MX2007016573A - Vacunas y peptidos terapeuticos. - Google Patents

Abstract

Se presentan composiciones que inducen ampliamente VIH terapéutico y vacuna que inducen anticuerpos para varios clados VIH y se relaciona con la habilidad de identificar las inmunógenos de secuencia de péptido corto derivado de gpl-20 VIH y varias composiciones terapéuticas elaboradas con los péptidos identificados de los cuales se componente los sitios de unión CCR5. También se presentan métodos para seleccionar secuencias de péptidos que son candidatos para fármacos que ofrecerán tratamiento efectivo en estas áreas como la enfermedad de Alzheimer, soriasis, esclerosis múltiple y otras enfermedades asociadas con la cascada inflamatoria humana como también los retroviruses relacionados, tales como HTLV-1, la causa de paraparesis espástico tropical.

Description

VACUNAS Y PEPTIDOS TERAPEUTICOS Antecedentes de la Invención Mucha gente cree que una vacuna capaz de proteger contra la infección del VIH-1 y SIDA requerirá de inmunógenos que inducen altos niveles de anticuerpos con actividad neutralizante potente contra aislantes primarios de los virus, independientemente de su origen geográfico, especificidad de subtipo o genotipo, una meta, que las actuales candidatas a vacunas no pueden incluso aproximarse. Por lo tanto, la identificación de epítopes que medien la extensa neutralización es importante para el diseño de vacunas racionales y desarrollo. Particularmente importante es el desarrollo de anticuerpos candidatos a vacunas para los subtipos Ciado C o Clade C, presentes en países en desarrollo, comparados al subtipo Ciado B o Clade B Norteamericano predominante, y que comprende una cepa emergente de relevancia mundial. La envuelta del VIH es el objetivo predominante de anticuerpos neutralizantes en Individuos infectados con VIH. Algunos grupos de epítopes neutralizantes parecen estar expuestos por lo menos parcialmente en la proteína gp120 env de aislantes primarios y/o monocitotrópicos. A pesar de estudios extensos, por 20 años, no se ha encontrado ningún inmunógeno capaz de producir una amplia respuesta neutralizante en vacuna. Por esta razón una vacuna contra la infección de VIH ha sido difícil de encontrar. La invención específica implica la identificación de secuencias cortas de gp120 que se unen al co-receptor CCR5 que identifica péptidos capaces de producir una respuesta de anticuerpos con actividad neutralizante potente para las diversas cepas y péptidos del VIH que son un componente importante de una estrategia de inmunización para la protección de VIH-1. Los anticuerpos producidos para estas uniones de secuencias, que comprenden sitios de unión de péptidos inmunógenos, se ha anticipado que confieren protección contra la infección por el virus del VIH, independientemente de la cepa, y también son se espera que sean terapéuticos, es decir, su administración pasiva reducirá niveles virales y proveerá beneficios clínicos en personas ya infectadas con VIH. El anticuerpo neutralizante responde a la infección de VIH- 1. Los anticuerpos neutralizantes del tipo de virus de inmunodeficiencia anti-humano, primero aparecen meses después de la viremia que sigue a la infección inicial. Los anticuerpos neutralizantes de surgimiento temprano son de tipo altamente específico. La respuesta de los anticuerpos neutralizantes puede ampliarse después en la infección (16) pero generalmente permanece pobre y ocurre esporádicamente en la mayoría de los pacientes, incluyendo individuos infectados por largo tiempo. Los anticuerpos neutralizantes reconocen las glicoproteínas de la envuelta del VIH-1, que consisten de las glicoproteínas transmembrana gp41 y gp120 exterior. Las glicoproteínas gp120 se unen al objetivo CD4 y a los receptores de quimiocina CCR5 y CXCR4. Los anticuerpos han, en muy pocos casos, elevado a los epítopes de las gp120 que son expresadas únicamente después de que gp120 forma un complejo con CD4. Se cree que el co-receptor actual del sitio de unión, un objetivo de vacuna deseada, se forma únicamente a la asociación de CD4 con gp120. Estos anticuerpos (CD4i) inducidos por CD4 bloquean CCR5 y CXCR4 unido al complejo gp120-sCD4. El número de anticuerpos CD4i aislado de humanos infectados con VIH-1 es bajo. La mayoría del trabajo inicial con vacunas de VIH-1 fue dirigido en desarrollar vacunas que producen una respuesta de anticuerpos neutralizantes. Estos anticuerpos neutralizantes han estado limitados en su acción y casi específicamente por completo a cepas del virus que inocula en modelos de animales. Estos anticuerpos, por lo tanto, no son de amplia especificidad y no serán buenos candidatos para vacunas. La mayoría de las vacunas exitosas bloquean el virus que se une a su receptor (s), que para el VIH son los co-receptores CXCR4 y CC5 (1, 2). Así la identificación del sitio de unión del co-receptor, un foco de escrutinio intenso por los últimos 20 años, el cual no se ha logrado hasta ahora, sería deseado produjera un inmunogeno capaz de rendir la extensa neutralización deseada de las diversas cepas convenientes para el uso de la vacuna. El objeto de esta solicitud, en parte, es un anticuerpo contra un sitio de unión co-receptor biológicamente activo. Este anticuerpo mostró potente inhibición del complejo gp120-sCD4 que se une al receptor CCR5 en estudios in vitro y anticuerpos desarrollados con la conformación péptida apropiada que inducen ampliamente a los anticuerpos neutralizantes los cuales por lo tanto, se espera proporcionen inmunidad protectora contra la infección del VIH-1, es decir una vacuna. En más de 10 años, únicamente algunos MAbs humanos que median la extensa y potente neutralización de la mayoría de los aislantes de VIH-1 han sido aislados. Dos de estas uniones de MAbs a la superficie de gp120 (MAbs b12 y 2G12) (3,4), y uno unido a un epítope justo próximo a la membrana que comprende el dominio de gp41. MAb b12 reconoce un epítope discontinuo complejo que implica la región C3-V4 de gp120 y el carbohidrato. MAb 2F5 se une a un epítope lineal en el ectodominio de gp41; sin embargo, la simplicidad de este epítope es engañosa y probablemente más compleja que la secuencia lineal de seis residuos MAbs b12, 2G12, y 2F5 ha mostrado la actividad neutralizante in vitro contra una amplia variedad de aislantes primarios. Todos los candidatos a vacunas basados en la envuelta recombinante probados hasta ahora en pruebas clínicas, aún incluyendo epítopes conocidos para mediar la amplia neutralización, no produjeron una respuesta significante en los anticuerpos neutralizantes contra aislantes primarios. El péptido basado en los candidatos de vacunas también puede no producir una inmunorespuesta adecuada. Secuencias homologas al péptido DAPTA (Dala 1 -péptido T-amida, (5)) están presentes dentro de V2 de numerosos aislantes de VIH-1(hemos examinado 4,078 secuencias). Nuestros resultados con un policlonal, y un anticuerpo IgG purificado contra el péptido DAPTA, mostraron una actividad neutralizante significante contra cepas adaptadas de laboratorio y primarias, aumentando la perspectiva que las ocho secuencias del extremo carboxílico del dominio V2, en proximidad cercana a las láminas de puenteo que representan un nuevo epítope neutralizante. Generación de antisuero policlonal de péptido DAPTA Para generar anticuerpos purificados por afinidad, seis conejos fueron inmunizados por las inyecciones subcutáneas secuenciales de: 1) 75 g de péptido DAPTA suspendido en el Freud's Complete Adjuvant (día 1), 2) 75 g DAPTA suspendido en Freud's Incomplete Adjuvant (día -20) y 3) 150 [ig DAPTA sin adyuvante (día 35). Para la prueba de seroconversión , los conejos fueron sangrados de la vena del oído el día -1 y después semanalmente y los sueros probados por el ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) usando las placas de microvaloración revestidas con el péptido DAPTA purificado y el IgG cabra anti-conejo conjugado en peroxidasa de rábano picante. Los conejos seropositivos fueron sangrados posteriormente por puntura cardiaca. El anticuerpo del péptido DAPTA presente en los anti-sueros fue purificado por cromatografía por afinidad usando la columna de sefarosa por afinidad acoplada al péptido DAPTA purificado. Breve Descripción de la Invención Lo siguiente es un extracto de algunas modalidades preferidas y no significan que limitan el alcance de la invención de ninguna manera. Se describen composiciones que inducen anticuerpos ampliamente neutralizantes contra diversos ciados de VIH, el componente clave de una vacuna efectiva. Algunas modalidades se refieren a la capacidad para identificar inmunógenos