CN101242854A - 治疗肽及疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了广泛诱导HIV治疗剂和诱导不同HIV分化枝的抗体的疫苗的组合物，还涉及鉴别HIV gp120衍生的短肽序列免疫原和从鉴别的组成CCR5结合位点的肽中产生各种治疗组合物的能力。本发明还揭示了选择可能是有效治疗如下疾病的药物的候选肽序列的方法：阿尔茨海默氏症，银屑病，多发性硬化及与人炎症级联反应以及相关逆转录病毒如导致热带痉挛性瘫痪的HTLV－1相关的其它疾病。

Description

治疗肽及疫苗

本申请要求2005年6月23日提交的临时申请系列号60/693,087；2005年6月23日提交的临时申请系列号60/693,088和2005年6月23日提交的临时申请系列号60/693,089的优先权。本申请还与2006年6月23日提交的发明名称为“稳定烷基糖苷组合物及其方法”的申请系列号＿＿相关，它们的内容引入本文作为参考。

发明背景

普遍认为能够抗HIV-1感染和AIDS而起保护作用的疫苗需要这样的免疫原，其诱导高水平的对病毒原始分离株具有强中和活性的抗体，而不考虑其地理学来源、亚型或基因型特异性，目前的疫苗候选物还未达成这一目标。因此，介导广泛中和作用的表位的鉴别对于理想疫苗设计和开发很重要。特别重要的是开发针对分化支C亚型的疫苗候选抗体，所述分化支C亚型存在于发展中国家并包括具有世界范围相关性的新兴毒株，相比之下北美主要流行分化支B亚型。

在HIV感染的个体中HIV包膜是中和抗体的主要靶位。一些中和表位簇看起来至少部分暴露在原始和/或单核细胞嗜性(monocytotropic)分离株的gp120包膜蛋白上。尽管在过去的20年进行了广泛研究，但是仍未发现能引起广泛疫苗中和作用的免疫原。为此，抗HIV感染的疫苗仍难以捉摸。

本发明包括鉴别结合共同受体CCR5的gp120的短序列，其可鉴别能激发对不同的HIV毒株具有强中和活性的抗体的肽以及作为HIV保护作用的免疫策略的重要成分的肽。预期针对这些包含结合位点肽免疫原的附着序列产生的抗体赋予抗HIV病毒(无论何种毒株)的保护作用，也预期它们是治疗性的，即通过被动给药可降低已经感染HIV的病人体内的病毒水平并提供临床益处。

中和抗体应答于HIV-1感染。抗人免疫缺陷病毒型中和抗体在初次感染产生病毒血症之后的几个月内首次出现。早期产生的中和抗体是高度类型特异性的。中和抗体应答可以在感染后期扩大(16)，但在大多数患者包括长期感染的个体中通常较少并且是偶发的。

中和抗体识别由gp120外部(exterior)和gp41跨膜糖蛋白组成的HIV-1包膜糖蛋白。gp120糖蛋白结合靶CD4和趋化因子受体CCR5和CXCR4。仅在极少数情况中产生针对gp120表位的抗体，其仅在gp120与CD4形成复合物之后表达。确信实际的共同受体结合位点(希望的疫苗靶位)仅在CD4与gp120结合时形成。这些CD4诱导的(CD4i)抗体阻断CCR5和CXCR4与gp120-sCD4复合物的结合。分离自HIV-1感染的人体的CD4i抗体的数量较低。

大多数对HIV-1疫苗的初始研究涉及开发可引起中和抗体产生的疫苗。这些中和抗体在动物模型中的作用有限并且几乎完全特异于接种的病毒毒株。因此这些抗体不是广泛特异性的，不是良好的疫苗候选物。

大多数成功的疫苗可以阻断病毒与其受体的结合，对于HIV而言是共同受体CXCR4和CC5(1，2)。因此预期共同受体结合位点的鉴别(过去20年的研究焦点，但迄今为止仍未完成)可以产生这样的免疫原，其对于不同的毒株能产生希望的广泛中和作用，适合用于疫苗中。

本申请的部分主题是抗具有生物学活性的共同受体结合位点的抗体。这种抗体在体外研究中示出对gp120-sCD4复合物与CCR5受体结合的强抑制作用，而且针对正确的肽构象产生的抗体诱导广泛中和作用的抗体，因此预期能提供抗HIV-1感染的保护性免疫，即疫苗。

在过去的十多年里，仅分离了少数能介导大多数HIV-1分离株的广泛强中和作用的人MAb。这些MAb中有两种结合gp120表面(MAbs b12和2G12)(3，4)，一种结合与gp41的跨膜结构域紧邻的表位。MAb b12识别包含gp120的C3-V4区域和碳水化合物的复杂的不连续表位。MAb 2F5结合gp41的外结构域上的线性表位；然而，这个表位的简单性不可靠，很可能比六个残基的线性序列更复杂。MAbs b12、2G12和2F5已经示出针对多种原始分离株的体外中和活性。迄今为止对所有重组的基于包膜的疫苗候选物均进行了临床测试，甚至包括已知介导广泛中和作用的表位，但这些均未引起针对原始分离株的中和抗体的显著产生。基于肽的疫苗候选物也未能引起足够的免疫应答。

肽DAPTA(Dalal-肽T-酰胺，(5))的同源序列存在于多种HIV-1分离株的V2中(我们已经检测了4，078个序列)。我们使用针对肽DAPTA的多克隆纯化IgG抗体的结果显示出针对原始的和实验室适应的(laboratory adapted)毒株的显著中和活性，提示来自与桥层(bridging sheet)紧邻的V2结构域羧基末端的8个序列代表着新的中和表位。

多克隆肽DAPTA抗血清的产生

为了产生亲和性纯化的抗体，向六只兔中依次皮下注射如下材料进行免疫：1)悬浮于Freund′s完全佐剂中的75μg肽DAPTA(第1天)，2)悬浮于Freund′s不完全佐剂中的75μg DAPTA(第-20天)，3)无佐剂的150μg DAPTA(第35天)。为了测试血清转化，将兔在第-1天及随后每周从耳静脉中取血样，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测试血清，这使用与辣根过氧化物酶偶联的纯化的肽DAPAT和山羊抗兔IgG包被的微滴定平板来进行。随后通过心脏穿刺取血清阳性兔的血样。存在于抗血清中的肽DAPTA抗体通过使用与纯化的肽DAPTA结合的亲和性琼脂糖层析柱利用亲和层析法进行纯化。

