirectamente mediante QCM . La cuant ificación de masa incluye cierta cantidad de agua, a pesar de la deshidratación , y iones de baja masa como K+, Na+ y Cl~. Es probable la interpenetración parcial de las capas colindantes de péptido (ver Decaer, G. (1997) Science 227:1232; Schmitt et al. (1993) Macromolecules 26:7058; y Korneev et al. (1995) Physica B 214:954) ; esto puede ser importante para la eficiencia de la "estabilización" disulfuro. iii . Resultados Luego de la adsorción del polipéptido y el enjuague y secado del resonador QCM, se cuantifica la frecuencia resonante del resonador. Esto permitió el cálculo del desplazamiento de frecuencia en la adsorción y el cambio en masa adsorbida. Una disminución de frecuencia indica un aumento de masa adsorbida. Los resultados se proporcionan en las Figuras 3(a) y 3"{b) . La figura 3(a) muestra una comparación de los datos de adsorción para LP4 y LN3 en diferentes amortiguadores (10 mM fosfato de sodio, pH 7.4, 1 mM DTT y 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM DTT) . Es obvio a partir de estos datos que la adsorción depende más de las tendencias de los péptidos que de las propiedades especificas del amortiguador utilizado. La Figura 3(b) muestra la frecuencia del resonador con respecto a la capa adsorbida para diferentes combinaciones de SP2, SNl, LP4 y LN3 (a decir, SP2/SN1, SP2/LN3, LP4/SN1 y LP4/LN3) en 10 mM fosfato de sodio, pH 7.4 y 1 mM DTT (las lineas simplemente conectan los puntos de datos experimentales) . Cada una de estas combinaciones involucró un polipéptido negativo y un polipéptido positivo, como es requerido por ELBL. La Figura 3(c) muestra un gráfico de masa adsorbida calculada con respecto a la cantidad de capas para SNl y LP4 en 10 mM Tris-HCl, pH 7. y 1 mM DTT (calculado para datos experimentales utilizando la ecuación de Sauerbrey) . La masa adsorbida total, aproximadamente 5 µg, corresponde aproximadamente a 1 nmol de péptido. La ecuación utilizada para este cálculo fue Am = - 0.87 -1CT9 Af, donde m es masa en gramos y / es frecuencia en Hz (ver Lvov, Y., Ariga, K. , Ichinose, I., y Kunitake, T. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:6117 y Sauerbrey, G. (1959) Z. Physik 155:206, de los cuales ambos se incorporan aquí por referencia en su totalidad) . El grosor de la película, d, se estima como d = - 0.016?/, donde d es nm (ver Yuri Lvov, "Electrostatic Layer-by-Layer Assembly of Proteins and Polyions" en Proteín Architecture : Interfacial Molecular Assembly and Immobilizatlon Biotechnology, (Y. Lvov & H. Mohwald eds . , 2000) (New York: Dekker, 2000) pp. 125-167, que se incorpora aquí por referencia). La línea en la Figura 3(c) es un ajuste lineal a los puntos de datos experimentales. La linealidad de los datos es un indicador probable de un ensamblaje regular y preciso durante la adsorción y una densidad aproximadamente uniforme de los polipéptidos en cada capa adsorbida. La adsorción ocurrió con un desplazamiento de frecuencia de - 610 ± 60 Hz (cationes) o - 380 + 40 Hz (aniones) . El crecimiento lineal de masa de polipéptido depositado indica la capacidad de repetición de los pasos de adsorción al inicio del proceso de ensamblaje y el éxito general del proceso de fabricación de multicapas. iv. Conclusiones Los resultados anteriores muestran que los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención son adecuados para ELBL, a pesar de significativas diferencias cualitativas de PSS y PAH, los homopolímeros flexibles tienen 1 carga por unidad de longitud a pH 7.4. La carga por unidad de longitud en poli-L-lisina y ácido poli-L-glutámico es 1 a pH 7.4, al igual que con PSS y PAH, pero ambos de estos polipéptidos tienen una notable tendencia a formar una estructura -helicoidal en diversas condiciones, haciéndolos sustancialmente menos adecuados para el ensamblaje multicapa cuando se desea un control sobre una estructura de película delgada. Sin embargo, los polipéptidos monodispersos de la presente invención le permiten al practicante saber, en forma bastante precisa, la estructura del material que se está utilizando para ELBL. Más aún, las preparaciones comerciales usuales de poli-L-lisina y ácido poli-L-glutámico son polidispersas, y poli-L-lisina, ácido poli-L-glutámico, PSS y PAH provocan una respuesta inmunitaria (es decir, son inmunogénicas ) en humanos. Debido a que los polipéptidos diseñados se adsorben fácilmente en una superficie con carga opuesta, como se demuestra por el experimento, no hay necesidad de una capa "precursora". Como se sabe en la técnica, las capas "precursoras" se depositan sobre un sustrato para potenciar la