de VIH de secuencia de péptido corta derivados de gp120 y varias composiciones terapéuticas hechas de péptidos identificados que componen los sitios de unión CCR5. Los péptidos son seleccionados analizando secuencias del péptido de diversas cepas de VIH, secuencias de cepas de virus relacionadas, secuencias de otras envueltas virales y secuencias de neuropéptidos selectos. Además, otras modalidades provistas para composiciones que actúan como terapéuticas del VIH o cuando son administradas a humanos actúan como inmunógenos para inducir ampliamente anticuerpos de vacuna anti-VIH activos. Aún otras modalidades se refieren a la capacidad de estabilizar, reducir la agregación e inmunogeneticidad mejorada de péptidos en formulaciones útiles terapéuticamente. Más específicamente, la presente invención proporciona las composiciones terapéuticas que comprenden por lo menos una auto-asociación, o una auto-agregación, fármaco del péptido o de la proteína y por lo menos un tensioactivo, en donde el tensioactivo es además comprendido de una alquilglicosida y/o éster alquilo sacárido. Si por otro lado, las modalidades incluso se refieren a un método novedoso de selección de secuencias de péptido que son candidatas probables para fármacos que ofrecerán tratamiento efectivo en áreas tales como la enfermedad de Alzheimer, psoriasis, esclerosis múltiple y otras enfermedades asociadas con la cascada inflamatoria humana así como retrovirus relacionados tales como HTLV-1, la causa de paraparesis espástica tropical. Breve Descripción de los Dibujos Figura 1. DAPTA previene la Co-lnmunoprecipitación del complejo gp 120-CD4 con el receptor CCR5. Figura 2. Ensayo de Unión CCR5 de GP120. Figuras 3A-B. Etiquetado fluorescente de gp120 (FITC-gp120) unido eficientemente a las células Cf2Th/synCCR5 únicamente en presencia de sCD4. Figuras 4A-C. DAPTA inhibe la proteína de la envuelta gp120 que se une a CCR5. Figuras 5A-B. Unión del anti-péptido DAPTA a gp120 monomérico. Figura 6. Afinidad de Unión del Suero Anti-Péptido T DAPTA a gp120. Figura 7. CD4 soluble dependiente de la unión del Anti- Péptido T DAPTA IgG a las proteínas gp120. Figura 8. Afinidad de Unión de Anti-péptido T IgG y del suero policlonal a las proteínas gp120 recombinantes y virales inmovilizadas de la membrana. Descripción Detallada de la Invención En contraste con productos y métodos de estudios anteriores, los productos y métodos descritos en la presente exhiben las propiedades inesperadas que demuestran la actividad útil anti-VIH y otras propiedades terapéuticas. En los ejemplos siguientes, algunas, pero no todas, de las varias modalidades de la invención se ilustran. Descritos en la presente, está una familia de pentapéptidos bioactivos, en la región V2 de gp120 con secuencias homologas pero variables que bloquean la unión del co-receptor. En estudios anteriores, la región V2 fue pensada que no desempeñaba ningún papel importante en gp120 que se une a los receptores y contagiosidad. Fue creído que los mutantes carentes de V2 eran infecciosos (6, 7). En contraste con el bucle V2, el bucle V3 ha sido extensamente propuesto para contener al receptor que se une a los epítopes de gp120 (7-9). Todavía tales secuencias homologas pueden algunas veces enseñarse desde otras regiones de gp160 que de V2, donde pueden ocurrir. La presente invención describe las formulaciones que comprenden uno o más péptidos con actividad receptora en CCR5. Las secuencias homologas al péptido T (derivado del aislante SF-2) están presentes en la localización similar dentro de V2 de numerosos aislantes de VIH-1. Hemos examinado 4,078 secuencias de la envuelta V2 (gp120) disponibles en la base de datos de Entrez. De éstas, 60 % toman la forma xTxYx o xNxYx, y 23 % toman la forma xSxYx, mientras que el 17 % restante son distribuidas entre algunos otros 10 motivos menores con predominio de 2 a 7 %. La importancia de estas diversas envueltas derivadas de las secuencias de pentapéptidos es para definir motivos de receptores activos, tales como los dos motivos principales que comprenden más de 80 % de las secuencias disponibles, con algunos ejemplos menores agregados por completo. De esta colección de estructuras, una es capaz de diseñar péptidos, singularmente, o en mezclas, con amplia especificidad contra cepas de VIH diversas aparentemente, como tratamientos o inmunógenos de vacuna. Las secuencias V2 que hemos estudiado ocurren en casi la misma localización (V2, cerca de la madre) en numerosos, si no en todos, aislantes de VIH y son algo homologas a los cinco aminoácidos terminales del péptido T DAPTA. Los péptidos tienen homología con los miembros de los péptidos VIP/PACAP/GHRH. Muchos de estos neuropéptidos y derivados virales (incluyendo los de la tabla 1) han sido sintetizado, probados y mostrados que poseen bioactividad que es equivalente o aún más potente que el péptido T DAPTA octapéptido. Farmacológicamente, los pentapéptidos son antagonistas parciales de quimiocina de quimiotaxismo (10). El efecto antagonista de DAPTA es debido a su capacidad de bloquear gp120- sCD4 que se une a CCR5 (11) o bloquear la muerte del gp120 inducido neuronalmente in vitro (12). Identificación de una biblioteca de vacuna inmunógena y terapéutica de Pentapéptidos Relacionados con V2 de GP120 La siguiente tabla 1 contiene una biblioteca de diecinueve (19) pentapéptidos útiles de los cuales los péptidos terapéuticos y componentes de vacunas serán seleccionados. Tabla 1 En la siguiente tabla, están listados los pentapéptidos V2 y sus aislantes de VIH correspondientes. Tabla 2 SF-2 ASSTTTNYT* BAL NNRYR SF-2 TTNYT ADA NTSYR IIIB TTSYT WMJ-1 SSTYR RFII NTSYG NY5 NISYT Z3 SSTYR Sintético TTNdY*T Nota: *es la secuencia del péptido T, terminal del pentapéptido resaltada, # es un análogo inactivo que tiene una D-tirosina en la posición 4 (12). El aislante de VIH para el péptido V2 está listado, después la secuencia del péptido actual. Los péptidos están reconocidos como análogos ya que la tirosina (Y) ocurre en la misma posición y serina (S) y treonina (T) son aminoácidos relacionados estructuralmente diferenciados por un solo grupo metílico. Se observan ligeras variaciones y los detalles estructurales se han discutido previamente (18, 57). Es interesante que mientras el péptido T es derivado del virus SF-2 adaptado en laboratorio (previamente ARV, (13)) es activo contra CCR5. Esto sugiere que algunos de estos péptidos tienen actividad intrínseca en el receptor de entrada CXCR4 relacionado, y algunos receptores VIP (14,15). Las ligeras modificaciones ampliarían la utilización del receptor, un efecto que ocurre in vivo, con el surgimiento de los así llamados aislantes virales "dual-trópico" después en la progresión del VIH que también utiliza el receptor de entrada CXCR4. Los aislantes virales del cerebro parecen comprender un fenotipo de la proteína de la envuelta distinto que está adaptado por réplica en la microglia y macrófagos del cerebro que expresan niveles bajos de CD4 y CCR5 (16). Los pentapéptidos de la proteína de la envuelta derivados de aislantes virales del cerebro, por lo tanto, pueden ofrecer las ventajas de tratamiento específico para bloquear cepas de VIH, como los que infectan el cerebro, que están adaptados a la expresión del co-receptor o CD5 bajo. La capacidad para infectar células con CD4 bajo y/o CCR5 conferirían un tropismo mas amplio para ambos, células T y macrofagos y por lo tanto los pentapéptidos de cepas adaptadas del cerebro pueden también utilizarse para suprimir la infección de las cepas del VIH adaptadas a los números de receptores bajos en tejidos y células diversas, no limitados a los macrofagos o microglia del cerebro, o para crear inmunógenos para la generación de anticuerpos terapéuticos o vacunas. La supresión de aislantes virales adaptados a números de receptores bajos es probable sea la siguiente frontera en el desarrollo de los terapéuticos de VIH y los ligandos de alta potencia serán más eficaces. Al explorar por secuencias generadas por virus, naturales, la relevancia biológica y la utilidad práctica serán optimizadas. Los péptidos terapéuticos candidatos pueden probarse fácilmente por la potencia del receptor y los pentapéptidos más altamente activos anteriores como candidatos del fármaco haciendo modificaciones adicionales para la estabilidad y biodisponibilidad. Péptidos Activo-Receptores V2 Terapéuticos e Inmunógenos Identificados en el Cerebro y Vacuna de Pentapéptidos Identificada en Neuropéptidos Selectos. Las secuencias ejemplares fueron identificadas desde cinco aislantes del cerebro descritos en (16) y son mostradas en la tabla siguiente.