发明概述

如下是本发明一些优选实施方案的概述，这些实施方案无以任何方式限制本发明之意。本发明揭示了广泛诱导针对不同的HIV分化枝的中和抗体的组合物，其是有效疫苗的关键成分。

一些实施方案涉及鉴别以下物质的能力：HIV gp120-衍生的短肽序列免疫原和从鉴别的组成CCR5结合位点的肽制备的各种治疗组合物。所述肽通过分析不同HIV毒株的肽序列、相关病毒毒株的序列、其它病毒包膜的序列及选择的神经肽的序列而进行选择。

进一步地，其它实施方案提供了作为HIV治疗剂或者当给予人体时作为免疫原以广泛诱导活性抗HIV疫苗抗体的组合物。

进一步的实施方案涉及在有效的治疗性配方中稳定肽、降低聚集和增强免疫原性的能力。更特别地，本发明提供了治疗组合物，其包含至少一种自身结合或者自身聚集的肽或蛋白质药物及至少一种表面活性剂，其中所述表面活性剂由至少一种烷基苷和/或糖烷基酯组成。

进一步的实施方案还涉及一种新的选择下述肽序列的方法，所述肽序列是在治疗如下疾病中提供有效治疗作用的药物的可能候选物：阿尔茨海默氏症，银屑病，多发性硬化，及与人炎症级联反应以及相关逆转录病毒如导致热带痉挛性瘫痪的HTLV-1相关的其它疾病。

附图简述

图1：DAPTA阻止gp120-CD4复合物与CCR5受体的共免疫沉淀。

图2：GP120的CCR5结合分析。

图3A-B：荧光标记的gp120(FITC-gp120)仅在存在sCD4的条件下有效结合Cf2Th/synCCR5细胞。

图4A-C：DAPTA抑制gp120包膜蛋白与CCR5结合。

图5A-B：抗肽DAPTA与单体gp120的结合。

图6：抗肽T DAPTA血清与gp120的结合亲和性。

图7：抗肽T DAPTA IgG与gp120蛋白质的可溶性CD4依赖性结合。

图8：抗肽T IgG和多克隆血清与膜固定的病毒和重组gp120蛋白质的亲和性结合。

发明详述

与先前研究的产品和方法相反，本发明揭示的产品和方法显现未曾预料的有效抗HIV活性和其它治疗性质。在如下的实施例中，示出了本发明的一些但非全部的实施方案。

本发明揭示了gp120的V2区域中的生物活性五肽家族，它们具有阻断共同受体结合的可变但同源的序列。在先前的研究中，认为V2区域在gp120与受体的结合及感染性中不发挥重要作用。认为缺少V2的突变体是感染性的(6，7)。与V2环相反，已经广泛提议V3环含有gp120的受体结合表位(7-9)。还认为这种同源序列来自它们可在其中出现的gp120的V2之外的其它区域。

本发明描述了包含具有CCR5受体活性的一或多种肽的配方。与肽T(衍生自SF-2分离株)同源的序列存在于众多HIV-1分离株的V2中的相似位置。我们已经检测了Entrez数据库中4,078个包膜(gp120)V2序列。在这些序列中，60％是xTxYx或xNxYx形式，23％是xSxYx形式，而其余的17％分散于10种其它次要基序(minormotif)，流行性(prevalence)为2-7％。这些不同的包膜衍生的五肽序列的重要性是确定受体活性基序，如其中包含了超过80％的可得序列的两种主要基序(major motif)，并且添加了一些次要基序的例子以保证完整性。从获得的结构中，可以设计单独的肽或在混合物中的肽，其对于看起来不同的HIV毒株具有广泛特异性，可以作为治疗或疫苗免疫原。

我们研究的V2序列在众多但非全部的HIV分离株中几乎相同的位置(V2，接近主干)出现，其与肽T DAPTA的末端5个氨基酸有一些同源性。这些肽与VIP/PACAP/GHRH肽的成员同源。已经合成了许多这些病毒衍生的肽和神经肽(包括表1所示那些肽)并对其进行了测试，示出它们具有与肽T DAPTA八肽相同或者甚至更强的生物活性。从药理学而言，这些五肽是趋化因子趋化现象的部分拮抗剂(10)。DAPTA的拮抗剂效应归因于其阻断gp120-sCD4与CCR5的结合(11)或者阻断gp120诱导的体外神经元杀死作用(12)的能力。GP120的V2相关性五肽的治疗性和疫苗免疫原文库的鉴别

下表1含有19种有用的五肽，从中可以选择治疗肽和疫苗成分。

            表1

序列	在V2末端的频率(4085个可获得序列)
		NTSYR	1164
SSEYR	308
		NTSYM	127
YTSYR	121
		NTSYT	75
NSEYR	73
		TTSYR	73
TTSYT	70
		NTSYS	64
STSYR	63
		NSSYR	50
NNSYR	41

NTRYR	38
		STEYR	15
TTNYT	14
		NTEYR	11
NTNYR	6
		NGSYR	3
NSSYT	1

在下表中列出了V2五肽及其相应的HIV分离株。

                    表2

SF-2	ASTTTNYT*	BAL	NNRYR
				SF-2	TTNYT	ADA	NTSYR
IIIB	TTSYT	WMJ-1	SSTYR
				RFII	NTSYG	NY5	NISYT
Z3	SSTYR	合成的	TTNdY#T

注：^*是肽T的序列，末端五肽突出显示，#是在第4位具有D-酪氨酸的无活性类似物(12)。表中列出了V2肽的HIV分离株及实际的肽序列。这些肽被认为是类似物，因为酪氨酸(Y)在相同位置出现，丝氨酸(S)和苏氨酸(T)是结构相关的氨基酸，仅一个甲基基团不同。注意到了略微的差异，这些结构细节已经在先前研究中详细论述(18，57)。令人感兴趣的是虽然肽T衍生自实验室适应的病毒SF-2(先前称作ARV，(13))，但是其具有抗CCR5的活性。这提示这些肽中的一些肽对于相关的CXCR4进入受体及一些VIP受体具有固有(intrinsic)活性(14，15)。少量的修饰会扩大受体的利用，这是在体内出现的一种效应，导致在HIV进程晚期出现所谓的“双嗜性(dual-tropic)”病毒分离株，其也利用CXCR4进入受体。

