CN101309670B - 多肽膜及方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种制膜方法，该方法包括：将第一层聚电解质沉积到基底表面上，形成第一层；以及将第二层聚电解质沉积到第一层聚电解质上，形成第二层。第一层聚电解质或第二层聚电解质，或者这两层聚电解质在高分子沉淀剂存在条件下被沉积。第一层聚电解质和第二层聚电解质的净电荷极性相反。本文还公开了在聚电解质多层膜制备过程中改善生物活性分子留置的方法。

Description

多肽膜及方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2005年11月14日提交的、申请号为60/736,723的美国临时申请的优先权，其全文通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及纳米工程多肽膜和微胶囊的制备过程及制作这类膜和微胶囊的方法。更具体地说，本发明涉及将功能性生物大分子封装到纳米工程多肽微胶囊内。
背景技术
聚电解质多层膜是由带相反电荷的聚电解质层交替构成的薄膜(如几纳米到几毫米厚)。在合适的基底上通过层叠组装，可以形成这种膜。静电层叠自组装工艺(“ELBL”)中，静电是聚电解质结合的物理基础。由于膜表面电荷密度符号在层连续沉积时发生反转，所以有可能形成积层膜。带相反电荷的聚离子的ELBL沉积的一般原理如图1所示。鉴于ELBL膜工艺的普遍性和相对简单的特点，可以将许多不同类型的聚电解质沉积到许多不同类型的表面上。多肽多层膜属于聚电解质多层膜，包含至少一个含带电多肽的层。多肽多层膜的主要优点是环保。ELBL膜还可以用于封装工艺。多肽膜和微胶囊例如应用在纳米反应器、生物感应器、人工细胞和药物释放载体等方面。
美国专利(公开号：20050069950)中最先阐述了将多肽加到多层膜内的设计原理。简单来说，一个多肽是否适用ELBL，与其净电荷和长度有关。适于ELBL的多肽最好含有一个或多个氨基酸基元，即，长度约5-15个氨基酸残基并且具有适于静电沉积用的合适线性电荷密度的连续氨基酸序列。可以采用不同的方法设计适于ELBL的多肽，如直接将多个氨基酸序列基元相互连接，或者用接头将多个氨基酸序列基元连起来。具有合适长度和电荷特性的多肽可以很容易地通过沉积形成一层或多层多肽多层膜。
蛋白质、肽和寡核苷酸都可能是潜在的治疗制剂。但这些生物分子在体内会受到各种不同降解机制的攻击。为延长功效或控释需要，将生物分子和其他生物活性分子封装到一个生物相容性环境内，不失为一种提高靶位点生物活性分子利用度的策略。在被生物分子包覆的基底上沉积多肽膜，同样也有可能延长该生物分子的功效，或者实现该分子的控释。利用静电层叠纳米组装工艺制成的聚电解质多层膜和微胶囊的稳定性高、具有可调控渗透性。
因此，仍然需要发明其他方法，将蛋白质等生物活性大分子直接而有效地留置在生物可降解工程多肽膜和微胶囊内。
发明内容
在一实施例中，一种制膜方法包括：将第一层聚电解质沉积到基底表面上，形成第一层，然后将第二层聚电解质沉积到第一层聚电解质上，形成第二层。在高分子沉淀剂存在条件下，将第一层聚电解质或第二层聚电解质沉积到基底上，或者将这两层聚电解质都沉积到基底上，第一层聚电解质和第二层聚电解质的净电荷极性相反。在另一实施例中，第一层聚电解质或第二层聚电解质含有，或者这两层聚电解质都含有赖氨酸、谷氨酸或其它在中性pH条件下具有带电侧链的氨基酸的同聚多肽。在另一实施例中，第一层聚电解质或第二层聚电解质含有，或者这两层聚电解质都含有设计多肽，其中所述设计多肽含有一个或多个第一氨基酸序列基元，所述一个或多个第一氨基酸序列基元由5-15个氨基酸残基组成，每个残基的净电荷数量大于或等于0.4；所述设计多肽不是同聚多肽，有至少15个氨基酸残基长，每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。
在另一实施例中，在制备聚电解质多层膜过程中改善生物活性分子功能留置的方法包括：将第一层聚电解质沉积到基底表面上，形成第一层，然后将第二层聚电解质沉积到第一层聚电解质上，形成第二层。在高分子沉淀剂存在条件下，将第一层聚电解质或第二层聚电解质沉积到基底上，或者将这两层聚电解质都沉积到基底上，第一层聚电解质和第二层聚电解质的净电荷极性相反；并且，基底含有生物活性分子。
下面通过附图和详细说明对上述和其他特征进行举例阐述。
附图说明
现参见附图所示的典型实施例：
图1是带相反电荷多肽的组装体示意图。
图2是葡萄糖氧化酶(GOx)被吸附到CaCO3或三聚氰胺甲醛(MF)粒子模板上的吸附力与葡萄糖氧化酶浓度和NaCl浓度的函数关系图。
图3表示在不含高分子沉淀剂、含40％PEG300和含50％PEG300条件下，聚(L-赖氨酸)/聚(L-谷氨酸)(PLL/PLGA)封装膜的沉积过程中CaCO3模板上所吸附GOx的损失与因洗涤液、聚(L-赖氨酸)(PLL)组装缓冲液和聚(L-谷氨酸)(PLGA)组装缓冲液中含有释放出的GOx而在280nm处产生的吸光度的函数关系图。
图4表示沉积溶液中含或不含50％PEG 300时，PLL/PLGA封装膜沉积过程中GOx在CaCO3模板上的留置情况。
图5是用分光光度法测定多肽微胶囊内GOx活性的反应示意图。
图6是被封装的GOx的活性测定值与多肽层数的函数关系图。
图7表示(a)模板溶解后微胶囊的共焦显微图像。左：荧光，右：亮视场；(b)胶囊的荧光密度图。左：负载胶囊，右：模板溶解前被包覆在内的核。
具体实施方式
本发明涉及聚电解质多层膜，尤其涉及一种制备聚电解质多层膜的新方法。在一实施例中，聚电解质多层膜含有生物活性分子。在另一实施例中，该膜含有一个或多个多肽层。
本文中，“层”是指厚度增加体，例如经过吸附步骤后基底上方厚度增加，形成膜。“多层”是指多个(即两个或两个以上)厚度增加体。“聚电解质多层膜”是指包含一个或多个由聚电解质构成的厚度增加体的膜。多层膜的各个层在沉积之后可能不再是离散的独立层。事实上，厚度增加体相互间，尤其是两个厚度增加体界面之间的物质可能会有明显混合。