adsorción de sustancias menos adsorbentes. La falta de una capa precursora potencializa la biocompatibilidad de las películas de poliión debido a que los polímeros comúnmente utilizados como precursores son inmunogénicos o permiten un control menos preciso sobre la estructura polimérica o la estructura de la película de lo que lo hacen los polipéptidos diseñados. Las capas múltiples de los polipéptidos diseñados son estables al pH de sangre humana, 7.4. Por lo tanto, las capas múltiples deben ser útiles para una amplia gama de aplicaciones biológicas. La adsorción de los polipéptidos diseñados, cada uno con menos de 1 carga por residuo, está esencialmente completa en un periodo menor a 10 minutos a 2 mg/ml y baja fuerza iónica. Esto implica que estos polipéptidos pueden utilizarse para formar películas multicapa en forma rápida con facilidad relativa. La deshidratación de la película peptídica con N2(g) luego de la deposición de cada capa no impidió el ensamblaje. La deshidratación se lleva a cabo para obtener una medición exacta de la frecuencia QCM, pero no se requiere para el ensamblaje. Los experimentos del ensamblaje de la película se llevaron a cabo a una menor fuerza iónica que la sangre, pero el proceso proporciona un resultado cualitativamente similar a una mayor fuerza iónica. La principal diferencia es la cantidad de péptido depositado por capa de adsorción—mientras mayor es la fuerza iónica, mayor será la cantidad del péptido depositado. Esto se ilustra en el gráfico de la Figura 7, que muestra la cantidad de material depositado como función de fuerza iónica—los péptidos utilizados fueron ácido poli-L-glutámico y poli-L-lisina . La frecuencia resonante QCM se gráfica con respecto a una capa de adsorción. La masa molecular promedio de poli-L-glutamato es de 84,600 Da, mientras que de poli-lisina es de 84,000 Da. La concentración peptidica utilizada para el ensamblaje fue de 2 mg/ml. Los datos indican que la concentración de sal (fuerza iónica de solución) influye en el ensamblaje de la película delgada. En términos generales, la cantidad de material depositado por capa aumenta con la fuerza iónica en el intervalo de 0 - 100 mM NaCl. Al igual que con el carácter esencial de ELBL, los polipéptidos diseñados parecen no depender de la elección de amortiguador en condiciones de carga neta relativamente elevada por unidad de longitud y baja fuerza iónica, se esperan resultados cualitativamente similares con la fuerza iónica de sangre humana. Por lo tanto, la elección de amortiguador no deberá alterar fundamentalmente la estabilidad de las capas múltiples en su ambiente objetivo. Sin embargo, si la elección de amortiguador afecta la estabilidad de las capas múltiples, el mecanismo "estabilizador" estaría disponible como una característica de diseño para estabilizar la cápsula. La aparentemente mayor deposición de polipéptidos positivos que negativos puede resultar de una mayor carga por unidad de longitud en los polipéptidos positivos a pH 7.4. El material depositado en cada capa probablemente corresponda al requerido para la neutralización de la carga de la superficie subyacente. Las interacciones hidrófobas también podrían ayudar a explicar esta característica del comportamiento de adsorción. Los cálculos usuales para el grosor de la película delgada de proteínas y otros polímeros es probablemente inválido para los polipéptidos cortos (el grosor calculado es de 60-90 nm, pero la longitud sumada de los 10 polipéptidos es de aproximadamente 120 nm) . Esto probablemente da como resultado una mayor densidad de empacamiento de los péptidos relativamente cortos sobre la superficie de adsorción; el resultado también es consistente con el descubrimiento de que el grosor de la película varía con la fuerza iónica, ya que ocurrirán cambios en las propiedades estructurales de un polímero y la detección de cargas mediante iones reduce la repulsión de cargas dentro de la capa entre los péptidos adsorbidos. El grosor de la película delgada de polipéptido diseñado mencionada aquí se estima en 20-50 nm . Se podrían automatizar varios aspectos del diseño y ciclos de fabricación. Por ejemplo, se puede utilizar un algoritmo computarizado para optimizar la estructura primaria de péptidos para ELBL al comparar las propiedades peptídicas pronosticadas con las propiedades físicas observadas, incluyendo estructura en solución, comportamiento de adsorción y estabilidad de la película a pH extremo. Más aún, el proceso de ensamblaje de película polipeptídica puede mecanizarse, una vez que se hayan determinado suficientemente los detalles de las diversas etapas.

