MX2007010131A - Composicion de liberacion sostenida de farmaco de proteina. - Google Patents

Abstract

Se describe una composicion de liberacion sostenida de un farmaco de proteina; la composicion comprende un sustrato portador y un farmaco de proteina incorporado en el sustrato portador; el sustrato portador consistiendo esencialmente de un acido hialuronico o sus sales, un aminoacido, y un oxido de polialquilo.

Description

COMPOSICIÓN DE LIBERACIÓN SOSTENIDA DE FÁRMACO DE PROTEINA CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a una composición de liberación sostenida que comprende un sustrato portador y un fármaco de proteína incorporado dentro del sustrato portador, dicho sustrato portador consistiendo de manera esencial de (a) un ácido hialurónico o sus sales, (b) un óxido de polialquilo, y (c) un aminoácido. La composición permite una liberación persistente del fármaco activo fisiológicamente durante un periodo de tiempo extendido, preferiblemente por una semana o más.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se ha informado que los fármacos de proteína son útiles para el tratamiento de varias enfermedades debido a que tienen una actividad fisiológica alta en el cuerpo viviente y una especificad alta hacia un objetivo. También se refiere que los fármacos de proteína tienen una vida media corta y una tasa de absorción baja en el cuerpo viviente, que limita la disponibilidad de los fármacos de proteína como un fármaco para tratamiento. Los fármacos de proteína normalmente se administran a un paciente a través de vías de inyección. La inyección de los fármacos de proteína en el paciente normalmente es dolorosa. La vida media de los fármacos de proteína inyectados en el paciente generalmente es de 2 a 4 horas y se necesita administrar a los pacientes con los fármacos a diario o un día si y el otro no durante un periodo extendido de tiempo, por ejemplo, un año o más. Se proponen las formulaciones de liberación sostenida de fármacos de proteína. Durante la etapa inicial del desarrollo de las formulaciones de liberación sostenida de un fármaco de proteína, liposomas, microcápsulas, e implantes que contienen el fármaco se han sugerido. No obstante, estas formulaciones no son satisfactorias debido a que la proteína contenida en las formulaciones pierde fácilmente su actividad y no pueden producir una liberación sostenida del fármaco. Las micropartículas de polímero que contienen un fármaco de proteína se han propuesto. Las micropartículas formadas de un polímero no bíodegradable tienen problemas debido a que no se digieren en el cuerpo del paciente, y de este modo a veces, se necesita una operación para retirar los residuos no disueltos. También son dañinos para el cuerpo viviente y el control de la liberación del fármaco es difícil. Con el fin de superar las desventajas relacionadas con el uso de un polímero no biodegradable, las micropartículas en donde se atrapa un fármaco en el polímero bíodegradable se han sugerido. El polímero biodegradable de las micropartículas se degrada lentamente en el cuerpo del paciente y el fármaco se libera. Como ejemplos de polímeros biodegradables y biocompatibles, se han empleado poliésteres sintéticos tales como polilactidas, poliglicólidos, poli(lactida-co-glicólido) (PLGA), polianhídrídos, poliortoésteres, polifosfazenos, pseudopoliaminoácidos. Las microcápsulas elaboradas de poliésteres tales como PLGA producen una liberación sostenida de un fármaco de péptido por un periodo extendido de tiempo que varia de una semana a un mes. Sin embargo, el uso del PLGA en la producción de formulaciones de liberación sostenida de fármaco de proteína se limita debido a la propiedad hidrófoba del PLGA que provoca la degeneración de fármacos de proteína, la cual destruye la actividad fisiológica del fármaco. La degradación del propio PLGA en el cuerpo del paciente, que genera un ácido y de este modo reduce el pH de las micropartículas, también acelera la degeneración y agregación del fármaco de proteína. El uso de solventes orgánicos, que comúnmente se emplean en la producción de micropartículas que usan polímeros hidrófobos, también causa la inestabilización del fármaco de proteína. La digestión relativamente baja del polímero en el paciente también provoca una sensación de una sustancia extraña. Se ha propuesto un uso de formulaciones de liberación sostenida elaboradas de un polímero natural. Polímeros naturales tales como gelatina, colágeno, quitosán, carboximetíl celulosa, alginato, ó ácidos hialurónicos forman un gel viscoso en agua absorbente. El gel del polímero natural produce una liberación sostenida de un fármaco, incluyendo un fármaco de proteína. Sin embargo, el gel fácilmente pierde su capacidad para retener el fármaco, cuando se introduce en un cuerpo del paciente debido a la viscosidad y densidad del gel disminuye rápido en el cuerpo del paciente debido a la digestión del polímero y la dilución del gel dentro del cuerpo. De este modo, el gel de polímero natural no provee una liberación