脑病毒分离株似乎包含独特的包膜蛋白表型，适应于在表达低水平的CD4和CCR5的脑小胶质细胞和巨噬细胞中复制(16)。衍生自脑病毒分离株的包膜蛋白五肽因此可提供阻断HIV毒株的特殊治疗优势，例如感染脑部的、适应于低CD5或者共同受体表达那些毒株。低CD4和/或CCR5感染细胞的能力将提供更广泛的T细胞和巨噬细胞趋向性，因此来自脑适应型毒株的五肽也可用于在不限于脑巨噬细胞或小胶质细胞的不同组织和细胞中抑制适应于低受体数目的HIV毒株的感染，或者用来产生免疫原以用于生产疫苗或治疗性抗体。对适应于低受体数目的病毒分离株的抑制很可能接下来在HIV治疗中是研究的新领域，高效力的配体将是最有效的。通过扫描天然病毒产生的序列，可以优化生物学相关性和实际用途。可以容易地测试候选治疗肽的受体效力，将最高活性的五肽作为药物候选物，并进行进一步的修饰以优化稳定性和生物利用度。

在脑中鉴别的V2受体活性肽治疗剂和免疫原及在选择的神经肽中鉴别的疫苗五肽

下表示出了从参考文献(16)中描述的五个脑分离株中鉴别的序列实例。

表3

脑V2序列
	TSNYS
NSNYS
	TTSYR
NTSYR
	TISYR

除了gp120的V2区域中的五肽，我们注意到这种肽基序还存在于gp120的其它部分、gp41(其是膜结合的)及VIP/PACAP/GHRH相关的神经肽(17)中。这些序列实例在下表中列出。

                表4

神经肽序列	神经肽
		TDNYT	VIP(7-11)，人，大鼠
TDTYT	VIP(7-11)，鸡

TDSYR

GHRH(7-11)，人

因此表明V2相关的肽具有生物学活性，最简单的解释是其对于特殊的趋化因子受体具有药理学活性。在HIV包膜蛋白GP41中鉴别的V2相关的五肽

下表示出了可用作治疗剂或疫苗免疫原的GP41 HIV序列。

                表5

序列	频率	百分比(占702个序列的百分比)
			IDNYT	202	28.8％
ISNYT	192	27.4％
			INNYT	155	22.1％
ISNYS	27	3.8％
			IENYT	19	2.7％
VSNYT	15	2.1％
			ITNYT	9	1.3％
IGNYT	7	1％
			VNNYT	5	0.7％
IDKYT	5	0.7％
			IHNYT	4	0.6％
IDSYT	4	0.6％
			ISKYT	3	0.4％
ISTYT	3	0.4％
			SIIYE	3	0.4％
IGKYT	2	0.3％
			ISNYK	2	0.3％
VSNYS	2	0.3％
			IANYT	2	0.3％
NQIYE	2	0.3％
			ISQYS	1	0.1％
IDDYT	1	0.1％
			ISSYT	1	0.1％
ISDYT	1	0.1％
			VIYYT	1	0.1％
IYNYT	1	0.1％
			INNYS	1	0.1％
IRQYT	1	0.1％
			VRNYT	1	0.1％
INNYI	1	0.1％

STIYR	1	0.1％
			EYIYT	1	0.1％
DTIYR	1	0.1％
			ATIYD	1	0.1％
GTIYQ	1	0.1％
			HTKYI	1	0.1％

我们检测了Entrez数据库中的702个gp41序列。所有记录的五肽序列均位于大约在gp41的第126位的相同位置，与这些肽的类似物共有的结合功能一致。本发明描述了包含至少一种肽或者蛋白质的配方，包括高或低浓度的形式。

结合CCR5并阻断HIV GP120与CCR5结合的多种V2相关五肽的鉴别

使用上述及在参考文献(11)中详细描述的方法，通过在有或无附加的竞争性小gp120肽时gp120/sCD4复合物与表达ChtTh-CCR5的细胞的结合，我们示出在一般情况中V2衍生的DAPTA的同源肽也具有阻断gp120结合CCR5的能力。显示了结构-功能活性，其为特异性的指征，因为肽TTNYT中L→D的氨基酸取代明显降低效力，并且在肽INNYT中N→D的氨基酸取代形成活性较低的肽IDNYT。令人吃惊地，构成肽TTNYT的所有D氨基酸保持基本活性，表明构成这些肽的所有D氨基酸均是有用的，并且由于其对于肽酶降解的预期的稳定性而可以是优选的。

                表6

肽	对CCR5的GP120/sCD4结合抑制的EC50(nM)
		TTNYT	.1nM
TTN(dY)T	＞1000nM
		All D，ttnyt	2nM
NTSYR	.1
		TTSYT	.05
TSNYS	.2
		SSTYR	.1

NNRYR	.2
		NSNYS	.5
NSSYT	.2
		NSSYR	.04
NSEYR	.08
		SSEYR	.3
TTSYR	.1
		TISYR	.4
YSSYR	.6
		INNYT	.06
IDNYT	1

肽T DAPTA阻止Gp120-SCD4复合物与CCR5受体结合

如图1所示，DAPTA阻止gp120-CD4复合物与CCR5受体的共免疫沉淀。在A组示出的研究中，使用表达hCCR5受体的Cf2Th/synR5细胞。溶解的CCR5受体用抗标记抗体ID4免疫沉淀，在蛋白质A/G琼脂糖上捕获，在有或无DAPTA的条件下与gp120Bal-sCD4复合物一起保温。免疫沉淀的gp120使用人HIVIg通过Western印迹检测。洗涤相同的膜，与抗CCR5(NT)受体的兔多克隆抗血清杂交(底部A组)。B组示出Cf2Th亲代胸腺细胞系的细胞溶解产物。未检测到免疫沉淀的gp120蛋白。C组示出用DAPTA处理之后与gp120CM235蛋白质一起保温的HOS CD4.CCR5细胞。使用抗CCR5的MAb使大约2x1.107膜结合的CCR5免疫沉淀。将共免疫沉淀的gp120蛋白与膜结合的CD4受体通过Western印迹进行检测。

DAPTA阻断GP120与CCR5的CD4依赖性结合

如图2所示出，本发明人修改了gp120/sCD4复合物与表达CCR5的细胞的结合分析使其更加完美，所述的结合对于已知CCR5配体如MIP1-或者CCR5阻断抗体的抑制敏感。抗病毒分析在现有技术领域已经详细描述(Ruff et al.，2001，Antiviral Res，52，63-75)，在此并入作参考及简要描述。

