MX2007014088A

MX2007014088A - Uso novedoso de los agonistas del receptor x hepatico.

Info

Publication number: MX2007014088A
Application number: MX2007014088A
Authority: MX
Inventors: Pierre Broqua; Jean-Louis Junien; Bernadette Husson
Original assignee: Fournier Lab Sa
Priority date: 2005-05-10
Filing date: 2006-05-10
Publication date: 2008-02-07
Also published as: CA2608052A1; RU2007141058A; WO2006120213A2; KR20080009203A; CN101171002A; EP1879561A2; AU2006245717A1; CN101171002B; US20090118306A1; US20100297761A1; US8030335B2; JP2008540490A; RU2417078C2; JP4945555B2; WO2006120213A3; AU2006245717B2; AU2006245717B8; UA90718C2

Abstract

La presente invencion generalmente se refiere al novedoso uso terapeutico de los agonistas del receptor X hepatico (LXR); mas especificamente, la presente invencion se refiere al uso del agonista de LXR para la preparacion del medicamento util para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad asociada con la regeneracion de las celulas beta, tal como diabetes, y un metodo para incrementar la viabilidad ex vivo de las celulas de la isleta pancreatica, que comprende poner en contacto a dichas celulas de la isleta con un agonista de LXR.

Description

USO NOVEDOSO DE LOS AGONISTAS DEL RECEPTOR X HEPATDCO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención generalmente se refiere al uso terapéutico novedoso de los agonistas del receptor X hepático (LXR). Más específicamente, la presente invención se refiere al uso del agonista de LXR para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad asociada con la degeneración de las células beta, tal como la diabetes, y un método para incrementar la viabilidad ex vivo de ias células de la isleta pancreática, que comprende poner en contacto dichas células de la isleta con un agonista de LXR.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La diabetes generalmente se clasifica en dos grupos principales. En la diabetes tipo I, la destrucción autoinmune de las células beta dentro de las isletas de Langerhans llegar a un defecto marcado en la producción de insulina. En contraste, la diabetes tipo II se caracteriza por resistencia a la insulina en el músculo, el tejido graso, y el hígado junto con un deterioro relativa en la producción de insulina en las células beta. Múltiples genes contribuyen a la susceptibilidad tanto en la diabetes tipo I como en la diabetes tipo II, aunque en la mayoría de los casos sus identidades permanecen desconocidas. La apoptosis es un proceso activo de autodestrucción celular que se regula por señales extrínsecas e intrínsecas que se presentan durante el desarrollo normal. Se ha documentado bien que la apoptosis desempeña un papel clave en la plasticidad de las células beta endocrinas pancreáticas. Existe evidencia creciente de que en los mamíferos adultos la masa de células beta se somete los cambios dinámicos para adaptar la producción de insulina para el mantenimiento de la euglicemia en condiciones particulares, tales como la preñez y la obesidad. El control de la masa de células beta depende de un balance sutil entre la proliferación celular, el crecimiento y la muerte celular (apoptosis). Una alteración de este balance puede llevar al deterioro de la homeostasis de la glucosa. Por ejemplo, es notable que la intolerancia a la glucosa se desarrolla con el envejecimiento cuando la velocidad de replicación de la célula beta se reduce y que los pacientes con diabetes mellitus no dependiente de insulina tienen un 40-60% de pérdida de masa de célula beta en comparación con los sujetos no diabéticos. Generalmente se concuerda que, en los sujetos resistentes a insulina, la normoglicemia se mantiene por la hiperinsulinemia compensatoria hasta que las células beta se vuelven incapaces de satisfacer la demanda incrementada de insulina, punto en el cual la diabetes tipo II aparece. La diabetes mellitus tipo II o no dependiente de insulina (NIDDM) es una enfermedad poligénica y responde a > 90% de los casos de diabetes.

Esta enfermedad se caracteriza por la resistencia a la acción de la insulina sobre la toma de glucosa y la acción alterada de la insulina para inhibir la producción de la glucosa hepática. La regulación del metabolismo de glucosa por la insulina es un mecanismo clave por medio del cual se mantiene la homeostasis en un animal. La insulina estimula la toma de glucosa a partir de la sangre hacia los tejidos, especialmente músculo y tejido graso. Estos ocurren vía la translocación incrementada de Glut4, el transportador de glucosa sensible a insulina, a partir de un compartimiento vesicular intracelular hacia la membrana plasmática. Glut4 es el transportador de glucosa sensible a insulina más importante en estos estudios. La insulina se une a su receptor en la membrana plasmática, generando una serie de señales que resultan en la translocación o movimiento de las vesículas transportadoras de Glut4 hacia la membrana plasmática. Los receptores X hepáticos (LXRs) son miembros de una superfamilia del receptor nuclear que induce la activación transcripcional dependiente del ligando de los genes blanco. Estos desempeñan papeles importantes en el metabolismo del colesterol y la homeostasis. Se sabe que existen dos proteínas LXR (alfa y beta) en mamíferos. La expresión de LXRalfa es elevada en los órganos que participan en la homeostasis del lípido tal intestino, en los tejidos adiposos pardo y blanco mientras que LXRbeta es más ubicuo y está enriquecido en los tejidos de origen neuronal y endocrino. Recientemente, se ha encontrado que LXRalfa y beta se expresan en las isletas pancreáticas así como en las células alfa y las células beta (Efanov et al, Diabetes, 53 (3), S75-78, 2004). LXRalfa y LXRbeta están cercanamente relacionados y comparten 77% de identidad de aminoácidos tanto en sus dominios para unión al ADN como en sus dominios para unión al ligando. Los LXRs también están conservados entre los humanos y otros animales (por ejemplo, roedores). Como otros receptores nucleares, LXRs heterodimerizan con el receptor retinoide X (RXR) para su función. Se sabe que los LXRs se activan por ciertos derivados del colesterol oxidados que se presentan de manera natural, incluyendo 22(R)-hidroxicolesterol, 24(S)-hidroxicolesterol y 24,25(S)-epoxicolesterol. LXRalfa y beta son reguladores para los genes hepáticos implicados en el metabolismo del colesterol y de los ácidos grasos (HMGCoA sintasa/reductasa, farnesil difosfato sintasa, escualeno sintasa, SREBPI c, estearoil CoA desaturasa (SCD1 y 2), FAS), inhiben la expresión de las enzimas gluconeogénicas (PEPCK, fructuosa bifosfatasal , glucosa 6 fosfatasa), inducen la expresión del transportador trasmembranal (ABCA1 , Glutl y Glut4 ), inhiben la expresión de las enzimas que participan en la glicólisis (6-fosfofructo-2-cinasa) e inducen la piruvato deshidrogenasa cinasa 4 (un regulador negativo de la glicólisis), disminuyen la 11 -betahidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 (enzima que reactiva a la cortisona inactiva hacía el cortisol activo en humanos). La leptina y UPC-1 se han identificado como genes blanco de LXR (subregulación de los agonistas de LXR). Además, los LXRs superponen funciones con PPARs en el control negativo de la respuesta inflamatoria. Los LXRs inhiben la producción de TNFa e IL-1 ß y la expresión de los mediadores inflamatorios tales como COX2, ¡NOS, IL-6. LXR puede desempeñar un papel clave en las respuestas a la inflamación, y debido a que se ha mostrado es importante en el metabolismo de lípidos, LXR puede participar también en las respuestas inflamatorias inducidas por obesidad, (revisado en Steffensen et al, Diabetes, 2004, 53 (1 ), S36-42). En los ratones db/db, T0901317, un agonista de LXR descrito en la presente invención a continuación, ha mostrado que disminuye el nivel de glucosa en plasma (no en ratones normales). Este compuesto inhibe la expresión de PEPCK para limitar la producción total de glucosa hepática (Cao et al, J Biol Chem, 2003, 1278, 1131 -1136). El cultivo de isletas pancreáticas o de células MIN6 de secretan insulina con T0901317 ocasiona un incremento en la secreción insulina dependiente de glucosa y en el contenido de insulina en la isleta. El efecto estimulante de este compuesto sobre la secreción de insulina se observó solamente después de > 72 horas del cultivo de la isleta con T090131 . En las células MIN6, Tularik incrementó la expresión de proteína en enzimas lipogénicas, ácido graso sintasa y acetil-CoA carboxilasa. La activación de LXR también produjo un incremento en los niveles de actividad de la proteína glucocinasa y piruvato carboxilasa (PC). LXRs podrían controlar la secreción y biosíntesis de insulina vía la regulación del metabolismo de la glucosa y de lípidos en la célula beta pancreática (Efanov et al, Diabetes, 53 (3), S75-78, 2004). El gen homeobox-1 duodenal pancreático (Pdx-1 ) es un regulador maestro tanto del desarrollo pancreático como de la diferenciación de las células progenitoras hacia el fenotipo de célula beta. Además, en la célula beta diferenciada, Pdx1 es un regulador de la expresión del gen de insulina que responde a la glucosa y la función de Pdx1 en respuesta a la glucosa se regula tanto por su fosforilación como por la translocación nuclear. Durante las etapas tempranas del desarrollo de la isleta, la expresión de Pdx-1 se restringe principalmente a las células beta maduras del páncreas endocrino. En el páncreas adulto, las subpoblaciones de células que producen somatostatina y células que producen el polipéptido pancreático también expresan Pdx-1 , solamente unas pocas células que producen glucagon también lo expresan. Un defecto en la sensibilidad de la glucosa en las células beta pancreáticas se ha observado en varios modelos animales de diabetes tipo II y se ha correlacionado con una expresión reducida del gen del transportador de glucosa tipo 2 (Glut2). En un modelo de ratón transgénico, la expresión del ARN antisentido de Glut2 en las células beta pancreáticas ha mostrado estar asociada con una secreción alterada de insulina inducida por glucosa y el desarrollo de la diabetes. La expresión del gen del transportador de glucosa tipo 2 (GLUT2) disminuye de manera selectiva en las células beta pancreáticas de los modelos experimentales de la diabetes y promotor GLUT2 de murino se controla por PDX-1.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en parte en el descubrimiento inesperado de que la activación de los LXRs en ratas ZDF lleva a la mejoría del estado diabético con una disminución significativa de la glicemia después del tratamiento con un agonista de LXR. En la evaluación de los mecanismos potenciales subyacentes a la acción antidiabética del agonista de LXR, se ha encontrado de manera inesperada una reducción significativa de la apoptosis en las isletas aisladas a partir de ratas ZDF tratadas con el agonista de LXR conocido denominado "GW 3965" asociada con un incremento en el número de las isletas; además, estas isletas tienen un contenido significativamente mayor de insulina y una mejor sensibilidad a la glucosa que aquélla a partir de las ratas ZDF tratadas con el vehículo. Estos descubrimientos y el trabajo experimental adicional han mostrado que la administración del agonista de LXR in vivo es capaz de estimular la secreción de insulina a la vez que protege a las islas pancreáticas del deterioro. Además, se ha mostrado que se obtuvo un incremento significativo en el nivel de ARNm de PDX1 y Glut2, dos genes principales implicados en la regeneración de la isleta, en las isletas de las ratas ZDF tratadas con GW3965. La regeneración de las isletas pancreáticas también se ha confirmado por el análisis histológico pancreático de los ratones NOD tratados con GW3965. La presente invención también se basa en el descubrimiento reciente de que el agonista de LXR no solamente protege al páncreas diabético del deterioro adicional, en particular mediante la reducción de la apoptosis y de la insulitis en el páncreas, sino que también mejorar los procesos de regeneración pancreática y, por lo tanto, permite restablecer la función pancreática cuando se encuentra comprometida. Estos efectos son adicionales a la disminución de la producción total de la glucosa hepática descrita en el hígado (Cao et al, 2003, JBC, 278 (2), 1131 -1136) y potencia las propiedades antidiabéticas de los agonistas de LXRs. La propiedad benéfica de los agonistas de LXR para incrementar el número de isletas y para reducir la apoptosis en las isletas permite un nuevo modo de tratamiento: este consiste del tratamiento de los pacientes por un periodo de tiempo limitado hasta que la glicemia y/o HbAl c (hemoglobina A1 c) se reducen hasta un nivel estacionario (HbA1C < 7% y/o glicemia < 1.2-1.4 g/l); entonces, el tratamiento se suspende siempre y cuando la glicemia y/o HbAl c permanezcan en un intervalo aceptable (por ejemplo por un mes). Si el nivel de glicemia y/o de HbAlc se incrementa por arriba de los valores aceptables, se podría prescribir de nuevo un tratamiento con el agonista de LXR. En un primer aspecto, la presente invención se dirige entonces al uso de un agonista de LXR para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad asociada con la degeneración de las células beta. La presente invención también se dirige al uso de un agonista de LXR para la preparación de un medicamento útil para la regeneración de las células beta y para incrementar la viabilidad de las células beta. El uso de conformidad con la invención provee un medicamento que se puede utilizar en asociación con un fármaco antidiabético conocido. En un segundo aspecto, la presente invención se dirige a un método para incrementar la viabilidad ex vivo de las células primarias de la isleta pancreática, que comprende poner en contacto dichas células de la isleta con un agonista de LXR. En un tercer aspecto, la presente invención provee métodos para el tratamiento de la degeneración de la célula beta, que comprende la administración de un agonista de LXR a un sujeto. En una primera modalidad, la invención provee métodos para prevenir la diabetes tipo I en un sujeto, que comprende administrar una cantidad efectiva de un agonista de LXR a un sujeto. En otra modalidad, la presente invención provee métodos para el tratamiento o mejoría de la diabetes, en método comprende la medición del nivel de glucosa en circulación y/o de HbAlc en el sujeto y la administración diaria al sujeto de una cantidad efectiva de un agonista de LXR hasta la estabilización de la glicemia y/o HbAlc (HbAl c < 7% y/o glicemia < 1.2-1.4 g/l mantenida por por un mes con al menos dos dosis), luego deteniendo el tratamiento una vez que la glicemia y/o HbAlc se ha estabilizado; el tratamiento diario se realiza de nuevo de manera opcional si es necesario. En otra modalidad, la invención provee métodos para incrementar la viabilidad de las células donantes de la isleta pancreática trasplantada en un recipiente trasplantado, que comprende la administración ha dicho recipiente del transplante de un agonista de LXR. Un entendimiento adicional de la naturaleza y las ventajas de la presente invención se pueden comprender mediante la referencia a las porciones remanentes de la especificación y reivindicaciones.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA iNVENCION En un aspecto, la presente invención se dirige el uso de un agonista de LXR para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad asociada con la degeneración de las células beta. El uso de conformidad con la presente invención encuentra aplicación en el tratamiento de enfermedades asociadas en particular con una pérdida de la función de la célula beta o la disfunción de la célula beta y/o la muerte de las células beta, tales como, pero no limitadas a, la diabetes, hiperglicemia y obesidad. La presente invención también es útil para prevenir o modular el desarrollo de dichas enfermedades o trastornos en un sujeto que se sospecha que es, o que se sabe que es, propenso a dichas enfermedades o trastornos. La presente invención se relaciona así con el uso de un agonista de LXR para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento y/o la prevención de la diabetes tipo I y la diabetes tipo II, y preferiblemente de la diabetes tipo I. Como se explicó anteriormente, los pacientes diabéticos tipo II pueden exhibir más o menos características de la diabetes tipo I, principalmente relacionadas con la deficiencia en la producción de insulina. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención se dirige al uso de un agonista de LXR para la preparación de medicamento útil para prevenir, detener o hacer más lenta la progresión de la diabetes tipo II hacia el estado diabético subsecuente caracterizado por deficiencia en la producción de insulina. Puesto que la administración del agonista de LXR in vivo incrementa el número de isletas y reduce la apoptosis en las isletas, el uso de un agonista de LXR para la preparación de un medicamento útil para la regeneración de las células beta y para incrementar la variabilidad de las células beta representa dos modalidades adicionales de la presente invención. Con respecto al uso para incrementar la viabilidad de las células pancreáticas, se debe entender que las células viables se definen como capaces de llevar a cabo proliferación, diferenciación, crecimiento y desarrollo.