Ejemplo 2—Experimentos que involucran los polipéptidos diseñados de novo que contienen cisteina b . Polipéptidos Los polipéptidos utilizados fueron: Tyr Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys (SEQ ID NO: 5) Tyr Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu (SEQ ID NO: 6) A diferencia de los otros polipéptidos utilizados en los experimentos descritos aquí, estos dos no fueron diseñados utilizando la información del genoma humano; fueron diseñados de novo para el único propósito de evaluar la función de la formación de uniones disulfuro en la estabilización de la película polipeptídica . SEQ ID NO: 5 tiene una magnitud de carga neta de 16/32 (0.5) a pH 7; y SEQ ID NO: 6 tiene una magnitud de carga neta de 16/32 (0.5) a pH 7. En ambos casos, la magnitud de la carga neta es mayor o igual que aproximadamente la mitad de la longitud total del polipéptido de la primera capa a pH 7. c . Procedimientos Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente . Todos los experimentos de ensamblado utilizando QCM se llevaron a cabo en las mismas condiciones, excepto que las muestras que experimentaron oxidación se deshidrataron utilizando aire en vez de gas nitrógeno. Las condiciones de ensamblaje fueron 10 mM Tris-HCl, 10 mM DTT, pH 7.4. La concentración nominal del péptido fue 2 mg/ml. La cantidad de capas formadas fueron 14. Las condiciones de estabilización de disulfuro para las muestras oxidantes fueron 10 mM Tris-HCl, 1% DMSO, saturación de agua con aire, pH 7.5. La duración del paso de "estabilización" fue de 6 horas. Las condiciones para las muestras reductoras fueron 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, saturación de agua con nitrógeno, pH 7.5. La duración de este paso fue de 6 horas. Todos los experimentos de desensamble utilizando QCM se llevaron a cabo en las mismas condiciones, excepto que las muestras oxidantes se secaron utilizando aire en vez de nitrógeno. Las condiciones de desensamble fueron 10 mM KC1, pH 2.0. Las muestras se enjuagaron con agua desionizada durante 30 segundos antes de secarse. Se llevaron a cabo tres diferentes tipos de experimento: (1) Reducción—sin tratamiento: el desensamble se llevó a cabo inmediatamente después del ensamblaje; (2) Reducción—6 horas, como se describe anteriormente para las muestras reductoras; y (3) Oxidación—6 horas, como se describe anteriormente para las muestras oxidantes. d. Resultados Los resultados se ilustran en la Figura 10. En los primeros dos experimentos (ambos reductores), todo el material depositado (100%) se desensambló en 50 minutos. A diferencia, en el experimento oxidante, una cantidad sustancial de material permaneció luego de una incubación sustancial del resonador QCM recubierto con la película peptídica a pH 2 durante 5 horas. La estabilidad de las películas polipeptídicas a un pH ácido se determina mediante condiciones de ensamblaje; de esta forma, la estabilidad de la cápsula o película es una característica de diseño que es posible mediante el uso de los polipéptidos como polielectrolitos para ELBL. e. Conclusiones Las fuerzas electrostáticas tienen una función fundamental para mantener conjuntamente las capas de cargas opuestas de los polipéptidos diseñados. A un pH ácido, la carga neta de uno de los péptidos se neutraliza y la película polipeptídica se desensambla debido a la repulsión electrostática. Las condiciones reductoras evitan la formación de uniones disulfuro. Por lo tanto, la atracción electrostática entre las capas es la única fuerza de unión para estabilizar las capas en estas condiciones. A diferencia, en condiciones oxidantes, se forman uniones disulfuro. A un pH ácido, las uniones disulfuro inhiben el desensamble de la película. Los resultados indican que la estabilidad de la capa a un pH ácido está directamente afectada por la formación de uniones disulfuro dentro de las capas o entre las capas—es decir, entre moléculas en la misma capa, entre moléculas en capas adyacentes o ambas. Esto se ilustra mediante los resultados que se muestran en la Figura 10—debido a la estabilización disulfuro, más de 30% de , la película permanece estable a un pH ácido, a pesar de la repulsión electrostática a una fuerza iónica relativamente baja. Los péptidos con más residuos cisteína se anticipan para mejorar aún más la eficiencia de la estabilización disulfuro. Más aún, el ajuste de las condiciones del ensamblaje de péptidos será un aspecto importante para la manipulación de películas para que tengan las propiedades biológicas, químicas así como físicas deseadas .