我们使用荧光蛋白质标记试剂盒(Roche Diagnostics GmBh)，从可溶的gp120蛋白质(25g/ml)中制备了一种新的FITC-标记的示踪剂。在含有50mM HEPES(Gibco)，pH＝7.4，5mM MgCl₂，1mMCaCl₂.6H₂O(Sigma)，5％BSA(Sigma)和0.1％NaN₃(终体积为100l)的结合缓冲液中进行结合分析。使用指定的一些表达CCR5的细胞系，在96孔过滤平板(Millipore)中在37℃进行结合1小时。未结合的标记的蛋白质通过快速真空过滤除去并使用96孔平板多次洗涤。使用荧光平板读出器(Hewlett Packard)在495/530nm计数滤膜。在没有sCD4的条件下检测非特异性结合，将所得结果从在存在100nMsCD4的条件下的gp120-FITC结合量(总结合量)中减去。

荧光标记的gp120(FITC-gp120)仅在存在sCD4的条件下有效结合Cf2Th/synCCR5细胞

当分析中不存在sCD4时几乎检测不到结合。随后使用100nMsCD4获得FITC-gp120的最大结合。

如图3所示出，通过与非标记的HIV-1Bal或MIP-1(已知的CCR5配体)的竞争示出gp120(Bal和CM235)的结合特异性(18-22)(图2)。标记的FITC-gp120Bal(0.5nM)的结合在存在等摩尔量(0.5nM)非标记的HIV-1Bal(10nM)的条件下被抑制80％以上，或者在存在过量20倍的非标记的HIV-1Bal(10nM)的条件下降低至背景水平。如先前所述(23-25)，gp120蛋白Bal和CM235的结合均被CCR5特异性配体MIP-1(10nM)抑制。通过将犬胸腺细胞与阻断gp120结合(26)的抗CCR52D7抗体保温(图1)，FITC-gp120CM235的结合也被抑制。在存在100nM sCD4的条件下，FITC-gp120蛋白不结合亲代的CCR5阴性的犬胸腺细胞Cf2Th。这些研究示出gp120-FITC与CCR5受体的结合是CD4依赖性的(26-30)。

通过向(Cf2Th/synR5)细胞中加入增加量(0.25-2.5nM)的FITC-标记的gp120(图2，右侧)，研究两种CCR5结合gp120蛋白(Bal，CM235)中每一种蛋白质的饱和结合条件(图3)。在不存在sCD4的条件下检测非特异性结合，将所得结果从在存在100nM sCD4的条件下的结合量中减去。在Kd为0.46+0.17nM(P＜0.05)出现gp120Bal的可饱和且高亲和的结合，对于gp120CM2351是在Kd为0.77+0.35nM(P＜0.05)时出现可饱和且高亲和的结合，与其它研究结果一致(27，31，31，32)。

DAPTA抑制gp120包膜蛋白结合CCR5

为了描述gp120与CCR5受体结合的肽抑制剂的能力，在存在增加浓度的CCR5选择性趋化因子配体MIP-和DAPTA的条件下使用固定浓度的sCD4/gp120复合物进行抑制研究。这些研究在图4中示出。总的特异性结合通过在有或无加入的sCD4(100nM)的条件下FITIC-gp120结合中的差异而描述。

gp120BaL/sCD4与CCR5(Cf2Th/synR5)细胞的结合被MIP-1(IC50＝1.5+0.002nM，P＜.05)和DAPTA(IC50＝55+0.08pM，P＜0.05)完全抑制(图3A)。DAPTA的Hill斜率(slope)为-1.07，与单位点的竞争性结合模型一致。相似地，我们研究了gp120CMCM235/sCD4与相同细胞的结合抑制情况，再次示出MIP-1β(IC50＝1.8+0.006nM，P＜0.05)和DAPTA(IC50＝0.32+0.03nM，P＜0.05)对特异性结合的充分(＞80％)抑制作用(图3B)。我们也揭示了gp120CM235/sCD4与不同的表达CD4的细胞系(GHOSTCD4.CCR5)的结合也被MIP-1β(IC50＝0.43+0.07nM，P＜0.05)和DAPTA(IC50＝51+0.09pM，P＜0.05)抑制(图3C)。示出的数据(A-C组)是三个实验的平均值和sem，每个数值均是经一式三份实验确定的。通过PRISM进行分析。

这些临床和基础研究发现的实用性是其证实了gp120的肽T区域是结合趋化因子共同受体CCR5的表位的鉴定结果(11)。接近25年的尝试未能找到CCR5的临床有效的短肽受体竞争剂。例如，制备了两批跨越全部gp120分子的所有20mer并对其抗病毒活性进行了测试(第二批相对于第一批有10个位置移码)。这些样品无一呈现任何抗病毒活性。另外，10年来联邦/个人耗资300亿的尝试鉴别有效的HIV疫苗的努力全部失败，NIH疫苗研究中心临床研究院院长Barney Graham博士的题目为“Is an Effective HIV Possible”(Feb 15，2006，Bethesda，MD)的谈话表明我们的方法的非显而易见性，引导产生广泛中和的抗HIV抗体的能力。事实上，不能诱导这种抗体是所有过去和现在的尝试产生疫苗失败的主要因素。

结合CCR5受体的HIV包膜gp120的肽可用作免疫原以阻断病毒与受体的结合。几乎所有成功的抗体疫苗均通过阻断病毒受体结合或附着而起作用。

在最近的几年中，对配制的肽的性质的分析和详细的结构研究(MacPhee，未公布)已经表明DAPTA迅速溶解于水溶液中时趋于聚集的极强倾向，导致生物利用度和抗病毒活性均丧失。现在清楚了DAPTA的这种性质有时导致亚最理想的临床结果(33)，甚至不真实的阴性体外结果。例如，据报道肽T溶液变稠厚和“凝胶状”，潜在地丧失活性和/或通过粘膜例如鼻粘膜上皮转运的能力。从配方中除去氯化钠及将浓度降低至5mg/mL看起来可以解决这个问题。然而，即使在仅1mg/mL浓度，在室温进行的分光光度测定分析表明大峰值从更稀释的0.1mg/ml时的205.4nm变为237.2nm，表明肽T在导致凝胶化的聚集步骤中在浓度较高发生自身相互作用。电子显微镜证实肽T形成小纤维，根据我们的深入研究认为肽T较迄今描述的任何其它小肽均更容易形成小纤维。

确定小纤维形成

可以使用电子显微镜确定肽T或其类似物的小纤维形成。将DAPTA水溶液的2μl等份用于聚醋酸甲基乙烯脂/碳包被的镍EM载网。将该载网用10μl蒸馏水漂洗三次，并用10μl的2％乙酸铀酰染色。样品在具备LaB6灯丝(120kv)的FEI TEM Tecnai显微镜上检测并用Megaview II CCD照相机成象。