Tabla 3 SECUENCIA V2 DE CEREBRO TSNYS NSNYS TTSYR NTSYR TISYR En adición a los pentapéptidos dentro de la región V2 de gp120, hemos observado que este motivo de péptido existe en las otras partes de gp120, en gp41 (que es un enlace de membrana) y en neuropéptidos relacionados con VIP/PACAP/GHRH (17). Ejemplos de éstos están listados en la tabla siguiente. Tabla 4 Así los péptidos relacionados V2 son demostrados para ser biológicamente activos y la explicación más simple es que son activos farmacológicamente en los receptores de quimiocina específicos.

Pentapéptidos Relacionados con V2 Identificados en la Proteína GP41 de la envuelta de VIH La tabla siguiente ilustra las Secuencias VIH GP41 que pueden utilizarse como terapéuticas o Vacunas Inmunogenas.

Tabla 5 Examinamos 702 secuencias gp41 de la base de datos de Entrez. Todas las secuencias del pentapéptido registradas fueron localizadas en la misma posición, de aproximadamente la posición 126 de gp41 consistente con una función de unión compartida de estos análogos péptidos. La presente invención describe las formulaciones que comprenden por lo menos un péptido o proteína, ya sea en concentración alta o baja.

Identificación de Diversos Pentapéptidos Relacionados a V2 que se Unen a CCR5 v bloquean la unión de VIH GP120 a CCR5 Usando el método descrito arriba, y a detalle en (11), la unión del complejo gp120/sCD4 a ChfTh-CCR5 que expresan células con o sin pequeños péptidos gp120 competitivos agregados, mostramos el caso general en que los péptidos homólogos al V2 derivado de DAPTA también tienen capacidad potente para bloquear gp120 que se une a CCR5. La actividad de la función de la estructura es mostrada, un indicador de especificidad, en que de L a D forma la sustitución del aminoácido en el péptido TTNYT redujo grandemente la potencia, y en el péptido INNYT, una sustitución de N a D para formar el péptido IDNYT fue menos activa. Asombrosamente toda la forma del aminoácido D del péptido TTNYT conservó la actividad sustancial que indica que todas las formas de aminoácido D de estos pentapéptidos son útiles y pueden preferirse debido a su estabilidad prevista de degradación de peptidasa.