La viabilidad se puede medir mediante cualesquiera métodos conocidos en la técnica, y por ejemplo mediante el uso de la tinción con azul tripán. En otra modalidad, la presente invención se dirige al uso de un agonista de LXR para preparación de un medicamento útil para incrementar la viabilidad de las células trasplantadas de la isleta pancreática del donante en un recipiente del transplante. Las células de la isleta pancreática son principalmente células de la isleta. Para esta aplicación particular, el medicamento se puede administrar localmente hacia un sitio para el transplante o preferiblemente se administra de manera sistémica. En una modalidad, el medicamento se se administra al recipiente del transplante antes de y/o después del transplante de las células de la isleta pancreática del donante. En otra modalidad, el medicamento se administra al recipiente del transplante concurrentemente con el transplante de las células pancreáticas del donante. Cualesquiera agonistas de LXR conocidos y descritos en la técnica se pueden utilizar con el objeto de practicar todos los usos y métodos que se describen en la presente invención de conformidad con la presente invención. Preferiblemente, el agonista de LXR es un agonista LXRalfa, y en particular el agonista LXR se selecciona a partir del grupo que consiste de GW3965 y T0901317.

Además, de conformidad con una modalidad ventajosa, el medicamento a ser utilizado para todos los usos y métodos de la presente invención, se encuentra en una forma adecuada para administración oral. En todos los usos y métodos descritos en la presente invención, el medicamento preferiblemente se administra diariamente por al menos 30 días. Este también se puede administrar por al menos 60 días, 90 días, o durante un periodo más largo. Además, el medicamento de conformidad con la presente invención se puede utilizar en asociación con un fármaco antidiabétíco conocido, y en particular uno seleccionado a partir del grupo que consiste de metformina, pioglitizona, rosiglitazona, glimepirida, glipizida, gliburida/metformina, gliburida, miglitol, glipizida + metformina, repaglinida, acarbosa, troglitazona, nateglinida, y un agonista GLP-1 (péptido semejante al glucagon-1 ). En segundo aspecto, la presente invención se dirige a un método para incrementar la viabilidad ex vivo de las células primarias de la isleta pancreática, que comprende poner en contacto dichas células de la isleta con un agonista de LXR. Preferiblemente, el agonista de LXR es un agonista de LXRalfa, y en particular el agonista de LXR a ser utilizado se selecciona a partir del grupo que consiste de GW3965 y T0901317. En un tercer aspecto, la presente invención provee métodos para el tratamiento de la degeneración de la célula beta. Los métodos comprenden la administración a un sujeto de un agonista de LXR. En dichos métodos, el agonista de LXR empleado puede ser un agonista LXRalfa, y en particular el agonista de LXR a ser utilizado se selecciona a partir del grupo que consiste de GW3965 y T0901317. En los métodos de conformidad con la invención, el sujeto preferiblemente padece de diabetes tipo I o tipo II. Opcionalmente, el agonista de LXR se administra simultáneamente con un fármaco antidiabético conocido al sujeto, o cualquier otro fármaco que reduce la glicemia y/o HbAl c. En particular, el fármaco antidiabético conocido se selecciona a partir del grupo que consiste de metformina, pioglitizona, rosiglitazona, glimepirida, glipizida, gliburida/metformina, gliburida, miglitol, glipizida + metformina, repaglinida, acarbosa, troglitazona, nateglinida, y un agonista de GLP-1. En una modalidad, la invención provee métodos para la prevención de la diabetes tipo I en un sujeto. Los métodos comprenden la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un agonista de LXR. De manera similar, el agonista de LXR empleado en dichos métodos para la prevención de la diabetes tipo I puede ser un agonista de LXRalfa, y en particular el agonista de LXR a ser utilizado se selecciona a partir del grupo que consiste de GW3965 y T0901317. Opcionalmente, el agonista de LXR se administra simultáneamente con un fármaco antidiabético conocido al sujeto, o con cualquier otro fármaco reductor de la glicemia y/o HbAlc. En particular, el fármaco antidiabético conocido se selecciona a partir del grupo que consiste de metformina, pioglitizona, rosiglitazona, glimepirida, glipizida, gliburida/metformina, gliburida, miglitol, glipizida + metformina, repaglinida, acarbosa, troglitazona, nateglinida, y un agonista de GLP-1. En otro aspecto, la presente invención provee métodos para el tratamiento o mejoría de la diabetes, el método comprendiendo la medición del nivel de glucosa en circulación y/o de HbAlc en el sujeto y la administración diaria al sujeto de una cantidad efectiva de un agonista de LXR hasta la estabilización de la glicemia y/o de HbAlc (HbAlc < 7% y/o glicemia < 1.2-1.4 g/l mantenida por un mes con al menos dos dosis), luego deteniendo el tratamiento una vez que la glicemia y/o HbAlc se ha estabilizado; el tratamiento diario se realiza de nuevo de manera opcional si es necesario. El tratamiento diario se puede realizar de nuevo de manera opcional si la glicemia y/o HbAl c ya no se encuentra estabilizado o se pierde la sensibilidad a la insulina. Los métodos para medir los niveles de glucosa en circulación y/o de HbAl c son los métodos bien conocidos en la técnica anterior y se puede utilizar cualquier clase de métodos. De manera similar, el agonista de LXR empleado en dichos métodos para el tratamiento o mejoría de la diabetes puede ser un agonista de LXRalfa, y en particular el agonista de LXR a ser utilizado se selecciona a partir del grupo que consiste de GW3965 y T0901317. Opcionalmente, el agonista de LXR se administra simultáneamente con un fármaco antidiabético conocido al sujeto, o con cualquier otro fármaco reductor de la glicemia y/o HbAlc. En particular, el fármaco antidiabético conocido se selecciona a partir del grupo que consiste de metformina, pioglitizona, rosiglitazona, glimepirida, glipizida, gliburida/metformina, gliburida, miglitol, glipizida + metformina, repaglinida, acarbosa, troglitazona, nateglinida, y un agonista de GLP-1 . En dichos métodos, el agonista de LXR preferiblemente se administra al sujeto al menos diariamente por al menos 30 días. En otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para incrementar la viabilidad de las células de la isleta pancreática del donante del transplante en un recipiente de transplante, que comprende administrar ha dicho recipiente del transplante un agonista de LXR. Las siguientes secciones proveen las guías para la elaboración y uso del medicamento de conformidad con la invención, y para llevar a cabo los métodos de la invención.

Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por aquellos expertos en la técnica a los cuales pertenece esta invención. Las siguientes referencias proveen a un experto con una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (segunda edición 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Además, las siguientes definiciones se proveen para ayudar al lector en la práctica de la invención. El término "LXR" (receptor X hepático) o "receptor de LXR" incluye todos los subtipos de este receptor. Específicamente LXR incluye LXRalfa y LXRbeta. LXRalfa ha sido referido según una variedad de nombres tales como LXRU, LXRa, LXR, RLD-1 , NR1 H3. Este comprende cualquier polipéptido codificado por un gen con identidad de secuencia sustancial al GenBank número de acceso U22662. De manera similar, LXRbeta incluye cualquier polipéptido codificado por un gen referido como LXRb, LXRP, LXRbeta, NER, NER1 , UR, OR-1 , RIP 15, NR1 H2 o un gen con identidad de secuencia sustancial GenBank número de acceso U07132. El término "ligando" se refiere a un agonista o agonista parcial de LCR. En ligando puede ser selectivo para LXRalfa o LXRbeta, o puede tener actividad de unión mezclada tanto para LXRalfa como para LCRbeta. Aunque un ligando puede ya sea agonizar o antagonizar una función del receptor, a menos que se especifique de otra manera, un ligando LXR utilizado en la presente invención se refiere principalmente a un agonista de LXR que activa del receptor de LXR. El término "modular" con respecto a un receptor de LXR se refiere a la activación del receptor de LXR y a sus actividades biológicas asociadas con la ruta de LXR (por ejemplo, regulación de la transcripción de un gen blanco). La modulación de un receptor de LXR se puede sobre-regular (por ejemplo, agonismo, activación o estimulación) o sub-regulación (por ejemplo antagonismo, inhibición o supresión). El modo de acción de un modulador de LXR puede ser directo, por ejemplo, a través de la unión al receptor de LXR como un ligando. La modulación también puede ser indirecta, por ejemplo, a través de la unión a y/o la modificación de otra molécula que de otra manera se une a y activa el receptor de LXR. Por lo tanto, la modulación de LXR incluye un cambio en las bioactividades de un ligando agonista de LXR (por ejemplo, su actividad en la unión a y/o activación de un receptor de LXR) o un cambio en el nivel celular del ligando. Como se utiliza en la presente invención, la frase "selección de agonista de LXR" se refiere al uso de un sistema de ensayo apropiado para identificar los agonistas novedosos de LXR a partir de los agentes prueba. El ensayo puede ser un ensayo in vitro o un ensayo in vivo adecuado para la identificación de si un agente prueba puede estimular o activar una o más de las funciones biológicas del receptor de LXR. Los ejemplos de bioensayos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ensayos para examinar la unión de los agentes prueba a un polipéptido de LXR (por ejemplo, el fragmento de LXR que contiene su dominio de unión al ligando), ensayos basados en la transcripción, ensayos de creatina cinasa, ensayos basados en la diferenciación de los pre-adipocitos, ensayos basados en la toma de glucosa control en adipocitos, y ensayos inmunológicos. El "sujeto" preferiblemente es un mamífero, más preferiblemente un humano.

El término "degeneración de la célula beta" se pretende que signifique la pérdida de la función de la célula beta, disfunción de la célula beta, y muerte de las células beta, tal como necrosis o apoptosis de las células beta. El término "tratamiento de una enfermedad" se define como el manejo y cuidado de un paciente para el propósito de combatir la enfermedad, condición, o trastorno e incluye la administración de un agonista de LXR para prevenir el inicio de los síntomas o complicaciones, o el alivio de los síntomas o complicaciones, o la eliminación de la enfermedad, condición, o trastorno. El tratamiento incluye modular, inhibir, disminuir, reducir o detener la degeneración de la célula beta, tal como la necrosis o la apoptosis de las células beta, en particular la muerte programada de la célula beta conocida como apoptosis de las células beta así como la prevención de la degeneración de la célula beta, tal como la necrosis o apoptosis en las células beta, en particular la prevención de la apoptosis de las células beta. El tratamiento incluye también la regeneración de las células beta. El término "para el tratamiento" como se utiliza en la presente invención se debe entender que abarca el uso directo del compuesto para el tratamiento o el uso indirecto de dicho compuesto en un tratamiento para la enfermedad especificada. El término "deficiencia en la producción de insulina" se pretende que signifique la exhibición de una hiperglicemia significativa y normoinsulinemia o hipoinsulinemia. Los métodos para medir la glicemia o los niveles de insulina y para estimar la hiperglicemia y la normoinsulinemia o hipoinsulinemia se conocen bien en la técnica. El término "en asociación con" se pretende que se refiera ya sea a un medicamento en el cual los dos principios activos (el agonista de LXR y el fármaco antidiabético) son los constituyentes esenciales de la misma composición, o a dos medicamentos separados que se pueden administrar simultáneamente o subsecuentemente. Los términos "estabilización de la glicemia y/o HbAlc" o "una vez que la glicemia y/o HbAl c se ha estabilizado" como se utilizan en presente invención se pretende que signifiquen un valor del HbAlc < 7% y/o un valor de glicemia < 1.2-1.4 g/l mantenido por un mes con al menos dos dosis.