肽T或其类似物的小纤维形成也可以使用染料结合方法测定。将刚果红溶解于PBS(5mM磷酸钾，150mM NaCl，pH 7.4)中至浓度为7μg/mL。将该溶液冷却至4℃，将DAPTA加入水中至10mg/mL浓度作为原液，以使得肽在染料溶液中的终浓度为0.48mg/mL。将粉末溶解后立即将肽溶液与含有聚集的肽的陈旧原液对比。在4℃在400-700nm之间收集光谱。

肽T或其类似物的小纤维形成也可以使用圆二(CircularDichroism)(CD)色谱确定。将于新鲜制备的或者含有纤维状聚集物的10mg/mL肽水溶液在4℃加入蒸馏水中至浓度为50μg/mL。在Jasco型J-810分光计上使用0.1cm路径长度的石英管以1分钟间隔及2秒钟响应时间收集190-250nm之间的CD光谱。

另一种确定肽T或其类似物的小纤维形成的方法是使用傅里叶变换光谱法(FTIR)进行。将DAPTA溶解于重水中至浓度为10mg/ml，在促进小纤维形成的温度和时间条件下保温。然后将25μl样品置于预先冷却的传输室(transmission cell)中，所述传输室具有由6μm间隔件隔开的NaCl窗(windows)。使用DTGS检测仪以传输模式在BioRad FTS-175C傅里叶变换光谱仪上收集FTIR光谱。以2cm^-1分辩率记录2506干涉图。减去水蒸汽并校准光谱基线。

免疫原性质

抗肽DAPTA抗体与单体Gp120的结合

图5示出了抗肽DAPTA抗体与单体gp120的结合。在A组中，IIIB gp120(●)、gp120 ADA()和gp120 Bal(▲)直接包被于微孔板上(包被的ELISA)。向孔中加入25倍系列稀释的抗肽DAPTA。结合的抗体通过1∶1000的抗兔IgG-HPR-驴(KP&L)检测，在450nm光密度测定。背景通过正常兔血清对照来估算。与测试的所有三种gp120蛋白质达到半数最大结合所需的V2抗体的浓度为8-25ng/ml。数据来自代表性实验，但是每个数据点是一式三份实验的平均值。B组示出gp120IIIB在存在sCD4(■)及不存在sCD4(◇)的条件下与抗肽DAPTA的反应性。抗体在存在sCD4的条件下以高亲和性结合。结果来自重复两次的代表性实验。每个数据点是一式三份实验的平均值。

抗肽T DAPTA抗体与溶解的gp120的结合

通过ELISA测定抗肽T DAPTA抗体和纯化的IgG分子与来自多种实验室适应的病毒毒株的gp120重组蛋白质的亲和性。多克隆抗肽T DAPTA血清和溶解的gp120蛋白质与gp120 ADA和gp120IIIB具有高亲和性，与SF162 gp120具有最低亲和性。这个结果在图6中示出。捕获法ELISA的结果与中和活性具有良好相关性，表明我们在此揭示的简便ELISA测试可以区分疫苗候选抗体。

在微孔板上通过多克隆山羊抗HIV-1SF gp120血清捕获GP120(1μg/ml)(捕获法ELISA)。将三倍系列稀释的抗肽T DAPTA血清加热失活并加入孔中。结合的抗体通过驴抗兔IgG-HRP检测，在450nm光密度测定。通过预先免疫的抗结合的肽T DAPTA的兔血清的量估算背景并将其减去。这条线表示来自一式三份进行的两个实验数据。

抗肽T DAPTA抗体与溶解的gp120的结合是CD4依赖性的

使用衍生自从荷载肽T的亲和性ELISA中纯化的完全抗肽TDAPTA兔抗血清的免疫球蛋白级分，研究在有和无加入的溶解的Cd4(sCD4)的条件下纯化的抗附着位点IgG与gp120的亲和性结合。

这个结果在图7中示出。溶解的gp120蛋白质在用抗HIV-1SF2血清或sCD4(1μg/ml)包被的微孔板上捕获。一式三份加入三倍系列稀释的抗肽T DAPTA IgG。结合的抗肽T DAPTA IgG在具有2％正常山羊血清的封闭缓冲液中通过HPR-驴抗兔IgG检测。结果是一式三份进行的两个实验的平均值。误差杆示出SD，p＜0.05。

当与CD4分子结合时主要识别gp120的抗体是特别感兴趣的，并且其与疫苗相关联。所谓的CD4诱导的(CD4i)抗体抑制CCR5和CXCR4与gp120-CD4复合物的结合(34-36)，因此被认为对抗gp120的共同受体结合容许构象。然而，分离自人体的CD4i抗体有限，并且原型仅呈现对原始HIV-1分离株较弱的中和活性。这些抗体的明显少见性归结于CD4i表位的相对非可及性(6，37，38)。

发现具有gp120的CD4诱导(CD4i)的位点的这种抗体的数目非常有限。识别gp120的CD4触发的构象的Ab可能对抗共同受体结合表位。本发明示出抗肽T抗体优先识别CD4诱导的表位，因此推测其在共同受体结合位点附近或在此结合。

抗附着位点Ab阻断GP120/sCD4与CCR5进入共同受体的结合

在Western印迹中进一步研究抗肽T DAPTA抗血清和纯化的抗肽T DAPTA IgG与gp120的结合亲和性。富集来自两种HIV-1病毒毒株JR-CSF和SF162的病毒颗粒，在存在NP40的条件下溶解，并将病毒蛋白质在4-12％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。根据在溶解产物中测定的p24抗原具有三种不同浓度-1、2和3ng/槽。将病毒蛋白质移至NEM PVDF膜上，与纯化的抗肽T DAPTA IgG(1∶200)杂交。所述抗体以剂量依赖性方式识别病毒gp120蛋白质。

这个结果在图8中示出。在A组中，富集病毒颗粒并将其在4-12SDS PAGE上分离。通过ELISA测定加载的病毒溶解产物含有1、2和3ng p24蛋白质。将所述膜与抗肽T DAPTA IgG(1∶200)亲和纯化并用HRP-驴抗兔IgG(1∶2000)染色的抗肽T DAPTA杂交。用ECL溶液(Amersham)形成薄膜。将该实验重复两次。在B组中，将IIIB HIV-1病毒毒株的完全溶解产物和溶解的gp120IIIB重组蛋白质(浓度为2μg/ml)在10％SDS PAGE上电泳分离并转移。将所述膜与抗肽T DAPTA多克隆血清(#195)、预先取样的血清和抗肽TDAPTA血清在存在10μM的T DAPTA的条件下保温。揭示了抗肽T DAPTA抗体与HIV-1 gp120IIIB包膜蛋白的特异性。肽T DAPTA阻断抗肽T DAPTA与gp120蛋白质的结合(图8A)。