Ejemplo 3—Experimentos que involucran polipeptidos diseñados que contienen cisteina f. Materiales Los elementos esenciales de este experimento fueron un instrumento de microbalance por cristal de cuarzo; resonadores recubiertos de plata (frecuencia resonante a 9 MHz) ; el péptido (LN3) negativo de 48 residuos (SEQ ID NO: 4); y un péptido positivo de 48 residuos nombrado "SP5" de la siguiente secuencia : Tyr Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His (SEQ ID NO: 7) Al igual que con los otros péptidos diseñados mencionados anteriormente en la Parte (D) (1) , el SP5 se diseñó utilizando el proceso descrito anteriormente en la Parte (A) (1) para analizar la secuencia aminoacidica de la proteína lactotransferrina de sangre humana (gi | 4505043) . El amortiguador de ELBL fue 10 mM Tris, pH 7.4 , 10 mM NaCl y 1 mM DTT . El amortiguador del desensamble fue 10 mM KC1, pH 2. Se prepararon soluciones peptídicas de 2 mi para SP5 y LN3 al agregar 4 mg de cada péptido a 2 mi de la solución amortiguadora anterior y ajustándose el pH de cada solución a 7.4; la concentración peptídica fue de 2 mg-ml-1. g. Procedimiento para monitorizar el ensamblaje de capas polipeptidicas en resonadores QCM Los procedimientos de reducción fueron los siguientes: (1) La frecuencia del resonador se cuantifica y registra antes de la adsorción del péptido; (2) El resonador se sumerge en la solución del péptido SP5 durante 20 minutos; (3) El resonador se sumerge en la solución de enjuague SP5 durante 30 segundos; (4) El resonador se retira de la solución de enjuague y se seca utilizando gas nitrógeno; (5) Se registra la frecuencia resonante QCM del resonador; (6) El resonador se sumerge en la solución de péptido LN3 durante 20 minutos; (7) El resonador se sumerge en la solución de enjuague LN3 durante 30 segundos; (8) El resonador 1 se retira de la solución de enjuague y se seca utilizando gas nitrógeno; (9) Se registra la frecuencia resonante QCM del resonador; (10) Se repiten los Pasos 2 a 9 hasta que se adsorben las 16 capas en el resonador. Los procedimientos oxidantes fueron los mismos que los procedimientos reductores, excepto que el resonador se enjuagó en agua desionizada en vez del amortiguador SP5 o el amortiguador LN3 y se secó con aire en vez de nitrógeno antes de cada medición. h. Procedimientos de estabilización Los procedimientos reductores fueron los siguientes: El resonador se colocó en una solución acuosa que contiene 1 mM DTT durante 6 horas. DTT, un agente reductor, inhibió la formación de uniones disulfuro. Los procedimientos oxidantes fueron los siguientes: El resonador se colocó en una solución acuosa saturada con aire que contiene 1% DMSO durante 6 horas. DMSO, un agente oxidante, promovió la formación de uniones disulfuro. i . Desensamble en resonador i . Soluciones Las condiciones reductoras fueron las siguientes: 10 mM KC1, 1 mM DTT, pH 2. Las condiciones- oxidantes fueron las siguientes: 10 mM KC1, 20% DMSO, pH 2. ii . Procedimiento para la despolimerización Los procedimientos reductores fueron los siguientes: (1) Se registra y se cuantifica mediante QCM la frecuencia resonante inicial del resonador; (2) El resonador se sumerge en la solución reductora de despolimerización durante 5 minutos; (3) El resonador se enjuaga en solución de amortiguador reductor durante 30 segundos; (4) El resonador se seca con N2 gaseoso; (5) Se registra la frecuencia resonante del resonador y se cuantifica mediante QCM; (6) Se repiten los Pasos 2 al 5 para los tiempos de lectura de 5, 10, 15, 20, 30, 60 y 90 minutos. Los procedimientos oxidantes fueron los mismos que los procedimientos reductores, excepto que el enjuague del resonador se llevó a cabo en agua desionizada saturada con aire en lugar de un amortiguador reductor.

. Resultados La Figura 8 muestra un incremento aproximadamente lineal en la masa depositada durante el ensamblaje de la película delgada de SP5 y LN3. Ambos resonadores muestran una deposición de masa casi idéntica durante el proceso del ensamblaje, a pesar de las diferencias en las condiciones de ensamblaje. La Figura 9 muestra el porcentaje de material restante durante la despolimerización de la película. Las capas sometidas a condiciones oxidantes muestran una pérdida mínima de material a un pH ácido con casi 90 a 95% de retención de masa. A diferencia, las capas sometidas a condiciones reductoras perdieron casi la totalidad del material pelicular dentro de los primeros 5 minutos a exposición a un pH ácido. k. Conclusiones Los resultados demuestran que a un pH ácido, las uniones disulfuro evitan la degeneración de la capa y mantienen las capas firmemente unidas. La estabilidad de la capa a un pH ácido está directamente afectada por la formación de uniones disulfuro dentro de las capas y/o entre las capas. La formación de uniones disulfuro es dependiente de la concentración y proximidad de los residuos cisteína entre sí. Al aumentar la concentración por unidad de longitud de cadena del polipéptido se influye directamente en la formación de uniones disulfuro y en la estabilidad de la película delgada. El aumento de la fuerza iónica de las soluciones de amortiguador utilizadas para el ensamblaje de la película influye en la concentración de cisteina en la película al aumentar la cantidad de material depositado por ciclo de adsorción y el grosor de cada capa. La mayor cantidad de aminoácidos cisteina en una sola capa aumentaría así la cantidad de uniones disulfuro formadas y, al oxidarse, aumentan la estabilidad de la película.