“聚电解质”包括分子量大于1,000、每分子至少带5个电荷的聚阳离子或聚阴离子材料。合适的聚阳离子材料例如包括聚胺。聚胺例如包括多肽、聚乙烯胺、聚(氨基苯乙烯)、聚(氨基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基-甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯氯化物)、聚(甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化铵)、几丁质和包含前述至少一种或多种聚阳离子材料的组合。合适的聚阴离子材料例如包括多肽、核酸、海藻酸、卡拉胶、帚叉藻胶、果胶、黄原胶、透明质酸、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸葡聚糖、聚(甲基)丙烯酸、氧化纤维素、羧甲基纤维素、酸性多糖和交联羧甲基纤维素、含有侧链羧基的合成聚合物和共聚物，以及包含前述至少一种或多种聚阴离子材料的组合。
“氨基酸”是指多肽的结构单位。本文中，“氨基酸”包括20种常见的天然存在的L-氨基酸、其它所有天然氨基酸、所有非天然氨基酸和所有类氨基酸，如类肽(peptoid)。
“天然存在的氨基酸”是指20种常见的天然L-氨基酸，即甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和脯氨酸。
“非天然氨基酸”是指除20种常见天然L-氨基酸之外的氨基酸。非天然氨基酸可以是L-型或D-型。
“类肽”或N-取代的甘氨酸是指相应氨基酸单体的类似物，与相应氨基酸的侧链相同，但侧链是与氨基的氮原子相连，而不是与该残基的α碳原子相连。所以，聚类肽单体间的化学键不是肽键，可用来限制蛋白质水解。
“氨基酸序列”和“序列”是指有至少两个氨基酸长的多肽链的连续长度。
“残基”是指多聚体或寡聚体中的氨基酸；它是可形成多聚体的氨基酸单体的残基。多肽合成涉及脱水反应，也就是说，肽链上每增加一个氨基酸会失去一个水分子。
“氨基酸序列基元”是指含有n个残基的连续氨基酸序列，n是5-15。在一实施例中，氨基酸序列基元中每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。在另一实施例中，氨基酸序列基元中每个残基的净电荷数量大于或等于0.5。本文中，净电荷数量是指净电荷的绝对值，也就是说，所述净电荷可以是正电荷，也可以是负电荷。
“设计出的多肽”(以下简称“设计多肽”)是指含有一个或多个氨基酸序列基元的多肽，该多肽有至少15个氨基酸长，pH7.0时，相同极性的带电残基和与其极性相反的残基的数量差与多肽中残基总数的比值大于或等于0.4。换句话说，多肽中每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。在一实施例中，pH7.0时，相同极性的带电残基和与其极性相反的残基的数量差与多肽中残基总数的比值大于或等于0.5。换句话说，多肽中每个残基的净电荷数量大于或等于0.5。虽然多肽长度没有绝对上限，但总的来说，适于ELBL沉积的设计多肽的实际长度上限为1,000个残基。
“一级结构”是指多肽链中连续的线性氨基酸序列，“二级结构”是指多肽链中基本上规则的结构类型，通过非共价相互作用(通常为氢键)保持稳定。二级结构例如包括α-螺旋、β-折叠和β-转角。
“多肽多层膜”是指含有上述一条或多条设计多肽的膜。例如，多肽多层膜包括含设计多肽的第一层和含带有极性与该设计多肽相反的净电荷的聚电解质的第二层。例如，如果第一层的净电荷为负电荷，则第二层的净电荷为正电荷。第二层含有另一种设计多肽或另一种聚电解质。
“基底”是指一种固体材料，具有适于吸附水溶液中聚电解质的表面。基底表面基本上可以是平面、球形、棒状等任何形状。基底表面可以是规则或不规则的面。基底可以是晶体，可以是生物活性分子，其尺寸从纳米级到宏观级大小不等。另外，基底中也可以含一些微小的亚粒子。基底可以由有机材料、无机材料、生物活性材料或这些材料的组合制成。基底例如包括但不限于硅晶片；CaCO3微粒或三聚氰胺甲醛微粒等带电胶体粒子；红细胞、肝细胞、细菌细胞或酵母细胞等生物细胞；聚苯乙烯或苯乙烯共聚物等有机聚合物点阵结构体(polymer lattice)；脂质体；细胞器和病毒。在一实施例中，基底是人工起搏器、人工耳蜗或支架等医疗器械。
如果在膜形成期间或形成之后，将基底分离，或用其它方式去除，这时候将基底称为“模板”(用于膜的形成)。模板粒子可以用合适的溶剂溶解或加热去除。举例来说，如果使用部分交联的三聚氰胺甲醛模板粒子，可以用较为温和的化学方法，如使用DMSO或改变pH值来溶解模板。模板粒子溶解后，留下由聚电解质层交替构成的中空多层外壳。
“微胶囊”是指呈中空外壳或包覆核心的涂层形式的聚电解质膜。所述核心含有各种不同的胶囊填充剂，如蛋白质、药物或其组合。
“生物活性分子”是指有生物学效应的分子、大分子或大分子组装体。利用合适的试验，并经每单位重量或每分子标准化后，可以测出生物活性分子的特定生物学效应。可以将生物活性分子装入胶囊、固定在后面或者置于聚电解质膜内。生物活性分子例如包括但不限于药物、药物晶体、蛋白质、蛋白质功能片段、复合蛋白、脂蛋白、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖体、活性治疗剂、磷脂、多糖、脂多糖。本文中，“生物活性分子”进一步包括有生物活性的结构组成，如功能性膜碎片、膜结构组成、病毒、病原体、细胞、细胞团和细胞器。能被封装在胶囊内或固定在多肽膜后面的蛋白质例如有血红球蛋白；葡萄糖氧化酶、脲酶和溶菌酶等酶；纤维连接蛋白、层粘蛋白、玻连蛋白和胶原蛋白等胞外基质蛋白；以及抗体。能被封装在胶囊内或固定在多肽膜后面的细胞例如包括移植胰岛细胞、真核细胞、细菌细胞、植物细胞和酵母细胞。