基于V2肽的抗体抗肽DAPTA的中和性质

HIV-1的中和通过在HELA CD4+CXCR4/CCR5+细胞(P7)上进行合胞体计数分析而评定。在显微镜下计数蓝色病灶单位(Bluefocus units)(BFU/孔)。下表1中概括的数据是使用0.125μg/孔的固定抗体浓度获得的。也进行了纯化的IgG的中和活性滴定。跟随滴定曲线的IgG级分与肽DAPTA的多克隆抗血清相似，亲和性较低(数据未示出)。感染的抑制是一式三份实验的平均值，通过下式计算：抑制％：100-[(有Ab的BFU：无Ab的BFU)×100]。

表7：抗肽T DAPTA对原始及实验室适应的HIV-1病毒毒株的中和活性
				毒株	亚型	表型	抑制％(0.125μg/ml Ab)
92HT593	B	X4/R5(SI)	33.3
				92US077	B	X4/R5(SI)	15.3
92US727	B	R5(NSI)	0

93BR019	B/F	R5/X4	96.6
				93IN101	C	R5(NSI)	95.9
Bal	B	5(NSI)	84.6
				JR-FL	B	R5(NSI)	44.7
ADA	B	R5(NSI)	51.3
				IIIB	B	X4(SI)	35.7
MN		X4(SI)	69.3
				RF	B	X4/R5(SI)	11.8
pNL4.3	B	X4(SI)	0.9

对于一些普遍研究的分化枝B分离株，为了对比肽T/DAPTA的抗体的效力(达到50％抑制[IC50]需要的浓度)，在病灶形成分析中使用单轮病毒感染，使用具有指定共同受体特异性的细胞系(HELACD4-β半乳糖苷酶和HELA CD4.CCR5)进行(39)(表1)。

在上述实验中，如下进行感染分析。应用HeLa细胞系(MAGI)，所述细胞系表达高水平的CD4并含有在截短的人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)长末端重复(LTR)(40)控制下的β半乳糖苷酶基因的单一整合的拷贝，具有CCR5基因的这个细胞系(MAGI-CCR5)(Pirounaki et al.，2000)得自NIAID AIDS储存库。为了确定肽T的趋化因子受体亚型敏感性，如下述使用经先前方案适应的MAGI和MAGI-CCR5(40-43)。简而言之，将10,000个MAGI或MAGI-CCR5细胞/孔接种于96孔平板中。一天后，除去培养基，将肽T或MIP-1的稀释液加入具有20g/ml DEAE-Dextrin的Opti-MEM培养基(Gibco BRL，Life Technologies)中。将所述平板在37℃在5％CO₂条件下培养60分钟，然后加入病毒稀释液进一步培养1.5小时。除去病毒接种体，将孔用0.2mL Opti-MEM培养基洗涤两次，加入新鲜培养基(150μl/孔DMEM)。进一步培养46小时。将细胞在室温用1％甲醛、PBS中的0.2％戊二醛固定5分钟，用PBS洗涤两次，用PBS中的4mM亚铁氰化钾、4mM铁氰化钾、2mM MgCl₂和0.4mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷在37℃在5％CO₂条件下染色50分钟(X-gal染色，Inalco Pharmaceuticals，St.Luis Obispo，CA)，用PBS洗涤两次。在显微镜下计数蓝色病灶，以蓝色病灶单位记录感染水平(BFU/孔)。在所有分析中BFU/孔的背景水平均＜3。

在所述感染分析中测试粗制的抗血清和预先免疫的对照血清对于CCR5毒株SF162和JR-CSF的感染性的抑制作用。在免疫血清中1∶20至1∶40稀释度范围的中和效价(IC50)及预先免疫的血清中的非特异性中和作用可以忽略(数据未示出)。

为了增强特异性和效力，使用肽T/DAPTA层析柱制备亲和性纯化的抗血清以进行深入研究。CCR5毒株SF162和JR-CSF的亲和纯化的抗体级分的中和效价对于SF162为0.25-125μg/ml，对于JR-CSF为0.125和0.06μg/ml(数据未示出)。纯化的IgG级分的中和活性的滴定依照与利用下述的多克隆血清获得的滴定曲线相似的滴定曲线，所述的多克隆血清对抗与SF162疫苗株亲和性较低的gp120共受体附着位点。将预先取样的血清在相同分析中测试。对于1∶20稀释的血清样品，背景抑制范围在2-4％之间。接下来在针对其多样性和代表性而从不同分化枝中选择的较大HIV分离株样品中评估gp120共受体附着位点亲和性纯化的Ig的活性。

19％的截留(cut off)值是基于用1∶5稀释度正常兔血清获得的95％置信水平(Laboratory of Antiviral Drug Mechanisms，ScienceApplications International Corporation at Frederick National CancerInstitute-Frederick Cancer Research and Development Center)。表X所示结果得自至少两个独立的实验，每种病毒毒株一式三份实验。

gp120共受体附着位点亲和性纯化的免疫球蛋白示出对于两种原始分离株(来自分化枝B/F的93BR019和来自分化枝C病毒毒株的93IN101)极高的中和活性和对于除这两种毒株之外所有毒株的显著中和活性。对于X4病毒分离株的活性是未曾预料到的，表明这些肽可用于产生抗R5、X4及双嗜性HIV毒株的免疫原或者治疗剂。

亲和性纯抗肽T对HIV的中和作用

Duke大学AIDS疫苗实验室(David Montefiori，personalcommunication)在单轮荧光素酶报道基因分析中已经证实抗附着位点IgG对于HIV-1分化枝C分离株(Du123和Du156)的中和活性，IC50为0.045μg/ml。数据如下所示。

                                       表8

病毒	SF162.LS	SS1196.1	6101.10	6535.3	Du123.6	Du156.12
							分化枝	B	B	B	B	C	C
(亲和性纯Ig)	＞0.125μg/ml	0.08μg/ml	0.05μg/ml	0.06μg/ml	0.04μg/ml	0.05μg/ml