Tabla 6 Péptido T DAPTA previene la unión de Gp120-SCD4 Complejo a Receptores de CCR5 Según lo representado en el Figura 1, DAPTA previene la co-inmunoprecipitación del Complejo gp120-CD4 con el Receptor CCR5. En el estudio ilustrado en el panel A, fueron utilizadas las células Cf2Th/synR5 que expresan al receptor hCCR5. Los receptores CCR5 solubilizados fueron inmunoprecipitados con un anticuerpo ID4 anti-etiqueta, capturados en la proteína agarosa A/G e incubados con el complejo gp120 Bal-sCD4 en presencia o ausencia de DAPTA. El gp120 inmunoprecipitado fue detectado por Western blotting con un VIHIg humano. Las mismas membranas fueron peladas e hibridizadas con un antisuero policlonal de conejo contra el receptor CCR5 (NT) (panel inferior A). El panel B muestra los Usados de la célula de la línea celular timocito parental Cf2Th. Ninguna de las proteínas gp120 inmunoprecipitadas fueron detectadas. El panel C mostró HOS CD4. Las células CCR5 fueron tratadas con DAPTA antes de la incubación con la proteína gp120CM235. La membrana se unen a CCR5 de aproximadamente 2x1. 107 fueron inmunoprecipitadas con MAb contra CCR5. Las proteínas gp120 coinmunoprecipitadas y los receptores CD4 unidos a la membrana fueron detectadas por el Western blot. DAPTA bloquea la unión de CD4 Dependiente de GP120 a CCR5 Según lo ilustrado en la Figura 2, los inventores han perfeccionado un ensayo de unión del complejo gp120/sCD4 a células que expresan CCR5 el cual es sensible a la inhibición por ligandos CCR5 conocidos tales como ???1-µ o anticuerpos que "bloquean" CCR5. Los ensayos antivirales son descritos a detalle en la técnica anterior (Ruff y colaboradores, 2001, Antiviral Res, 52, 63-75), que está incorporada en la presente por referencia, y que serán únicamente descritos aquí brevemente. Preparamos un rastreador etiquetado FITC nuevo de las proteínas solubles gp120 (25 Mg/ml) utilizando un kit de etiquetado de Proteína Fluorescente (Roche Diagnostics GmBh) Los ensayos de unión fueron realizados en el tampón de unión que contiene 50 mM HEPES (Gibco), pH = 7.4, 5 mM MgC12, 1mM CaC12.6H20 (Sigma), 5 % BSA (Sigma) y 0.1 % NaN3, volumen final 100µ1. La unión fue llevada a cabo por 1 h a 37°C en placas de filtro de 96-pozos (Millipore) usando varias líneas que expresan CCR5, según lo indicado. Las proteínas etiquetadas no unidas fueron retiradas por filtración al vacío rápida y lavándolas usando una placa colectora de 96-pozos. Los filtros fueron contados con un lector de placa fluorescente (Hewlett Packard) en 495/530 nm. La unión no específica fue determinada en la ausencia de sCD4 y fue sustraída de gp120-FITC que se une en presencia de 100 nM sCD4 (unión total). Etiquetado Fluorescente de gp120 (FITC-gp120) unido eficientemente a las células Cf2Th/synCCR5 únicamente en presencia de sCD4 La unión fue casi imperceptible cuando sCD4 no estuvo presente en el ensayo. La unión máxima de FITC-gp120 fue obtenida con 100 nM sCD4, usado posteriormente. Según lo ilustrado en la Figura 3, la especificidad de la unión de gp120 (Bal y CM235) fue mostrada por la competición con VIH-1Bal no etiquetado, o ???-1µ, un ligando CCR5 conocido (18-22) (figura 2, arriba). La unión de FITC-gp 20Bal etiquetado (0.5 nM) fue inhibido por arriba del 80 % en la presencia de una cantidad equimolar (0.5 nM), o reducido a niveles resumidos con exceso 20-veces (10 nM) de VIH-1Bal no etiquetado. Las uniones de las proteínas gp120 Bal y CM235 fueron inhibidaa con el ligando específico CCR5 ???-1µ (10 nM), según lo descrito previamente (23-25). La unión de FITC-gp120CM235 también fue inhibida por la incubación de las células timocito caninas con el anticuerpo 2D7 en CCR5 (figura 1), que bloquea la unión de gp120 (26). Las proteínas -gp120 FITC no se unieron apreciablemente al parental, CCR5 negativa, células Cf2Th timocito caninas en la presencia de 100 nM sCD4. Estos estudios muestran al CD4 dependiente de la unión de gp120-FITC al receptor CCR5 (26-30). Las condiciones de unión por saturación (figura 3) para cada uno de los dos CCR5 que unen a las proteínas gp120 (Bal, CM235) fueron estudiadas agregando cantidades crecientes (0.25 a 2.5 nM) de gp120 etiquetado FITC a la célula (Cf2Th/sy n R5) (figura 2, derecha). La unión no específica fue determinada en la ausencia de sCD4 y fue sustraída de la unión, en presencia de 100 nM sCD4. La unión por afinidad más alta y saturable de gp120Bal ocurrió con Kd de 0.46 + .17 nM (P<.05), y con Kd de 0.77 + .35 nM (P<.05) para gp120CM2351, resultados que están en acuerdo con otros (27, 31, 31, 32) DAPTA inhibe la unión de la proteína gp120 de envuelta a CCR5 Para definir la potencia de los inhibidores del péptido de gp 120 que se unen a los receptores CCR5, los estudios de inhibición fueron realizados usando una concentración fija del complejo sCD4/gp120, en la presencia de concentraciones crecientes del ligando quimiocina selectivo CCR5 ???-µ, y DAPTA. Estos estudios están ilustrados en la figura 4. La unión específica total fue definida como la diferencia en la unión de FITIC-gp120 con o sin sCD4 agregado (100 nM). La unión de gp120Bal_/sCD4 a las células CCR5 (Cf2Th/synR5) fue inhibida totalmente por ???-1µ (IC50= 1.5 + .002 nM, P<.05) y DAPTA (IC50 = 55 + 0.08 pM, P<.05) (figura 3A). La pendiente Hill para DAPTA fue -1.07, consistente con un modelo de unión competitivo de un solo sitio. Similarmente, estudiamos la inhibición de la unión de gp120CMCM235/sCD4 en las mismas células y nuevamente mostraron inhibición sustancial (> 80%) de la unión específica por ???-1µ (IC50 = 1.8 + 0.006 nM, P<.05) y DAPTA (IC50 = 0.32 + 0.3 nM, P<.05) (figura 3B). También mostramos que la unión de gp120CM235/sCD4 a una diferente, línea celular que expresa CD4, (GHOST CD4.CCR5) también fue inhibida por ???-1µ (IC50 = 51 + 0.07 nM, P<.05) y DAPTA (IC50 = 51 + 0.09 pM, P<.05) (figura 3C). Los datos mostrados (paneles A-C) son la media y error típico de la media de tres experimentos, cada uno con determinaciones triplicadas. Los análisis fueron realizados por PRISM. La relevancia de estos hallazgos por la investigación básica y clínica, es que ellas prueban la identificación de la región del péptido T del gp120 como el epítope que se une al co-receptor CCR5 (11) quimiocina. Un esfuerzo de casi 25 años ha fallado en activar clínicamente competidores receptores de péptido corto de CCR5 efectivos. Por ejemplo, dos juegos de todos, inclusive 20 meros que comprenden la molécula gp120 completa fueron preparados y probados para la actividad antivirus. (El segundo juego fue desplazado del marco de lectura 10 posiciones con relación al primero). Ninguna de estas muestras exhibió alguna actividad antiviral. En adición, la falla total al esfuerzo Federal/Privado de $ 30B, y 10 años, para identificar una vacuna eficaz de VIH, reconocida en pláticas con del Dr. Barney Graham, Director de Estudios Clínicos, en el Vaccine Research Center, NIH, podría presentar una plática titulada, "Is an Efective HIV Possible" (15 de Febrero 2006, Bethesda, MD), indica la no-evidencia de nuestro método, que conduce a la capacidad de crear anticuerpos anti-VIH que neutralicen ampliamente. Es, de hecho, la inhabilidad para inducir tales anticuerpos que es la base para la falla de todos los intentos de vacuna presentes y pasados. Los péptidos de la gp120 de la envuelta del VIH que se unen al receptor CCR5 pueden utilizarse como inmunógenos para bloquear el virus que se une al receptor. Casi todas las vacunas de anticuerpo exitosas trabajan bloqueando la unión o enlace del receptor viral. En los últimos años, los análisis de las propiedades del péptido formulado y los estudios estructurales detallados (MacPhee, inéditas) han revelado la muy fuerte tendencia de DAPTA para agregarse después de la disolución rápida en una solución acuosa que resulta en la pérdida de ambas, la biodispon ibilidad y actividad antiviral. Está claro ahora que esta propiedad de DAPTA ha conducido algunas veces a resultados clínicos subóptimos (33) e incluso a resultados in vitro falsamente negativos. Por ejemplo, las soluciones de péptido T han sido reportadas para espesar y "gelar", la pérdida potencial de actividad y/o la capacidad de ser transportadas a través de la membrana mucosa, por ejemplo, el epitelio nasal, fue una consideración. Retirando el cloruro de sodio de la formulación y reduciendo la concentración a 5 mgs por ml_ aparenta solucionar el problema. Sin embargo, aún con únicamente 1 mg/mL, el análisis espectropolarimétrico a temperatura ambiente reveló un cambio de un pico largo en el más diluido 0.1mg/ml de 205.4 nm a un pico largo de 237.2 nm, que indica que el péptido T estuvo interactuando con sí mismo a concentraciones más altas en etapas de agregación que conducirían a la gelación. La microscopía electrónica confirmó que el péptido T formó fibrillas, y para nuestro mejor conocimiento el péptido T forma fibrillas más fácilmente que cualquier otro péptido pequeño hasta ahora descrito. Determinación de la formación de fibrilla La formación de fibrilla del péptido T o análogo del mismo puede determinarse usando microscopía electrónica. Una alícuota de 2 µ? de la solución de DAPTA en agua fue aplicada a una rejilla EM de níquel revestido de formvar/carbón. Las rejillas