Agonistas de LXR Existen muchos agonistas de LXR que son adecuados para la práctica de los métodos de la presente invención. Estos pueden ser agentes conocidos que activan al receptor de LXR, por ejemplo, GW3965 (véase los ejemplos a continuación), u otros compuestos comercialmente disponibles tales como F3MetilAA (a partir de Merck; véase Menke et al., Endocrinology 143: 2548-58, 2002) y T0901316 (Tularik, California). Estos también pueden ser agonistas novedosos de LXR a ser seleccionados de conformidad con la presente invención. Como se detalla a continuación, los agonistas de LXR adecuados para la presente invención pueden ser polipéptido, péptidos, moléculas pequeñas, u otros agentes. Los agonistas de LXR pueden ser agonistas para LXR de humano así como de otros animales. Se ha descrito en la técnica un gran número de agonistas de LXR. Los ejemplos de agonistas de LXR de molécula pequeña incluyen los oxiesteroles bien conocidos y los compuestos relacionados (Janowski et al., Nature 383: 728-31 , 1996); T0901317 y T0314407 (Schultz et al., Genes Dev 14: 2831 -8, 2000); 24(S)-hidroxicolesterol, y 22(R)-hidroxicolesterol (Janowski et al., Nature 383: 728-731 , 1996); y 24,25-epoxicolesterol (Patente de E.U.A. No. 6,316,503). Los agonistas polipeptídicos ejemplares de LXR también se han descrito en la técnica, por ejemplo, WO 02/077229. Los agonistas de LXR adicionales se han descrito en la técnica, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 6,316,503; Collins et al., J Med Chem. 45: 1963-6, 2002; Joseph et al., Proc Nati Acad Sci USA 99: 7604-9, 2002; Menke et al., Endocrinology 143: 2548-58, 2002; Schultz et al., Genes Dev. 14: 2831 -8, 2000; y Schmidt et al., Mol Cell Endocrinol. 155: 51 -60, 1999. Muchos agonistas de LXR son efectivos en la activación tanto de LXRalfa como de LXRbeta (por ejemplo, GW3965 como se describe en Collins et al., J Med Chem. 45: 1963-6, 2002). Algunos agonistas de LXR activan a LXRalfa y a LXRbeta bajo diferentes condiciones. Por ejemplo, los ácidos biliares 6-alfa-hidroxilados son agonistas de LXRalfa, pero también activan a LXRbeta a mayores concentraciones (Song et al., Steroids 65: 423-7, 2000). Algunos agonistas de LXR actúan exclusivamente sobre LXRalfa, mientras que algunos otros activan solamente a LXRbeta. Por ejemplo, la introducción de un oxígeno en el anillo B de esterol del oxiesterol resulta en un ligando con selectividad del subtipo LXRalfa (Janowski et al., Proc Nati Acad Sci USA 96: 266-71 , 1999). Utilizando ensayos de transcripción dependiente del ligando, se encontró que el ácido 5-tetradeciloxi-2-furancarboxílico (TOFA) y el hidroxicolesterol transactiva a los receptores quiméricos compuestos del dominio de unión a ADN del receptor glucocorticoide y las regiones de unión al ligando de los receptores LXRbeta, PPARalfa, y PPARbeta (Schmidt et al., Mol Cell Endocrinol. 155: 51 -60, 1999). Los agonistas de LXR también se pueden obtener a partir de derivados de agonistas del polipéptido conocido del receptor de LXR. Estos se pueden producir por una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los oligopéptidos específicos (por ejemplo, 10-25 residuos de aminoácidos) que abarcan un agonista polipeptídico conocido de LXR se pueden sintetizar (por ejemplo, químicamente o recombinantemente) y pueden ser evaluados por su capacidad para activar un receptor de LXR. Los fragmentos del agonista de LXR se pueden sintetizar utilizando técnicas estándares tales como aquellas descritas en Bodansky, M. Principies of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlín (1993) y Grant, G. A (ed.). Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992). Los sintetizadores peptídicos automatizados estén comercialmente disponibles, por ejemplo, a partir de Advanced ChemTech Modelo 396 11 , Milligen/Biosearch 9600. Alternativamente, dichos agonistas de LXR se pueden producir mediante la digestión de agonistas polipeptídicos de LXR nativos o producidos de manera recombinante utilizando una proteasa, por ejemplo, tripsina, termolisina, quimotripsina, o pepsina. El análisis por computadora (utilizando el software comercialmente disponible, por ejemplo MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) se puede utilizar para identificar los sitios de escisión proteolítica. Los agonistas polipeptídicos o peptídicos para uso en los métodos de la presente invención preferiblemente están aislados y sustancialmente libres de material celular o de otras proteínas contaminantes a partir de la célula o del tejido fuente a partir del cual se derivan los agonistas de LXR, o está sustancialmente libres de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. Los agonistas proteolíticos o polipeptídicos sintéticos o sus fragmentos pueden comprender tantos residuos de aminoácidos como sea necesario para activar la actividad del receptor LXR, y pueden comprender al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más aminoácidos en longitud. Otros compuestos y polipéptido conocidos que activan al receptor LXR, los agonistas de LXR también se pueden obtener mediante agentes prueba para selección (por ejemplo, librerías del compuesto) para identificar agonistas de LXR novedosos que se unen a y/o que activan las actividades del receptor LXR. Para seleccionar dichos agonistas de LXE novedosos, se puede emplear un LXR de humano o LXR de otros animales en un sistema de ensayo adecuado. Se conocen las secuencias polinucleotídicas y de aminoácidos de los receptores LXR y se describe en la técnica. También se han caracterizado sus estructuras y organizaciones funcionales, incluyendo sus dominios de unión al ligando. Véase, por ejemplo, Apfel et al., Mol Cell Biol 14: 7025-7035, 1994; Willy et al., Genes Dev 9: 1033-1045, 1995; Song et al., Proc Nati Acad Sci USA 91 : 10809-10813, 1994; Shinar et al., Gene 147: 273-276, 1994; Teboul et al., Proc Nati Acad Sci USA 92: 2096-2100, 1995; y Seol et al., Mol Endocrinol 9: 72-85, 1995. Los agonistas pueden activar ya sea a LXR o a LXRalfa. Además, en lugar de la molécula de LXR de longitud total, algunos de los ensayos de selección pueden emplear un polipéptido LXR que comprende un fragmento de una molécula LXR. Por ejemplo, los dos dominios funcionales del receptor LXR, el dominio de unión al ADN N-terminal (DBD) y el dominio de unión al ligando C-terminal (LBD), median la función de activación transcripcional de los receptores nucleares. Un polipéptido LXR que contiene cualesquiera de estos dominios se puede utilizar en la selección para agonistas de LXR novedosos. Se pueden emplear numerosos sistemas de ensayo para seleccionar los agentes prueba para agonistas de un receptor LXR. Como se detalla a continuación, los agentes prueba se pueden seleccionar para la unión directa a un polipéptido LXR o a un fragmento del mismo (por ejemplo, su dominio de unión al ligando). Alternativamente o adicionalmente, los agonistas LXR potenciales se pueden examinar por su capacidad para activar la ruta del receptor LXR o por su capacidad para estimular otras actividades biológicas del receptor LXR. En la selección se puede utilizar ya sea un sistema de ensayo in vitro o un sistema de ensayo basado en célula. La selectividad de los agonistas de LXR potenciales para diferentes receptores (por ejemplo, LXRalfa, LXRbeta, RXR, o PPAR) se puede evaluar utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, los ensayos de centelleo por proximidad mediante una competencia del radioligando de LXR descrito en, por ejemplo, WO 01/41704, y los ensayos de unión por competencia de PPAR descritos en, por ejemplo, Berger et al., J Biol Chem 274: 6718-6725, 1999). Los agentes prueba que se pueden seleccionar para agonistas de LXR novedosos incluyen polipéptidos, miméticos con giro beta, polisacáridos, fosfolípidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiacepinas, glicinas oligoméricas N-sustituidas, oligocarbamatos, polipéptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Algunos agentes prueba son moléculas sintéticas, y otras moléculas naturales. Los agentes prueba se obtienen a partir de una amplia variedad de fuentes incluyendo librerías de compuestos sintéticos o naturales. Las librerías combinatoriales se pueden producir para muchos tipos de compuestos que se pueden sintetizar de manera paso a paso. Las grandes librerías combinatoriales de compuestos se pueden construir mediante el método de librerías sintéticas codificadas (ESL) descrito en WO 95/12608, WO 94/08051 , WO 95/35503 y WO 95/30642. Las librerías peptídicas también se pueden generar mediante métodos de exhibición del fago (véase, por ejemplo, Devlin, WO 91/18980). Las librerías de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngales, vegetales o animales se pueden obtener a partir de fuentes comerciales o se pueden recolectar en el campo. Los agentes farmacológicos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas directas o al azar, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación para producir análogos estructurales. Las librerías combinatoriales de póptidos o de otros compuestos pueden estar completamente al azar, sin preferencias de secuencia o constantes en ninguna posición. Alternativamente, la librería puede tener cierto sesgo, por ejemplo, algunas posiciones dentro de la secuencia se mantienen constantes, o se seleccionan a partir de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, en algunos casos, los nucleótidos o los residuos aminoácidos se encuentran al azar dentro de una clase definida, por ejemplo, de aminoácidos hidrófobos, residuos hidrófilos, residuos estéricamente sesgados (ya sea pequeños o grandes), hacia la creación de cisteína, para el entrecruzamiento, prolinas para los dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para los sitios de fosforilación, o a purinas. Los agentes prueba pueden ser proteínas que se presentan de manera natural o sus fragmentos. Dichos agentes prueba se pueden obtener a partir de una fuente natural, por ejemplo, un lisado de célula o de tejido. Las librerías de agentes polipeptídicos también se pueden preparar, por ejemplo, a partir de una librería de ADNc comercialmente disponible o se pueden generar con métodos de rutina. Los agentes prueba también pueden ser péptidos, por ejemplo, péptidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 aminoácidos, siendo preferidos los péptidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, y siendo particularmente preferidos los péptidos de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 aminoácidos. Los péptidos pueden ser digeridos de proteínas que se presentan de manera natural, péptidos al azar, o péptidos al azar "sesgados". En algunos métodos, los agentes blanco son polipéptidos o proteínas. Los agentes prueba también pueden ser ácidos nucleicos. Los agentes prueba de ácido nucleicos pueden ser ácidos nucleicos que se presentan de manera natural, ácidos nucleicos al azar, o ácidos nucleicos al azar "sesgados". Por ejemplo, los digeridos de genomas procariontes o eucariontes se pueden utilizar de manera similar como se describió anteriormente para las proteínas. En algunos métodos preferidos, los agentes prueba son moléculas orgánicas pequeñas (por ejemplo, moléculas con un peso molecular no mayor de aproximadamente 1 ,000). Preferiblemente, los ensayos de alta resolución se adaptan y se utilizan para seleccionar dichas moléculas pequeñas. En algunos métodos, las librerías combinatoriales de agentes prueba de molécula pequeña como se describió anteriormente se pueden emplear fácilmente para la selección de moduladores de molécula pequeña de un receptor LXR. Numerosos ensayos están disponibles para dichas selección, por ejemplo, como se describe en Schultz (1998) Bioorg Med Chem Lett 8: 2409-2414; Weller (1997) Mol Divers. 3: 61 -70; Femandes (1998) Curr Opin Chem Biol 2: 597-603; y Sittampalam (1997) Curr Opin Chem Biol 1 : 384-91. Los agonistas de LXR potenciales también se pueden identificar basándose en un diseño racional. Por ejemplo, Janowski et al. (Proc Nati Acad Sci USA 96: 266-71 , 1999) describen requerimientos estructurales de los ligandos para LXRalfa y LXRbeta. Se mostró que la monooxidación específica de la posición del lado esterol de la cadena del oxiesterol es un requisito para la unión de alta afinidad y activación a LXR. La unión y activación mejorada también se pueden lograr a través del uso de ligandos 24-oxo que actúan como aceptores del puente de hidrógeno en la cadena lateral. Además, la introducción de un oxígeno en el anillo B del esterol resulta en un ligando con selectividad del subtipo LXRalfa. Las librerías de los agentes prueba a ser seleccionados con los métodos reclamados también se pueden generar basándose en los estudios estructurales de los receptores LXR, sus fragmentos o análogos. Dichos estudios estructurales permiten la identificación de los agentes prueba que más probablemente están unidos al receptor LXR. La estructura tridimensional de un receptor LXR se puede estudiar de numerosas formas, por ejemplo, modelado de la estructura cristalina y molecular. Los métodos para estudiar las estructuras proteicas utilizando cristalografía de rayos X se conocen bien en la literatura. Véase Physical Bio-chemistry, Van Holde, K. E. (Prentice-Hall, N.J. 1971 ), pp. 221 -239, y Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisenberg & D. C. Crothers (Benjamín Cummings, Menlo Parí 1979). Los métodos de modelado molecular se han descrito en la literatura, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,612,894 titulada "System and method for molecular modeling utilizing a sensitivity factor", y la Patente de E.U.A. No. 5,583,973 titulada "Molecular modeling method and system". Además, las estructuras proteicas también se pueden determinar mediante la difracción del neutrón y resonancia magnética nuclear (RMN). Véase, por ejemplo, Physical Chemistry, 4a Edición Moore, W.J. (Prentice-Hall, N.J. 1972), y NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich (Wiley-lnterscience, New York 1986). En algunos ensayos de selección, se determina la unión de un agente prueba a un LXR o a un polipéptido de LXR que contiene su dominio de unión a ligando. La unión de los agentes prueba (por ejemplo, polipéptidos) al polipéptido de LCR se puede ensayar mediante numerosos métodos incluyendo, por ejemplo, ensayos de unión proteína-proteína marcados in vitro, ensayos de cambio de movilidad electroforética, inmunoensayos para la unión a la proteína, ensayos funcionales (ensayos de fosforilación, etc.), y los similares. Véase, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 4,366,241 ; 4,376,110; 4,517,288; y 4,837,168; y también Bevan et al., Trends in Biotechnology 13: 1 15-122, 1995; Ecker et al., BioATechnology 13: 351 -360, 1995; y Hodgson, Bio/Technology 10: 973-980, 1992. El agente prueba se puede identificar mediante la detección de una unión directa al polipéptido LXR, por ejemplo, co-inmunoprecipitación con el polipéptido LXR por un anticuerpo dirigido al polipéptido de LXR. El agente prueba también se puede identificar mediante la detección de una señal que indica que el agente se une al polipéptido de LXR, por ejemplo, disminución de la fluorescencia. Los ensayos de competencia proveen un formato adecuado para la identificación de los agentes prueba (por ejemplo, péptidos o compuestos de molécula pequeña) que se unen específicamente a un polipéptido de LXR. En dichos formatos, los agentes prueba se seleccionan en competencia con un compuesto que ya se sabe que se une al polipéptido de LXR. El compuesto de unión conocido puede ser un compuesto sintético. También puede ser un anticuerpo, el cual reconoce específicamente al polipéptido de LXR, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido en contra del polipéptido de LXR. Si el agente prueba inhibe la unión del compuesto que se sabe que se une al polipéptido de LXR, entonces el agente prueba también se une al polipéptido de LXR. Se conocen numerosos tipos de ensayos para unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo (RÍA), inmunoensayo enzimático directo o indirecto en fase sólida (ElA), ensayos intercalado de competencia (véase Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242-253 (1983)); ElA directo de biotina-avidina en fase sólida (véase Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614-3619 (1986)); ensayos directo marcado en fase sólida, ensayos directo marcado intercalado en fase sólida (véase Harlow y Lañe, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold spring Harbor Press (1988)); RÍA directo marcado en fase sólida utilizando la marca de 125l (véase Morel et al., Mol. Immunol. 25 (1): 7-15 (1988)); ElA directo de biotina-avidina en fase sólida (Cheung et al., Virology 176: 546-552 (1990)); y RÍA directo marcado (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32: 77-82 (1990)). Típicamente, dicho ensayo implica el uso de un polipéptido purificado unido a una superficie sólida o células que contienen cualesquiera de éstos, un agente prueba no marcado y un compuesto marcado de referencia. La inhibición competitiva se mide al determinar la cantidad de marca unida a la superficie sólida o células en la presencia del agente prueba. Usualmente el agente prueba está presente en exceso. La modulación de los agentes identificados por el ensayo de competencia incluye la unión de los agentes al mismo epítope que el compuesto de referencia y los agentes de unión a un epítope adyacente suficientemente próximo al epítope unido al compuesto de referencia para que se presente el impedimento estérico. Usualmente, cuando un agente de competencia está presente en exceso, éste inhibirá la unión específica de un compuesto de referencia a un polipéptido blanco común en al menos 50 o 75%. Los ensayos de selección pueden estar ya sea en formatos insolubles o solubles. Un ejemplo de los ensayos insolubles es inmovilizar un polipéptido de LXR o sus fragmentos sobre una matriz en fase sólida. La matriz en fase sólida se pone entonces en contacto con los agentes prueba, por un intervalo suficiente para permitir que los agentes prueba se unen. Después del lavado de cualquier material no unido a partir de la matriz en fase sólida, la presencia del agente unido a la fase sólida permite la identificación del agente. Los métodos pueden incluir adicionalmente el paso de eluir el agente unido a la matriz en fase sólida, aislando así el agente. Alternativamente, además de inmovilizar el polipéptido de LXR, los agentes prueba se unen a la matriz sólida y se añade la molécula polipeptídica de LXR. Los ensayos solubles incluyen algunos de los métodos de selección de las librerías combinatoriales anteriormente descritos. Bajo los formatos del ensayo soluble, ni los agentes prueba ni el polipéptido de LXR se unen a un soporte sólido. La unión de un polipéptido de LXR o fragmento del mismo a un agente prueba se puede determinar mediante, por ejemplo, los cambios en la fluorescencia de cualquiera del polipéptido de LXR o los agentes prueba, o ambos. La fluorescencia puede ser intrínseca o se puede conferir por el marcado de cualquier componente con un fluoróforo. En algunos ensayos de unión, ya sea el polipéptido de LXR, el agente prueba, o una tercera molécula (por ejemplo, un anticuerpo en contra del polipéptido de LXR) se puede proveer como entidades marcadas, por ejemplo, covalentemente unido o asociado a una marca o grupo detectable, o grupo entrecruzaable, para facilitar la identificación, detección y cuantificación del polipéptido en una situación dada. Estos grupos detectables pueden comprender un grupo polipeptídico detectable, por ejemplo, una enzima o epítope del anticuerpo que se puede ensayar. Alternativamente, el grupo detectable se puede seleccionar a partir de una variedad de otros grupos detectables o marcas, tales como radiomarcas (por ejemplo, 125l, 32P, 25S) o un grupo quimioluminiscente o fluorescente. De manera similar, el grupo detectable puede ser un sustrato, cofactor, inhibidor o ligando de afinidad. La unión de un agente prueba a LXR también se puede evaluar de manera indirecta con un ensayo basado en célula. Por ejemplo, un dominio de unión al ADN del factor de transcripción no receptor GAL4 se puede funcionar al dominio de unión al ligado de LXR (por ejemplo, LXRalfa). La construcción resultante se introduce dentro de una célula hospedera (por ejemplo, la células 293) junto con una construcción reportera (por ejemplo, una construcción de la luciferasa reportera que contiene UAS). Las células transfectadas se tratan entonces con librerías de agentes prueba, y se mide la actividad del polipéptido reportero (por ejemplo, actividad de luciferasa). Los efectos de los agentes prueba individuales sobre la actividad del polipéptido reportero se evaluó en relación con un control (por ejemplo, cuando no está presente el compuesto prueba). El ensayo de sensibilidad al ligando libre de célula (USA) también se puede emplear para identificar agonistas novedosos de LXR. Esto se puede llevar a cabo como se describe la técnica, por ejemplo, Collins et al., J Med Chem. 45: 1963-6, 2002; y Spencer et al., J. Med. Chem. 44: 886-97, 2001. Este ensayo mide el reclutamiento dependiente del ligando de un péptido a partir del coactivador 1 del receptor esteroide (SRC1 ) al receptor nuclear. Con este ensayo (LiSA), se pueden estudiar los requerimientos estructurales para la activación del receptor LXR por los agentes prueba.