数值是血清稀释度，在此稀释度在TZM-b1细胞中相对发光单位(RLU)与病毒对照孔(无测试样品)相比降低50％。具有活性的样品以黑体字表示。

重复序列

可用的五肽序列也可以通过其重复基序鉴别，所述重复基序在线性阵列中以未分隔或者由一至几百个氨基酸分隔的形式出现2-5次，即在V2中不出现但在包膜蛋白的任何其它部分出现。这些肽的不合需要的聚集性质可用于构建病毒包膜三级结构，这些五肽序列作为粘着于包膜内的“钉书钉样(staple-like)”位点。在任何情况中，任何给定病毒中五肽序列的重复可教导其它可用序列，即使其不符合规则也如此。例如，重复EYIYT被重复五次。这个重复不紧密跟随一个共有序列。不过因为其重复，将其加入活性化合物的范畴。

CCR5受体活性

可用的候选物对于CCR5受体具有保守的(preserved)亲和性。因此，各种五肽组合物(即具有其各种接头和附着的免疫原)与CCR5受体的相对亲和性的活性分析(集合分析，抗病毒或其它CCR5受体相对生物学活性分析)是另一种有用的筛选。与CCR5受体的亲和性越高，则终产物具有治疗性的可能性越大。

有用的候选物典型呈现广泛的抗病毒活性，之后用做免疫原。因此，预期这些自身疫苗是具有治疗作用。

本发明的一个特别重要方面涉及这些肽作为混合的拮抗药的药理学作用。药物的混合(部分)激动药形式是临床有利的受体相互作用类型，如Nobelist Arvid Carlsson(Medicine/Physiology，2000)所述。混合/部分激动药通常避免了完全拮抗剂药的脱敏现象、抗性和副作用，药物公司已经成功生产出这种类型的药物。部分激动药可以平衡受体活性(见Redwine，1999所述，其示出DAPTA作用的混合激动药)，因此是优选的治疗方法。我们揭示了确定这些肽的固有生物学活性的方法，探寻混合激动药如表6所示肽的产生，所述混合激动药正如所预期地在给予人体6个月后未示出诱导受体抗性。

HIV-1 gp120是最广泛糖基化的蛋白质之一。其含有23或24个N连接的糖基化位点，附于这些位点的多糖大约占蛋白质总量的一半。使用糖基化和糖苷酶抑制剂的许多研究已经表明碳水化合物组分在确定HIV-1包膜糖蛋白构象中的重要性。定向诱变表明大多数糖基化位点个别是不必要的。在24个位点中，仅均位于gp120的氨基末端部分的5个位点(氨基酸88、141、197、262和276)影响病毒感染性。位点197见于V2区域中，所述V2区域在我们已经确定的接近或位于大多数结合位点肽的位置。例如，要注意糖基化基序T/SxN通常存在于本发明的肽中。我们的结果表明N-连接的糖基化位点通常接近、位于或者在本发明的肽中，进一步解释病毒结合表位为共受体如CCR5。如果存在糖基化，则其通过天然抗体消除这个关键表位的免疫监视而导致结构特异性或者掩饰中和作用。

本发明的一个实施方案是具有免疫原性质的组合物。这种组合物通常被描述为A-L-P-C组分的组合，其中A是任何佐剂，L是任何连接组分，P是肽组分，C是保护性基团。

在揭示的化合物中，可以使用任何佐剂。所述肽和接头区被认为是不依赖于佐剂而起作用，因此不以任何方式限制佐剂的选择。可用佐剂的一些但非全部实例是：任何人体可接受的佐剂、肝炎病毒核心抗原、多赖氨酸等。确信即使在本发明之后研发的佐剂也如从前的那些佐剂一样起作用。

或者，在某些情况下可以省去佐剂。例如在如果导致所述肽聚集的情况中。

本发明的另一实施方案是具有治疗性质的的一种组合物。这种组合物通常描述为L-P-C组分的组合，其中L是任何组分，但优选是短肽组分，P是另一种肽组分，C是保护性基团。

关于组合的L和P区域的长度，确信从大约7-16个氨基酸的每个具体长度均发挥作用。在一个优选的实施方案中，所述组合范围是7-11。在另一个优选的实施方案中，所述组合范围是7-9。在另一个优选的实施方案中是8。或者，由于天然的神经系统肽存在28个氨基酸，因此确信本发明组合物的肽区域长度可以是大约28个氨基酸(见表4)。

本发明揭示的各种化合物被设计为单独或组合成混合物应用。可以使用任何数目的化合物，无上限。确信最有益的混合物由2-7种不同的化合物组成。

C组分可以是任何保护性基团。一个优选的实施方案是酰胺。

本发明还涵盖了具有如下活性的化合物及筛选所述化合物的方法：抑制R5或双嗜性(R5/X4)毒株、感染了HIV病毒的人体中的单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)、小胶质细胞或者T细胞中的HIV。其他活性包括通过调节CCR5受体可治疗任何人体疾病，包括但非限于神经元炎症导致的阿尔茨海默氏症、多发性硬化、银屑病和关节炎。这些疾病应被抑制或消除，疾病进程终止或逆转，获得临床益处。

最后，本发明涵盖了筛选所述组合物的稳定性的方法。这是通过选自病毒感染性、趋化性、MAP激酶激活、gp120结合、CCR5激活或抑制、或者G-蛋白信号转导等生物学鉴定方法确定的。

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29.Trkola，A.，J.Matthews，C.Gordon，T.Ketas，and J.P.Moore.1999.A cell line-based neutralization assay for primary human immunodeficiency virus type 1isolates that use either the CCR5 or the CXCR4 coreceptor.J Virol.73：8966-8974.

30.Moore，J.P.，and J.Sodroski.1996.Antibody cross-competition analysis of thehuman immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein.JVirol.70：1863-1872.

31.Doms，R.W.2000.Beyond receptor expression：the influence of receptorconformation，density，and affinity in HIV-1 infection.Virology.276：229-237.

32.Mondor，I.，M.Moulard，S.Ugolini，P.J.Klasse，J.Hoxie，A.Amara，T.Delaunay，R.Wyatt，J.Sodroski，and Q.J.Sattentau.1998.Interactions amongHIV gp120，CD4，and CXCR4：dependence on CD4 expression level，gp120viral origin，conservation of the gp120 COOH-and NH2-termini and V1/V2 andV3 loops，and sensitivity to neutralizing antibodies.Virology.248：394-405.

33.Simpson，D.M.，D.Dorfman，R.K.Olney，G.McKinley，J.Dobkin，Y.So，J.Berger，M.B.Ferdon，and B.Friedman.1996.Peptide T in the treatment ofpainful distal neuropathy associated with AIDS：results of a placebo-controlledtrial.The Peptide T Neuropathy Study Group.Neurology.47：1254-1259.

