CN101171002A - 肝x受体激动剂的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明主要涉及一种肝X受体(LXR)激动剂的治疗新用途。更具体而言，本发明涉及LXR激动剂在制备用于治疗和/或预防与β细胞退化有关的疾病例如糖尿病的药物中的应用，以及增强胰岛细胞的离体生存能力的方法，所述方法包括将所述胰岛细胞与LXR激动剂相接触。

Description

肝X受体激动剂的新用途

技术领域

本发明主要涉及一种肝X受体(LXR)激动剂的治疗新用途。更具体而言，本发明涉及LXR激动剂在制备用于治疗和/或预防与β细胞退化有关的疾病例如糖尿病的药物中的应用，以及增强胰岛细胞的离体(exvivo)生存能力的方法，所述方法包括将所述胰岛细胞与LXR激动剂相接触。

背景技术

糖尿病一般分为两种主要类型。在I型糖尿病中，胰岛内β细胞的自身免疫破坏导致胰岛素生成显著缺乏。与此不同，II型糖尿病的特点在于肌肉、脂肪和肝的胰岛素抗性以及在β细胞中胰岛素生成的相对损伤。在I型和II型糖尿病中，多个基因有助于易感性，虽然在大多数情况下其本身仍然未知。

细胞凋亡是在正常发育中发生的通过体外和体内信号调节的细胞自毁的活动进程。已经充分证明了细胞凋亡在胰腺内分泌β细胞的可塑性中起关键作用。有越来越多这样的证据表明在特定的情况下，例如怀孕和肥胖时，在成年哺乳动物中的β细胞团发生动态变化以适应胰岛素生成而保持血糖正常。β细胞团的调节作用取决于细胞增殖、发育和细胞死亡(细胞凋亡)之间的微妙平衡。该平衡的破坏可能导致葡萄糖体内平衡的损伤。例如，值得注意的是当β细胞的复制率降低时，葡萄糖失耐(glucoseintolerance)随着老化而得以发展，而且与非糖尿病受试者相比，非胰岛素依赖性糖尿病患者的β细胞团损失40-60％。一般认为在胰岛素抗性受试者中，通过代偿性的高胰岛素血症维持血糖量正常，直到β细胞不能满足对胰岛素需求的增加，此时就发生了II型糖尿病。

II型或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)是一种多基因疾病，并且占糖尿病病例的90％以上。该疾病的特点在于抵抗胰岛素对葡萄糖摄取的作用，并使得胰岛素对于肝葡萄糖生成的抑制作用损伤。

胰岛素对葡萄糖代谢的调节是维持动物体内平衡的关键机制。胰岛素促进从血液向组织，特别是肌肉和脂肪中摄取葡萄糖。通过增加Glut4从细胞内小泡间隙向质膜的转运实现该作用，所述Glut4是胰岛素敏感性葡萄糖转运蛋白。在这些组织中，Glut4是最重要的胰岛素敏感性葡萄糖转运蛋白。胰岛素结合到在质膜内的胰岛素受体上，产生一系列导致Glut4转运蛋白从小泡向质膜的转运或运动的信号。

肝X受体(LXR)是诱导靶基因的配体依赖性转录激活的核受体超家族成员。其在胆固醇代谢和体内平衡中起重要作用。已知两种LXR蛋白(α和β)存在于哺乳动物中。在涉及脂质平衡的器官，例如肠、褐色和白色脂肪组织中，LXRα表达量高，而LXRβ更普遍存在和富集于神经元和内分泌源的组织中。最近已发现在胰岛以及α细胞和β细胞中表达LXRα和LXRβ(Efanov等人，Diabetes，53(3)，S75-78，2004)。

LXRα和LXRβ是密切相关的，并且在其DNA结合域和配体结合域中具有77％的氨基酸相似度。在人类和其它动物(例如啮齿类动物)之间，LXR也是保守的。如同其它核受体，LXR与视黄醇X受体(RXR)进行异源二聚化以发挥作用。已知某些天然存在的胆固醇氧化衍生物，包括22(R)-羟基胆固醇、24(S)-羟基胆固醇和24，25(S)-环氧胆固醇激活LXR。

LXRα和LXRβ是涉及胆固醇和脂肪酸代谢(HMGCoA合成酶/还原酶、法呢基焦磷酸合酶、鲨烯合成酶、SREBP1c、硬脂酰CoA去饱和酶(SCD1和SCD2)、FAS)的肝脏基因的调节剂，其抑制糖原异生酶(PEPCK、果糖二磷酸酶1、葡萄糖-6-磷酸酶)的表达，诱导跨膜转运蛋白(ABCA1、Glut1和Glut4)的表达，抑制涉及糖酵解的酶(6-磷酸果糖-2-激酶)的表达，并且诱导丙酮酸脱氢酶激酶4(糖酵解的负调节剂)，减少I型11-β-羟类固醇脱氢酶(使人体中活性皮质醇中的非活性可的松再活化的酶)。已确认瘦素(leptin)和UCP-I是LXR的靶基因(被LXR激动剂下调)。另外，在炎症反应的负调节中，LXR具有与PPAR重叠的功能。LXR抑制TNFα和IL-1β的产生和炎症介体如COX2、iNOS、IL-6的表达。LXR可能在炎症反应中起关键作用，并且因为已经证明LXR在脂质代谢中很重要，所以LXR还可能涉及肥胖诱导的炎症反应(在Steffensen等人，Diabetes，2004，53(1)，S36-42中综述)。

在db/db小鼠中，下文所述的一种LXR激动剂T0901317已经显示了较低的血浆葡萄糖水平(正常小鼠未显示)。该化合物抑制PEPCK的表达以限制肝葡萄糖产量(Cao等人，J Biol Chem，2003，278，1131-1136)。

将胰岛或分泌胰岛素的MIN6细胞与T0901317一起培养，引起葡萄糖依赖性胰岛素分泌和胰岛素含量的增加。在胰岛与T0901317一起培养仅仅超过72小时后就观察到该化合物对于胰岛素分泌的刺激效应。在MIN6细胞中，T0901317(Tularik)提高了生脂酶、脂肪酸合酶和乙酰CoA羧化酶的蛋白表达。LXR激活作用也导致葡萄糖激酶蛋白和丙酮酸羧化酶(PC)活性水平的增加。LXR可通过胰腺β细胞中的葡萄糖和脂质代谢的调节控制胰岛素的分泌和生物合成(Efanov等人，Diabetes，53(3)，S75-78，2004)。

胰腺十二指肠同源框基因-1(PDX-1)是胰腺发育以及祖细胞分化成β细胞表型的主要调节剂。另外，在分化的β细胞中，PDX1是胰岛素基因表达的葡萄糖应答调节剂，并且PDX1应答于葡萄糖的功能受到其磷酸化和核转运两方面的调节。在胰岛发育的后期，PDX-1的表达主要限于内分泌胰腺的成熟β细胞。在成熟胰腺中，生长激素抑制素产生细胞和胰多肽产生细胞的亚群也表达PDX-1，只有少数胰高血糖素产生细胞表达PDX-1。

在糖尿病II型的几种动物模型中已经观察到胰腺β细胞在葡萄糖感应上的缺陷，并且已经将该缺陷与2型葡萄糖转运蛋白(Glut2)的基因表达降低相关联。已经证明在转基因小鼠模型中，胰腺β-细胞中Glut2反义RNA的表达是与损伤的葡萄糖诱导胰岛素分泌和糖尿病的发展有关。在糖尿病试验模型的β-胰腺细胞中，2型葡萄糖转运蛋白(Glut2)基因表达选择性地降低，且鼠科Glut2启动子受PDX-1控制。

发明内容

本发明部分地基于如下意外发现：LXR激动剂治疗之后，LXR在ZDF大鼠中的激活作用使得糖尿病病情改善，血糖明显降低。在评价LXR激动剂的抗糖尿作用的潜在机制时，出人意料地发现使用已知的称为“GW3965”的LXR激动剂对ZDF大鼠进行治疗，从该大鼠分离的胰岛中细胞凋亡的明显减少与胰岛数目的增加有关；另外，与源自载体治疗的ZDF大鼠的胰岛相比，这些胰岛具有明显更高的胰岛素含量和更好的葡萄糖敏感性。这些发现和另外的试验工作已经表明体内LXR激动剂给药能促进胰岛素分泌，同时保护胰岛免于退化。

另外，已经表明在使用GW3965治疗的ZDF大鼠的胰岛中，涉及胰岛再生的两种主要基因PDX1和Glut2的mRNA水平得到明显升高。通过对GW3965治疗的NOD小鼠的胰腺进行组织分析已经证实胰岛的再生。

本发明也是基于如下新发现：LXR激动剂不仅保护糖尿病患者的胰腺免于进一步退化，尤其是通过减轻胰腺中的细胞凋亡和胰岛炎实现这一效果，而且增强胰腺再生过程，因此当胰受到损伤时可以修复胰功能。这些效果是所述的使肝脏中肝葡萄糖产量降低(Cao等人，2003，JBC，278(2)，1131-1136)以外的效果，加强了LXR激动剂的抗糖尿病性质。