“生物相容性”是指经口服、局部给药、透皮给药、皮下注射、肌内注射、吸入、植入或静脉内注射后不会对健康产生实质性的不良影响。例如，生物相容性膜包括那些与免疫系统(如人的免疫系统)接触后不会引起实质性免疫应答的膜。
“免疫应答”是指细胞或体液免疫系统对体内任何部位出现的物质所产生的反应。免疫应答可以表现为很多方式，如血流中识别某种抗原的抗体数量增加。抗体是由B细胞分泌的蛋白质，而抗原是诱导产生免疫应答的物体。人体通过增加血流或其它部位的抗体数量来抵抗感染和抑制再感染。
“表位”和“抗原决定簇”可互换使用，是指被抗体识别的抗原(如蛋白质或设计肽)的结构或序列。表位通常位于蛋白质表面。“连续表位”是指表位中包括的若干氨基酸残基相互连接、而不是在折叠蛋白中碰巧接触或处于有限的空间区域内。
“高分子沉淀剂”是指一种化学物质，如可溶性聚合物，它能影响生物活性分子的溶解性。在一实施例中，高分子沉淀剂是指一种能降低模板上吸附的生物活性分子水溶性和/或降低模板上制膜所用的聚电解质的水溶性聚合物。水溶液中，高分子沉淀剂能将外部包覆生物活性分子的模板表面的溶剂水分子吸走，所以在聚电解质膜组装工艺中能增加留置在模板上的生物活性分子的量。改变跨胶囊壁渗透压梯度，使胶囊模板分解时，这种高分子沉淀剂还有助于保持胶囊的稳定性。
高分子沉淀剂例如有聚乙二醇(PEG)、聚(丙烯酸)钠盐、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙二醇(PPG)、二乙氨基乙基葡聚糖和聚乙烯亚胺(PEI)，以及前述一种或多种高分子沉淀剂的组合。高分子沉淀剂的优选分子量因不同聚合物而异。一定要注意，分子量是决定高分子聚合物溶解性的关键因素，分子量越高，其可溶性越低。上面某些用作生物大分子高分子沉淀剂的聚合物所实际使用的分子量为：PPG 425Da、PVA 5,000Da、PEI 40-60kDa。从科学文献中很容易查阅到有关这些聚合物溶解性的详细内容。
本发明的一个方面是提供一种制备多层膜的方法。该方法包括：在基底上沉积多个带相反电荷的聚电解质层。沉积这些带相反电荷的聚电解质层时，至少有一层的沉积过程中使用了高分子沉淀剂。某些实施例中沉积过程采用层叠组装(LBL)工艺完成。依次沉积的各个层带有不同符号的净电荷。在一实施例中，一个或多个层含有设计多肽。在另一实施例中，带不同电荷的多肽中，至少有一条多肽含有同聚多肽，如聚(L-赖氨酸)或聚(L-谷氨酸)。
适于静电层叠沉积工艺用的多肽的设计原理在美国专利(公开号：2005/0069950)有所记载，该文通过引用并入本文。简单说来，设计时首先要考虑多肽的长度和电荷。静电是多肽设计时需要考虑的最重要因素，因为它是ELBL的基础。如果一个多肽的电荷特性不合适，那么它在pH4-10时基本上不溶于水溶液，所以不能很容易地通过ELBL工艺制备多层膜。其他考虑因素包括多肽的物理结构、由多肽形成的膜的物理稳定性，以及膜与组成该膜的多肽之间的生物相容性和生物活性。
如上所述，设计多肽是指包含一个或多个氨基酸序列基元的多肽，其中，所述多肽有至少15个氨基酸残基长，pH7.0时，多肽中每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。“氨基酸序列基元”是指含n个氨基酸残基的连续氨基酸序列，其中n是5-15。pH7.0时，天然存在的正电荷氨基酸(碱性)是Arg、His和Lys，天然存在的负电荷氨基酸(酸性)是Glu和Asp。使用的氨基酸基元中可以包含带相反电荷的混合氨基酸残基，只要整个电荷比例满足以上规定的标准即可。在一实施例中，设计多肽不是同聚多肽。
在一典型实施例中，氨基酸序列基元含7个氨基酸。对长7个氨基酸的基元来说，含4个带电氨基酸是较为合适的最低限度，因为少于4个电荷，肽的可溶性和对ELBL工艺的控制能力会降低。而且，关于生物相容性，基因组数据中述及的各氨基酸序列基元都比7个氨基酸长，足以构成连续表位，但并没有长到基本上与蛋白质表面和其内部的残基相对应。所以，氨基酸序列基元的电荷和长度有助于确保基因组数据中提到的序列基元可能出现在该序列基元所来源的折叠蛋白表面上。相反，非常短的序列基元在机体看来有可能是随机序列，或者是非特定“自体”的随机序列，从而会诱导免疫应答。
某些情况下，设计氨基酸序列基元和设计多肽时，需要考虑形成二级结构尤其是α-螺旋或β-折叠的倾向性。某些实施例中，最好能控制水介质中设计多肽形成二级结构的可能性，如最大程度降低这种可能性，以便尽可能地控制薄膜层形成工艺。首先，序列基元最好比较短，约5-15个氨基酸残基，因为长基元在溶液中更有可能形成稳定的三维结构。第二，设计多肽中共价连接相邻氨基酸序列基元的接头，如甘氨酸或脯氨酸残基，会降低多肽在水溶液中形成二级结构的倾向。例如，甘氨酸的α-螺旋和β-折叠倾向性很低，非常不利于甘氨酸和其相邻氨基酸在水溶液中形成规则二级结构。第三，选择α-螺旋总体倾向性小于7.5、β-折叠总体倾向性小于8的氨基酸序列基元，可将设计多肽本身的α-螺旋和β-折叠倾向性降到最低。“总体”倾向性是指基元中所有氨基酸的α-螺旋或β-折叠的倾向性总和。α-螺旋和/或β-折叠的总体倾向性稍高的氨基酸序列基元适用于ELBL工艺，尤其是由Gly或Pro等接头连接时更是如此。某些应用中，如果作为薄膜制备中的特定设计特征，多肽形成二级结构的倾向可以较高。用Chou和Fasman法(参见P.Chou and G.FasmanBiochemistry 13：211(1974)，其整体通过引用并入本文)可以计算出所有20种天然存在的氨基酸的二级结构倾向性。
另一考虑因素是多肽ELBL膜的稳定性控制。离子键、氢键、范德华力和憎水作用都有助于多层膜的稳定性。另外，同一层内或相邻层中多肽的含巯基氨基酸之间形成的共价二硫键可以增加结构强度。含巯基的氨基酸包括半胱氨酸和同型半胱氨酸。另外，可以往β-氨基酸中加入巯基，如D，L-β-氨基-β-环己基丙酸、D，L-3-氨基丁酸或5-(甲基硫代)-3-氨基戊酸。使用含巯基的氨基酸，通过改变氧化电位，可以将多肽多层膜各层“锁住”(结合在一起)和“脱离”。另外，设计多肽中序列基元中加入含巯基的氨基酸后，由于分子内形成二硫键，所以可以在薄膜制备中使用较短的肽。可以使用下面叙述的方法从基元文库中选取包括含巯基氨基酸的氨基酸序列基元，或者可以从头设计。