34.Babcock，G.J.，T.Mirzabekov，W.Wojtowicz，and J.Sodroski.2001.Ligandbinding characteristics of CXCR4 incorporated into paramagneticproteoliposomes.J Biol Chem.276：38433-38440.

35.Trkola，A.，T.Dragic，J.Arthos，J.M.Binley，W.C.Olson，G.P.Allaway，C.Cheng-Mayer，J.Robinson，P.J.Maddon，and J.P.Moore.1996.CD4dependent，antibody-sensitive interactions between HIV-1 and its co-receptor CCR5.Nature.384：184-187.

36.Wu，L.，N.P.Gerard，R.Wyatt，H.Choe，C.Parolin，N.Ruffing，A.Borsetti，A.A.Cardoso，E.Dejardin，W.Newman，C.Gerard，and J.Sodroski.1996.CD4-induced interaction of primary HIV-1 gp120 glycoproteins with thechemokine receptor CCR-5.Nature.384：179-183.

37.Sullivan，N.，Y.Sun，Q.Sattentau，M.Thali，D.Wu，G.Denisova，J.Gershoni，J.Robinson，J.Moore，and J.Sodroski.1998.CD4-Induced conformationalchanges in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 glycoprotein：consequences for virus entry and neutralization.J Virol.72：4694-4703.

38.Kwong，P.D.，M.L.Doyle，D.J.Casper，C.Cicala，S.A.Leavitt，S.Majeed，T.D.Steenbeke，M.Venturi，I.Chaiken，M.Fung，H.Katinger，P.W.Parren，J.Robinson，R.D.Van，L.Wang，D.R.Burton，E.Freire，R.Wyatt，J.Sodroski，W.A.Hendrickson，and J.Arthos.2002.HIV-1 evades antibody-mediatedneutralization through conformational masking of receptor-binding sites.Nature.420：678-682.

39.Ruff，M.R.，L.M.Melendez-Guerrero，Q.E.Yang，W.Z.Ho，J.W.Mikovits，C.B.Pert，and F.A.Ruscetti.2001.Peptide T inhibits HIV-1 infection mediated bythe chemokine receptor-5(CCR5).Antiviral Res.52：63-75.

40.Kimpton，J.，and M.Emerman.1992.Detection of replication-competent andpseudotyped human immunodeficiency virus with a sensitive cell line on thebasis of activation of an integrated beta-galactosidase gene.J Virol.66：2232-2239.

41.Harrington，R.D.，and A.P.Geballe.1993.Cofactor requirement for humanimmunodeficiency virus type 1 entry into a CD4-expressing human cell line.JVirol.67：5939-5947.

42.Vodicka，M.A.，W.C.Goh，L.I.Wu，M.E.Rogel，S.R.Bartz，V.L.Schweickart，C.J.Raport，and M.Emerman.1997.Indicator cell lines for detection of primarystrains of human and simian immunodeficiency viruses.Virology.233：193-198.

43.Pirounaki，M.，N.A.Heyden，M.Atens，and L.Ratner.2000.Rapid phenotypicdrug susceptibility assay for HIV-1 with a CCR5 expressing indicator cell line.JVirol Methods.85：151-161.

Claims (20)

1.一种有效抗人免疫缺陷病毒的治疗组合物和疫苗免疫原，其包含A-L-P-C结构，其中：

A是任何佐剂，

L是任何连接组分，

P是具有R₁R₂R₃R₄R₅结构的肽，其中

R1选自N、S、T、D、R、K、A或E，

R2选自N、S、T、D、G、I或E，

R3选自N、S、T、D、G、R、K、I、Q、H或E，

R4是Y，

R5选自N、S、T、R、K、A、M、W或G或其酰胺，及任何其它氨基酸，

C是任何保护基团。

2.权利要求1的组合物，其中L由三个氨基酸组分组成，P由五个氨基酸组分组成。

3.权利要求1的组合物，其中L是三肽组分A-S-T。

4.权利要求1的组合物，其中R2选自T、S和N。

5.权利要求1的组合物，其中P选自：EYIYT、INNYT、ISNYS、ISNYT、ISYRL、NNRYR、NNSYR、NSNYS、NSSYR、NTIYT、NTSYG、NTSYM、NTSYR、NTSYS、SSEYR、SSRYR、SSTYR、STNYT、STSYR、TISYR、TSNYS、TTNFT、TTNYT、ALL D-TTNYT、TTSYR、TTSYT和YTSYR。

6.权利要求1的组合物，其中A是任何人体可接受的佐剂。

7.权利要求1的组合物，其中C是C末端酰胺基团。

8.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含两至五种成分的混合物，其中这些成分的P区域中氨基酸组分的序列不同。

9.权利要求1的组合物，其中L-P区域包含长度为大约7-16个氨基酸残基的肽。

10.权利要求1的组合物，其中所述氨基酸是D立体异构体。

11.一种具有L-P-C结构的治疗组合物，其中：

L包含任何三肽序列，

P包含具有R₁R₂R₃R₄R₅结构的肽，其中：

R1选自N、S、T、D、R、K、A或E，

R2选自N、S、T、D、G、I或E，

R3选自N、S、T、D、G、R、K、I、Q、H或E，

R4是Y，

R5选自N、S、T、R、K、A、M、W或G或其酰胺，即任何其它氨基酸，

C是任何保护基团。

12.权利要求11的组合物，其中L由三个氨基酸组分组成，P由五个氨基酸组分组成。

13.权利要求11的组合物，其中L是三肽组分A-S-T。

14.权利要求11的组合物，其中R2选自T、S和N。

15.权利要求11的组合物，其中P选自：EYIYT、INNYT、ISNYS、ISNYT、ISYRL、NNRYR、NNSYR、NSNYS、NSSYR、NTIYT、NTSYG、NTSYM、NTSYR、NTSYS、SSEYR、SSRYR、SSTYR、STNYT、STSYR、TISYR、TSNYS、TTNFT、TTNYT、ALL D-TTNYT、TTSYR、TTSYT和YTSYR。

16.权利要求11的组合物，其中A是任何人体可接受的佐剂。

17.权利要求11的组合物，其中C是C末端酰胺基团。

18.权利要求11的组合物，其中所述组合物包含两至五个成分的混合物，其中这些成分的P区域中氨基酸组分的序列不同。

19.权利要求11的组合物，其中L-P区域包含长度为大约7-16个氨基酸残基的肽。

20.权利要求11的组合物，其中所述氨基酸是D立体异构体。

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