De otra manera o además de la detección de una unión directa de un agente prueba a un polipéptido de LXR, también se puede examinar el potencial de los agonistas de LXR para uso en los métodos de la presente invención por su capacidad para activar otras bioactividades o actividades celulares del receptor LXR. Los agentes prueba que activan el receptor LXR se pueden identificar mediante el monitoreo de sus efectos sobre numerosas actividades celulares por LXR. Las actividades celulares por LXR incluyen cualquier actividad mediada por el receptor LXR activado (por ejemplo, regulación transcripcional de un gen blanco). Por ejemplo, LXR trans-activa la expresión de numerosos genes blanco (por ejemplo, ABCA1 ), inhibe la diferenciación del fibroblasto hacia adipocitos, modula la producción de las enzimas específicas del músculo, por ejemplo, creatina cinasa, modula la toma de glucosa por las células, y estimula a la proliferación de la célula mioblasto. El grado en el cual un agente prueba activa un receptor LXR se puede identificar mediante la prueba por la capacidad del agente para mejorar dichas actividades por LXR. Por lo tanto, un agonista de LXR novedoso se puede identificar mediante la identificación de un agente prueba que mejora la expresión de un gen blanco LXR (por ejemplo, ABCA 1 , ABCG 1 , SREBP 1 , o el gen de la colesterol 7-hidroxilasa). Los métodos para la identificación de los agentes prueba que inducen una expresión del gen blanco LXR (por ejemplo, que incrementan los niveles de ARNm de ABCA1 ) se han descrito en la técnica, por ejemplo, Menke et al., Endocrinology 143: 2548-58, 2002; Sparrow et al., J. Biol. Chem. 277: 10021 -7, 2002; y Murthy et al., J Lipid Res. 43: 1054-64, 2002. Además del monitoreo de la expresión del gen blanco LXR, los agonistas de LXR también se pueden identificar al examinar otras actividades celulares estimuladas por la ruta de LXR. Por ejemplo, los agonistas de LXR modulan el nivel de proteína y por lo tanto la actividad de una enzima específica del músculo, creatina cinasa. Por lo tanto, los agonistas de LXR se pueden seleccionar al examinar los agentes prueba por su capacidad para modular la actividad de la creatina cinasa, por ejemplo, como se describe en Somjen et al., J Steroid Biochem Mol Biol 62: 401 -8, 1997. El ensayo se puede llevar a cabo en una línea celular, por ejemplo, la línea celular de mioblasto esquelético de ratón o una línea celular primaria de mioblasto de pollo. Los efectos de los compuestos prueba sobre la actividad de la creatina cinasa en las células cultivadas se pueden medir en los lisados celulares utilizando un equipo comercialmente disponible (disponible por Sigma, St. Louis, Mo.). La modulación de otras bioactividades celulares del receptor de LXR también se puede detectar utilizando métodos bien conocidos y practicados de manera rutinaria en la técnica. Por ejemplo, el agente prueba se puede ensayar por sus actividades en el incremento del eflujo del colesterol a partir de las células tales como macrófagos (Menke et al., Endocrinology 143: 2548-58, 2002; y Sparrow et al., J. Biol. Chem. 277: 10021 -7, 2002). Otros ensayos incluyen los ensayos de transcripción dependiente del ligando (Schmidt et al., Mol Cell Endocrinol 155: 51 -60, 1999), los métodos para medir la capacidad de los agonistas de LXR para interferir con el proceso de diferenciación de los pre-adipocitos (fibroblastos) hacia adipocitos (Plaas et al., Biosci Rep 1 : 207-16, 1981 ; Hiragun et al., J Cell Physiol 134: 124-30, 1988; y Liao et al., J Biol Chem 270: 12123-32, 1995), o la capacidad para estimular la proliferación de la célula mioblasto (Konishi et al., Biochemistry 28: 8872-7, 1989; y Austin et al., J Neurol Sci 101 : 193-7, 1991 ). Como un control, todos estos ensayos pueden incluir las mediciones antes y después de que se añada el agente prueba al sistema de ensayo.

Aplicaciones terapéuticas La presente invención provee métodos para el tratamiento de la degeneración de la célula beta en un sujeto que comprende la administración de un agonista de LXR a dicho sujeto. El método también encuentra aplicación en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por insuficientes células beta y por lo tanto disfunción de la insulina (por ejemplo, resistencia, inactividad o deficiencia) y/o transporte insuficiente de glucosa hacia las células. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a la diabetes, hiperglicemia y obesidad. El tratamiento de la degeneración de la célula beta también es útil para prevenir o modular el desarrollo de dichas enfermedades o trastornos en un sujeto que se sospecha que es propenso, o que se sabe que es propenso a dichas enfermedades o trastornos.

Más particularmente, puesto que actualmente se han encontrado de manera inesperada que es posible evitar la degeneración de las células beta, la invención también se dirige a un método para prevenir la diabetes tipo I en un sujeto, el método comprendiendo la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un agonista de LXR. Los agonistas de LXR a ser utilizados en estas aplicaciones pueden ser cualesquiera de los agonistas de LXR conocidos que se han descrito en la técnica. Alternativamente, los métodos terapéuticos comprenden la selección de agentes prueba para identificar agonistas de LXR novedosos como se describió anteriormente, y la administración de dichos agonistas novedosos para tratar la degeneración de las células beta o para tratar las enfermedades anteriormente mencionadas en un sujeto. Los presentes inventores observaron que se puede lograr la detención de la degeneración de las células beta después de la aplicación de un agonista de LXR por un muy corto periodo de tiempo, por ejemplo, a 21 días. Sin embargo, cuando el objetivo es mejorar la sensibilidad a la insulina o mejorar los síntomas de la diabetes en un sujeto, es necesario un periodo de tratamiento más largo. Para dichas aplicaciones, el agonista de LXR típicamente se administra a un sujeto por un periodo de tiempo continuo, por ejemplo, al menos 30 días, 60 días, 90 días o más largo. La invención también se refiere a un método novedoso con una aceptación mejorada. Se sabe bien que el sujeto diabético tiene que tomar un gran número de fármacos. La presente invención permite reducir el número de fármacos a ser ingeridos, e incluso permite detener el tratamiento una vez que la glicemia y/o el valor de HbAlc se estabilizan o que se recupera la sensibilidad a la insulina. Por lo tanto, la presente invención también se dirige a un método para el tratamiento o mejoría de la diabetes, el método comprendiendo la medición del nivel de glucosa en circulación y/o de HbAlc en el sujeto y la administración diaria al sujeto de una cantidad efectiva de un agonista de LXR hasta la estabilización de la glicemia y/o HbAl c, luego deteniendo el tratamiento una vez que la glicemia y/o HbAlc se estabiliza. El agonista de LXR preferiblemente se administra al sujeto diariamente por al menos 30 días. También se puede administrar por al menos 60 días, 90 días, o durante más tiempo. El tratamiento diario opcionalmente se puede realizar de nuevo tanto si la glicemia y/o HbAlc ya no están estabilizados como si se pierde la sensibilidad a la insulina. Los métodos para la medición del nivel de glucosa en circulación son los métodos bien conocidos en la técnica previa y se puede utilizar cualquier clase de métodos.