LXR激动剂增加胰岛数目并且减少胰岛细胞凋亡的有益特性可以产生一种新的治疗模式：其包括在有限的时间段内治疗患者，直到血糖和/或HbA1c(A1c血红蛋白)降低到稳态水平为止(HbA1c≤7％和/或血糖≤1.2-1.4g/l)；然后，只要血糖和/或HbA1c在可接受的时间范围内(例如一个月内)得以维持，则暂停治疗。如果血糖和/或HbA1c水平增加到可接受值以上，就要再次使用LXR激动剂进行治疗。

因此第一方面，本发明涉及LXR激动剂在制备用于治疗和/或预防与β细胞退化有关的疾病的药物中的应用。

本发明还涉及LXR激动剂在制备用于β细胞的再生和增强β细胞生存能力的药物中的应用。

本发明的应用提供了一种可以与已知的抗糖尿病药物联合使用的药物。

第二方面，本发明涉及一种增强初级胰岛细胞的离体生存能力的方法，所述方法包括将所述胰岛细胞与LXR激动剂相接触。

第三方面，本发明提供用于治疗β细胞退化的方法，所述方法包括向受试者给予LXR激动剂。

在第一实施方案中，本发明提供了在受试者中预防I型糖尿病的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的LXR激动剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或改善糖尿病的方法，该方法包括测定受试者中的循环葡萄糖水平和/或HbA1c，每日给予受试者有效量的LXR激动剂，直到血糖和/或HbA1c稳定为止(至少两次给药，HbA1c≤7％和/或血糖≤1.2-1.4g/l，维持一个月)，然后一旦血糖和/或HbA1c稳定就停止治疗；如果必要，选择性地重新进行每日治疗。

在另一个实施方案中，本发明提供用于增强在移植受体中移植供体胰岛细胞的生存能力的方法，所述方法包括向所述的移植受体给予LXR激动剂。

通过参考本说明书的其余部分和权利要求书可以对本发明性质和优点作进一步的理解。

具体实施方式

第一方面，本发明涉及LXR激动剂在制备用于治疗和/或预防与β细胞退化有关的疾病的药物中的应用。

本发明的应用在治疗特别是与β细胞功能丧失或β细胞机能障碍和/或β细胞死亡相关的疾病中得到应用，这些疾病例如糖尿病、高血糖症和肥胖症，但不限于此。本发明还用于在怀疑具有或已知具有患这些疾病或病症倾向的受试者中，预防或调节这些疾病或病症的发展。

本发明因此涉及LXR激动剂在制备用于治疗和/或预防I型和II型糖尿病，优选I型糖尿病的药物中的应用。

如上所述，II型糖尿病患者可或多或少地显示I型糖尿病的特征，主要与胰岛素生成不足相关。因此，在一个实施方案中，本发明涉及LXR激动剂在制备用于预防、停止或减慢II型糖尿病向着并发的以胰岛素生成不足为特征的糖尿病状态发展的药物中的应用。

体内给予LXR激动剂增加了胰岛数目且减少了胰岛中的细胞凋亡，因此LXR激动剂在制备用于β细胞的再生和增强β细胞生存能力的药物中的应用代表了本发明的另外两个实施方案。

关于增强胰腺细胞生存能力的用途，应当理解将活细胞定义为能够增殖、分化、生长和发育。生存能力可使用本领域已知的任意方法进行测定，例如使用台盼蓝染色。

在另一个实施方案中，本发明涉及LXR激动剂在制备用于增强移植受体中移植供体胰岛细胞的生存能力的药物中的应用。

对于该特定的应用，该药物可对移植部位局部给药，或优选全身给药。

在一个实施方案中，在供体胰岛细胞移植之前和/或之后，将该药物给予移植受体。在另一个实施方案中，在供体胰岛细胞移植的同时将该药物给予移植受体。

为实施本文所述的本发明全部用途和方法，可使用本领域已知的和记载的任意LXR激动剂。优选地，所述LXR激动剂是LXRα激动剂，特别是所述LXR激动剂选自GW3965和T0901317。

另外，根据一个有益的实施方案，用于本发明的全部应用和方法的药物是适于口服给药的形式。

在本文所述的全部应用和方法中，优选每日给药持续至少30天。还可给药持续至少60天、90天或更长。

另外，本发明的药物可与已知的抗糖尿病药物特别是下列药物联合使用：二甲双胍、匹格列酮、罗格列酮、格列美脲、格列吡嗪、格列本脲+二甲双胍、格列本脲、米格列醇、格列吡嗪+二甲双胍、瑞格列奈、阿卡波糖、曲格列酮、那格列奈和GLP-1(胰高血糖素样肽-1)激动剂。

第二方面，本发明涉及一种增强初级胰岛细胞的离体生存能力的方法，所述方法包括使所述胰岛细胞与LXR激动剂相接触。

优选地，LXR激动剂是LXRα激动剂，并且所用的LXR激动剂特别选自GW3965和T0901317。

第三方面，本发明提供用于治疗β细胞退化的方法。该方法需要给予受试者LXR激动剂。在该方法中，所用的LXR激动剂可以是LXRα激动剂，并且所用的LXR激动剂特别选自GW3965和T0901317。

在本发明的方法中，所述受试者优选患有I型或II型糖尿病。选择性地，将LXR激动剂与已知的抗糖尿病药物或任意其它的降低血糖和/或HbA1c的药物同时给予该受试者。特别地，该已知的抗糖尿病药物选自下列物质：二甲双胍、匹格列酮、罗格列酮、格列美脲、格列吡嗪、格列本脲+二甲双胍、格列本脲、米格列醇、格列吡嗪+二甲双胍、瑞格列奈、阿卡波糖、曲格列酮、那格列奈和GLP-1激动剂。

在一个实施方案中，本发明提供用于在受试者中预防I型糖尿病的方法。该方法包括给予受试者有效量的LXR激动剂。类似地，在所述的用于预防I型糖尿病的方法中，所用的LXR激动剂可以是LXRα激动剂，并且所用的LXR激动剂特别选自GW3965和T0901317。

或者，将LXR激动剂与已知的抗糖尿病药物或任意其它的降低血糖和/或HbA1c的药物同时给予该受试者。特别地，该已知的抗糖尿病药物选自下列物质：二甲双胍、匹格列酮、罗格列酮、格列美脲、格列吡嗪、格列本脲+二甲双胍、格列本脲、米格列醇、格列吡嗪+二甲双胍、瑞格列奈、阿卡波糖、曲格列酮、那格列奈和GLP-1激动剂。

另一方面，本发明提供用于治疗或改善糖尿病的方法，该方法包括测定受试者的循环葡萄糖水平和/或HbA1c，并且每日给予受试者有效量的LXR激动剂，直到血糖和/或HbA1c稳定为止(至少两次给药，HbA1c≤7％和/或血糖≤1.2-1.4g/l，维持一个月)，然后一旦血糖和/或HbA1c稳定就停止治疗；如果必要，选择性地重新进行每日治疗。

如果血糖和/或HbA1c不再稳定或者胰岛素敏感性丧失，则可选择性地重新进行每日治疗。

测定循环葡萄糖和/或HbA1c水平的方法是现有技术中公知的方法，并且可使用任意类型的方法。

类似地，所述的用于治疗或改善糖尿病的方法中使用的LXR激动剂可以是LXRα激动剂，并且所用的LXR激动剂特别选自GW3965和T0901317。或者，将LXR激动剂与已知的抗糖尿病药物或任意其它的降低血糖和/或HbA1c的药物同时给予该受试者。特别地，该已知的抗糖尿病药物选自下列物质：二甲双胍、匹格列酮、罗格列酮、格列吡嗪、格列甲嗪、格列本脲+二甲双胍、格列本脲、米格列醇、格列吡嗪+二甲双胍、瑞格列奈、阿卡波糖、曲格列酮、那格列奈和GLP-1激动剂。

在所述方法中，优选至少每日给予受试者LXR激动剂持续至少30天。

在另一实施方案中，本发明涉及用于增强移植受体中移植供体胰岛细胞的生存能力的方法，所述方法包括向所述移植受体给予LXR激动剂。

以下部分提供用于制备和应用本发明的药物以及实施本发明的方法的指导。

定义

除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常已知的相同含义。下列参考文献为一个技术人员提供了用于本发明的许多术语的一般定义：Singleton等人，DICTIONARYOF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(微生物学和分子生物学词典)(1994年第二版)；THE CAMBRIDGE DICTIONARY OFSCIENCE AND TECHNOLOGY(剑桥科技词典)(Walker等人，1988年)和Hale & Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(哈珀柯林斯生物学词典)(1991年)。另外，提供下列定义来帮助读者实施本发明。

术语“LXR”(肝X受体)或“LXR受体”包括该受体的全部亚型。特别地，LXR包括LXRα和LXRβ。许多名称例如LXRU、LXRa、LXR、RLD-1、NR1H3都是指LXRα。其包括由与GenBank登录号U22662具有相当高的序列同源性的基因所编码的任意多肽。类似地，LXRβ包括例如LXRb、LXRP、LXRβ、NER、NER1、UR、OR-1、RIP15、NR1H2所指的基因或与GenBank登录号U07132具有相当高的序列同源性的基因所编码的任意多肽。