sostenida satisfactoria. El ácido hialurónico es un polímero de alto peso molecular, biodegradable, natural, elaborado de N-acetil-D-glucosamina y ácido D-glucurónico. Se encuentra en varios órganos y tejidos en el cuerpo viviente. Se usa en las operaciones del ojo y tratamientos reumáticos. Se han hecho intentos para usar geles de ácido hialurónico en formulaciones de liberación sostenida. Generalmente, entre más alta sea la viscosidad del gel de ácido hialurónico, más efectiva será en la producción de la liberación sostenida de un fármaco de proteína. Sin embargo, una composición que contiene algo de porcentaje del gel de ácido hialurónico es muy viscosa y difícil de introducir en un paciente por medio de una inyección. Al igual que otras formulaciones de gel de polímero natural, la formulación de gel de ácido hialurónico de un fármaco de proteína no provee una liberación sostenida efectiva del fármaco una vez que se introduce en un sujeto. Por ejemplo, cuando una formulación de insulina que comprende 1 % de gel de ácido hialurónico, como se describe en JP 1989-287041 , se inyecta a un conejo, el nivel de glucosa en sangre disminuye el efecto que no dura más de 24 horas después de la inyección. La patente de E.U.A. No. 5,416,071 describe una formulación de liberación sostenida de ¡nterferón que comprende 1.5% de ácido hialurónico y proteína de plasma. Cuando la formulación de interferón se introduce en un sujeto, el nivel de sangre de interferón disminuye abruptamente a 1/10 de su nivel inicial, dentro de 24 horas después de la inyección. Como una alternativa a las formulaciones de gel, se han propuesto micropartículas que comprenden un fármaco de proteína y un ácido hialurónico o sus sales, que se producen por secado por aspersión. Por ejemplo, la publicación de solicitud de E.U.A. No. 2003/0064105 describe una formulación de liberación sostenida que se prepara al producir micropartículas de ácido hialurónico que comprenden un fármaco de proteína que usa secado por aspersión; recubriendo las micropartículas con un material lipofílico tal como lecitína, y dispersando las micropartículas recubiertas en un aceite. También describe que las micropartículas recubíertas se formulan en una emulsión aceite en agua. Cuando una emulsión aceite en agua de las micropartículas recubiertas con lecitina de interferón-alfa se inyecta a un conejo, el nivel de sangre del interferón-alfa se mantiene durante un periodo extendido de tiempo. Para eliminar el procedimiento de recubrimiento mencionado anteriormente, un material lipofílico se puede dispersar en una solución que contiene un ácido hialuróníco y un ingrediente activo y la solución resultante se somete a secado (por ejemplo, secado por aspersión). La publicación de solicitud de E.U.A. No. 2003/0064105. La patente de E.U.A. No. 6,375,988 describe una composición farmacológica con una tasa de liberación controlada del fármaco. La composición farmacológica comprende: una matriz formada de (a) una sustancia de alto peso molecular biodegradable y biocompatible y/o iones de metal polivalente o una fuente de ion de metal polivalente, y (b) ácido hialurónico o una sal del mismo; y un fármaco incorporado como un ingrediente (c) en la matriz. El componente (a) incluye gelatina, caseína de sodio, albúmina, cloruro de lisozima, poli-L-lísina, quitosán, Ca2+, Al3+, y Fe3+. El fármaco cubre un amplio espectro de fármacos anti-inflamatorios para terapéuticos para artritis. El ácido hialurónico o sus sales tienen un peso molecular que varía de 600,000 a 2,000,000 Da, especialmente de 1 ,000,000 a 2,000,000 Da. Este no describe de manera específica un suministro controlado de fármacos de proteína. La patente de E.U.A. No. 6,375,988 no describe una composición de liberación sostenida que comprende un sustrato portador que consiste esencialmente de un ácido hialuróníco o sus sales, un aminoácido y un óxido de polialquileno y un fármaco de proteína incorporados en el sustrato portador, en donde una relación de un peso molecular (Da) del fármaco de proteína a un peso molecular (Da) del óxido de polialquileno es de aproximadamente 1 :0.5 - 1 :10. En conclusión, existe aún la necesidad de una formulación de liberación sostenida de un fármaco de proteína, que muestre una excelente liberación sostenida del fármaco durante un periodo de tiempo extendido y que retenga la actividad fisiológica del fármaco. El polietilen glicol (PEG) es un tipo de óxidos de polialquilo. Los PEG de bajo peso molecular (peso molecular de menos de 1000 Da) son líquidos a temperatura ambiente, aunque los PEG de alto peso molecular (peso molecular de 1000 Da o más) son sólidos. Los PEG de alto peso molecular se han usado como un plastificante, una base para supositorio, y un excipiente hidrófilo. Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edición, The Pharmaceutical Press (1994). Los PEG de bajo peso molecular se han usado principalmente como un solvente o un vehículo para composiciones farmacológicas. Los PEG de bajo peso molecular se han usado como un estabilizador para prevenir la cristalización o precipitación de los fármacos de proteína en formulaciones líquidas de los fármacos de proteína. International Journal of Pharmaceutics, 185, 129-188 (1999). Los PEG de bajo peso molecular en una forma líquida se proponen para usarse como un vehículo para una formulación sólida de proteínas. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,385,738 describe un método en donde las proteínas tales como IGF-1 o B-hGH mezcladas con colágeno se secan por congelación y se pulverizan para proporcionar polvos, los cuales entonces se dispersan en el PEG líquido. La patente de E.U.A. No. 6,004,549 describe un uso de PEG como un vehículo de interferones cristalinos. De acuerdo a la patente de E.U.A. No. 6,004,549, se proponen mezclas de PEG de diferentes pesos moleculares. Por ejemplo, describe el uso de la mezcla de PEG 3350 y PEG 400 ó PEG 40,000 y PEG 550 en la producción de una composición de liberación sostenida inyectable de interferones cristalinos. Usos de los PEG de peso molecular de 8000 Da o 3350 Da, también se sugieren. Sin embargo, la patente de E.U.A. No. 6,004,549 no enseña o describe una composición de liberación sostenida que comprende un sustrato portador que consiste esencialmente de un ácido hialurónico o sus sales, un aminoácido y un óxido de polialquileno y un fármaco de proteína incorporados en el sustrato portador, en donde una relación de un peso molecular (Da) del fármaco de proteína a un peso molecular (Da) del óxido de polialquileno es de aproximadamente 1 :0.5 - 1 :10. La composición de liberación sostenida de interferón-alfa descrita por la patente de E.U.A. No. 6,004,549 se libera interferón-alfa hasta 48 horas después de la inyección. Se ha mencionado que las composiciones farmacológicas que comprenden PEG de bajo peso molecular como un vehículo producen una liberación sostenida de un fármaco durante un periodo de tiempo corto. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,041 ,155 describe un uso de una solución de 80% de PEG 400 ó PEG 300 como un vehículo de somatostatina. Una solución de somatostatina dispersada en una solución al 38% de PEG 400 muestra una liberación sostenida de somatostatina por 4 horas. La patente de E.U.A. No. 6,011 ,011 describe una liberación sostenida de fármacos de proteína a partir de una composición que comprende PEG 300 ó PEG 600. Se recomienda usar menos del 30% de PEG 300 debido a que una concentración alta de 40% en volumen o más de PEG 300 puede inducir efectos hemolítícos alrededor del sitio inyectado. Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edición, The Pharmaceutical Press (1994).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Solución técnica Una composición de liberación sostenida comprende un sustrato portador y un fármaco de proteína incorporado en el sustrato portador, dicho sustrato portador consistiendo esencialmente de (a) un ácido hialurónico o sus sales, (b) un óxido de polialquilo, y (c) un aminoácido, en donde una relación de un peso molecular (Da) del fármaco de proteína a un peso molecular (Da) del óxido de polialquilo es de aproximadamente 1 :0.5 - 1 :10. La presente invención se refiere a una composición de liberación sostenida que comprende un sustrato portador y un fármaco de proteína fisiológicamente activo incorporado en el sustrato portador, en donde el sustrato portador consiste esencialmente de un ácido hialuróníco o sales del mismo en una cantidad suficiente para producir liberación sostenida del fármaco de proteína, un óxido de políalquilo en una cantidad suficiente para producir liberación sostenida del fármaco de proteína, y un aminoácido en una cantidad suficiente para producir liberación sostenida del fármaco de proteína. En la composición de la presente invención, una relación de un peso molecular (Da) del fármaco de proteína a un peso molecular (Da) del óxido de polialquilo es de aproximadamente 1 :0.5 - 1 :10. La composición preferiblemente produce una liberación sostenida de un fármaco de proteína en su cantidad efectiva o aún más, por al menos 7 días. Preferiblemente, el sustrato portador y el fármaco de proteína se pueden formar en una micropartícula. La micropartícula puede tener un diámetro promedio de 1 -500 µm.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra in vivo perfiles de liberación (rata) de micropartículas de interferón-alfa del ejemplo 1 (-.-) , ejemplo comparativo 1 (-0-) y control (-V-). La figura 2 muestra in vivo un perfil de liberación de micropartículas de eritropoyetina del ejemplo 20. La figura 3 muestra in vivo un perfil de liberación de micropartículas de FSH del ejemplo 21. La figura 4 muestra in vivo un perfil de liberación de micropartículas de eritropoyetina del ejemplo 22. La figura 5 muestra in vivo un perfil de liberación de micropartículas de FSH del ejemplo 23. La figura 6 muestra in vivo un perfil de liberación de micropartículas (en monos) de interferón-alfa del ejemplo 1 , según se mide por ELISA (-•-) y CPE (-=-).