Ejemplo . Películas con polipéptidos que comprenden un dominio funcional R6D donde la magnitud de la densidad de carga lineal por residuo es de aproximadamente 0.75. En una modalidad, la región funcional de un polipéptido compuesto es una secuencia RGD donde la densidad de carga del péptido compuesto es de aproximadamente 0.75. La secuencia RGD une la porción extracelular de la proteína receptora, integrina, y promueve así la adhesión celular. Los diseños de péptidos de muestra son los siguientes: KKKAKKKGKKKAKKKGRGDKKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 8) EEEAEEEGEEEAEEEGRGDEEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO: 9) En este ejemplo, el polipéptido de SEQ ID NO: 8 es un polipéptido de carga positiva que tiene una región funcional de RGD, una primera región de adsorción de superficie de KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 10) y una segunda región de adsorción de superficie de KKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 11) . La magnitud de la carga neta por residuo a pH 7 del péptido compuesto es +26/35 o 0.74. El polipéptido de SEQ ID NO: 9 es un polipéptido de carga negativa que tiene una región funcional de RGD, una primera región de adsorción de superficie de EEEAEEEGEEEAEEEG (SEQ ID NO: 12) y una segunda región de adsorción de superficie de EEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO: 13) . La magnitud de la carga neta por residuo a pH 7 del péptido compuesto es -26/35 o -0.74. Se han sintetizado diversos péptidos que contienen la secuencia RGD y se ha estudiado su adecuabilidad para el ensamblaje de películas multicapa. También se ha estudiado el efecto de la inclusión de secuencias RGD en películas de multicapa polipeptídica sobre la fijación y proliferación de diferentes tipos de células de mamífero. Las películas multicapa que comprenden 5 bicapas de (secuencia positiva) y (secuencia negativa) se depositan en una placa de cuarzo. La concentración del polipéptido compuesto para la adsorción de la capa es 2 mg-ml"1 en una solución acuosa a pH 7. El tiempo de adsorción fue de 20 minutos. Se enjuagan las placas de cuarzo durante 1 minuto en agua pura antes de los subsiguientes ciclos de adsorción para retirar el material débilmente unido. Luego de la deposición de cada capa, se secan los estratos para el ensamblaje de la película en un flujo de N2 gaseoso. Luego se cuantifica mediante espectroscopia de rayos ultravioleta la masa óptica del péptido depositado. La Figura 16 compara el efecto de la proliferación celular al incluir RGD en péptidos utilizados para elaborar la película multicapa. La tecnología es potencialmente útil para cultivo tisular y celular in vitro para el propósito a largo plazo de la medicina regenerativa .

E emplo 5 : Películas con polipéptidos que comprenden un dominio funcional RGD donde la magnitud de la densidad de carga lineal por residuo es de aproximadamente 0.4. En una modalidad, la región funcional de un polipéptido compuesto comprende una secuencia RGD donde la densidad de carga del péptido compuesto es ~0. . Los diseños del péptido de muestras son los siguientes: AAKAKAKGKAKAKAKGRGDKAKAKAKGKAKAKAAT (SEQ ID NO: 14) AAEAEAEGEAEAEAKGRGDKAEAEAEGEAEAEAAY (SEQ ID NO: 15) En este ejemplo, el polipéptido de SEQ ID NO: 14 es un polipéptido con carga positiva que tiene una región funcional de RGD, una primera región de adsorción de superficie de AAKAKAKGKAKAKAKG (SEQ ID NO: 16) y una segunda región de adsorción de superficie de KAKAKAKGKAKAKAAY (SEQ ID NO: 17). La magnitud de carga neta por residuo a un pH neutro del péptido compuesto es +14/35 o +0.4. El polipéptido de SEQ ID NO: 15 es un polipéptido con carga negativa que tiene una región funcional de RGD, una primera región de adsorción de superficie de AAEAEAEGEAEAEAEG (SEQ ID NO: 18) y una segunda región de adsorción de superficie de EAEAEAEGEAEAEAAY (SEQ ID NO: 19) . La magnitud de la carga neta por residuo a pH 7 del péptido compuesto es 14/35 o -0.4. Se debe observar que la magnitud de la carga neta por residuo de un péptido compuesto se puede determinar al cambiar la estructura de las regiones de adsorción de superficie o de las regiones funcionales. En el ejemplo actual, la carga neta del péptido compuesto del ejemplo previo se cambia al cambiar de estructura únicamente de las regiones de adsorción de superficie. En principio, es posible utilizar el mismo método para controlar la magnitud de la carga neta por residuo en cualquier péptido compuesto. Sin embargo, en este método, tanto las regiones de adsorción de superficie como las regiones funcionales deberán ser indistintamente solubles para que sea soluble el péptido compuesto.