术语“配体”指LXR的激动剂或部分激动剂。该配体对LXRα或LXRβ具有选择性，或其对LXRα和LXRβ二者具有混合的结合亲合性。配体可激动或拮抗受体功能，除非另作说明，本文所使用的LXR配体主要指激活LXR受体的LXR激动剂。

关于LXR受体的术语“调节”指LXR受体及其与LXR途径相关的生物学活性(例如靶基因的转录调节)的激活。LXR受体的调节可为上调(即激动、激活或刺激)或下调(即拮抗、阻止或抑制)。LXR调节剂的作用方式可为直接的，例如作为配体结合到LXR受体。所述调节也可以是间接的，例如通过结合到另一分子和/或改变另一分子，所述分子另外结合到LXR受体并激活LXR受体。因此，LXR的调节包括LXR激动剂配体生物活性的改变(即：其结合到LXR受体和/或激活LXR受体的活性)或配体的细胞水平的改变。

如本文所使用的短语“筛选LXR激动剂”指采用适当的测定系统，从待测试剂中鉴别新的LXR激动剂。该测定可以是适于鉴别待测试剂是否可以刺激或激活LXR受体的一种或多种生物功能的体外或体内测定。适当的生物测定的例子包括但不局限于研究待测试剂结合到LXR多肽(例如包含其配体结合域的LXR片段)的测定、基于转录的测定、肌酸激酶的测定、基于前脂肪细胞分化的测定、基于脂肪细胞中葡萄糖摄取控制的测定和免疫学测定。

“受试者”优选是哺乳动物，更优选是人类。

术语“β细胞退化”用来表示β细胞功能损失、β细胞机能障碍和β细胞死亡，例如β细胞的坏死或细胞凋亡。

术语“疾病的治疗”是指为了抗击疾病、病情或病症而管理和照顾患者，包括给予LXR激动剂以防止该症状或并发症的发作，或者减轻该症状或并发症，或者消除该疾病、病情或病症。治疗包括调节、阻止、减少、降低或停止β细胞退化(例如β细胞的坏死或细胞凋亡，尤其是已知为β细胞凋亡的程序性β细胞死亡)以及预防β细胞凋亡(例如β细胞的坏死或细胞凋亡)，特别是预防β细胞凋亡。治疗也包括β细胞的再生。

本文所用的术语“用于治疗”被理解为包括直接使用用于治疗的化合物或间接使用用于治疗特定疾病的所述化合物。

术语“胰岛素生成不足”用于表示显示明显的高血糖症以及正常或低胰岛素血症。测定血糖或胰岛素水平以及估测高血糖症以及正常或低胰岛素血症的方法在本领域中为大家所熟知。

术语“与……相关”用来指其中两种活性成分(LXR激动剂和抗糖尿病药物)作为同一组合物的主要成分的药物，或者指可同时或随后给药的两种分开的药物。

本文所使用的术语“血糖和/或HbA1c的稳定”或“一旦血糖和/或HbA1c稳定”是用来表示至少通过两次给药使HbA1c值≤7％和/或血糖值≤1.2-1.4g/l维持一个月。

LXR激动剂

许多LXR激动剂适于实施本发明的方法。它们可以是已知的激活LXR受体的试剂，例如：GW3965(参见以下实施例)，或其它市售可得的化合物，例如F3MethylAA(来自Merck；参见Menke等人，Endocrinology143：2548-58，2002)和T0901317(Tularik，Calif.)。它们还可以是本发明筛选的新的LXR激动剂。如下详述，适于本发明的LXR激动剂可以是多肽类、肽类、小分子类或其它试剂。LXR激动剂可以是用于人类以及其它动物的LXR的激动剂。

本领域中记载了大量的LXR激动剂。小分子LXR激动剂的例子包括众所周知的氧化型胆固醇类和有关的化合物(Janowski等人，Nature383：728-31，1996)；T0901317和T0314407(Schultz等人，Genes Dev.14：2831-8，2000)；24(S)-羟基胆固醇和22(R)-羟基胆固醇(Janowski等人，Nature 383：728-731，1996)；以及24，25-环氧胆固醇(美国专利号6,316,503)。本领域中也公开了典型的LXR多肽激动剂，例如：WO02/077229。本领域中记载了另外的LXR激动剂，例如：在美国专利6,316,503；Collins等人，J Med Chem.45：1963-6，2002；Joseph等人，Proc Natl Acad Sci USA 99：7604-9，2002；Menke等人，Endocrinology 143：2548-58，2002；Schultz等人，Genes Dev.14：2831-8，2000；以及Schmidt等人，Mol Cell Endocrinol.155：51-60，1999。

许多LXR激动剂在激活LXRα和LXRβ中都有效(例如Collins等人，JMed Chem.45：1963-6，2002中所述的GW3965)。一些LXR激动剂在不同的条件下激活LXRα和LXRβ。例如，6-α-羟基化胆汁酸类是LXRα的激动剂，但在较高浓度下也激活LXRβ(Song等人，Steroids 65：423-7，2000)。一些LXR激动剂专门作用于LXRα，而其它一些仅激活LXRβ。例如，氧化型胆固醇的固醇B-环上引入氧产生具有LXRα亚型选择性的配体(Janowski等人，Proc Natl Acad Sci USA 96：266-71，1999)。利用配体依赖性转录试验，人们发现5-十四烷氧基-2-呋喃甲酸(TOFA)和羟基胆固醇反式激活由糖皮质激素受体DNA结合域和LXRβ、PPARα和PPARβ受体的配体结合区域组成的嵌合受体(Schmidt等人，Mol Cell Endocrinol.155：51-60，1999)。

还可以从LXR受体的已知的多肽激动剂衍生物中获得LXR激动剂。它们可以通过各种已知技术产生。例如，可以使已知的LXR的多肽激动剂延伸合成(例如以化学方法或重组方法)特异性寡肽类(例如：10-25个氨基酸残基)，并测定其激活LXR受体的能力。可以应用标准技术，例如：Bodansky，M.Principles of Peptide Synthesis，Springer Verlag，Berlin(1993)和Grant，G.A(ed.)，Synthetic Peptides：A User′s Guide，W.H.Freeman and Company，New York(1992)所记载的技术合成LXR激动剂片段。自动化肽合成装置是市售可得的，例如来自Advanced ChemTechModel 396；Milligen/Biosearch 9600。或者，还可以使用蛋白酶(例如胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶)将天然的或重组产生的LXR多肽激动剂进行消化而制备这样的LXR激动剂。计算机分析(利用市售可得的软件，例如MacVector、Omega、PCGene，MolecularSimulation，Inc.)可用于鉴定蛋白水解作用的切割位点。

本发明的方法中所用的多肽或肽激动剂优选是分离得到的，并且基本上不含来自于获取LXR激动剂的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染蛋白，或当以化学方法合成时，基本上不含化学前体或其它化学试剂。蛋白水解的或合成的多肽激动剂或其片段可以包含激活LXR受体活性所需的同样数量的氨基酸残基，长度可以包含至少5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个氨基酸。

除了已知的激活LXR受体的化合物和多肽，LXR激动剂还可以通过筛选待测试剂(例如化合物文库)鉴别结合到和/或激活LXR受体活性的新的LXR激动剂。为了筛选这样的新LXR激动剂，可在适当的测定系统中使用人类的LXR或其它动物的LXR。LXR受体的多聚核苷酸和氨基酸序列是已知的，并且在本领域中有所记载。也已经表征了其结构和功能组织(functional organization)，包括其配体结合域。参见，例如，Apfel等人，Mol Cell Biol 14：7025-7035，1994；Willy等人，Genes Dev.9：1033-1045，1995；Song等人，Proc Natl Acad Sci USA 91：10809-10813，1994；Shinar等人，Gene 147：273-276，1994；Teboui等人，Proc Natl AcadSci USA 92：2096-2100，1995；以及Seol等人，Mol Endocrinol 9：72-85，1995。

激动剂可以激活LXR或LXRα。另外，一些筛选方法可以使用包含LXR分子片段的LXR多肽，而不是全长的LXR分子。例如LXR受体的两个功能结构域(即N末端DNA结合域(DBD)和C末端配体结合域(LBD))具有介导核受体的转录激活功能。包含任何一个这些结构域的LXR多肽可用于筛选新的LXR激动剂。

可以使用许多测定体系对待测试剂进行筛选以获得LXR受体激动剂。如下文详述，可以对待测试剂进行筛选以获得直接结合到LXR多肽或其片段(例如其配体结合域)。或者抑或可以另外地研究潜在的LXR激动剂激活LXR受体途径的能力或促进LXR受体的其它生物学活性的能力。可使用体外测定体系或基于细胞的测定体系进行筛选。

可使用本领域众所周知的方法对不同受体(例如：LXRα、LXRβ、RXR或PPAR)的潜在的LXR激动剂的选择性进行测试，例如：如WO01/41704中所述的LXR放射性配体竞争性闪烁亲近测定法(scintillationproximity assay)，以及如Berger等人，J Biol Chem 274：6718-6725，1999中所述的PPAR竞争性结合测定法。