在一实施例中，将无论是化学合成还是宿主体内产生的含巯基的设计多肽，在含有用于防止二硫键过早形成的还原剂条件下，采用ELBL法进行组装。然后除去还原剂，再加入氧化剂。氧化剂使巯基之间形成二硫键，将各层内多肽“锁”在一起，而且存在硫醇基团时还会将各层之间的多肽“锁”在一起。合适的还原剂包括二硫苏糖醇(“DTT”)、2-巯基乙醇(2-ME)、还原谷胱甘肽、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)和前述一种以上化学物质的组合。合适的氧化剂包括氧化谷胱甘肽、叔丁基过氧化氢(t-BHP)、硫柳汞、肼、5，5′-二硫代-双-(2-硝基-安息香酸)(DTNB)、4，4′-二硫代二吡啶、溴酸钠、过氧化氢、连四硫酸钠、porphyrindin、邻碘苯甲酸钠，及前述一种以上化学物质的组合。
生物相容性是生物药学应用中所考虑的一个因素。这类应用中，首先利用作为多聚体设计基础的基因组或蛋白质信息，得到我们需要的“免疫惰性”多肽。如果生产出的或外覆涂层的物体要与循环血接触，则这一方法特别有用。由于氨基酸序列基元的极性较高，所以它们通常位于其来源蛋白质天然折叠结构的表面。“表面”是指折叠蛋白质中与溶剂接触或因水的微粒性而难以单独靠近溶剂的那一部分。已鉴定出的血液蛋白氨基酸序列基元在血液中总是能与细胞有效接触。所以，来源于血液折叠蛋白质的多肽有免疫原性的可能性低于随机选择的序列。设计多肽一般都有生物相容性，但免疫应答或其它任何类型的生物应答所达到的程度可能完全取决于序列基元的具体细节。
可以用很多方法使膜、涂层或微胶囊具备生物活性。例如，含设计多肽的膜可以含有功能域。或者，具有多肽薄膜涂层或装在多肽薄膜胶囊内的其它生物活性分子也可能有生物活性。在一实施例中，所述模板包含蛋白晶体等生物活性分子。
这里提到的功能域是指蛋白质中一段有特定生物功能(如结合磷酸化酪氨酸)的独立耐热区域。多结构域蛋白质中可能存在多功能域，例如，张力蛋白中就包含磷酸酪氨酸结合域和蛋白酪氨酸磷酸酶域。多层膜内加入的设计多肽中包含功能域，可以使膜具有与特异性配体结合、体内靶定、生物感应和生物催化等所需功能。
生物活性分子可以是蛋白质，蛋白质功能片段，非设计多肽构成部分的蛋白质功能片段、复合蛋白、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖体、活性治疗剂、磷脂、多糖、脂多糖、功能性膜碎片、膜结构组成、病毒、病原体、细胞、细胞团、细胞器、脂、碳水化合物、药物或抗菌剂。生物活性分子可以是规则排列的结晶型或无定形。所述蛋白质可以是酶或抗体。所述基底可以包含这类生物活性分子。在一实施例中，在带相反电荷的各多肽层沉积前，基底表面含有生物活性分子。在另一实施例中，基底是含生物活性分子的晶体。
在一实施例中，氨基酸序列基元采用从头设计。在另一实施例中，氨基酸序列基元选自特定生物的基因组或蛋白质组信息，如人的基因组。例如，可以利用补体C3(gi|68766)或乳转铁蛋白(gi|4505043)的一级结构，从人血液蛋白中检索氨基酸序列基元。
鉴定多肽内第一个氨基酸序列基元的方法包含：选择多肽的起始氨基酸残基；检查多肽内含该起始氨基酸残基和后面n-1个(即n减1)氨基酸残基的氨基酸序列中存在的正电荷和负电荷，其中n是5-15；如果pH7.0时，这5-15个氨基酸残基侧链的净电荷大于或等于0.4×n，则将这些氨基酸残基确定为氨基酸序列基元；或者，如果pH7.0时，这5-15个氨基酸残基侧链的净电荷小于0.4×n，则舍弃该序列。
下面叙述在一实施例中从氨基酸序列数据中检索含n个氨基酸、仅包含中性或负电荷氨基酸的负电荷氨基酸序列基元的方法。第一步，从蛋白质序列中选择起始氨基酸残基。第二步，检查起始氨基酸残基和后面n-1个氨基酸残基中是否含有精氨酸、组氨酸或赖氨酸(中性pH时，这三种天然存在的氨基酸可能带正电荷)，其中n是5-15。第三步，如果发现这n个氨基酸残基中有一个或多个精氨酸、组氨酸或赖氨酸，则从第二个氨基酸残基重新开始上述步骤。但如果这n个氨基酸中不含精氨酸、组氨酸或赖氨酸，则检查并确定n个氨基酸残基中谷氨酸(Glu)和/或天冬氨酸(Asp)(中性pH时这两个氨基酸带负电荷)出现的数量。第四步，如果这n个残基中有至少0.4×n个Glu和/或Asp，则将该序列归类为负电荷氨基酸序列基元。但如果发现负电荷氨基酸数量少于0.4×n个，则舍弃从第一个氨基酸残基开始的序列，然后再重新开始以上步骤，例如，立即从与第一个氨基酸残基相邻的第二个氨基酸残基开始以上步骤。将基元归好类后，再从第二个氨基酸残基开始，重复以上步骤。
鉴定正电荷序列基元的方法大致是从蛋白序列数据中检索仅含中性或正电荷氨基酸、n个氨基酸长而且中性pH时这些氨基酸残基侧链的净电荷数量大于或等于0.4×n的氨基酸序列。
鉴定含n个氨基酸、允许同时存在正电荷和负电荷氨基酸残基的负电荷氨基酸序列基元或正电荷氨基酸序列基元的方法也差不多类似。例如，鉴定含n个氨基酸的正电荷氨基酸序列基元的步骤也是从多肽中选择起始氨基酸残基。然后，检查该氨基酸残基和后面n-1个氨基酸残基中是否有pH7时带正电荷或负电荷的残基。确定这n个氨基酸残基侧链的净电荷数。如果净电荷的绝对值小于0.4×n，则舍弃该序列，从另一个氨基酸重新开始检索。但如果净电荷的绝对值大于或等于0.4×n，则该序列为一个氨基酸序列基元。若净电荷大于0，该基元为正电荷基元，若小于0，该基元为负电荷基元。
本文述及的氨基酸序列基元的从头设计方法与上面的原理大体相同，不同在于：设计用的序列并不限于天然发现的序列。首先，选择基元长度n和所需的净电荷符号和数量。然后，选定n个能作为氨基酸序列基元而得到所需电荷符号和数量的氨基酸，这n个氨基酸的净电荷绝对值大于或等于0.4×n。从头设计氨基酸序列基元的潜在优点是，操作者可以从所有氨基酸(20种天然存在的和所有非天然的氨基酸)中挑选以获取所需的净电荷，而不仅限于特定已知氨基酸序列中发现的那些氨基酸。与从基因组序列中鉴定氨基酸基元相比，大型氨基酸池扩大了基元序列设计时可供选择的物理、化学和/或生物学特征的潜在范围。