Composiciones farmacéuticas (o medicamento) Los agonistas de LXR de la presente invención se pueden administrar directamente bajo condiciones estériles al sujeto a ser tratado. Los moduladores se pueden administrar solos o como el ingrediente activo de una composición farmacéutica. La composición terapéutica de la presente invención se puede combinar con o utilizar en asociación con otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, un sujeto se puede tratar con un agonista de LXR junto con otros fármacos antidiabéticos convencionales. Los ejemplos de dichos fármacos antidiabéticos conocidos incluyen Actos (pioglitizona, Takeda, Eli Lilly), Avandia (rosiglitazona, Smithkline Beacham), Amaryl (glimepirida, Aventis), Glipizida Sulfonilurea (genérico) o Glucotrol (Pfizer), Glucophage (metformina, Bristol Meyers Squibb), Glucovance (gliburida metformina, Bristol Meyers Squibb), Glucotrol XL (glipizida de liberación extendida, Pfizer), Glyburide (Micronase; Upjohn, Glynase; Upjohn, Diabeta; Aventis), Glyset (miglitol, Pharmacia & Upjohn), Metaglip (glipizida + metformina; tableta de combinación fija), Prandin (repaglinida, NOVO), Precose (acarbosa, Bayer), Rezulin (troglitazona, Parke Davis), y Starlix (nateglinida, Novartis). Un sujeto también se puede tratar con un agonista de LXR junto con análogos de GLP-1 y derivados. Dichos análogos de GLP-1 y derivados que se pueden utilizar de conformidad con la presente invención incluyen aquellos referidos en WO 99/43705 (Novo Nordisk A/S), WO 99/43706 (Novo Nordisk A/S), WO 99/43707 (Novo Nordisk A/S), WO 98/08871 (Novo Nordisk A/S), WO 99/43708 (Novo Nordisk A/S), WO 99/43341 (Novo Nordisk A/S), WO 87/06941 (The General Hospital Corporation), WO 90/11296 (The General Hospital Corporation), WO 91/11457 (Buckley et al.), WO 98/43658 (Eli Lilly & Co.)- Las composiciones farmacéuticas de la presente invención típicamente comprenden al menos un ingrediente activo junto con uno o más vehículos aceptables del mismo. Los vehículos farmacéuticos mejoran o estabilizan la composición, o facilitan la preparación de la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular a ser administrada (por ejemplo, ácido nucleico, proteína, o compuestos moduladores), así como por el método particular utilizado para administrar la composición. Estos también deben ser tanto farmacéuticamente como fisiológicamente aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes y no deletéreos al sujeto. Este vehículo puede tomar una amplia variedad de forma dependiendo de la forma de preparación deseada para administración, por ejemplo, oral, sublingual, rectal, nasal, o parenteral. Existe una amplia variedad de vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables para practicar la presente invención (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20a edición, 2000). Sin limitación, estos incluyen jarabe, agua, solución salina isotónica, 5% de dextrosa en agua o solución de acetato con pH regulado con sodio o con amonio, aceites, glicerina, alcoholes, agentes saborizantes, conservadores, agentes colorantes, almidones, azúcares, diluyentes, agentes granulantes, lubricantes, y aglutinantes, entre otros. El agonista de LXR también se puede formar en complejo con proteínas vehículo tales como ovalbúmina o albúmina de suero antes de su administración con el objeto de mejorar la estabilidad. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar en diversas formas, tales como granulos, tabletas, pildoras, supositorios, cápsulas, suspensiones, ungüentos, lociones y las similares. La concentración del compuesto terapéuticamente activo en la formulación puede variar de aproximadamente OJ -100% en peso. Las formulaciones terapéuticas se preparan mediante cualesquiera métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman et al., eds., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a edición, Pergamon Press, 1990; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20a edición, 2000; Avis et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, publicado por Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1993; y Lieberman et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, publicado por Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1990. Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su ruta de administración pretendida. Los ejemplos de rutas adecuadas de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradermal, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdermal (tópica), transmucosal, y rectal. Para la administración parenteral, los agonistas de LXR de la presente invención se pueden formular en una variedad de formas. Las soluciones acuosas de los moduladores se pueden encapsular en lechos poliméricos, nanopartículas u otras formulaciones inyectables en depósito conocidas por aquellos expertos en la técnica. Adicionalmente, los compuestos de la presente invención también se pueden administrar encapsulados en liposomas. Las composiciones, dependiendo de su solubilidad, pueden estar presentes tanto en la capa acuosa como en la capa lipídica, o en lo que generalmente se denomina una suspensión liposómica. La capa hidrófoba, generalmente pero no exclusivamente, comprende fosfolípidos tales como lecitina y esfingomielina, esteroides tal como colesterol, agentes tensioactivos más o menos iónicos tales como diacetilfosfato, estearilamina, o ácido fosfatídico, y/u otros materiales de una naturaleza hidrófoba. Las composiciones se pueden suplementar mediante otros ingredientes farmacéuticos activos cuando sea deseable. También pueden estar presentes de manera opcional agentes antibacterianos, antisépticos, y antioxidantes en las composiciones en donde éstos llevarán a cabo sus funciones ordinarias. En algunas aplicaciones, los antagonistas de LXR se preparan con vehículos que protegerán al compuesto en contra de la eliminación rápida a partir del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Un material de liberación sostenida tal como un monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o con una cera se puede incluir en las composiciones. Los polímeros biodegradables, biocompatibles también se pueden utilizar, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágena, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes a aquellos expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente a partir de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un contenedor, empaque, o dispensador junto con instrucciones para la administración.

Dosis Los sujetos que padecen de diabetes o de trastornos relacionados típicamente se tratan con composiciones farmacéuticas de la presente invención por un periodo de tiempo continuo (por ejemplo, al menos 30 días, 60 días, 90 días, o más tiempo). Las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad farmacéuticamente efectiva o cantidad profilácticamente efectiva de un agonista de LXR. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se pretende que signifique esa cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que inducirá la respuesta biológica o médica de un tejido, un sistema, animal o humano que se busca por un investigador, veterinario, doctor u otro médico clínico. El término "cantidad profilácticamente efectiva" se pretende que signifique esa cantidad de un fármaco farmacéutico que prevendrá o reducirá el riesgo de ocurrencia del evento biológico o médico que se desea prevenir en un tejido, un sistema, animal o humano.

Una dosis terapéutica adecuada se puede determinar mediante cualesquiera de los métodos bien conocidos tales como estudios clínicos en especies de mamíferos para determinar la dosis máxima tolerable y sobre los sujetos humanos normales para determinar la dosis segura. Particularmente, la cantidad de dosis de un ligando LXR que recibe un sujeto se puede seleccionar para que logre la regeneración de la célula beta; la dosis que recibe un sujeto también se puede titular durante un tiempo con el objeto de estabilizar la glicemia y/o HbAlc o de recuperar la sensibilidad a la insulina. La toxicidad y eficiencia terapéutica de los agonistas de LXR se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, para la determinación de la LD50 (la dosis letal al 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La relación de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación de LD50/ED5o. Se prefieren los agonistas de LXR que exhiben grandes índices terapéuticos. Aunque se pueden utilizar los agonistas de LXR que exhiben efectos laterales tóxicos, se debe tener cuidado para diseñar un sistema de administración que dirija dichos agonistas de LXR al sitio del tejido afectado con el objeto de minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos laterales. Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y de los estudios animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosis para uso en humanos. La dosis de dichos compuestos preferiblemente yace dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluye la ED50 con poca toxicidad o sin toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier agonista de LXR utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de los ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para lograr una concentración plasmática en circulación en el intervalo que incluye la IC5o (por ejemplo, la concentración de los agonistas de LXR prueba que logra una inhibición máxima de la mitad de los síntomas) como se determina en el cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar de manera más precisa las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. En general, excepto bajo ciertas circunstancias cuando las dosis más elevadas se pueden requerir, la dosis preferida de un agonista de LXR usualmente yace dentro del intervalo de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 1000 mg, más usualmente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 500 mg por día. La dosis preferida y modo de administración de un agonista de LXR puede variar para diferentes sujetos, dependiendo de los factores que se pueden revisar individualmente por el médico tratante, tal como la condición o condiciones a ser tratadas, la elección de la composición a ser administrada, incluyendo el agonista de LXR particular, la edad, peso, y respuesta del sujeto individual, la severidad de los síntomas del sujeto, y la ruta de administración elegida. Como una regla general, la cantidad de un agonista de LXR administrada es la dosis más pequeña que previene o minimiza de manera efectiva y confiable las condiciones de los sujetos. Por lo tanto, los intervalos de dosis anteriormente mencionados se pretenden para proveer una guía general y soporte para las enseñanzas en la presente invención, pero no se pretende que limiten el alcance de la invención. En algunas aplicaciones, se utiliza un primer agonista de LXR en combinación con un segundo agonista de LXR o un fármaco antidiabético conocido con el objeto de alcanzar efectos terapéuticos que no pueden ser logrados cuando solamente se utiliza un agonista de LXR de manera individual.

Tratamiento ex vivo La invención se refiere adicionalmente un método para inhibir la pérdida de una célula beta en el tejido de la isleta pancreática mediante el contacto del tejido de la isleta pancreática con un agonista de LXR. Al disminuir la pérdida se pretende que el tejido pancreático tenga 10%, 20%, 30%, 40% o más de células beta en la presencia del agonista de LXR en comparación con la ausencia del agonista de LXR. La invención también se refiere a un método para incrementar la viabilidad o proliferación de las células de la isleta pancreática al poner en contacto a una célula con un agonista de LXR. Adicionalmente, se incrementa la viabilidad de las células de la isleta pancreática mediante la administración a un recipiente del transplante con un agonista de LXR. Las células de la isleta pancreática son células primarias de la isleta. Alternativamente, las células son células pancreáticas del donante transplantadas. Por viabilidad se entiende que la célula excluye un colorante vital, tal como tripán. Las células viables también son capaces de llevar a cabo proliferación, diferenciación, crecimiento y desarrollo. La viabilidad se mide mediante los métodos conocidos en la técnica tales como tinción con azul tripán. Las células se ponen en contacto in vivo, in vitro o ex vivo. El agonista de LXR se administra localmente hacia un sitio transplantado. Alternativamente el agonista de LXR se administra sistemáticamente. El agonista de LXR se administra al recipiente del transplante antes de o después del transplante de las células de la isleta pancreática del donante. Opcionalmente, el agonista de LXR se administra al recipiente del transplante de manera concurrente con el transplante del tejido pancreático del donante. También se incluyen en la invención los métodos para la inhibición de la muerte celular mediante el contacto de la célula con un agonista de LXR. Las células se ponen en contacto in vivo, in vitro o ex vivo. La célula es una célula pancreática tal como una célula beta de la isleta pancreática. La muerte celular es muerte celular inducida por estrés oxidativo o muerte celular apoptótica.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra el efecto de GW3965 (10 mg/kg) oralmente administrado en ratas ZDF por 3 semanas sobre la glucosa plasmática y después del término del tratamiento. La figura 2 muestra el efecto de GW3965 (10 mg/kg) oralmente administrado en ratas ZDF por 3 semanas sobre la secreción de insulina estimulada por glucosa en isletas pancreáticas aisladas. La figura 3 muestra el efecto de GW3965 (10 mg/kg) oralmente administrado en ratas ZDF por 3 semanas sobre el contenido de insulina de las isletas pancreáticas aisladas. La figura 4 muestra el efecto de GW3965 (10 mg/kg) oralmente administrado en ratas ZDF por 3 semanas sobre el número de las isletas pancreáticas cosechadas. La figura 5A y figura 5B muestran el efecto de GW3965 (10 mg/kg) oralmente administrado en ratas ZDF por 4 semanas sobre la apoptosis en isletas pancreáticas aisladas y secciones pancreáticas. La figura 6A (figura de arriba) y figura 6B (figura de abajo) muestra el efecto de GW3965 sobre la expresión del ARNm de PDX1 y GLUT2. La figura 7 muestra el efecto de GW3965 (50 mg/kg) sobre la regeneración de las células beta en ratones NOD.

La figura 8A y figura 8B muestran el efecto de GW3965 (50 mg/kg) sobre el desarrollo de la insulitis en ratones NOD y en donde el panel A representa las secciones pancreáticas de los ratones NOD control tratados solamente con el vehículo y el panel B ilustra las secciones pancreáticas de los ratones NOD tratados con GW3965.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la presente invención.