可用于筛选新的LXR激动剂的待测试剂包括多肽类、β-转角模拟体类、多糖类、磷脂类、激素类、前列腺素类、甾族类化合物、芳香族类化合物、杂环类化合物、苯二氮杂

类、低聚N-取代甘氨酸类、低聚氨基甲酸酯类、糖类、脂肪酸类、嘌呤类、嘧啶类、其衍生物、结构类似物或组合。一些待测试剂是合成的分子，其它是天然分子。

待测试剂从多种来源获得，包括合成的或天然的化合物文库。可制备以逐步方式合成多种化合物的组合文库。可通过在WO 95/12608、WO93/06121、WO 94/08051、WO 95/35503和WO 95/30642中所述的编码合成文库(ESL)方法构建大的化合物组合文库。还可以通过噬菌体展示技术产生肽文库(参见例如Devlin，WO 91/18980)。以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库可以从市售获得或在本领域中收集。可对已知药剂进行直接的或随机的化学修饰，例如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化(amidification)以产生结构类似物。

肽或其它化合物的组合文库可以是完全随机的，没有序列偏爱性或者在任意位点上都保持不变。或者，该文库可具有偏爱性，即：在该序列内的一些位点或保持不变，或选自有限的可能。例如，有时在指定类别内，该核苷酸或氨基酸残基是随机的，所述类别例如疏水性氨基酸；亲水性残基；具有空间偏爱的(小的或大的)残基；有助于产生半胱氨酸；用于交联；用于SH-3结构域的脯氨酸；用于磷酸化位点的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或组氨酸；或与嘌呤连接。

待测试剂可以是天然存在的蛋白或其片段。这样的待测试剂可以从天然来源例如细胞或组织裂解物中获得。还可以通过例如从市售可得的cDNA文库或以常规方法制备多肽试剂的文库。该待测试剂还可以是肽类，例如从大约5个至大约30个氨基酸的肽，优选从大约5个至大约20个氨基酸的肽，特别优选从大约7个至大约15个氨基酸的肽。该肽可以是天然存在的蛋白的消化物、任意的肽或“偏爱的”任意肽。在一些方法中，待测试剂是多肽类或蛋白类。

待测试剂还可以是核酸类。核酸类待测试剂可以是天然存在的核酸、任意的核酸或“偏爱的”任意核酸。例如，可将如上所述的用于蛋白的方法类似地应用于原核或真核基因组的消化。

在一些优选的方法中，待测试剂是小的有机分子(具有分子量不超过大约1,000的分子)。优选地，采取高通量方法对这样的小分子进行筛选。在一些方法中，使用如上所述的小分子待测试剂的组合文库可以容易地筛选LXR受体的小分子调节剂。可使用许多方法用于这样的筛选，例如Schultz(1998)Bioorg Med Chem Lett 8：2409-2414；Weller(1997)Mol Divers.3：61-70；Fernandes(1998)Curr Opin Chem Biol 2：597-603和Sittampalam(1997)Curr Opin Chem Biol 1：384-91。

还可以根据合理的设计鉴别潜在的LXR激动剂。例如，Janowski等人(Proc Natl Acad Sci USA 96：266-71，1999)公开了对于LXRα和LXRβ的配体的结构要求。表明氧化型胆固醇的固醇侧链的位点特异性单氧化对于LXR高亲合性结合和活性是必需的。还可以通过使用24-氧代配体作为侧链上的氢键受体，实现增强的结合和激活。另外，在固醇B-环上引入氧产生对LXRα亚型具有选择性的配体。

基于对LXR受体、其片段或类似物的结构研究，还可以使用要求保护的方法制备待筛选的待测试剂文库。这样的结构研究可用于鉴别更可能结合到LXR受体的待测试剂。可通过许多方式，例如晶体结构和分子模拟研究LXR受体的三维结构。使用X-射线晶体学研究蛋白质结构的方法在文献中为大家所熟知。参见Physical Bio-chemistry，Van Holde，K.E.(Prentice-Hall，N.J.1971)，221-239页，以及Physical Chemistry withApplications to the Life Sciences，D.Eisenberg & D.C.Crothers(BenjaminCummings，Menlo Park 1979)。在文献中记载了分子模拟的方法，例如名称为“System and method for molecular modeling utilizing a sensitivityfactor(应用灵敏度系数的分子模拟体系和方法)”的美国专利5,612,894，以及名称为“Molecular modeling method and system(分子模拟方法和体系)”的美国专利5,583,973。另外，还可以通过中子衍射以及核磁共振(NMR)确定蛋白质结构。参见例如Physical Chemistry，第4版，Moore，W.J.(Prentice-Hall，NJ.1972)，以及NMR of Proteins and Nucleic Acids，K.Wuthrich(Wiley-Interscience，New York 1986)。

在一些筛选方法中，测定待测试剂对LXR或含有其配体结合域的LXR多肽的结合。可以通过许多方法检测待测试剂(例如多肽类)对LXR多肽的结合，所述方法包括，例如标记的体外蛋白-蛋白结合检测、电泳迁移率检测、蛋白结合的免疫检测、功能检测(磷酸化检测等)等。参见例如美国专利号4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168；以及Bevan等人，Trends in Biotechnology 13：115-122，1995；Ecker等人，Bio/Technology 13：351-360，1995；以及Hodgson，Bio/Technology10：973-980，1992。可以通过测定对LXR多肽的直接结合鉴别待测试剂，例如使用抗LXR多肽的抗体与LXR多肽共免疫沉淀。还可以通过测定指示待测试剂结合到LXR多肽的信号例如荧光猝灭鉴别待测试剂。

竞争性测定提供了一种鉴别特异性结合到LXR多肽的待测试剂(例如肽或小分子化合物)的适当形式。在该形式中，将待测试剂与已知的结合到LXR多肽的化合物竞争进行筛选。已知的结合化合物可以是合成的化合物。它还可以是特异地识别LXR多肽的抗体，例如针对抗LXR多肽的单克隆抗体。如果待测试剂抑制已知的结合LXR多肽的化合物的结合，那么该待测试剂也结合LXR多肽。

已知有多种竞争性结合方法，例如：固相直接或间接放射免疫测定法(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定法(EIA)、三明治竞争测定法(参见Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242-253(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA法(参见Kirkland等人，J.Immunol.137：3614-3619(1986))；固相直接标记测定、固相直接标记三明治测定法(参见Harlow和Lane，“Antibodies，A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Press(1988))；利用¹²⁵I标记的固相直接标记RIA法(参见Morel等人，Mol.Immunol.25(1)：7-15(1988))；固相直接生物素-亲和素EIA法(Cheung等人，Virology 176：546-552(1990))；以及直接标记的RIA法(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77-82(1990))。典型地，这样的测定涉及纯化多肽的应用，所述纯化多肽结合到携带有未标记的待测试剂或标记的参照化合物的固相表面或细胞上。通过测定待测试剂存在时结合到固体表面或细胞上的标记数量测定竞争性抑制。通常待测试剂过量存在。通过竞争性测定所鉴别的调节试剂包括结合到与参照化合物的结合表位相同的试剂以及结合到相邻表位的试剂，所述的相邻表位足够接近于参照化合物结合的表位以产生空间位阻。通常当竞争性试剂过量存在时，参照化合物与常规靶多肽的特异性结合至少被抑制50％或75％。

该筛选方法可以为不溶解或可溶解的形式。不溶解方法的一个例子是将LXR多肽或其片段固定于固相基质上。然后将固相基质与待测试剂接触足够长的时间间隔，使待测试剂结合。在将所有未结合的物质从固相基质洗脱后，存在的结合于固相的试剂可用于该试剂的鉴别。该方法可进一步包括从固相基质上将结合试剂洗脱从而分离该试剂的步骤。或者，不同于固定LXR多肽，将待测试剂结合于固体基质上，然后加入LXR多肽分子。

可溶解方法包括如上所述的一些组合文库筛选方法。在可溶解方法的形式中，待测试剂和LXR多肽都不结合于固态支持体上。可以通过例如LXR多肽或待测试剂或两者的荧光变化确定LXR多肽或其片段对待测试剂的结合。荧光可为固有的荧光或通过任一含有荧光体的组分标记所产生的荧光。

在一些结合测试中，可将LXR多肽、待测试剂或第三分子(例如抗LXR多肽的抗体)作为标记本体，即：共价结合或连接到可检测的标记物或基团上，或可交联的基团上，从而便于在给定条件下鉴别、检测和定量多肽。这些可检测的基团可以包括可检测的多肽基团，例如可检测的酶或抗体表位。或者，可检测基团可选自各种其它的可检测基团或标记物，例如放射性标记物(例如：¹²⁵I、³²P、³⁵S)或化学发光基团或荧光基团。类似地，可检测基团可以是底物、辅助因子、抑制剂或亲合配体。