本文所述的设计多肽包含一个或多个氨基酸序列基元。设计用于ELBL工艺的多肽时，可以重复同一基元，或者将不同基元连在一起。在一实施例中，氨基酸序列基元之间共价连接，无插入序列。在另一实施例中，设计多肽包含两个或两个以上由接头共价连接的氨基酸序列基元。该接头可以是氨基酸型接头，如一个或多个氨基酸残基，如赖氨酸或脯氨酸，或者可以是适于共价连接两个氨基酸序列基元的其它任何化合物。在一实施例中，接头包含1-4个氨基酸，如1-4个赖氨酸和/或脯氨酸残基。该接头包含合适的长度或组成，使设计多肽中每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。
在一实施例中，设计多肽的长度大于或等于15个氨基酸残基。在其它实施例中，设计多肽的长度大于18、20、25、30、32或35个氨基酸。实际使用的多肽长度上限为1,000个残基。
氨基酸序列基元被选出或从头设计后，即可利用本领域熟知的方法，如固相合成和F-moc化学合成法，或者通过基因克隆、转化及细菌异源表达的方法，合成带有氨基酸型接头的设计多肽。可以委托肽合成公司如SynPep公司(Dublin，California)，在实验室内用肽合成器合成，或者采用重组DNA的方法合成。任何新型开发的肽合成法可能会增加肽的产量，但对本文所述的肽设计方法应该不会有实质性改变。
制备聚电解质多层膜的方法包含：将多个带相反电荷的聚电解质层沉积到基底上，其中至少一个层含有设计多肽。在一实施例中，至少一种聚电解质含有多肽，如一种带电荷的同聚多肽或一种设计多肽。依次沉积的聚电解质的净电荷相反。图1是ELBL沉积过程的示意图。在一实施例中，设计多肽(或其它聚电解质)的沉积过程包括将基底暴露在水溶液中，水溶液中含有设计多肽(或其它聚电解质)，其pH值使设计多肽带有适于进行ELBL工艺的净电荷。在另一实施例中，将设计多肽或其它聚电解质沉积到基底上的方法是将带有相反电荷的多肽溶液先后喷涂到基底上。在其它实施例中，沉积到基底上的方法是将带有相反电荷的多肽溶液同时喷涂到基底上。
在形成多层膜的ELBL方法中，相邻层的相反电荷能驱动组装发生。其关键因素不是相对层中聚电解质的净线性电荷密度相同，而是相对层带有相反电荷。一种用于沉积的标准膜组装程序包括：在能使聚电解质以离子形式存在的pH值(即pH4-10)条件下，形成聚电解质水溶液，然后选用带有表面电荷的基底，最后将基底交替浸入带电荷的聚电解质溶液内。视情况可以在各层交替沉积步骤之间洗涤基底。
本领域普通技术人员可以很容易地确定适于聚电解质沉积的聚电解质浓度。典型的浓度为0.1-10mg/mL。一般来说，制出的层厚基本上不受沉积过程中所述范围内聚电解质溶液浓度的影响。对于典型的非多肽聚电解质如聚(丙烯酸)和聚(烯丙胺盐酸盐)，层厚通常约3-5
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，具体视溶液离子强度而定。较短的聚电解质通常比较长的电解质形成的层薄。聚电解质膜的厚度与湿度、层数和膜组成有关。例如，50nm厚的PLL/PLGA膜经氮气干燥后收缩到1.6nm。一般来说，可以形成1-100nm或更厚的膜，具体取决于膜的水合状态和组装体中所用聚电解质的分子量。
另外，形成稳定聚电解质多层膜所需的层数取决于膜内的聚电解质。对仅含有低分子量多肽层的膜来说，通常要有4个或4个以上带相反电荷的多肽双层。而对于含高分子量聚电解质如聚(丙烯酸)和聚(烯丙胺盐酸盐)的膜来说，含一个带相反电荷聚电解质的双层就可以保持稳定。
如本文所述，在含有高分子沉淀剂，通常在pH4-10的水溶液中，将一种或多种聚电解质沉积到基底上。使用高分子沉淀剂的一个优点例如是，能最大程度的减少多层膜内所含生物活性分子的损失。
对于所给定的整个沉积条件，可以选择具特定分子量的高分子沉淀剂的用量，使模板吸附的生物活性分子的损失尽可能减少，同时不影响适合特定沉积工艺的沉积溶液粘度。一般来说，高分子沉淀剂的合适浓度依沉淀剂的分子结构及其分子量而定。通常，高分子沉淀剂的浓度越高，大分子的可溶性越低。高分子沉淀剂实际使用的具有代表性的浓度值可列举如下：对于分子量3500-4000Da的PEG、分子量425Da的PPG、分子量5000Da的PVA和分子量40-60kDa的PEI，其使用浓度为5-15重量％。300Da的PEG的可溶性要远远地高于3500-4000Da的PEG，前一PEG在水溶液中的溶解度达到约50重量％。特定沉淀剂能够发挥效用的浓度上限会随共沉淀剂浓度增加而降低。例如，如果同时含有PVA，PEG 300的有效浓度会有所降低。如果含高分子沉淀剂和肽的溶液过于粘稠，则无法很好地控制溶液的喷涂操作。对于LBL方法，粘度能影响沉积溶液中聚电解质的扩散速度。可以权衡任何一整套特定沉积条件对所吸附生物活性分子的留置和对沉积溶液粘度的影响，以此确定其他聚合物用作高分子沉淀剂的浓度和分子量。
以PEG作高分子沉淀剂为例，在使溶液保持液态的整个温度范围内(对纯水来说，约1atm气压下，标称温度约0-100℃)，溶液中PEG300浓度可以达到约50％(v/v)。当溶液中含有沉淀剂而且生物活性分子的功能活性不会发生非可逆失活时，温度范围可以稍微再宽些。要确定能够在这些方法中、在整个给定沉积条件下发挥作用的特定分子量PEG的浓度，至少一定程度上应根据该浓度是否维持适当的溶液粘度而定。
在一实施例中，多层膜或微胶囊中含有生物活性分子。在一实施例中，将生物活性分子与一个或多个聚电解质层进行共沉积。在另一实施例中，基底含有生物活性分子，例如，基底可以是含有液态或结晶生物活性分子的模板，如药物或蛋白质。在另一实施例中，生物活性分子包覆在基底外部。例如，在进行聚电解质层沉积前，先将生物活性分子包覆在惰性核如CaCO3粒子外部。聚电解质沉积完后可以除去CaCO3粒子，形成含有生物活性分子的中空微胶囊。