MODALIDAD PREFERIDA DE LA INVENCIÓN El sustrato portador contenido en la composición de liberación sostenida de la presente invención consiste esencialmente de un ácido hialurónico o sus sales, un óxido de polialquilo, y un aminoácido. El término "sustrato portador", según se emplea en la presente, indica un material base o una matriz la cual permite un atrapado y una liberación sostenida de un fármaco. El sustrato portador puede llegar a ser aproximadamente 50-99.95% en peso, y preferiblemente aproximadamente 70-99.95% en peso, con base en el peso seco de la composición. De acuerdo a la presente invención, la interacción física o interacción de van der Waals entre el ácido hialurónico o sus sales, el aminoácido y el óxido de polialquilo produce la formación del sustrato portador. Una estructura densa o una textura densa de micropartículas formadas a partir de un ácido hialurónico o sus sales, un aminoácido y un óxido de polialquilo permite la producción de la liberación sostenida de un fármaco de proteína incorporado en ésta por un periodo extendido de tiempo. Las micropartículas pueden tener enlaces entrelazados o enlaces químicos formados entre cada uno de los ingredientes. En este caso, si es necesario, se puede usar un agente de entrelazamiento. El agente de entrelazamiento es conocido por un experto en la técnica. El término "consiste esencialmente de", como se emplea aquí, significa que el sustrato portador contiene, como ingredientes esenciales, un ácido hialurónico o sus sales, un óxido de polialquilo y un aminoácido. El sustrato portador puede contener otros ingredientes no esenciales que no afectan materialmente su efecto de liberación sostenida. Un ácido hialurónico, que se puede usar en la presente invención, puede ser un ácido libre o sales. Las sales pueden incluir, pero no limitarse a, hialuronato de sodio, hialuronato de potasio, hialuronato de amonio, híaluronato de calcio, hialuronato de magnesio, híaluronato de zinc, e hialuronato de cobalto. Se puede usar preferiblemente hialuronato de sodio. Se puede usar ácido hialurónico o sales en forma individual o como mezclas. Varios métodos de extracción, purificación, y medición se pueden usar para producir ácidos hialurónicos de varios pesos moleculares. Los ácidos hialurónicos o sus sales, que se usan en la presente invención, pueden tener un peso molecular de 1 ,000,000 Da o más, y preferiblemente 3,000,000 Da, o más. No existe límite superior para el peso molecular de los ácidos hialurónicos o sus sales, pero usualmente los ácidos hialurónicos de hasta 4,000,000-6,000,000 Da son comercialmente disponibles. Un ácido hialurónico o sus sales se pueden incorporar en la composición de la presente invención en una cantidad de 5-90% en peso, preferiblemente 10-60% en peso, y más preferiblemente 20-50% en peso, basado en el peso seco de la composición. En una modalidad de la presente invención, la composición de la invención comprende hialuronato de sodio de peso molecular de aproximadamente 3,000,000 Da en una cantidad de 20-50% en peso basado en el peso seco de la composición.