还可以用基于细胞的测定方法间接测定待测试剂对LXR的结合。例如，可以将非受体转录因子GAL4的DNA结合域融合到LXR(例如：LXRα)的配体结合域上。将生成的结构与报告基因结构(例如含有UAS的荧光素酶报告基因结构)一起导入宿主细胞(例如293细胞)。然后用待测试剂的文库处理转染的细胞，并且测定报告基因多肽的活性(例如荧光素酶活性)。评价单个待测试剂相对于对照物(即当无待测试剂存在时)对报告基因多肽活性的影响。

还可以使用非细胞的配体敏感性测定(LiSA)鉴别新的LXR试剂。可以如本领域例如Collins等人，J Med Chem，45：1963-6，2002；以及Spencer等人，J.Med.Chem.44；886-97，2001的记载进行该测定。该测定测量从类固醇受体辅激活因子1(SRC1)到核受体的肽的配体依赖性补充。通过该测定(LiSA)，可以研究用待测试剂激活LXR受体的结构要求。

除了或除检测待测试剂直接结合到LXR多肽之外，还可以检测用于本发明的方法的潜在LXR激动剂，以获得其激活LXR受体的其它生物活性的能力或细胞活性的能力。可以通过监测其对许多LXR细胞活性的作用鉴别激活LXR受体的待测试剂。该LXR细胞活性包括通过激活LXR受体(例如靶基因的转录调节)所介导的任意活性。例如，许多靶基因(例如ABCA1)的LXR反式激活表达、抑制成纤维细胞分化为脂肪细胞、调节肌肉特异性酶例如肌酸激酶的产生、调节通过细胞的葡萄糖摄取以及刺激成肌细胞增殖。可以通过测试该试剂增强该LXR活性的能力鉴别待测试剂激活LXR受体的程度。

因此，可以通过测试待测试剂对增强LXR靶基因(例如：ABCA 1、ABCG 1、SREBP 1或胆固醇7-羟化酶基因)的表达鉴别新的LXR激动剂。在本领域已经公开了用于鉴别诱导LXR靶基因表达(例如提高ABCA 1mRNA水平)的待测试剂的方法，例如：Menke等人，Endocrinology 143：2548-58，2002；Sparrow等人，J.Biol.Chem.277：10021-7，2002；以及Murthy等人，J Lipid Res.43：1054-64，2002。

除了监视LXR靶基因表达，还可以通过检测由LXR途径刺激的其它细胞活性以鉴别LXR激动剂。例如，LXR激动剂调节蛋白水平并由此调节肌肉特异性酶肌酸激酶的活性。因此可以通过检测待测试剂调节肌酸激酶活性的能力筛选LXR激动剂，例如Somjen等人，J Steroid BiochemMol Biol 62：401-8，1997所述。该测试可在细胞系中进行，例如小鼠骨骼成肌细胞系或初级鸡成肌细胞系。可使用市售可得的试剂盒(获自Sigma，St Louis，Mo.)在细胞裂解物中测定测试化合物对培养细胞中的肌酸激酶活性的影响。

还可以使用本领域众所周知和常规使用的方法测定对LXR受体的其它细胞生物活性的调节。例如，可测定待测试剂增加胆固醇从细胞(例如巨噬细胞)中流出的活性(Menke等人，Endocrinology 143：2548-58，2002；以及Sparrow等人，J.Biol.Chem.277：10021-7，2002)。其它方法包括配体依赖性转录方法(Schmidt等人，Mol Cell Endocrinol 155：51-60，1999)、测定LXR激动剂干扰前脂肪细胞(成纤维细胞)向脂肪细胞分化过程的能力的方法(Plaas等人，Biosci Rep 1：207-16，1981；Hiragun等人，J Cell Physiol 134：124-30，1988；和Liao等人，J Biol Chem270：12123-32，1995)、或者刺激成肌细胞增殖的能力(Konishi等人，Biochemistry 28：8872-7，1989；以及Austin等人，J Neurol Sci 101：193-7，1991)。作为对照，所有这些方法可以包括将待测试剂加入测试系统前后进行测定。

治疗上的应用

本发明提供了用于治疗受试者中β细胞退化的方法，所述方法包括向所述受试者给予LXR激动剂。

该方法也在治疗以β细胞不足并由此导致胰岛素机能障碍(例如抗性、无活性或缺乏)和/或葡萄糖运输至细胞不足为特征的疾病上得到应用。这样的疾病包括但不限于糖尿病、高血糖症和肥胖症。β细胞退化的治疗还用于预防或调节怀疑具有或已知具有患这些疾病或病症倾向的受试者中该疾病或病症的发展。

更具体而言，由于目前已经出乎意料地发现有可能避免β细胞退化，因此本发明还涉及一种在受试者中预防I型糖尿病的方法，所述方法包括给予受试者有效量的LXR激动剂。

用于这些应用的LXR激动剂可以是在本领域中记载的任意已知的LXR激动剂。或者，所述治疗方法包含如上所述的筛选待测试剂以鉴别新的LXR激动剂，并且在受试者中给予该新的激动剂以治疗β细胞退化或治疗上述所述的疾病。

本发明人注意到在使用LXR激动剂非常短的一段时间例如21天之后可使β细胞的退化停止。然而，当目标是在受试者中增强胰岛素敏感性或改善糖尿病症状时，则需要较长的疗程。对于该应用，一般将LXR激动剂连续给予受试者一段时间，例如：至少30天、60天、90天或更长。

该发明还涉及一种改善依从性的新方法。众所周知，糖尿病的受试者必须服用很多种药物。本发明使所服用药物的数量减少，甚至使得一旦血糖和/或HbA1c值稳定或胰岛素敏感性恢复时可以停止治疗。

因此本发明还涉及一种治疗或改善糖尿病的方法，所述方法包含测量受试者体内的循环葡萄糖水平和/或HbA1c，并每日给予受试者有效量的LXR激动剂直至血糖和/或HbA1c稳定为止，然后一旦血糖和/或HbA1c稳定就停止治疗。

优选将LXR激动剂每日给予受试者持续至少30天。还可以持续给药至少60天，90天，或更长。

如果血糖和/或HbA1c不再稳定或胰岛素敏感性丧失，可以选择性地再进行每日治疗。

测定循环葡萄糖水平的方法是现有技术中众所周知的方法，并且可以使用任意类型的方法。

药物组合物(或药物)

本发明的LXR激动剂可以在无菌条件下直接给予待治疗的受试者。调节剂可单独给药或作为药物组合物的活性成分给药。本发明的治疗性组合物可以与其它治疗剂组合使用或联合使用。例如，可用LXR激动剂与其它常用的抗糖尿病药物一起对受试者进行治疗。该已知抗糖尿病药物的例子包括艾可拓(Actos)(匹格列酮，Takeda，Eli Lilly)、文迪雅(Avandia)(罗格列酮，Smithkline Beacham)、亚莫利(Amaryl)(格列美脲，Aventis)、格列吡嗪磺酰脲(Generic)或瑞易宁(Glucotrol)(Pfizer)、格华止(Glucophage)(二甲双胍，Bristol Meyers Squibb)、库鲁泛斯(Glucovance)(格列本脲+二甲双胍，Bristol Meyers Squibb)、瑞易宁XL(Glucotrol XL)(格列吡嗪缓释剂，Pfizer)、优降糖(Glyburide)(Micronase；Upjohn，Glynase；Upjohn，达安疗(Diabeta)；Aventis)、格列赛特(Glyset)(米格列醇，Pharmacia & Upjohn)、美特列(Metaglip)(格列吡嗪+二甲双胍；固定比例的组合片剂)、帕瑞丁(Prandin)(瑞格列奈，NOVO)、普瑞考斯(Precose)(阿卡波糖，Bayer)、复胰灵(Rezulin)(曲格列酮，Parke Davis)以及使糖立释(Starlix)(那格列奈，Novartis)。

还可以用LXR激动剂与GLP-1类似物和衍生物一起对受试者进行治疗。本发明可以使用的GLP-1类似物和衍生物包括记载于WO 99/43705(Novo Nordisk A/S)、WO 99/43706(Novo Nordisk A/S)、WO 99/43707(Novo Nordisk A/S)、WO 98/08871(Novo Nordisk A/S)、WO 99/43708(Novo Nordisk A/S)、WO 99/43341(Novo Nordisk A/S)、WO 87/06941(The General Hospital Corporation)、WO 90/11296(The General HospitalCorporation)、WO 91/11457(Buckley等人)、WO 98/43658(EIi Lilly &Co.)的那些GLP-1类似物和衍生物。

本发明的药物组合物一般包含至少一种活性成分和一种或多种可接受的载体。药学载体用于增强或稳定该组合物，或便于该组合物的制备。药学上可接受的载体部分地由给药的特定组分(例如核酸、蛋白质或调节化合物)以及用于给予该组合物的特定方法所决定。就与其它组分相容以及对受试者无害的角度而言，所述载体也应当是药学上和生理学上可接受的。根据所要给药的制剂形式，例如口服给药制剂、舌下给药制剂、直肠给药制剂、鼻腔给药制剂或胃肠外给药制剂，该载体可采取多种形式。