fueron aclaradas x3 con 10 µ? de agua destilada y manchadas con I0 µ? de 2 % de acetato de uranilo. Las muestras fueron examinadas en un microscopio Tecnai FEI TEM con un filamento LaB6 (120kv) y reflejado con una cámara Megaview II CCD. La formación de fibrilla del péptido T o análogo del mismo, puede también determinarse usando la unión del tinte. El rojo de Congo fue disuelto en PBS (5 mM de fosfato de potasio, 150 mM de NaCI, pH 7.4) a una concentración de 7 ug/mL. La solución fue enfriada a 4°C, y DAPTA agregado como una solución madre en 10 mg/mL de agua, para rendir la concentración del péptido final en la solución del tinte de 0.48 mg/mL. La solución del péptido inmediatamente después de la disolución del polvo, fue comparada con una solución madre añejada que contiene los péptidos agregados. Los espectros fueron recogidos entre 400-700 nm, a 40°C. La formación de fibrilla del péptido T o análogo del mismo puede también determinarse usando la espectroscopia Dicroísmo Circular (CD). Diez soluciones mg/mL en agua de cada péptido preparado recientemente o que contiene agregados de fibrillas fueron agregadas en agua destilada a 4°C a una concentración de 50 ug/mL. Los espectros "CD" fueron recogidos en un espectrómetro modelo J-810 Jasco usando una cubeta de cuarzo de longitud de camino de 0.1 cm, entre 190-250 nm, con un intervalo de 1 de minuto, y un tiempo de reacción de 2 seg. Aún otro método para determinar la formación del péptido T o análogo del mismo es realizado usando la Espectroscopia Fourier Transform Infrared (FTIR). DAPTA fue disuelto en agua deuterizada, a una concentración de 10 mg/ml e incubado bajo condiciones de temperatura y tiempo que promueven la formación de fibrilla. Muestras de 25 ul fueron después colocadas en una célula de transmisión pre-enfriada con ventanas NaCI separadas por un espaciador de 6 um. Los espectros FTIR fueron recogidos en un espectrómetro de transformación Fourier BioRad FTS -175C en el modo de transmisión usando un detector DTGS. 2,506 interferogramas fueron registrados con una resolución de 2 cm- 1. El vapor de agua fue sustraído y las líneas base de los espectros corregidas. PROPIEDADES INMUNOGENAS Unión del Anticuerpo Anti-Péptido DAPTA a Gp120 Monomérico La figura 5 ilustra la unión del Anticuerpo anti-péptido DAPTA a gp120 monomérico. En el panel A, IIIB gp120 (·); gp120 ADA () y gp120 Bal ( ? ) están revestidos directamente en microplacas (ELISA revestido). Anti-péptido DAPTA diluido serialmente veinticinco veces fue agregado a los pozos. La unión del anticuerpo fue detectada por el anti-conejo IgG-HPR-asno (KP&L) 1:1000 y medido como densidades ópticas a 450 nm. El resumen fue estimado por un control normal de suero de conejo. Las concentraciones del anticuerpo V2 requeridas para alcanzar la unión mitad-máxima de las tres proteínas gp120 probadas estuvo entre 8-25 ng/ml. Los datos son de un experimento representativo, pero cada punto del dato es un valor medio de triplicados. El panel B muestra reactividad de gp120 IIIB con el -anti-péptido DAPTA en presencia de sCD4 (¦) y sin sCD4 (0). El anticuerpo se une con alta afinidad en presencia de sCD4. Los resultados son de un experimento representativo repetido dos veces. Cada punto de entrada de datos es un valor medio de triplicados. Unión del Anticuerpo Anti-Péptido T DAPTA a gp120s Solubilizado La afinidad del anticuerpo anti-péptido T DAPTA y de la molécula purificada IgG a las proteínas recombinantes gp120 de una variedad de cepas virales adaptadas en laboratorio fueron medidas por el ensayo de ELISA. El suero policlonal anti-péptido T DAPTA unido a las proteínas gp120 solubilizadas con alta afinidad a gp120 ADA y gp120 IIIB y con baja afinidad inferior a SF162 gp120. Esto está ilustrado en la Figura 6. Los resultados capturados de ELISA están en una buena correlación con la actividad neutralizante e indican que una prueba simple de ELISA como aquí hemos desarrollado puede discriminar anticuerpos candidatos a vacunas. GP120s (1 pg/ml) fueron capturadas por el suero policlonal de cabra gp120 anti-VIH-ISF en microplacas (ELISA capturado). El suero anti-péptido T DAPTA diluido serialmente tres veces fue inactivado por calentamiento y agregado a los pozos. La unión del anticuerpo fue detectada por el anti-conejo IgG HRP-asno y medido como densidades ópticas en 450 nm. El resumen fue estimado por la cantidad de suero de conejo pre-inmune contra el péptido T DAPTA unido y sustraído. Las líneas representan los datos de dos experimentos realizados en triplicado. La unión del Anticupero Anti-Péptido T DAPTA a gp120 Solubilizado es Dependiente de CD4 La unión por afinidad del Sitio purificado Anti-Unión IgG a gp120s con y sin Cd4 soluble agregado (sCD4) fue estudiado usando la fracción de inmunoglobulina derivada del antisuero de conejo anti-péptido T DAPTA completo purificado de un péptido T cargado con afinidad a ELISA. Esto se ilustra en la figura 7. Las proteínas gp120 solubles fueron capturadas en los pozos de microplaca revestidos con suero anti-VIH-ISF2 o sCD4 (1 ug/ml). El anti-péptido T DAPTA IgG diluido serialmente tres veces fue agregado en triplicado para cada dilución. La unión del péptido T DAPTA IgG fue detectado por el anti conejo IgG HPR-asno en un tampón de bloqueo con 2 % de suero de cabra normal. Los resultados son la media de dos experimentos realizados en triplicado. Las barras de error mostraron el SD, p<0.05. Los anticuerpos que en gran parte reconocen gp120 cuando están unidos a la molécula CD4 son de interés particular y de relevancia en la vacuna. Los, así llamados, anticuerpos (CD4i) inducidos por CD4 inhiben CCR5 y CXCR4 que se unen al complejo gp120-CD4 (34-36) y así son percibidos según sean dirigidos contra un co-receptor que se une a la conformación permisiva de gp120. Sin embargo, los ejemplos de anticuerpos CD4i aislados de humanos, son limitados y los prototipos exhiben únicamente actividad neutralizante débil contra los aislantes de VIH-1 primarios. La aparente rareza de estos anticuerpos ha sido atribuida a la inaccesibilidad relativa de los epítopes CD4i (6, 37, 38). Hay únicamente un número muy limitado de tales anticuerpos que han sido encontrados en el sitio (CD4i) inducido por CD4 de gp120. Un Ab que reconoce la conformación accionada CD4 de gp120 probablemente se deberá dirigir contra el co-receptor que une al epítope. Los anticuerpos anti-péptido T son aquí mostrados para reconocer preferencialmente un epítope inducido por CD4 y por lo tanto se presume se unen cerca o en el sitio de unión del co-receptor. Sitio Anti-Unión Abs que bloquea la Unión de GP120/sCD4 al Co-receptor de Entrada CCR5 La afinidad del antisuero anti-péptido T DAPTA y el anti-péptido T DAPTA IgG purificado a gp120s fue estudiada posteriormente en Western blot. Las partículas del virus de dos cepas virales de VIH-1, JR-CSF y SF 162, fueron concentradas, Usadas en presencia de NP40 y las proteínas virales fueron separadas electroforeticalmente en 4-12 % de gel de poliacrilamida. Tres diferentes concentraciones fueron utilizadas de acuerdo al antígeno p24 medido en los lisados- , 2 y 3 ng por ranura. Las proteínas virales fueron transferidas en la membrana NEM PVDF e hibrizadas con anti-péptido T DAPTA IgG (1:200) purificado. El anticuerpo reconoció las proteínas gp120 virales en manera dependiente de dosis. Esto es ilustrado en la figura 8. En el panel A las partículas del virus fueron concentradas y separadas en 4-12 PAGE SDS. Los lisados virales cargados contuvieron las proteínas 1, 2 y 3 ng p24 según lo medido por un ELISA. La membrana fue hibrizada con la afinidad del anti-péptido T DAPTA purificado contra el péptido T DAPTA IgG (1:200) y manchado con anti conejo IgG HRP-asno (1:2000). La película fue desarrollada con la solución ECL (Amersham). El experimento fue repetido dos veces. En el panel B, el Usado completo de la cepa viral de VIH-1 IIIB y las proteínas recombinantes g p 120111 B solubles en la concentración 2 pgs/ml fueron separadas electroforeticalmente en 10 % de PAGE SDS y transferidas. Las membranas fueron incubadas con el suero policlonal anti-péptido T DAPTA (# 195), suero pre-sangrado y suero anti-péptido T DAPTA en presencia del péptido T DAPTA 10 µ?. Es mostrada la especificidad del anticuerpo anti-péptido T DAPTA a las proteínas de la envuelta de VIH-1 gp120I I IB. El péptido T DAPTA bloquea al anti-péptido T DAPTA que se une a las proteínas gp120 (figura 8 A). Propiedades neutralizantes del Anticuerpo Anti-péptido DAPTA base péptido de V2. La neutralización de VIH-1 fue determinada por un ensayo de cuenta sincitial en las células CD4+ CXCR4/CCR5+ (P7) HELA. Las unidades de foco azul (BFU/pozo) fueron contadas bajo un microscopio. Los datos, resumidos en la tabla 1 abajo, fueron obtenidos usando una concentración de anticuerpo fija de 0.125 pg/pozo. Las titulaciones de la actividad neutralizante de un IgG purificado también fueron realizadas. La fracción de IgG siguió la curva de titulación similar a la del antisuero policlonal contra el péptido DAPTA, con una afinidad inferior (datos no mostrados). La inhibición de la infección son los valores medios de triplicado y fue calculada por la fórmula: % de Inhibición: 100-[(BFU con Ab: BFU sin Ab)x100].