一实施例中，在制膜时，高分子沉淀剂有助于聚电解质的沉积，能降低所吸附生物活性分子的可溶性，从而增加被封装材料的量。在根据经验确定所用高分子沉淀剂的合适浓度时，可以使用一种合适的分析法来测定生物活性分子从模板上脱离的损失。例如，可以用荧光基团如荧光素或CY3、荧光菁蓝化合物(Amersham BioSciences)，或者用具有吸附光谱特征的基团如酪氨酸标记生物活性分子。利用试验方法确定附着在模板上的荧光或吸收量，以此评价含或不含特定浓度的给定高分子沉淀剂时生物活性分子的留置情况。
本发明进一步包括用本发明的方法制备的膜。制备工艺中将某些高分子沉淀剂加到膜内，是有可能的。某些情况下，这种加入可能是有益或有用的。
另一方面，本发明提供了在制备聚电解质多层膜过程中改善生物活性分子留置的方法。在某些实施例中，这一方法包括：将多个带相反电荷的聚电解质层沉积到含有生物活性分子的基底上，其中，一种或多种带相反电荷的聚电解质的沉积过程是在含有高分子沉淀剂的条件下进行。在一实施例中，一种或多种聚电解质含有多肽。在另一实施例中，这一方法包括：将生物活性分子吸附到基底上，然后将多个带相反电荷的聚电解质层沉积到外面包覆生物活性分子的基底上。一种或多种带相反电荷的聚电解质的沉积过程和/或生物活性分子的吸附过程均在含有高分子沉淀剂条件下进行。含高分子沉淀剂时沉积一层聚电解质过程中生物活性分子的留置量与不含高分子沉淀剂相比，至少增加15％、30％、50％、67％、100％或200％。
某些实施例中，带相反电荷的聚电解质的沉积是在水溶液中通过LBL沉积工艺完成。在另一实施例中，沉积在模板上的带相反电荷的聚电解质含有氨基酸序列基元，其中，氨基酸序列基元含有n个氨基酸，氨基酸基元中相同电荷的电荷平衡值大于或等于0.4×n。在另一实施例中，带相反电荷的多肽中，至少一个多肽含有PLL或PLGA。
生物活性分子例如是蛋白质、寡肽、核酸、寡核苷酸、脂、碳水化合物、药物、抗菌剂、膜结构组成、细胞、病毒、组织，或其组合。蛋白质可以是酶。在某些实施例中，酶是葡萄糖氧化酶。
某些实施例中，将生物活性分子沉积到模板上。合适的模板包括有机基底和/或无机基底。模板可以含有一种材料，改变基底或含基底的溶液的化学或物理特性，可以使这种材料溶解或崩解。例如，某些实施例中，模板含有CaCO3微粒，与EDTA混合后，CaCO3微粒能被溶解。另一实施例中，模板是结晶生物活性分子，如蛋白质或药物。
本发明的这一方面进一步提供利用这些方法制得的留置生物活性分子的多肽膜。
现用以下非限制性实施例进一步阐述本发明。
实施例1：葡萄糖氧化酶(GOx)吸附到CaCO3和MF粒子上
考虑到要利用GOx的酶学特性，所以选用GOx作模板蛋白质。GOx吸附实验中，将5mg CaCO3粒子(德国PlasmChem GmbH公司)或三聚氰胺甲醛(MF)粒子与100μL、含有来自A.niger的37,300U/g II-S型GOx(美国SIGMA公司)的10mM Tris缓冲液(pH7.4)混合。进行GOx吸附的温度为使GOx溶液保持液态的温度(对纯水来说，约1atm气压下，标称温度约0-100℃)，而且该温度下，GOx的酶活性不会非可逆失活。粒子终浓度是5％(w/v)。使用Jasco V-430分光光度计(日本)，280nm，测定液相吸光度，通过吸光度减小，来确定微粒表面对酶的吸附量。离心，将多肽吸附溶液中负载有GOx的微粒分离出来。粒子吸附量与进料溶液中GOx浓度和盐浓度的函数关系如图2所示。假定粒子体积为4.6×10-11cm3，则负载到CaCO3粒子上的GOx最大量约为76μg/mg粒子或9.4×10-12克酶/粒子。图2显示，在所示沉积条件下任一模板在不加单价盐时的吸附量达到最大。
实施例2：将酶封装到多肽微胶囊内
本例封装试验研究中，由于从市场上很容易买到聚(L-赖氨酸)(PLL)(MW约14.6kDa)和聚(L-谷氨酸)(PLGA)(MW约13.6kDa)，所以选用它们作为带相反电荷的多肽，进行层沉积操作。用设计多肽代替PLL和/或PLGA进行封装的过程也基本类似。Li和Haynie(2004)Biomacromolecules 5：1667-1670中记载了一对发挥同样作用的带相反电荷肽的例子。
使GOx吸附到CaCO3微粒上的操作如下：向5mg CaCO3微粒中加入0.10mL 5mg/mL GOx溶液，充分混合2小时，1000×g离心5分钟，除去液相。
各多肽多层沉积到吸附了GOx的CaCO3微粒上的操作过程包括：4℃、轻微摇动10分钟，进行自组装；离心，将粒子与液相中未结合的肽分开。在4℃，将0.1mL含1mg/mL PLL(MW约14.6kDa)或PLGA(MW约13.6kDa)、10mM Tris和0.5M NaCl的溶液(pH7.4)加到微粒中，充分混合。将PLL层和PLGA层交替沉积到微粒上。多肽溶液中含有50％(v/v)PEG 300(Fluka)。如果PEG的平均分子量太高，形成的溶液相对本例来说，会过于粘稠。继各多肽吸附、液相与粒子分离步骤之后，对组装液上清进行芳烃吸光度分析。PLL和PLGA中不含芳烃残基，所以在280nm无吸光度；而GOx可以吸收这个波长的光。在各个多肽组装循环之间，用4℃去离子水洗涤两次。重复这一过程，直到获得所需的沉积层数(一般6个双层)。最后一层多肽组装完后，漂洗被包覆的粒子，并离心收集。然后用0.2M EDTA(pH7.4)处理，使粒子核溶解。溶解过程需要10-20分钟。2000×g离心5分钟，收集微粒，去离子水漂洗，重悬在0.25mL、10mM Tris缓冲液中。各份样品的酶活性分析如下所述。后续实验用的样品浓度估测为1.5×108个胶囊/mL。用Cy3标记的GOx代替GOx，按相同程序进行共焦荧光实验，如图7所示。
图3显示，分别在不含高分子沉淀剂、含40％PEG300和含50％PEG300的缓冲液中组装时，由于洗涤液、PLL组装缓冲液和PLGA组装缓冲液中含有释放出来的GOx，所以通过280nm处吸光度来反映在PLL/PLGA封装膜的沉积过程中CaCO3模板上所吸附GOx的损失。40％或50％的PEG 300存在时，第一个PLGA层沉积过程中因GOx释放而产生的280nm吸光度明显小于不含PEG300的吸光度。将沉积缓冲液中的PEG300的浓度从10％增加到50％，结果发现，膜组装过程中从模板上解吸附的GOx量减少。