Ejemplo 6: Péptido compuesto donde la región funcional comprende dos dominios funcionales, donde existe una región de adsorción de superficie en el N-término de la región funcional y en el C- término . En este ejemplo, los dominios funcionales son un dominio de homología 2 Ser (SH2, por sus siglas en inglés), por ejemplo, a partir de tensina humana y un dominio de unión a fosfotirosina (PTB), por ejemplo, a partir de tensina humana. Estos dominios unen proteínas especificas que se fosforilan en tirosina. Un ejemplo de un péptido compuesto que comprende los dominios indicados de tensina humana es el siguiente: KKKAKKKGKKKAKKKGKYWYKPEISREQAIALLKDQEPGAFI IRDSHSFRGAYGLAMKV SSPPPTIMQQNKKGDMTHELVRHFLIETGPRGVKLKGCPNEPNFGSLSALVYQHSI IPLALPCK LVIKYWYKPEISREQAIALLKDQEPGAFIIRDSHSFRGAYGLAMKVSSPPPTI QQNKKGD TH ELVRHFLIETGPRGVKLKGCPNEPNFGSLSALVYQHSI I PLALPCKLVIKKKAKKKGKKKAKKK Y (SEQ ID NO: 20) Las regiones de adsorción de superficie son iguales que en SEQ ID NO: 10 y en SEQ ID NO: 11. Las secuencias del dominio SH2 y del dominio PTB están disponibles con el número de acceso NP_072174 a partir del National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para Información Biotecnológica) : SH2 = KYWYKPEISR EQAIALLKDQ EPGAFIIRDS HSFRGAYGLA MKVSSPPPTI QQNKKGDMT HELVRHFLIE TGPRGVKLKG CPNEPNFGSL SALVYQHSII PLALPCKLVI (SEQ ID NO: 21) PTB = VLFVNSVDME SLTGPQAISK ATSETLAADP TPAATIVHFK VSAQGITLTD NQRKLFFRRH YPLNTVTFCD LDPQERKWMK TEGGAPAKLF GFVARKQGST TDNACHLFAE LDPNQPASAI VNFVSKVMLN AGQKR (SEQ ID NO: 22) Hemos sintetizado un gen que corresponde al dominio SH2 en tensina humana y un gen que corresponde al dominio PTB en tensina humana, hemos clonado los genes en un hospedero bacteriano, hemos sobreexpresado los genes, purificado las proteínas recombinantes y caracterizado las diversas propiedades físicas de los dominios. En una modalidad, las películas multicapa . que comprenden 5 bicapas del péptido bioactivo indicado y poli (ácido L-glutámico) se depositan sobre una oblea de silicio para una caracterización de superficie y una placa de cuarzo para monitorizar el ensamblaje de la película. La concentración polipeptídica para la adsorción de la capa es 2 mg-ml-1 en una solución acuosa a pH 7. El tiempo de adsorción es de 20 minutos. Los sustratos se enjuagan durante 1 minuto en agua entre los subsiguientes ciclos de adsorción para retirar el material débilmente unido. Luego de la deposición de cada capa, los sustratos se secan en un flujo de N2 gaseoso. Luego la masa óptica del péptido depositado en cuarzo se cuantifica mediante espectroscopia de luz ultravioleta y se caracteriza la morfología de superficie de la película sobre la oblea de silicón mediante microscopía de fuerza atómica. La tecnología es potencialmente útil para el cultivo tisular y celular in vitro para el propósito a largo plazo de la medicina regenerativa . La incorporación del dominio SH2 en un péptido bioactivo como se define aquí permite que la película multicapa se una a los péptidos fosfotirosinilo . La tecnología es potencialmente útil para propósitos de dominio.

Ejemplo 7 : Polipéptido compuesto que comprende una sola región funcional y una sola región de adsorción de superficie en el N- término del polipéptido. En este ejemplo, la región funcional es un dominio funcional conocido de una proteina, por ejemplo, el dominio de la proteina tirosina fosfatasa (PTP) de la auxilina humana: KKKAKKKGKKKAKKKGLKDTLKDTSSRVIQSVTSYTKGDLDFTYVTSRIIVMSFPLDNVDIG FRNQVDDIRSFLDSRHLDHYTVYNLSPKSYRTAKFHSRVSECSWPIRQAPSLHNLFAVCRNMYNWLL QNPKNVCWHCLDGRAASSILVGA FIFCNLYSTPGPAIRLLYAKRPGIGLSPSHRYLGYMCDLLA (SEQ ID NO: 23) La región de adsorción de superficie es igual que en SEQ ID NO: 10. La secuencia del dominio PTP está disponible del National Center for Biotechnology Information en el acceso 075061: Dominio PTP: LKDTLKDTSSRVIQSVTSYTKGDLDFTYVTSRIIVMSFPLDNVDIGFRNQVDDIRSFLDSRH LDHYTVYNLSPKSYRTAKFHSRVSECSWPIRQAPSLHNLFAVCRN YNWLLQNPKNVCWHCLDGRA