有多种适宜的药学上可接受的载体可用于实施本发明(参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Mack Publishing Co.，第20版，2000)。所述载体包括糖浆、水、等渗盐溶液、5％葡萄糖水溶液或5％葡萄糖醋酸钠或醋酸铵缓冲溶液、油剂、甘油、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂、淀粉、糖、稀释剂、成粒剂、润滑剂和粘合剂等，但不限于此。还可以在给药之前使LXR激动剂与载体蛋白例如卵清蛋白或血清白蛋白复合以增强稳定性。

该药物组合物可以制备成各种形式，例如颗粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊剂、悬浮剂、软膏剂、洗剂等。在组合物中，具有治疗活性的化合物浓度可以在大约0.1-100wt％之间变化。可以使用在药学领域众所周知的任意方法制备治疗组合物。参见例如Gilman等人编辑，Goodmanand Gilman′s：The Pharmacological Bases of Therapeutics，第8版，PergamonPress，1990；Remington：The Science and Practice of Pharmacy，MackPublishing Co.，第20版，2000；Avis等人编辑，Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications，Marcel Dekker，Inc.，N.Y.出版，1993；以及Lieberman等人编辑，Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems，Marcel Dekker，Inc.出版，N.Y.，1990。

将本发明的药物组合物配制成适合其预定的给药途径。适宜的给药途径的例子包括胃肠外给药，例如静脉、真皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(局部的)、经粘膜和直肠给药。就胃肠外给药而言，可采用各种方式配制本发明的LXR激动剂。可将调节剂的水溶液包封在本领域技术人员已知的聚合物微珠、纳米颗粒或其它可注射的储库制剂中。另外，还可以将本发明的组合物包封在脂质体中给药。根据其溶解性，该组合物可存在于水层和油脂层中，或存在于通常称为脂质体悬浮液的液体中。通常疏水层包含磷脂类例如卵磷脂和鞘磷脂、甾族类化合物例如胆固醇、或多或少的离子型表面活性剂如二乙酰磷酸酯、十八烷基胺或磷脂酸，和/或其它疏水性物质，但并不限于此。

当需要时，可将其它活性药物组分添加到该组合物中。在组合物中也可含有任选的抗菌剂、防腐药和抗氧剂，这些物质在其中发挥其通常的功能。在一些应用中，使用使得化合物免于从体内迅速消除的载体制备LXR激动剂，例如控释剂型，包括植入给药系统和微囊给药系统。组合物中可包括持续释放物质，例如单独的硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯或其与蜡的混合。还可以使用可生物降解的、生物相容的聚合体，例如乙烯-乙酸乙烯共聚物(EVA)、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。配制该制剂的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。这些原料还可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.购得。

药物组合物可与给药说明书一起放入容器、包装或药物分配器中。剂量

使用本发明的药物组合物治疗患有糖尿病或相关病症的受试者一般经过一段连续的时间(例如至少30天、60天、90天或更长)。药物组合物包括药学上有效量或预防学上有效量的LXR激动剂。术语“治疗上有效量”是研究人员、兽医、医生或其他临床医生考察的引起组织、系统、动物或人类的生物学或医学反应的药物或药剂的量。术语“预防学上有效量”是用来指所寻求的预防或减少组织、系统、动物或人类中发生生物学或医学事件的风险所需的药剂的量。

可以根据众所周知的任意方法确定适当的治疗剂量，例如对哺乳动物类进行临床研究以确定最大容许剂量，以及对正常的人类受试者进行临床研究以确定安全剂量。特别地，可以选择受试者接受的LXR配体的剂量以实现β细胞的再生；还可以采用滴定法测量受试者接受的剂量随时间的变化，以稳定血糖和/或HbA1c或恢复胰岛素敏感性。LXR激动剂的毒性和治疗效果可以采用标准药学方法测定细胞培养物或实验动物中的例如LD₅₀(使总体的50％死亡的剂量)和ED₅₀(对总体的50％治疗有效的剂量)进行确定。毒性效果和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为比值LD₅₀/ED₅₀。优选显示高治疗指数的LXR激动剂。当使用显示毒性副作用的LXR激动剂时，应该小心设计给药系统，使该LXR激动剂靶向给药到感染组织部位，以使其对未感染细胞的潜在损害减到最低，由此降低副作用。

根据细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可用作配制用于人类的剂量范围。该化合物的剂量优选位于几乎没有或没有毒性的包含ED₅₀的循环浓度范围之内。根据使用的剂型和采用的给药途径，该剂量可以在上述范围内变化。对于本发明方法中使用的任意LXR激动剂而言，可以从细胞培养物的测定中初步估算治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量，使其具有包含如在细胞培养物中确定的IC₅₀(即：达到症状的半最大抑制时，测试LXR激动剂的浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可用于更精确地确定对人类有用的剂量。可通过例如高效液相色谱法测定血浆中的药物水平。

一般而言，除了在特定情况下需要更高剂量，LXR激动剂优选的日剂量通常在大约0.001mg至大约1000mg之间，更通常在大约0.01mg至大约500mg之间。LXR激动剂的优选剂量和给药方式可以根据不同的受试者变化，取决于那些可以由治疗医生单个检查的因素，例如待治疗的病情、包括特定LXR激动剂在内的给药组合物的选择、年龄、体重和受试者的个体应答、受试者症状的严重程度以及选择的给药途径。一般而言，LXR激动剂的给药量是有效而可靠地预防或使受试者的病情减轻至最低的最小剂量。因此，上述剂量范围是用于提供对于本文教导的一般指导和支持，而不是用以限制本发明的范围。

在一些应用中，第一LXR激动剂与第二LXR激动剂或已知的抗糖尿病药物联合使用，以达到仅单独使用一种LXR激动剂时所不能达到的治疗效果。

离体治疗

本发明进一步的特点在于一种通过将胰岛组织与LXR激动剂接触以抑制胰岛组织中β细胞损失的方法。减少损失是指与不存在LXR激动剂相比，当存在LXR激动剂时，胰腺组织具有10％、20％、30％、40％或更多的β细胞。

本发明的特点还在于一种通过将细胞与LXR激动剂接触以提高胰岛细胞生存能力或增殖的方法。另外，通过将LXR激动剂给予移植受体，提高胰岛细胞的生存能力。胰岛细胞是初级胰岛细胞。或者，该细胞是移植供体的胰腺细胞。生存能力表示细胞排斥活体染料，例如台盼蓝。活细胞还能增殖、分化、生长和发育。通过本领域已知的方法例如台盼蓝染色法测定生存能力。细胞在体内、体外或离体进行接触。将LXR激动剂局部地给予移植部位。或者，将LXR激动剂全身给药。在供体胰岛细胞移植之前或之后，将LXR激动剂给予移植受体。或者，在供体胰岛细胞移植的同时，将LXR激动剂给予移植受体。

在本发明中还包括通过将细胞与LXR激动剂接触以抑制细胞死亡的方法。细胞在体内、体外或离体进行接触。细胞是胰腺细胞，例如胰岛β细胞。细胞死亡是氧化应激(oxidative stress)诱发的细胞死亡或细胞调亡的细胞死亡。

附图说明

图1显示在ZDF大鼠中口服给予GW3965(10mg/kg)持续3周对血浆葡萄糖以及在治疗结束后的影响。

图2显示在ZDF大鼠中口服给予GW3965(10mg/kg)持续3周对分离的胰岛中葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响。

图3显示在ZDF大鼠中口服给予GW3965(10mg/kg)持续3周对于分离的胰岛的胰岛素含量的影响。

图4显示在ZDF大鼠中口服给予GW3965(10mg/kg)持续3周对于获得的胰岛数目的影响。

图5显示在ZDF大鼠中口服给予GW3965(10mg/kg)持续4周对于分离的胰岛和胰腺切片中细胞凋亡的影响。

图6显示GW3965对PDX1和Glut2 mRNA表达的影响。

图7显示GW3965(50mg/kg)对于NOD小鼠中β细胞再生的影响。

图8显示GW3965(50mg/kg)对于NOD小鼠中胰岛炎发展的影响，其中，图A表示仅用载体治疗的对照NOD小鼠的胰腺切片，图B表示用GW3965治疗的NOD小鼠的胰腺切片。

实施例

通过下列实施例举例说明，而不是限制本发明。

动物

雄性Zucker Diabetic Fatty fa/fa(ZDF)大鼠是II型糖尿病的模型。该大鼠是胰岛素抗性的，但出生时血糖量正常，其从大约7周龄至10周龄发生糖尿病。在过渡时期内，该动物经历了葡萄糖耐性损伤的状态。虽然该动物在糖尿病发病之前和糖尿病早期具有高胰岛素血症，随后却丧失葡萄糖刺激的胰岛素分泌，并最终发展为几乎完全胰岛素缺乏。

雄性ZDF fa/fa和ZDF fa+大鼠获自Genetic Models(Indianapolis，IN)，6周龄，用载体或GW3965(10mg/kg)口服治疗3周之后，于12周龄时用于实验。化合物每日一次(在17点钟)通过管饲法口服给药。在使用这些大鼠时，ZDF fa/fa大鼠体重为310-350g，而年龄匹配的ZDF fa+大鼠体重为245-285g。ZDF fa+和ZDF fa/fa动物自由摄取致糖尿病的食物(Purina5008)。以每笼放5只动物，将其置于温度和湿度控制的房间内，亮暗周期为12/12小时。在化合物给药16h之后，经由尾部静脉采血样，并在Konelab 300(Labsystem)临床化学分析仪中进行测定。