与PEG300相对应的PEG8000浓度所产生的溶液粘度使多肽层的自组装过程耗费时间较长。具有室温下为液体的分子量的PEG，如PEG300，在用作高分子沉淀剂时，适于在4℃使用。
图4表示PLL/PLGA封装膜沉积过程中CaCO3模板上GOx的留置情况。第一个点表示负载在模板上的GOx起始量。后面的点表示后续肽组装和离子漂洗步骤中模板上GOx的剩余量。图中只表示了两个沉积循环过程。所插入小图中的补充数据表示洗涤液和组装液上清中GOx负载模板所释放出的GOx量。
使用以Amplex Red作底物的比色酶联分析试验测定GOx的活性。图5是表示该试验的反应图。葡萄糖和氧气扩散到胶囊内，被GOx氧化成葡萄糖醛酸和H2O2。H2O2扩散到胶囊外，然后通过Amplex Red以间接方式检测H2O2。Amplex Red试剂最开始是无色的，在辣根过氧化物酶(HRP)存在条件下，被H2O2氧化成试卤灵(resorufin)，在λ＝563nm可以测定出试卤灵的吸光度。先配制下述母液：用DMSO配制10mMAmplex Red试剂(美国Molecular Probes公司)；50mM磷酸盐缓冲液(含0.15M NaCl)(PBS)中含10U/mL HRP；50mM PBS中含400mM葡萄糖，以及50mM PBS中含100U/mL GOx。将30μL Amplex Red、75μL HRP和450μL葡萄糖三种溶液混合，制得工作溶液。将100U/mL GOx母液稀释，制备GOx标准溶液，每份500μL，含GOx 0-10mU/mL。用50mMPBS缓冲液将胶囊样品和不含GOx的对照样品稀释到500μL。将40μLAmplex Red/HRP/葡萄糖工作溶液分别加到装有标准、对照和胶囊样品的试管内，开始反应。环境温度、黑暗中轻微摇动，反应30分钟。测定试卤灵在563nm的吸光度。根据GOx已知量对应的活性值，将测定的酶活性转换成活性GOx的量。
图6表示利用酶学分析试验测定出的被封装活性GOx的量与多肽层数的函数关系。图中显示了模板溶解后，多肽组装溶液中加入和未加PEG时留置在胶囊内的材料量。层数少于6的胶囊在溶液中不稳定。如图6所示，不含PEG条件下进行多肽组装时，与微胶囊相关的GOx活性在PLL/PLGA沉积到2个双层时显著降低。测定出的活性往往达到恒定值(例如，多肽沉积前约11％)，这个值在3-6个双层范围内不随层数而变化。往PLL和PLGA组装溶液中加入PEG后，由多肽构成的“人工细胞”的GOx负载量显著增加。6个双层沉积完之后，固液相分离前，有约70％的酶活性留置在细胞内。将含6个双层的细胞用超声波处理20分钟，其效果与使用PEG类似，酶活性没有降低。这一结果暗示，用多肽多层膜封装GOx，既不会抑制酶活性，也不会阻止小分子(如葡萄糖(酶底物)和反应产物)通过屏障扩散。GOx进入人工细胞壁的程度尚未确定。
通过以下操作可以确定，所测定的酶活性事实上与人工细胞相关。用0.22μm过滤器将有6个双层的细胞与液相分离后，测定溶液中GOx的活性。在不含PEG时，没有检测到滤液中的GOx活性，但检测到人工细胞内的GOx活性。使用PEG时，检测到部分酶(约1.5×10-12g/胶囊)。这可能是由于反复离心和洗涤过程中模板/细胞出现部分裂解所致。细胞重悬后，没有在滤液中进一步检测到活性，表明负载的GOx没有被滤除。再用相同方法测定细胞内GOx的留置量。
用荧光染料Cy3单活性基NHS-酯(英国AmershamBiosciences)标记GOx以便肉眼观察GOx负载微粒。将Cy3-GOx吸附到CaCO3微粒上，然后封装到PLL/PLGA膜内。通过荧光显微技术研究层数对人工细胞稳定性的影响，结果表明，少于3个双层的涂层在粒子核溶解后往往容易分离，而3个或3个以上双层通常在水溶液中能稳定数周。这一结果与本文所述的GOx活性测定值吻合。膜厚与层数直接相关。利用共焦激光荧光显微技术进一步证明Cy3标记的GOx被装载到含6个双层的PLL/PLGA微胶囊内(图7a，左半块)。亮视场照明得到的右半块显示，用EDTA处理后，微粒模板完全溶解。含6个双层的胶囊的荧光密度剖视图揭示，微粒内充满大量不受约束的Cy3标记GOx(图7b，左)。细胞直径与原始模板的直径近似(图7b，右)。密度范围内出现两个峰，说明一些GOx与细胞“膜”结合，这可能是由静电引力和耗散现象引起。运用圆二色谱法进一步证明GOx被封装到多肽细胞内。
实施例3：将酶封装到聚电解质微胶囊内
另一实施例中，在磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.0)中将血红蛋白负载到碳酸钙粒子上，然后用非肽类聚电解质封装。向蛋白质溶液中加入高分子沉淀剂如40％PEG300，蛋白负载效率增加。用两种带相反电荷的聚电解质，按LBL工艺，对吸附蛋白进行封装。适合本例用的聚合物有聚(苯乙烯磺酸酯)、聚阴离子和聚(烯丙胺)、聚阳离子。用分光光度计在可见光范围内可以证明蛋白质已被负载：由于血红蛋白含有血红素，所以在近410nm处有一个大的吸收谱。
本发明提出一种通过往组装缓冲液中加入高分子沉淀剂，而将功能性生物活性分子高效留置在纳米工程聚电解质膜内的方法。聚电解质多层膜是半透膜，可以阻止生物分子向外泄漏，但不会阻止小分子渗透。与LBL工艺制备薄膜时更普遍使用的不能生物降解的合成聚电解质相比，封装多肽所固有的生物相容性更有利于在生物医药方面应用。
本文中“第一”和“第二”等词不表示任何特定顺序，而仅便于表示例如多个层。除非另外说明，“包含”、“具有”、“包括”和“含有”等词均应理解为开放式用语(即意指“包括但不限于”)。文中表示数值范围的方式仅仅是作为单独谈及落在该范围内的每个分散数值的简略表示法，除非本文另外指明，而且每个分散值就好比文中以一一叙述的方式被引入本说明书。所有范围的端点包含在该范围内，而且可独立组合。文中所述所有方法均按合适的顺序操作，除非文中另外指明或上下文清楚地出现不同说法。任一和所有实施例或典型用语(如“例如/如”)仅仅是为了更好地阐述本发明，而非对本发明范围予以限制，除非另外要求。说明书中任何语言均不应解释为将任何未要求权利保护的特征作为实施本文所述发明的必要特征。