ASSILVGAMFIFCNLYSTPGPAIRLLYAKRPGIGLSPSHRRYLGYMCDLLA (SEQ ID NO: 24) Ejemplo 8 : Polipéptido compuesto que comprende dos regiones funcionales, donde hay regiones de adsorción de tres superficies una en el N-término y otra en el C-término del péptido compuesto una entre ambas regiones funcionales y donde hay dos diferentes regiones funcionales para la glucosilación . Una estructura peptidica representativa es la siguiente: SAR-región funcional-SAR-región funcional-SAR donde, como anteriormente, el SAR es un motivo y por lo tanto adecuado para la adsorción de superficie, por ejemplo, RRRARRR (SEQ ID NO: 25), y una región funcional contiene un sitio de reconocimiento para la glucosilación N-ligada, por ejemplo, GGNVSGG (SEQ ID NO: 26), y el otro para la glucosilación 0-ligada, por ejemplo, PPSSSPP (SEQ ID NO: 27) . La secuencia aminoacidica de un péptido compuesto representativo es: RRRARRRGGNVSGGRRRARRRPPSSSPPRRRARRR (SEQ ID NO: 28) La magnitud de la carga neta por residuo a pH 7 del polipéptido compuesto es +18/35 «+0.5. En este caso, la película multicapa se construye a partir del péptido positivo indicado y un péptido negativo adecuado, por ejemplo: EEEAEEEGEEEAEEEGEEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO: 29) Ejemplo 9: Péptido compuesto con una región funcional, donde hay- una sola región de adsorción de superficie en el C-término del péptido compuesto y donde hay una región funcional que comprende una secuencia peptidica que se sabe tiene actividad antimicrobiana . Una estructura peptidica representativa es la siguiente: Región funcional-SAR donde, como antes, SAR es una región de adsorción de superficie adecuada, por ejemplo, KKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 11), y la región funcional contiene la secuencia de histatina 5, viz., DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY (SEQ ID NO: 30) . La secuencia aminoacidica de un péptido compuesto representativo es: RRRARRRGGNVSGGRRRARRRPPSSSPPRRRARRR (SEQ ID NO: 31) La magnitud de la carga neta a pH 5.5 por residuo de la secuencia aminoacidica de este péptido compuesto representativo es +24/39 = +0.6. La película multicapa en este caso, se construye a partir del péptido positivo indicado y un péptido negativo adecuado, por ejemplo, SEQ ID NO: 29.

Ejemplo 10: Péptido compuesto con una sola región funcional, donde hay regiones de adsorción de dos superficies , una en el N- término y otra en el C-término de la región funcional, y donde la región funcional comprende dos sitios de reconocimiento específicos de proteasa y dos ligadores, los cuales cada uno es un solo residuo glicina. En una modalidad, los sitios de reconocimiento de proteasa son para enterocinasa y trombina: SAR-reconocimiento de enterocinasa-ligador-reconocimiento de trombina-ligador-SAR en donde en cada caso SAR representa una región de adsorción de superficie adecuada, por ejemplo, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11. La región funcional está codificada, por ejemplo, en forma de DDDDKGLVPRGSG (SEQ ID NO: 32), donde DDDDK (SEQ ID NO: 33) es un sitio de reconocimiento de enterocinasa, G es un ligador, LVPRGS (SEQ ID NO: 34) es un sitio de reconocimiento de trombina y G es un ligador. La secuencia aminoacidica de un péptido compuesto representativo es: KKKAKKKGKKKAKKKGDDDDKGLVPRGSGKKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: ) La magnitud de la carga neta por residuo a un pH neutro del péptido compuesto es +22/46 « +0.5. La película multicapa, en este caso, se construye a partir del péptido positivo indicado y un péptido negativo adecuado, por ejemplo, SEQ ID NO: 29.

Ejemplo 11: Péptido compuesto con dos regiones funcionales, donde hay regiones de adsorción de tres superficies , una en el N-término y otra en el C-término del péptido compuesto y una entre ambas regiones funcionales, y donde hay dos regiones funcionales idénticas para la formación de entrecruzamiento de péptidos naturales .