Para comparar la potencia (concentraciones requeridas para alcanzar la inhibición del 50 % [IC50]) del anticuerpo contra el péptido T/DAPTA para algunos aislantes ciado B estudiados comúnmente, utilizamos un sola-ronda de la infección del virus en un ensayo de formación de focos usando las líneas de célula (HELA CD4- galactosidasa y HELA CD4.CCR5) que han definido la especificidad del co-receptor (39) (tabla 1). En los experimentos anteriores, el ensayo de infección fue realizado como sigue. Una línea de célula HeLa (MAGI) fue usada para que ambos expresen altos niveles de CD4 y contengan una copia integrada única de un gen beta-galactosidasa que esté bajo el control de un virus de inmunodeficiencia humana truncado tipo 1 (VIH-1) de repetición terminal larga (LTR) (40), y esta línea de célula con el gen CCR5 (MAGI-CCR5) (Pirounaki y colaboradores, 200), fueron obtenidos del NIAID AIDS Repository. Determinar la sensibilidad del subtipo del receptor de la quimiocina del péptido T, MAGI y MAGI-CCR5, son usados según lo descrito abajo, y fueron adaptados de protocolos anteriores (40-43). Brevemente, 10.000 MAGI o MAGI-CCR5 células/pozo fueron sembradas en una placa de 96-pozos. Un día después el medio fue retirado y las diluciones del péptido T o ???-1µ fueron agregadas en el medio Opti-MEM (Gibco BRL, Life Technologies) con 20 pg/ml DEAE-Dextrina. Las placas fueron cultivadas por 60 minutos, 37°C, 5% C02, y después las diluciones del virus agregadas con el cultivo por 1.5 horas más. El inoculo viral fue retirado y los pozos lavados dos veces con 0.2 mL del medio Opti-MEM y el medio fresco (150 µ1/???? DMEM) agregado. Después cultivado por 46 horas más. Las células fueron fijadas por 5 minutos a temperatura ambiente con 1 % de formaldehído, 0.2 % de glutaraldehido en PBS, lavado dos veces con PBS, manchado con 4 mM de ferrocianida de potasio, 4 mM de ferricianida de potasio, 2 mM Mg Cl, y 0.4 mg/ml 5-bromo-cloro-3-indolilo- -D-galactopiranosida (tinte X-gal, Inalco Pharmaceuticals, St. Luis Obispo, CA) en PBS a 37°C, 5 % C02, por 50 minutos, y lavado dos veces con PBS. Los focos azules fueron contados microscópicamente y los niveles de infección fueron registrados como unidades de foco azul (BFU/pozo). Los niveles resumidos de BFU/pozo fueron normalmente <3 en todos los ensayos. Un antisuero crudo y el suero de control pre-inmunes fue probados por la inhibición de la contagiosidad de las cepas de CCR5, SF 162 y JR-CSF en el ensayo de infección descrito. Los títulos neutralizantes (IC50) con un intervalo de 1:20 a 1:40 en los sueros inmunes y la neutralización no específica en los sueros pre-inmunes fue insignificante (no mostrada). Para mejorar la especificidad y potencia un antisuero purificado por afinidad fue preparado para otros estudios usando una columna del péptido T/DAPTA. Los títulos neutralizantes de la fracción del anticuerpo purificado por afinidad para las cepas de CCR5, SF 162 y JR-CSF, estuvo entre 0.25-125 Mg/ml para SF 162 y 0.125 y 0.06 Mg/ml para la cepa viral JR-CSF (no mostrada). La titulación de la actividad neutralizante de la fracción IgG purificada siguió la curva de titulación similar a la del suero policlonal contra el sitio de unión del co-receptor gp120 con una afinidad inferior para la cepa de la vacuna SF 162. Los sueros pre-sangrados fueron probados en los mismos análisis. La inhibición resumida tuvo un intervalo entre 2-4 por ciento en 1:20 muestras de suero diluidas. La actividad del sitio de unión del co-receptor gp120 de Ig por afinidad purificada fue evaluada después en una muestra más grande de los aislantes de VIH elegidos para su diversidad y representación entre diferentes ciados. Una reducción de valor de 19 % está basada en el 95 % del nivel de confianza obtenido con el suero de conejo normal (Laboratory of Antiviral Drug Mechanisms, Science Applications International Corporation at Frederick National Cáncer Institute-Frederick Cander Research and Development Center), probado en diluciones 1:5. Los resultados presentados en la tabla X son de por lo menos dos experimentos independientes para cada cepa viral realizados en triplicado. La inmunoglobulina purificada por afinidad en el sitio de unión del co-receptor gp120 mostró actividad neutralizante muy alta contra dos aislantes primarios, 93BR019 del ciado B/F y 931 N 101 de cepas virales del ciado C y actividad neutralizante significante contra todos excepto dos cepas. La actividad contra los aislantes virales X4 fue inesperada e indica que estos péptidos pueden ser útiles para crear inmunógenos o terapéuticos contra cepas dual trópico VIH y R5, X4. Neutralización de VIH Por Un Anti-Péptido T Puro por Afinidad La actividad neutralizante del sitio anti-unión IgG con IC50 0.045 pg/ml contra aislantes ciado C de VIH- (Du123 y Du156) ha sido confirmada en una solo ronda del ensayo del gen reportero luciferasa por Duke Univerisity AIDS Vaccine Lab. (David Montefiori, comunicación personal). Los datos son como sigue: Tabla 8 Los valores son la dilución del suero en el cual las unidades de luminescencia relativas ( LU) fueron reducidas 50 % comparadas a los pozos de control de virus (no muestra de prueba) en células TZM-bl. Las muestras con actividad están en negrilla. Secuencias Repetidas Las secuencias útiles del pentapéptido , pueden también identificarse por su motivo repetitivo, que ocurre de 2 a 5 veces en una matriz lineal ya sea separada o no separada por todas partes desde 1 a varios cientos de aminoácidos, es decir que no ocurre en V2 si no en cualquier otra parte de la proteína de la envuelta. La propiedad de agregación indeseable de estos péptidos puede ser útil para construir la estructura terciaria de la envuelta viral con estas secuencias de pentapéptidos que sirven como sitios de adherencia "tipo grapa" dentro de la envuelta. En cualquier caso, la repetición de secuencias del pentapéptído dentro de cualquier virus dado puede enseñar útiles secuencias adicionales incluso si no se conforman a las reglas. Por ejemplo, la repetición EYIYT fue repetida cinco veces. Esta repetición no sigue de cerca una secuencia de consenso. No obstante, porque se repite, es agregado a la biblioteca de compuestos activos. Actividad Presente Del Receptor CCR5 Los candidatos útiles habrán preservado la afinidad para el receptor CCR5. Por consiguiente, la actividad de los ensayos (, ensayos de unión, antiviral u otros ensayos del receptor CCR5 de bioactividad relativa) de las varias composiciones del pentapéptido (es decir con sus varios enlazadores e inmunogenos unidos) por afinidad relativa a los receptores CCR5 será un análisis útil adicional. Entre más alta la afinidad para los receptores CCR5 mayor es la probabilidad de que el producto final tendrá actividad terapéutica. Los candidatos útiles exhibirán normalmente amplia actividad antiviral antes de ser utilizados como inmunogenos. Así, se espera que estas vacunas por sí mismas sean terapéuticas. Un aspecto especialmente importante de la invención se refiere a la acción farmacológica de estos péptidos como antagonistas mixtos. La versión agonista mixta (parcial) de un fármaco es un tipo favorecido clínicamente de la interacción del receptor según lo observado por Nobelist Arvid Carlsson (Medicine/Physiology, 2000). La desensibilización, resistencia, y efectos laterales del antagonista completo se evitan normalmente por fármacos agonistas parciales/mixtos y las compañías farmacéuticas han creado fármacos exitosos de este tipo. Los fármacos agonistas parciales trabajan para balancear la actividad del receptor (ver Redwine, 1999, que muestra los aspectos del agonista mixto de la acción DAPTA) y por lo tanto son terapéuticos preferidos. Desarrollamos los métodos aquí descritos para determinar la actividad biológica intrínseca de estos péptidos y buscamos la creación de agonistas mixtos tales como los péptidos de la tabla 6, que según lo esperado, no ha mostrado inducir la resistencia en el receptor después de 6 meses de administración humana. VIH-1 gp120 es una de las proteínas más extensivamente glicosiladas. Contiene 23 o 24 sitios de glicosilación ligado a N, y los glicanos unidos a estos sitios cuentan por aproximadamente una mitad de la masa total de la proteína. Numerosos estudios usando inhibidores de glicosilación y glicosidasa han revelado la importancia de las fracciones del carbohidrato en determinar la conformación de la glicoproteína de la envuelta de VIH-1. La mutagénesis dirigida al sitio indicó que la mayoría de los sitios de glicosilación fueron prescindibles individualmente. De los 24 sitios, únicamente 5 (aminoácidos 88, 141, 197, 262, y 276), todos de los cuales están localizados en la mitad de la terminal amino de gp 120, afectaron la contagiosidad del virus. El sitio 197 ocurre en el V2 cerca o en la localización de la mayoría de los sitios de unión de los péptidos que hemos definido. Por ejemplo, observe que el motivo de glicosilacion T/SxN está con frecuencia presente en los péptidos de la invención. Nuestros resultados indican que un sitio de glicosilacion ligado a N está con frecuencia cerca, en, o dentro de los péptidos de la especificación y además define el epítope de la unión del virus a co-receptores como CCR5. La glicosilacion, si está presente, puede contribuir a la especificidad estructural o neutralización enmascarada por anticuerpos naturales como un medio para evitar la vigilancia inmune de este epítope crítico. Una modalidad de la invención es una composición con las propiedades inmunogénicas. Esta composición está descrita, en general como una combinación de las fracciones A - L - P - C en donde A es cualquier adyuvante, L es cualquier fracción ligante, P es una fracción de péptido y C es un grupo de protección. En los compuestos descritos, cualquier adyuvante puede utilizarse. El péptido y las regiones de ligaduras están pensadas para actuar independientemente del adyuvante y así no limitan la opción del adyuvante de ninguna manera. Algunos, pero no todos los ejemplos del adyuvante útil son: cualquier adyuvante aceptible humano, antígeno nuclear de la hepatitis, polilisina, etc. Se cree que incluso el adyuvante desarrollado después de esta descripción trabajará tan bien como los desarrollados antes. Alternativamente, un adyuvante puede dispensarse bajo ciertas circunstancias. Por ejemplo, si los péptidos son hechos para agregarse. Otra modalidad de la invención es una composición con propiedades terapéuticas. Esta composición está descrita, en general como una combinación de fracciones L - P - C en donde L es cualquier fracción, pero preferible una fracción de péptido corta, P es otra fracción de péptido y C es un grupo de protección. Con respecto a la longitud de las regiones combinadas de L y P, se cree que cada longitud específica de aproximadamente 7 a aproximadamente 16 aminoácidos funcionarán. En una modalidad preferida el intervalo combinado es de 7 a 11. En aún otra modaldiad preferida el intervalo combinado es de 7 a 9. Aún otra modalidad preferida es 8. Alternativamente, ya que los péptidos neurales naturales existen que son 28 aminoácidos, se cree que las regiones de péptidos de las composiciones descrias pueden ser de aproximadamente 28 aminoácidos en longitud. (Ver Tabla 4). Los varios compuestos descritos en la presente están diseñados para trabajar solos o en combinación, como cócteles. Cualquier número de diferentes compuestos puede utilizarse sin límite superior. Se cree que la mayoría de los cócteles útiles consistirán desde 2 a 7 diferentes compuestos. La fracción C puede ser cualquier grupo de protección. Una modalidad preferida es la amida.