虽然参照典型实施例对本发明进行了描述，但本领域技术人员应当明白，在本发明范围内可以进行各种改动而且可以将本发明的特征用等同特征替代。另外，根据本发明的教导有可能在本发明的范围内进行多种改进以适应特定情况或材料，所以，本发明并非要局限于本文公开的作为实施本发明最佳模式的特定实施例，而是要包括权利要求范围内的所有实施例。本发明涵盖上述特征所有可能变化形式的任一组合，除非本文另外指明或有清楚的相反叙述。

Claims (20)

1.一种制膜方法，该方法包括：
将第一层聚电解质沉积到基底表面上，形成第一层；以及
将第二层聚电解质沉积到第一层聚电解质上，形成第二层；
其中，在高分子沉淀剂存在条件下，将第一层聚电解质或第二层聚电解质沉积到基底上，或者将这两层聚电解质都沉积到基底上；以及
第一层聚电解质和第二层聚电解质的净电荷极性相反；
其中，所述聚电解质是分子量大于1,000、每分子至少带5个电荷的聚阳离子或聚阴离子材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一层聚电解质或第二层聚电解质含有，或者这两层聚电解质都含有设计多肽，其中
所述设计多肽含有一个或多个第一氨基酸序列基元，所述一个或多个第一氨基酸序列基元由5-15个氨基酸残基组成，每个残基的净电荷数量大于或等于0.4；
所述设计多肽不是同聚多肽，有至少15个氨基酸残基长，每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一层聚电解质或第二层聚电解质，或者这两层聚电解质在生物活性分子存在条件下被沉积。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基底含有生物活性分子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述生物活性分子以基底表面的涂层形式存在。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述基底含有适于在聚电解质多层膜沉积完后发生崩解的模板。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述生物活性分子以核的形式存在。
8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：在沉积第一层聚电解质之前，将生物活性分子沉积到所述基底的表面上。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述高分子沉淀剂包含聚乙二醇、聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙二醇，或者前述一种或多种高分子沉淀剂的组合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述膜是微胶囊形式。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，生物活性分子被所述微胶囊封装在内。
12.一种在聚电解质多层膜制备过程中改善生物活性分子留置的方法，该方法包括：
将第一层聚电解质沉积到基底表面上，形成第一层；以及
将第二层聚电解质沉积到第一层聚电解质上，形成第二层；
其中，在高分子沉淀剂存在条件下，将第一层聚电解质或第二层聚电解质沉积到基底上，或者将这两层聚电解质都沉积到基底上；
第一层聚电解质和第二层聚电解质的净电荷极性相反；以及
所述基底含有生物活性分子；
其中，所述聚电解质是分子量大于1,000、每分子至少带5个电荷的聚阳离子或聚阴离子材料。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第一层聚电解质或第二层聚电解质含有，或者这两层聚电解质都含有设计多肽，其中
所述设计多肽含有一个或多个第一氨基酸序列基元，所述一个或多个第一氨基酸序列基元由5-15个氨基酸残基组成，每个残基的净电荷数量大于或等于0.4；
所述设计多肽不是同聚多肽，有至少15个氨基酸残基长，每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，在沉积第一层聚电解质之前，将生物活性分子沉积到所述基底的表面上。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述生物活性分子以基底表面的涂层形式存在。
16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述基底含有适于在聚电解质多层膜沉积完后发生崩解的模板。
17.根据权利要求12所述的方法，其中，所述生物活性分子以核的形式存在。
18.一种制膜方法，该方法包括：
在高分子沉淀剂存在条件下，将生物活性分子沉积到基底表面上；
将第一层聚电解质沉积到基底表面上，形成第一层；以及
将第二层聚电解质沉积到第一层聚电解质上，形成第二层；
其中，所述第一层聚电解质和第二层聚电解质的净电荷极性相反；
其中，所述聚电解质是分子量大于1,000、每分子至少带5个电荷的聚阳离子或聚阴离子材料。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第一层聚电解质或第二层聚电解质，或者这两层聚电解质在高分子沉淀剂存在条件下被沉积。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述基底含有适于在聚电解质多层膜沉积完后发生崩解的模板。
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