NOD(非肥胖型糖尿病)小鼠是自然产生的类似人类I型(胰岛素依赖性)糖尿病的试验模型，其由自身反应性T细胞逐步侵入胰岛和β细胞破坏而产生。这种自然产生的糖尿病模型为研究自身反应性T细胞参与的β细胞破坏过程以及在疾病临床发病之前确定预防策略提供了独特的机会。

大鼠胰岛的制备

通过胶原酶消化和密度梯度纯化制备大鼠胰岛。XI型胶原酶(SigmaChemical，Sigma Chemical，St.Louis，MO)用于胰腺的消化。在禁食整夜之后，将动物深度麻醉并处死。然后，将导管插入胰腺管，慢慢注入37℃的20ml消化溶液(30mg/ml胶原酶溶于20ml Hank氏平衡盐液[HBSS]中)(Sigma Chemical，Sigma Chemical，St.Louis，MO)，使组织扩张。在扩张之后，把胰腺放入装有37℃的5ml消化溶液的20ml玻璃烧杯中，将所述玻璃烧杯置于37℃的振荡水浴中振荡8分钟。在4℃下，以633g离心1min之后，除去上清液，并使用HBSS通过在4℃下以633g离心1min，洗涤胰岛三次。就纯化方法而言，将胰岛重悬于4ml 80％ Histopaque 1.077(Sigma)和4ml HBSS中。在4℃下以1943g离心20min之后，在Histopaque层和HBSS层之间的界面处回收胰岛。将胰岛重悬于含有11mM葡萄糖、10％FCS、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI 1640培养基中，并在CO₂恒温箱中于37℃下过夜培养。

通过测定DNA片段估算细胞凋亡

根据厂家建议的方法，使用获自Roche的细胞死亡检测酶联免疫吸附测定(ELISA)增强试剂盒确定胰岛细胞的细胞凋亡，并将其应用到大鼠胰岛试验中。在含有11mM葡萄糖、10％FCS、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI 1640培养基中过夜培养后，使用裂解缓冲液在室温下将每组10个胰岛孵育30min，然后在4℃下以200g离心10min，使细胞凋亡。把上清液的等分部分(20μl)放入涂有链霉亲合素的微量滴定板孔中。然后将含有抗组蛋白-生物素抗体和抗DNA-过氧化物酶抗体的混合物共80μl加入，在37℃下孵育120min。随后洗涤制备物，并加入100μl含有ABTS(2，2′-连氮-二[3-乙基苯并噻唑-磺酸盐])(过氧化物酶的底物)的溶液。孵育5min后，用分光光度计在405nm处读取样品的吸光度。结果可以表示为内标(核小体颗粒)的百分数。

通过TUNEL染色估算细胞凋亡

通过转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)染色测定胰岛细胞凋亡。通过使用生物素化的脱氧尿苷三磷酸3′原位末端标记片段DNA鉴别细胞死亡。将每个胰腺块纵向切成5μm厚的切片，将其收集在涂有明胶的载玻片上。每隔一定时间从头和尾的切片中拣出四个切片。在用蛋白酶K(2μg/ml；Sigma)消化之后，在TdT缓冲液(0.5mol/l二甲胂酸盐[pH6.8]、1mmol/l氯化钴、0.15mol/lNaCl)中连续洗涤各切片，然后在37℃下与TdT(25U；Boehringer-Mannheim，Mannheim，Germany)和生物素化的dUTP(1nmol/μl)一起孵育。在TB缓冲液(300mmol/l NaCl、30mmol/l柠檬酸钠)中洗涤使反应终止后，通过修改的亲合素-生物素复合物法检测生物素化的dUTP的结合。使用结合有辣根过氧化物酶的链霉亲合素-生物素复合物(Vector Laboratories)。然后利用DAB作为色素原将各切片进行显影，用苏木精轻微复染，并用dePex(BDH Laboratory，Poole，England)封片。

葡萄糖刺激的胰岛素分泌和胰岛的胰岛素含量

经过37℃下30min的预孵育阶段之后，在含有0.5％BSA、不含葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氢盐(KRB)-HEPES溶液(129mM NaCl、4.8mM KCl、1.2mM MgSO₄、1.2mM KH₂PO₄、2.5mM CaCl₂、5mM NaHCO₃和pH7.4的10mM HEPES)中培养30min。将每批为大小类似的3个胰岛放入加有200μl含有0.5％BSA和3.3mM葡萄糖的KRB-HEPES溶液的微量滴定板孔中，在搅拌以及5％CO₂、95％O₂的气氛下于37℃培养1小时。经过该刺激试验后，完全除去培养基，并用含有16.7mmol/l葡萄糖的KRB-HEPES置换。另外再培养1小时后，除去培养基，并冷冻。在乙醇-酸过夜提取(乙醇75％+HCl 0.15N)之后，在相同的胰岛中测定胰岛素含量。通过大鼠胰岛素ELISA测试(Insulin Rat Elite plus，MERCODIA)确定在不同培养基中的胰岛素浓度。

实时定量反转录-PCR

通过实时定量RT-PCR测定胰腺和十二指肠同源盒基因1 PDX1(Genbank：NM_022852)以及易化葡萄糖转运蛋白成员2 Glut2(Genbank：NM_012879)的基因表达。

根据厂家的说明书(Qiagen，France)，利用Rneasy 96试剂盒制备来自新分离的大鼠胰岛的总RNA，用Dnase I处理以除去污染的DNA(Stratagene，France)，并利用iScript cDNA合成和iQ SYBR GreenSupermix试剂盒(Stratagene，France)进行定量。利用iCycler检测系统仪器和软件(Bio-Rad)进行实时定量RT-PCR。因为扩增cDNA的预计大小和引物的Tm值是相似的，所以适用统一的扩增条件(即：于60℃退火)。通过在每次扩增后绘制熔解曲线监测扩增产物的特性。通过制作六点连续标准曲线量化表达水平(总RNA单位)。通过测定18S rRNA水平，使RNA样品归一化以进行比较。

引物序列

PDX1(正向)：CCACAGCCCTCCAGCATCG

PDX1(反向)：CAGACCCGCTCACCCTCAG

Glut2(正向)：ACCAGCACATACGACACCAGAC

Glut2(反向)：GACACAGACAGAGACCAGAGCATAG

18S(正向)：CGTCTGCCCTATCAACTTTCG

18S(反向)：GATGTGGTAGCCGTTTCTCAG

数据分析

数据可以表示为平均值±均数的标准误。通过Student t-检验获得各组间的比较。在实验组之间，当p＜0.05时就认为差异在统计上是显著的。就比较而言，ZDF fa/fa组与ZDF fa+组相比较，而ZDF fa/fa GW3965组与ZDF fa/fa组相比较。

胰腺切片和组织学分析

在最后一次给予化合物后两天处死未禁食的小鼠。切除胰腺，并在Bouin氏醇溶液中固定之后进行常规的组织学研究。按照Thivolet C.H.等人，1991，Diabetologia，34，314-319所述的用苏木精-曙红对5μm的切片进行染色。

实施例1

在ZDF大鼠中口服给予GW3965(10mg/kg)持续3周对血浆葡萄糖以及在 治疗结束后的影响

图1中显示了血浆葡萄糖的变化图。在研究开始时，在载体治疗和GW3965治疗的ZDF大鼠中血糖相近。

第6天时，在载体治疗组中血浆葡萄糖水平上升至超过400mg/ml。GW3965治疗显著阻止了这种上升，并保持血糖处于低水平直到第21天治疗结束为止。

从第21天到试验结束，动物不接受任何治疗。第44天时，先前用GW3965治疗过的ZDF大鼠中血糖仍然显著降低。这表明在用GW3965治疗有限的一段时间后血糖长期得到控制，这可能是由于β细胞功能和量的恢复，这与离体的数据一致。本实施例支持基于将LXR激动剂给予糖尿病患者有限的一段时间的治疗新模式的建议。

结果表明：虽然在停止治疗之后对于甘油三酯的作用降低，但维持降低的血糖超过一个月。LXR激动剂配体因此能作为负荷剂量给予一天或几天，并随后依据负荷剂量每周或更长时间再次给药，或者每隔一天或者每隔几周(或几天)给药。

实施例2

从口服GW3965(10mg/kg)进行持续治疗3周的ZDF大鼠分离的胰岛中葡 萄糖刺激的胰岛素分泌

结果显示于图2中。在3.3mmol/l和16.7mmol/l葡萄糖存在时，与fa+大鼠胰岛相比，ZDF的胰岛素分泌分别减少了82.6％和69.6％。与载体治疗的ZDF大鼠胰岛相比，在GW3965治疗的ZDF大鼠中，对应于3.3mmol/l和16.7mmol/l葡萄糖的胰岛素分泌分别显著增加了133.8％和74.5％。因此，可以表明LXR激动剂改善了ZDF大鼠胰岛的葡萄糖刺激的胰岛素分泌。