La descripción también comprende compuestos y métodos de análisis para los compuestos que tienen las actividades siguientes: supresión de VIH en R5 o cepas (R5/X4) dual-trópico, en macrófagos derivados de monocitos (MDMs), microglia, o células T en personas infectadas con el virus VIH. Otras actividades incluyen cualquier enfermedad humana tratable por modulación de los receptores CCR5 que incluyen pero no se limitan a Neuroinflamación que causa Alzheimers, esclerosis múltiple, psoriasis y artritis. Éstos serán suprimidos o eliminados y los procesos de la enfermedad detenidos o invertidos, y los beneficios clínicos ocurrirán . Finalmente, la descripción comprende métodos de análisis pra la estabilidad de la composición. Esto es determinado por un método de caracterización biológica seleccionado del grupo que consiste de la contagiosidad viral, quimiotaxis, activación Cinasa MAP, unión gp120, activación o inhibición de CCR5, o señalización de la proteína-G. Literatura Citada 1. Berger, E. A., P.M. Murphy, and J.M. Farber. 1999.

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Sattentau. 1998. Interactions among HIV gpl20, CD4, and CXCR4: dependence on CD4 expression level, gpl20 viral origin, conservation of the gpl20 COOH- and NH2-termin¡ and V1/V2 and V3 loops, and sensitivity to neutralizing antibodies. Virology. 248:394-405. 33. Simpson, D.M., D. Dorfman, R.K. Olney, G. McKinley, J. Dobkin, Y. So, J. Berger, M.B. Ferdon, and B. Friedman. 1996. Peptide T in the treatment of painful distal neuropathy associated with AIDS: results of a placebo-controlled trial. The Peptide T Neuropathy Study Group. Neurology. AI:\25A-\259. 34. Babcock, GJ., T. Mirzabekov, W. Wojtowicz, and J. Sodroski. 2001. Ligand binding characteristics of CXCR4 incorporated into paramagnetic proteoliposomes. J Biol Chem. 276:38433-38440. 35. Trkola, A., T. Dragic, J. Arthos, J.M. Binley, W.C.