Animales La rata macho diabética obesa Zucker fa/fa (ZDF) es un modelo de la diabetes tipo II. Las ratas son resistentes a la insulina pero son normoglicémicas desde el nacimiento y desarrollan la diabetes a partir de aproximadamente la semana 7 a la semana 10 de edad. Durante el periodo transicional, los animales pasan por una etapa de tolerancia alterada a la glucosa. Aunque los animales son hiperinsulinémicos antes del inicio de la diabetes y durante las etapas tempranas de la diabetes, estos pierden posteriormente la secreción de insulina estimulada por glucosa y finalmente se vuelven casi completamente insulinopénicos. Las ratas macho ZDF fa/fa y ZDF fa+ se obtuvieron a partir de Genetic Models (Indianapolis, IN), a la edad de 6 semanas y se utilizaron en los experimentos a las 12 semanas de edad, después de 3 semanas de tratamiento oral con el vehículo o con GW3965 (10 mg/kg). Los compuestos se proporcionaron una vez al día (a las 17 horas) vía cebadura oral. En el momento de su uso, las ratas ZDF fa/afa pesaban 310-350 g, mientras que las ratas ZDF fa+ con edad coincidente pesaban 245-285 g. Los animales ZDF fa+ y ZDF fa fa tuvieron libre acceso a croquetas diabetogénicas (Purina 5008). Los animales fueron alojados 5 por jaula en un cuarto con temperatura y humedad controlada con un ciclo de luz-oscuridad de 12/12 horas. Las muestras de sangre se tomaron 16 horas después de la administración del compuesto vía la vena de la cola y se midieron en un analizador químico clínico Konelab 300 (Labsystem). Los ratones NOD (diabéticos no obesos) es un modelo experimental de diabetes espontánea que se parece a la diabetes tipo I (dependiente de insulina) de humano, que resulta a partir de la invasión progresiva de la isleta y de la destrucción de las células beta por las células T auto-reactivas. Este modelo de diabetes espontánea ofrece una oportunidad única para el estudio de las células T auto-reactivas implicadas en el proceso de destrucción de la célula beta y en el establecimiento de estrategias preventivas antes del inicio clínico de la enfermedad.

Preparación de las isletas pancreáticas de la rata Las isletas pancreáticas de la rata se prepararon mediante digestión con colagenasa y purificación por gradiente de densidad. La enzima colagenasa tipo XI (Sigma Chemical, St. Louis, MO) se utilizó para la digestión del páncreas. Después de un ayuno durante toda la noche, los animales se anestesiaron profundamente y se sacrificaron. Posteriormente, el conducto pancreático se canuló, y se inyectaron lentamente 20 ml de la solución de digestión a 37°C (colagenasa 30 mg/ml disuelta en 20 ml de solución salina balanceada de Hank [HBSS]) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) para distender el tejido. Después de la distensión, el páncreas se colocó en un vaso de precipitado de vidrio de 20 ml que contenía 5 ml de la solución de digestión a 37°C que se colocó en un baño con agua en agitación a 37°C por 8 minutos. Después de la centrifugación a 633 g por 1 minuto a 4°C, el sobrenadante se removió y las isletas se lavaron tres veces con HBSS mediante centrifugación a 633 g por 1 minuto a 4°C. Para el procedimiento de purificación, las isletas se resuspendieron en 4 ml de Histopaque 1.077 al 80% (Sigma) y 4 ml de HBSS. Después de la centrifugación a 1943 g por 20 minutos a 4°C, las isletas se recuperaron en la interfase entre las capas del Histopaque y el HBSS. Las isletas se resuspendieron en medio RPMI 1640 que contenía glucosa 11 mM, 10% de FCS, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 µg/ml) y L-glutamina (2 mM) y se cultivaron durante toda la noche a 37°C en una incubadora con C02.

Evaluación de la apoptosis por la medición de los fragmentos de ADN La apoptosis de las células de la isleta evaluada por el ensayo inmunosorbente asociado a enzima para detección de muerte celular (ELISA) más el equipo de Roche, de conformidad con los procedimientos recomendados por el fabricante y aplicados al experimento con isleta de rata. Después de una incubación durante toda la noche en medio RPMI 1640 que contenía glucosa 11 mM, 10% de FCS, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 µg/ml) y L-glutamina (2 mM), grupos de 10 isletas fueron informadas por 30 minutos con un regulador de pH para lisis a temperatura ambiente y luego se centrifugaron a 200 g por 10 minutos a 4°C para la apoptosis. Las alícuotas del sobrenadante (20 µl) se colocaron en pozos de una placa de microtitulación revestidos con estreptavidina. Un total de 80 µl de una mezcla que contenía anticuerpo anti-histona-biotina y anticuerpo anti-ADN-peroxidasa se añadió entonces, y la incubación se permitió por 120 minutos a 37°C. Posteriormente, las preparaciones se lavaron y se añadieron 100 µl de una solución que contenía ABTS (2,2'-azino-di[3-etilbenztiazalin-sulfonato]) (el sustrato para la oxidasa). Al término de la incubación de 5 minutos, la absorbancia de las muestras se leyó de manera espectrofotométrica a 405 nm. Los resultados se expresaron como un porcentaje del estándar interno (partículas nucleosomales).

Evaluación de la apoptosis por tinción mediante TÚNEL La apoptosis de la célula de la isleta se determinó mediante tinción con marcado de dUTP con corte terminal mediado por transferasa (TÚNEL). La muerte celular se identificó por el marcado in situ del extremo hacia 3' del ADN fragmentado con deoxiuridina-trifosfato biotinilada. Cada pieza pancreática se cortó de manera extensiva en secciones de 5 µm de espesor, las cuales se recolectaron sobre portaobjetos revestidos con gelatina. Se tomaron cuatro secciones a intervalos regulares tanto en las piezas de la cabeza como de la cola. Después de la digestión con Proteinasa K (2 µg/ml; Sigma), las secciones se lavaron consecutivamente en regulador de pH TdT (0.5 moles/l de cacodilato [pH 6.8], 1 milimol/l de cloruro de cobalto, 0J5 moles/l de NaCI) y luego se incubaron a 37°C con TdT (25U; Boehringer-Mannheim, Mannheim, Alemania) y dUTP biotinilado (1 nanomol/µl). Después del lavado en regulador de pH TB (300 milimoles/l de NaCI, 30 milimoles/l de citrato de sodio) para terminar la reacción, se detectó la incorporación de dUTP biotinilado mediante una modificación del método de complejo avidina-biotina a. Se aplicó el complejo de estreptavidina-biotina conjugado a peroxidasa de rábano (Vector Laboratories). Las secciones se desarrollaron entonces utilizando DAB como cromógeno y se contratiñeron ligeramente con hematoxilina y se montaron en dePex (aBDH Laboratory, Poole, Inglaterra).

Secreción de insulina estimulada por glucosa y contenido de insulina en la isleta Después de un periodo de preincubación de 30 minutos a 37°C por 30 minutos en solución de Kerbs-Ringer bicarbonato (KRB)-HEPES (NaCI 129 mM, KCl 4.8 mM, MgS04 1.2 mM, KH2P04 1.2 mM, CaCI2 2.5 mM, NaHC03 5 mM, y HEPES 10 mM a pH 7.4) que contenía BSA al 0.5% y sin glucosa. Los lotes de 3 isletas de tamaño comparable se colocaron dentro de pozos de una placa de microtitulación que contenía 200 µl de solución de KRB-HEPES que contenía BSA al 0.5% y glucosa 3.3 mM a 37°C por 1 hora a bajo agitación y a una atmósfera de 5% de C02 y 95% de 02. Al término de esta prueba, el medio se removió completamente y se reemplazó con KRB-HEPES que contenía 16.7 milimoles/l de glucosa. Después de 1 hora adicional de incubación, el medio se removió y se congeló. El contenido de insulina se midió en las mismas isletas después de una extracción durante toda la noche con alcohol-ácido (etanol al 75% + HCl 0J5 N). Las concentraciones de insulina en los diferentes medios se determinaron mediante una prueba de ELISA para insulina de rata (Insulin Rat Élite plus, MERCODIA).

Transcripción reversa-PCR cuantitativa en tiempo real La expresión del gen homeobox 1 pancreático y duodenal, Pdx1 (GenBank: NM D22852) y del gen del facilitador del transporte de glucosa, miembro 2, Glut2 (GenBank: NMJ312879) se midieron mediante RT-PCR en tiempo real. Los ARN totales a partir de las isletas pancreáticas de rata aisladas se prepararon utilizando el equipo Rneasy 96 de conformidad con el protocolo del fabricante (Qiagen, Francia), se trataron con Dnasa I para remover el ADN contaminante (Stratagene, Francia), y se cuantificaron utilizando los equipos de síntesis de ADNc iScript e iQ SYBR Green Supermix (Biorad, Francia). La RT-PCR cuantitativa en tiempo real se llevó a cabo utilizando el aparato y software ¡Cycler Detection System (Bio-Rad). Puesto que el tamaño pronosticado de los ADNc amplificados y los valores Tm para los iniciadores fueron similares, se aplicaron condiciones de amplificación uniforme (por ejemplo fijación a 60°C). La especificidad de los productos amplificados se monitoreó al llevar a cabo las curvas de fusión al término de cada amplificación. Los niveles de expresión se cuantificaron (unidades de ARN total) mediante la generación de una curva estándar de seis puntos en serie. Las muestras de ARN se normalizaron para comparación mediante la determinación de los niveles de ARNr 18S.

Secuencias del iniciador PDX1 (hacia adelante): CCACAGCCCTCCAGCATCG PDX1 (reverso): CAGACCCGCTCACCCTCAG Glut2 (hacia adelante): ACCAGCACATACGACACCAGAC Glut2 (reverso): GACACAGACAGAGACCAGAGCATAG 18S (hacia adelante): CGTCTGCCCTATCAACTTTCG 18S(reverso): GATGTGGTAGCCGTTTCTCAG Análisis de datos Los datos se expresan como la media ± SEM. Las comparaciones entre diversos grupos se obtuvieron mediante la prueba t de Student. Las diferencias en p < 0.05 entre los grupos experimentales se consideraron estadísticamente significativas. Para las comparaciones, el grupo ZDF fa fa se comparó con el grupo ZDF fa+ y el grupo ZDF fa/fa GW3965 se comparó con el grupo ZDF fa/fa.

Secciones pancreáticas y análisis histológico Los ratones que no se sometieron al ayuno se eliminaron dos días después de la última administración de los compuestos. Las glándulas pancreáticas se escindieron y se procesaron para estudios histológicos convencionales después de la fijación en solución alcohólica de Boiun. Las secciones de cinco µm se tiñeron con hematoxilina-eosina como se describió previamente por Thivolet C.H. et al., 1991 , Diabetologia, 34, 314-319.

EJEMPLO 1 Efecto de GW3965 (10 mq/kq) oralmente administrado en ratas ZDF por 3 semanas sobre la glucosa en plasma y después del término del tratamiento Los patrones de cambios en la glucosa en plasma se muestran en la figura 1. Al inicio del estudio, la glicemia fue similar en las ratas ZDF tratadas con el vehículo y en las ratas ZDF tratadas con GW3965. Al día 6, los niveles de glucosa en plasma en el grupo tratado con el vehículo se incrementaron por arriba de 400 mg/ml. El tratamiento con GW3965 previno significativamente esta elevación y mantuvo la glicemia a un nivel bajo hasta el término del tratamiento al día 21. A partir del día 21 hasta el término del experimento, los animales no recibieron ningún tratamiento. Al día 44, la glicemia aún se redujo de manera significativa en ratas ZDF que fueron previamente tratadas con GW3965. Esto indica que el control de la glicemia de larga duración después de un período limitado de tratamiento con GW3965, probablemente resultó a partir del restablecimiento de la función de la célula beta y de la masa de conformidad con los datos in vivo. Este ejemplo apoya la propuesta del modo de tratamiento novedoso que se basa en la administración de un agonista de LXR por periodos limitados de tiempo a pacientes diabéticos. Los resultados muestran que mientras el efecto sobre los triglicéridos se reduce después del paro del tratamiento, la disminución de la glucosa en sangre se mantiene por más de un mes. Los ligandos agonistas de LXR se pueden administrar entonces ya sea como una dosis de carga por uno o varios días y la administración de recarga subsecuente en una base semanal o durante más tiempo dependiendo de la dosis de carga, o alternativamente cada tercer día o alternativamente cada tercer semana (o varios días).