实施例3

口服给予ZDF大鼠GW3965(10mg/kg)持续3周对分离的胰岛的胰岛素含 量的影响

结果显示于图3中。与fa+大鼠的胰岛相比，在ZDF大鼠的胰岛中，胰岛素含量剧烈下降(4.78±0.86对27.74±6.85ng/胰岛)。与使用载体治疗的ZDF的胰岛相比，使用GW3965(10mg/kg)治疗的ZDF的胰岛中胰岛素的含量显著增加(13.05±2.49对4.78±0.86ng/胰岛)。

本实施例表明：胰岛的胰岛素含量随LXR激动剂而增加。

实施例4

口服给予ZDF大鼠GW3965(10mg/kg)持续3周对获得的胰岛数目的影响

结果显示于图4中。在ZDF大鼠中获得的胰岛数目较在fa+大鼠中收集的胰岛数目少(分别为51±13和120±28胰岛/大鼠)。与使用载体治疗的ZDF大鼠相比，使用GW3965治疗的ZDF大鼠具有更多数目的胰岛(分别为80±16和51±13胰岛/大鼠)。

因此，胰岛的数目随LXR激动剂的体内治疗而增加。

实施例5

口服给予ZDF大鼠GW3965(10mg/kg)持续4周对分离的胰岛和胰腺切片 中细胞调亡的影响

在本实施例中，研究了胰岛的细胞凋亡比例。结果显示于图5中(参见图A)。在RPMI培养基中过夜培养之后，通过特异性ELISA方法测定DNA片段，与对照fa+大鼠的胰岛相比，ZDF大鼠的胰岛中DNA片段显著增加(43.1±9.2％对19.9±6.2％)。与载体治疗的ZDF大鼠相比，从GW3965治疗的ZDF大鼠分离的胰岛中的细胞凋亡减少(分别为34.0±7.5％和43.1±9.2％)。

还利用TUNEL染色法对5只动物的胰腺切片估算了细胞凋亡，所述的动物是使用10mg/kg的GW3965治疗了4周的8周龄的ZDF大鼠。结果显示于图5中(参见图B)，表明与用载体治疗的对照大鼠相比，GW3965治疗的ZDF大鼠的胰腺切片中的细胞凋亡显著降低(分别为1.41±0.96％和4.55±1.29％的细胞凋亡(p＜0.05))。

使用LXR激动剂的口服体内治疗使得相应的分离胰岛的细胞凋亡降低。特别地，因为β细胞代表85-95％的胰岛，所以这些结果表明给予LXR激动剂显著降低了β细胞的细胞凋亡。

实施例6

GW3965对PDX1和Glut2 mRNA表达的影响(图6)

在本实施例中，测定了PDX1和Glut2的mRNA表达。如前所述，PDX1和Glut2是β细胞再生的标志物。与对照的fa+大鼠相比，ZDF的胰岛中PDX1和Glut2 mRNA表达显著降低(分别为0.17对0.38±0.21以及0.27对0.40±0.22)。与载体治疗的ZDF大鼠相比，从GW3965治疗的ZDF大鼠分离的胰岛中，PDX1和Glut2 mRNA表达增加。对于PDX1，值为0.35±0.11，而对于Glut2，值为0.55±0.23。

本实施例表明：当使用LXR激动剂治疗时，胰岛的β细胞经历了再生。

实施例7

GW3965(50mg/kg)对于NOD小鼠中β细胞再生的影响(图7)

使用载体或GW3965以50mg/kg治疗4周龄的NOD小鼠4周(5天/7)。如上所述进行了胰腺的组织学研究。

如图7中所清楚显示的那样，划在圆圈内的新胰岛形成，当用LXR激动剂治疗时，胰岛的β细胞经历了再生。另外，β细胞的再生出现了与正常胰岛形态结构相同的胰岛形态结构。

实施例8

GW3965(50mg/kg)对NOD小鼠中胰岛炎发展的影响(图8)

在胰腺中分析胰岛炎的发展。胰岛炎的五种状态通常描述为：状态0的特征在于没有单核细胞渗入(T淋巴细胞)的正常胰岛，状态1对应于胰岛周围炎(periinsulitis)，状态2中胰岛炎不到50％，状态3中胰岛炎超过50％，状态4中细胞凋亡。在8周龄的小鼠中观察不到状态4，该状态出现在大约9-10周龄。

使用载体或GW3965以50mg/kg治疗4周龄的NOD小鼠4周(5天/7)。如上所述进行了胰腺的组织学研究。

如图A中所示，仅使用载体治疗的对照NOD小鼠的胰腺切片显示胰岛炎，而GW3965治疗的NOD小鼠的胰腺显示阻止淋巴细胞渗入，如图B所示。实际上，在GW3965治疗的NOD小鼠的胰腺中观察到94％的正常胰岛，而对照NOD小鼠仅仅显示了32％的正常胰岛(数据未显示)。

本实施例表明：体内给予LXR激动剂GW3965能抑制NOD小鼠中胰岛炎的发展。

这些实施例表明：在患有严重糖尿病的ZDF大鼠中，LXR激动剂GW3965增加了葡萄糖刺激的胰岛素分泌、胰岛素含量和胰岛的数目、减少了β细胞的细胞凋亡，并促进了β细胞的再生。这与治疗21天之后糖尿病状态的改善以及血糖和HbA1c的显著降低相关。

在评价LXR激动剂的抗糖尿病作用存在的潜在机制时，我们发现使用GW3965治疗，使得β细胞凋亡明显减少以及胰岛素含量明显增加。而且我们发现PDX1和Glut2的mRNA水平恢复到如在fa+大鼠中所得到的对照值。

在GW3965治疗结束之后三十天，我们证明该化合物对于II型糖尿病的发展具有长期的保护和预防作用，因为血浆葡萄糖仍然维持在低水平上。

使用其它的LXR激动剂，例如T0901317，获得了与上述实施例中所述结果相类似的试验结果(数据未显示)。

可以理解的是本文所述的实施例和实施方式仅用于解释的目的，本领域技术人员将会由此得到启示，由此得到各种改变或变化，却仍然包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。虽然与本文所述的方法和原料类似或等效的任何方法和原料均可用于实施或测试本发明，但却记载了优选的方法和原料。

序列表

<110>Laboratoires Fournier S.A.实验室富尼耶公司

     Husson，Bernadette贝纳代特·于松

<120>Novel use of liver X receptor agonists肝X受体激动剂的新用途

<130>1H151440 0043 WO PCT

<150>US 60/679,768

<151>2005-05-10

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial人工序列

<220>

<223>PDX-1 forward primer PDX-1正向引物

<400>1

ccacagccct ccagcatcg    19

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial人工序列

<220>

<223>PDX-1 reverse primer PDX-1反向引物

<400>2

cagacccgct caccctcag    19

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial人工序列

<220>

<223>Glut-2 forward primer Glut-2正向引物

<400>3

accagcacat acgacaccag ac       22

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial人工序列

<220>

<223>Glut-2 reverse primer Glut-2反向引物

<400>4

gacacagaca gagaccagag catag    25

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial人工序列

<220>

<223>18S forward primer 18S正向引物

<400>5

cgtctgccct atcaactttc g         21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial人工序列

<220>

<223>18S reverse primer 18S反向引物

<400>6

gatgtggtag ccgtttctca g          21

Claims (16)

1.LXR激动剂在制备用于治疗和/或预防与β细胞退化有关的疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述疾病选自I型和II型糖尿病。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述疾病是I型糖尿病。

4.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物用于预防、停止或减慢II型糖尿病向并发的以胰岛素生成不足为特征的糖尿病状态发展。

5.根据权利要求1-4之任一项所述的应用，其中所述药物用于β细胞的再生。

6.根据权利要求1-4之任一项所述的应用，其中所述药物用于增强β细胞的生存能力。

7.根据权利要求6所述的应用，其中所述药物用于增强移植受体中移植供体胰岛细胞的生存能力。

8.根据权利要求1-7之任一项所述的应用，其中所述LXR激动剂是LXRα激动剂。

9.根据权利要求1-7之任一项所述的应用，其中所述LXR激动剂选自GW3965和T0901317。

10.根据权利要求1-9之任一项所述的应用，其中所述药物是适于口服的形式。

11.根据权利要求1-10之任一项所述的应用，其中每日使用所述药物持续至少30天。

12.根据权利要求1-11之任一项所述的应用，其中将所述药物与已知的抗糖尿病药物联合使用。

13.根据权利要求12所述的应用，其中所述的已知的抗糖尿病药物选自二甲双胍、匹格列酮、罗格列酮、格列美脲、格列吡嗪、格列本脲+二甲双胍、格列本脲、米格列醇、格列吡嗪+二甲双胍、瑞格列奈、阿卡波糖、曲格列酮、那格列奈和GLP-1激动剂。

14.一种用于增强初级胰岛细胞离体生存能力的方法，所述方法包括使所述胰岛细胞与LXR激动剂相接触。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述LXR激动剂是LXRα激动剂。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述LXR激动剂选自GW3965和T0901317。

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