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Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Vacuna immunógena y composición terapéutica eficaz contra el Virus de I nmunodeficiencia Humana que comprende la estructura: A-L-P-C- en donde, A es cualquier adyuvante, L es cualquier fracción ligante P es un péptido que tiene la estructura R-1R2R3R4R5 en donde: es seleccionado del grupo que consiste de N, S, T, D, R, K, A, o E R2 es seleccionado del grupo que consiste de N, S, T, D, G, I, o E R3 es seleccionado del grupo que consiste de, N S, T, D, G, R, K, I, Q, H, o E R4 es Y R5 es seleccionado del grupo que consiste de N, S, T, R, K, A, M, W, o G o sus amidas; y cualquier otro aminoácido, C es cualquier grupo de protección.

2. Composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde L consiste en tres fracciones de aminoácido y P consiste en cinco fracciones de aminoácido.

3. Composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde L es la fracción tripeptido A - S - T.

4. Composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde R2 es seleccionado del grupo que consiste de T, S y N.

5. Composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde P es seleccionado del grupo que consiste de EYIYT, INNYT, ISNYS, ISNYT, ISYRL, NNRYR, NNSYR, NSNYS NSSYR, NTIYT, NTSYG, NTSYM, NTSYR, NTSYS, SSEYR, SSRYR, SSTYR, STNYT, STSYR, TISYR, TSNYS, TTNFT, TTNYT, ALL D-TTNYT, TTSYR5 TTSYT y YTSYR.

6. Composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde A es cualquier adyuvante aceptable humano.

7. Composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde C es un grupo de amida C-terminal.

8. Composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde comprende un cóctel de dos a cinco componentes, en donde estos componentes se diferencian en la secuencia de las fracciones del aminoácido en la región P.

9. Composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde la región L-P comprende un péptido con una longitud de aproximadamente 7 a aproximadamente 16 residuos de aminoácido.

10. Composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde los aminoácidos son estéreo-isómeros D.

11. Composición terapéutica que tiene la estructura: L - P - C en donde, L comprende cualquier secuencia tri-péptido, P comprende un péptido que tiene la estructura F^RaRaF^Rs en donde: es seleccionado del grupo que consiste de N, S, T, D, R, K, A, o E R2 es seleccionado del grupo que consiste de N, S, T, D, G, I, o E R3 es seleccionado del grupo que consiste de, N S, T, D, G, R, K, I, Q, H, o E R4 es Y R5 es seleccionado del grupo que consiste de N, S, T, R, K, A, M, W, o G o sus amidas; y cualquier otro aminoácido. C es cualquier grupo de protección.

12. Composición de conformidad con la reivindicación 11, en donde L consiste de tres fracciones de aminoácido y P consiste en cinco fracciones del aminoácido.

13. Composición de conformidad con la reivindicación 11, en donde L es la fracción tripéptido A- S - T.

14. Composición de conformidad con la reivindicación 11, en donde R2 es seleccionado del grupo que consiste de T, S y N.

15. Composición de conformidad con la reivindicación 11, en donde P es seleccionado del grupo que consiste de EYIYT, INNYT, ISNYS, ISNYT, ISYRL, NNRYR, NNSYR, NSNYS NSSYR, NTIYT, NTSYG, NTSYM, NTSYR, NTSYS, SSEYR, SSRYR, SSTYR, STNYT, STSYR, TISYR, TSNYS, TTNFT, TTNYT, ALL D-TTNYT, TTSYR, TTSYT y YTSYR.

16. Composición de conformidad con la reivindicación 11, en donde A es cualquier adyuvante aceptable humano.

17. Composición de conformidad con la reivindicación 11, en donde C es un grupo amida C-terminal.

18. Composición de conformidad con la reivindicación 11, en donde comprende un cóctel de dos a cinco componentes en donde estos componentes se diferencian en la secuencia de las fracciones del aminoácido en la región de P.

19. Composición de conformidad con la reivindicación 11, en donde la región de L-P comprende un péptido con una longitud de aproximadamente 7 a aproximadamente 16 residuos de aminoácido.

20. Composición de conformidad con la reivindicación 11, en donde los aminoácidos son estéreo-isómeros D.