EJEMPLO 2 Secreción de insulina estimulada por glucosa en isletas pancreáticas aisladas a partir de ratas ZDF oralmente tratadas por 3 semanas cor» GW3965 (10 mq/m8) Los resultados se presentan en la figura 2. En la presencia de 3.3 milimoles/l y 16.7 milimoles/l de glucosa, la secreción de insulina de las isletas de la rata ZDF en comparación con las isletas de la rata ZDF fa-i- se redujo en un 82.6% y 69.6%, respectivamente. En las isletas de la rata ZDF tratada con GW3965 en comparación con las isletas de la rata ZDF tratada con el vehículo, la secreción de insulina en respuesta a 3.3 milimoles/l y 16.7 milimoles/l se redujo significativamente en un 133.8% y 74.5%, respectivamente. Por lo tanto, se muestran que la secreción de insulina estimulada por glucosa de las isletas pancreáticas de la rata ZDF se mejora por un agonista de LXR.

EJEMPLO 3 Efecto de GW3965 (10 mg/kg) oralmente administrado a ias ratas ZDF por 3 semanas sobre el contenido de insulina de las isletas pancreáticas aisladas Los resultados se presentan en la figura 3. El contenido de insulina se redujo fuertemente en las isletas de ratas ZDF en comparación con las isletas de ratas ZDF fa+ (4.78 ± 0.86 contra 27.74 ± 6.85 ng/isleta). El contenido de insulina de las isletas de las ratas ZDF tratadas con GW3965 (10 mg/kg) se incrementó significativamente en comparación con las isletas de las ratas ZDF tratadas con el vehículo (13.05 ± 2.49 contra 4.78 ± 0.86 ng/isleta). Este ejemplo demuestra que el contenido de insulina de las isletas pancreáticas se incrementa con un agonista de LXR.

EJEMPLO 4 Efecto de GW3965 (10 mg/kg) oralmente administrado a ratas ZDF por 3 semanas sobre el número de isletas pancreáticas cosechadas Los resultados se presentan en la figura 4. El número de isletas pancreáticas cosechadas en las ratas ZDF fue menor que aquél recolectado en ratas ZDF fa+ (51 ± 13 y 120 ± 28 isletas/rata, respectivamente). Las ratas ZDF tratadas con GW3965 tuvieron un número incrementado de isletas pancreáticas en comparación con las ratas ZDF tratadas con el vehículo (80 ± 16 y 51 ± 13 isletas/rata, respectivamente). Por lo tanto, el número de isletas pancreáticas se incrementa después de un tratamiento in vivo con un agonista de LXR.

EJEMPLO 5 Efecto de GW3965 (10 mq/kq) oralmente administrado a ratas ZDF por 4 semanas sobre la apoptosis en isletas pancreáticas aisiadas y secciones pancreáticas En este ejemplo, se investigó la relación de apoptosis de las isletas pancreáticas. Los resultados se presentan en la figura 5A. Los fragmentos de ADN, como se mide por un ensayo de ELISA específico después de un cultivo durante toda la noche en medio RPIVil, se incrementaron significativamente en las isletas de las ratas ZDF en comparación con las isletas de las ratas ZDF fa+ control (43.1 ± 9.2% contra 19.9 ± 6.2%). La apoptosis en las isletas pancreáticas aisladas a partir de las ratas ZDF tratadas con GW3965 en comparación con las ratas ZDF tratadas con el vehículo se redujo (34.0 ± 7.5% y 43.1 ± 9.2%, respectivamente). La apoptosis también se ha estimado utilizando el método de tinción TÚNEL sobre secciones pancreáticas de 5 animales de ratas ZDF de 8 semanas de edad tratadas con GW3965 10 mg/kg por 4 semanas. Los resultados se representan en la figura 5B y muestran que la apoptosis en las secciones pancreáticas a partir de las ratas ZDF tratadas con GW3965 se redujo significativamente en comparación con aquella de los ratones control tratados con el vehículo (1.41 ± 0.96% y 4.55 ± 1.29% de apoptosis, respectivamente (p < 0.05). Un tratamiento oral in vivo con un agonista de LXR permite reducir la apoptosis de las isletas pancreáticas aisladas correspondientes. Específicamente, puesto que las células beta representan el 85-95% de la isleta pancreática, estos resultados muestran que la administración del agonista de LXR reduce significativamente la apoptosis de las células beta.

EJEMPLO 6 Efecto de GW3965 sobre la extensión del ARNm de PDX1 y GLUT2 (figura 6A y figura 6B) En este ejemplo, se determinó la extensión del ARNm de PDX1 y Glut2. Como se describió previamente, PDX1 y Glut2 son marcadores de la regeneración de las células beta. La expresión del ARNm de PDX1 y Glut2 se redujo marcadamente en las isletas de las ratas ZDF contra las ratas ZDF fa+ control (0.17 contra 0.38 ± 0.21 y 0.27 contra 0.40 ± 0.22, respectivamente). La expresión del ARNm de PDX1 y Glut2 se incrementó en las isletas aisladas a partir de ratas ZDF tratadas con GW3965 en comparación con las ratas tratadas con el vehículo. Los valores fueron 0.35 ± 0.11 para PDX1 y 0.55 ± 0.23 para Glut2.

Este ejemplo demuestra que las células beta de las isletas pancreáticas llevan a cabo regeneración después del tratamiento con un agonista de LXR.

EJEMPLO 7 Efecto de GW3965 (50 mq/kq) sobre la regeneración de ias células beta en los ratones NOD (figura 7) Los ratones NOD de 4 semanas de edad habían sido tratados por 4 semanas (5 días/7) con el vehículo o con GW3965 50 mg/kg. Los estudios histológicos pancreáticos se llevaron a cabo como se describió anteriormente. Como se muestra claramente mediante la formación de isletas nuevas identificadas en círculos en la figura 7, las células beta de las isletas pancreáticas llevaron a cabo regeneración después del tratamiento con un agonista de LXR. Además, la regeneración de las células beta se presenta con una estructura morfológica de la isleta pancreática equivalente a aquella de las isletas pancreáticas normales.

EJEMPLO 8 Efecto de GW3965 (50 mg/kg) sobre el desarrollo de ia insulitñs en ratones NOD (figura 8A y figura 8B) La evolución de la insulitis se analizó en el páncreas.

Comúnmente se describen cinco estados de la insulitis: estado = caracterizado por las isletas normales sin infiltración de monocitos (linfocitos T), estado 1 que corresponde a una periinsulitis, estado 2 con insulitis inferior al 50%, estado 3 con insulitis superior al 50% y estado 4 con apoptosis. El estado 4 no se observó en ratones de 8 semanas de edad, este estado apareció alrededor de las 9-10 semanas. Los ratones NOD de 4 semanas de edad habían sido tratados por 4 semanas (5 días/7) con el vehículo o con GW3965 50 mg/kg. Los estudios histológicos pancreáticos se llevaron a cabo como se describió anteriormente. Corno se muestra en la figura 8A, las secciones pancreáticas de los ratones NOD control tratados solamente con el vehículo exhibieron insulitis mientras que el páncreas de los ratones NOD tratados con GW3965 parecieron estar protegidos en contra de la infiltración de linfocitos como se ilustra en la figura 8B. De hecho, se observó 94% de las isletas normales en los páncreas de ratones NOD tratados con GW3965 mientras que los ratones NOD control mostraron solamente 32% de isletas normales (datos no mostrados).

Este ejemplo demuestra que la administración in vivo del agonista de LXR GW3965 es capaz de inhibir el desarrollo de la insulitis en ratones NOD. Estos ejemplos muestran que un agonista de LXR, GW3965, incrementa la secreción de insulina estimulada por glucosa, el contenido de glucosa y el número de las isletas, reduce la apoptosis de la célula beta y promueve la regeneración de las células beta en la rata ZDF severamente diabética. Esto se asoció con una mejoría del estado diabético y una disminución significativa de la glicemia y HbAlc después de 21 días de tratamiento. En la evaluación de los mecanismos potenciales que subyacen a las acciones antidiabéticas de los agonistas de LXR, los inventores descubrieron que el tratamiento con GW3965 resultó en una reducción significativa de la apoptosis de la célula beta y un incremento significativo del contenido de insulina. Además los inventores encontraron un restablecimiento del nivel de ARNm de PDX1 y Glut2 con respecto a los valores control que se obtienen en las ratas ZDF fa+. Treinta días después del término del tratamiento con GW3965, los inventores demostraron que el compuesto tuvo un efecto protector y preventivo a largo plazo sobre el desarrollo de la diabetes tipo II puesto que las glucosa en plasma aún se mantuvo a un nivel bajo.

Se han obtenido resultados experimentales similares a aquéllos anteriormente ilustrados en los ejemplos mediante el uso de otros agonistas de LXR tal como T0901317 (datos no mostrados). Se entiende que los ejemplos y modalidades descritas en la presente invención son para propósitos ilustrativos solamente y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugeridas a las personas expertas en la técnica y deben ser incluidas dentro del espíritu y competencia de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquéllos descritos aquí pueden ser utilizados en la práctica o evaluación de la presente invención, se describen los métodos preferidos y materiales.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un agonista de LXR para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad asociada con la regeneración de las células beta.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha enfermedad se selecciona a partir del grupo que consiste de diabetes tipo I y diabetes tipo II.

3.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha enfermedad consiste de diabetes tipo I.

4.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho medicamento es útil para prevenir, detener o disminuir la velocidad de progresión de la diabetes tipo all hacia el estado diabético subsecuente determinado por la deficiencia en la producción de insulina.

5.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho medicamento es útil para la regeneración de las células beta.

6.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho medicamento es útil para incrementar la viabilidad de las células beta.

7.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho medicamento es útil para incrementar la viabilidad de las células de la isleta pancreática del donante para transplante en un recipiente de transplante.

8.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el agonista de LXR es un agonista de LXRalfa.

9.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el agonista de LXR se selecciona a partir del grupo que consiste de GW3965 y T0901317.

10.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho medicamento se encuentra en una forma adecuada para administración oral. 1 1.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho medicamento se adapta para ser administrable diariamente por al menos 30 días. 12.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , en donde dicho medicamento se adapta para ser administrable en asociación con un fármaco antidiabético conocido. 13.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, en donde dicho fármaco antidiabético conocido se selecciona a partir del grupo que consiste de metformina, pioglitizona, rosiglitazona, glimepirida, glipizida, gliburida/metformina, gliburida, miglitol, glipizida + metformina, repaglinida, acarbosa, troglitazona, nateglinida, y un agonista GLP-1. 14.- Un método para incrementar la viabilidad ex vivo de las células primarias de la isleta pancreática, que comprende poner en contacto a dichas células de la isleta con un agonista de LXR. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el agonista de LXR es un agonista de LXRalfa. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el agonista de LXR se selecciona a partir del grupo que consiste de GW3965 y T0901317.