Una estructura peptidica representativa es la siguiente: SAR-región funcional-SAR-región funcional-SAR donde, como anteriormente, SAR es una región de adsorción de superficie adecuada, por ejemplo, EEEAEEE (SEQ ID NO: 36), y la región funcional contiene una cantidad especifica de residuos Cys, por ejemplo, GGCGGCGG (SEQ ID NO: 37) . La secuencia aminoacidica de un péptido compuesto representativo es: EEEAEEEGGCGGCGGEEEAEEEGGCGGCGGEEEAEEEY (SEQ ID NO: 38) La magnitud de la carga neta por residuo a pH 7 del péptido compuesto es ~0.5. En este caso, la película multicapa se construye a partir del péptido negativo indicado y un péptido positivo adecuado, por ejemplo: KKKAKKKGKKKAKKKGKKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 39) Ejemplo 12 : Polipéptido compuesto que comprende una sola región funcional y una sola región de adsorción de superficie en el C- término del polipéptido. En este ejemplo, la región funcional es un dominio funcional conocido a partir de una proteína, por ejemplo, el dominio BAG del National Center for Biotechnology Information con acceso AAP06461: Secuencia BAG-EEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO: 40) donde "secuencia BAG" representa la secuencia aminoacidica del dominio BAG de una proteina hipotética de Schistosoma japonicum: Secuencia BA6 SLQPEIDRFDGTPHSKEFKCLMENLEQLILSLDNLETDGNVEFRTMRRDAVKEIQQLME MLDYRSLISSQNDEVLAD (SEQ ID NO: 41) La región de adsorción de superficie es igual que en SEQ ID NO: 13. El uso de términos "un/una" y "una/uno" y "el/la" y referentes similares (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) deberán interpretarse por abarcar tanto el singular como el plural, a menos que se indique otra cosa o esté claramente contradicho en el contexto. Los términos primero, segundo, etc., como se utilizan aquí, no pretenden denotar ningún ordenamiento particular, ¦ pero simplemente por conveniencia, denotar una pluralidad de, por ejemplo, capas. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye", y "que contiene" deberán interpretarse como términos no limitados de antemano (es decir, que signifiquen "incluyendo, entre otras cosas") a menos que se indique otra cosa. La mención de los intervalos de valores simplemente pretenden servir como un método corto para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique otra cosa aquí, y cada valor separado se incorpora en la especificación como si se hubiera mencionado individualmente aquí. Los puntos terminales de todos los intervalos se incluyen dentro del intervalo y son indistintamente combinables. Todos los métodos descritos aquí se pueden llevar a cabo en un orden adecuado a menos que se indique otra cosa aquí o a menos que esté claramente contradicho en el contexto. El uso de cualquier y todos los ejemplos o el lenguaje ejemplificante (por ejemplo, "tal como"), pretenden simplemente ilustrar mejor la invención y no son una limitación en cuanto al alcance de la invención a menos que se reivindique otra cosa. No deberá interpretarse ni una palabra en la especificación por indicar ningún elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención como se utiliza aquí. Son posibles otras modalidades de la invención y sus modificaciones se pueden llevar a cabo sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, la descripción detallada anterior no pretende limitar la invención. Más bien, el alcance de la invención está definido por las reivindicaciones anexas.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para . elaborar una película multicapa, donde la película comprende una primera capa y una segunda capa, donde las capas adyacentes comprenden polielectrolitos de carga opuesta, caracterizado porque el método comprende: unir covalentemente una o más regiones de adsorción de superficie y una o más regiones funcionales para formar, un polipéptido compuesto, donde el polipéptido compuesto y una o más regiones de adsorción de superficie tienen la misma polaridad, donde una o más regiones de adsorción de superficie comprenden uno o más motivos de secuencia aminoacídica que comprende de 5 a 15 residuos aminoacídicos y que tiene una magnitud de carga neta por residuo a un pH neutro mayor o igual a 0.4, y donde una o más regiones funcionales comprenden de 5 hasta aproximadamente 250 residuos aminoacídicos, donde el polipéptido compuesto no es un homopolímero, tiene al menos 15 residuos aminoacídicos de longitud y tiene una solubilidad acuosa dentro del intervalo de pH 4 a 10 mayor a 50 µq/ml; y depositar el polipéptido compuesto sobre un sustrato o la segunda capa para formar una primera capa; donde la segunda capa comprende un polielectrolito de segunda capa que comprende un material policatiónico o un material polianiónico con un peso molecular mayor a 1,000 y al c menos 5 cargas por molécula y una carga opuesta al polipéptido de la primera capa.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la deposición comprende depositar un polipéptido compuesto sobre un sustrato, y además comprende depositar el polielectrolito de la segunda capa en la primera capa .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una o más regiones de adsorción de superficie y una o más regiones funcionales se producen mediante síntesis en fase de solución, síntesis en fase sólida o producción de péptidos recombinantes .
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido compuesto tiene una solubilidad acuosa mayor o igual que aproximadamente 1 mg/ml.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región funcional comprende un motivo funcional que comprende de 3 hasta aproximadamente 50 residuos aminoacídicos y donde el polipéptido compuesto tiene una magnitud de carga neta por residuo a un pH neutro mayor o igual a 0.4.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región funcional es un dominio funcional que comprende de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 250 residuos aminoacídicos.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el dominio funcional tiene una solubilidad híbrida a pH 4 a 10 mayor que 50 µg/ml.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el dominio funcional tiene una solubilidad híbrida a pH 4 a 10 mayor o igual a 1 mg/ml.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el material policatiónico comprende una poliamina .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el material polianiónico comprende un ácido nucleico, alginato, carragenina, furcelarano, pectina, xantano, ácido hialurónico, heparina, sulfato de heparano, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato dextrano, ácido poli (met ) acrílico, celulosa oxidada, carboximetilcelulosa, polisacáridos ácidos y crosmarmelosa, copolímeros y polímeros sintéticos que contienen grupos carboxilo colgantes o una combinación que comprende uno o más de los materiales polianiónicos anteriores .
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la película está en forma de una microcápsula.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la microcápsula comprende un núcleo y el núcleo comprende, una proteína, un fármaco o una combinación de éstos.