El término "peso seco" como se emplea aquí, significa un peso de sólidos obtenidos por la remoción de líquidos de la composición mediante, por ejemplo, evaporación o filtración. El término "óxido de polialquilo" como se usa en la presente solicitud, incluye óxidos de polialquilo y óxidos de polialquileno. Estos se pueden ejemplificar por, sin limitarse a, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, y un copolímero de polietílen y polipropilen glicol (por ejemplo, poloxámeros). Estos se pueden usar en forma individual o como mezclas. El óxido de polialquilo es preferiblemente polietilen glicol. Como se discutió anteriormente, los PEG se han usado en composiciones farmacéuticas, particularmente composiciones de liberación sostenida. Sin embargo, no se reporta que el uso de un óxido de políalquilo, particularmente polietilen glicol, que tiene un peso molecular similar o mayor que el de un fármaco de proteína, en combinación con un ácido hialurónico y un aminoácido, aumenta la liberación sostenida del fármaco de proteína. La relación de pesos moleculares del fármaco de proteína para el óxido de polialquilo está generalmente en el intervalo de aproximadamente 1 :0.5 -1 :10, preferiblemente aproximadamente 1 :0.8 - 1 :5; y más preferiblemente aproximadamente 1 :1. Cuando PEG 8000, PEG 20,000 y PEG 35,000 cada uno se emplea en las composiciones de liberación sostenida de interferón-alfa (PM de 20,000 Da), el nivel de sangre de interferón-alfa de las composiciones se mantiene en 100 pg/ml por más de 5 días (Ejemplos 3-5). En particular, la composición del ejemplo 4 que emplea PEG 20,000 muestra los efectos de liberación sostenida más prolongados. Se puede incorporar un óxido de polialquilo en la composición de la presente invención en una cantidad de 1 -90% en peso, preferiblemente 5-60% en peso, y más preferiblemente 10-40% en peso, con base en el peso seco de la composición. Se ha usado un aminoácido como un estabilizador de proteínas, en forma individual o como mezclas con otros excipientes farmacéuticos conocidos. El International Journal of Pharmaceuticals, 185, 129-188 (1999). En la presente invención, el aminoácido es uno de los componentes del sustrato portador y se puede emplear en una cantidad de 5% en peso o más, preferiblemente 10-80% en peso o más, y más preferiblemente 20-60% en peso, con base en el peso seco de la composición. De acuerdo con la presente invención, aminoácidos hidrófobos preferiblemente se usan para aumentar la liberación sostenida del fármaco de proteína (véase ejemplo experimental 5). El término "aminoácidos hidrófobos" como se emplea en la presente solicitud puede incluir ácido aspártico, asparaginas, histidina, isoluecina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, triptofano, tirosina o valina. Se pueden usar convenientemente isoleucina, leucina, metionina, o valina. Es particularmente preferida la leucina. Los aminoácidos pueden tener uno más sustituyentes siempre y cuando la sustitución no afecte adversamente la hidrofobicidad o el perfil de liberación sostenida de la composición. Los aminoácidos se pueden usar en forma individual o como mezclas.

Cuando se usan juntos, cada uno en cantidades apropiadas, un ácido hialurónico o sus sales, un óxido de polialquilo, y un aminoácido producen una liberación sostenida aumentada de fármacos de proteína, en comparación a cuando se usan individualmente o como mezclas de dos ingredientes (véase ejemplo experimental 2). La cantidad total del ácido hialurónico o sus sales, el óxido de polialquilo y el aminoácido puede estar en un intervalo de aproximadamente 50-99.95% en peso, y preferiblemente aproximadamente 70-99.95% con base en el peso en seco de la composición. En una modalidad, la composición de la presente invención comprende una sustancia portadora que consiste esencialmente de hialuronato de sodio con un peso molecular de aproximadamente 3,000,000 Da en una cantidad de 20-50% en peso con base en el peso seco de una composición, un polietilen glicol que tiene un peso molecular que es aproximadamente el mismo que el del fármaco de proteína contenido en la composición en una cantidad de 10-40% en peso con base en el peso seco de una composición, y un aminoácido hidrófobo tal como leucina en una cantidad de 20-60% en peso con base en el peso seco de una composición, y un fármaco de proteína en una cantidad de 0.05-5% en peso con base en el peso seco de una composición. La composición de la presente invención comprende un fármaco de proteína activo fisiológicamente. El término "un fármaco de proteína activo fisiológicamente" como se emplea en la presente solicitud indica proteínas o (poli)péptidos que exhiben efectos antagonísticos en varios fenómenos fisiológicos y existen en forma activa. Ejemplos del fármaco de proteína, que se pueden usar en la composición de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, hormonas de crecimiento humano, hormonas de crecimiento bovino, hormonas de crecimiento porcino, hormonas de liberación de hormona de crecimiento, péptidos de liberación de hormona de crecimiento, interferones y receptores de interferón (por ejemplo, interferón-alfa, -beta y -gamma, receptor de interferón soluble del tipo I), factores de estimulación de granulocito-colonia (G-CSF), factores de estimulación de granulocito-macrófago-colonia (GM-CSF), péptidos similares a glucagón (GLP-1 , y lo similar), proteínas morfogénicas óseas, hormonas de estimulación del folículo, exendinas, receptores acoplados a proteína G, interleucinas (por ejemplo, interleucin-1 , -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11 , -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21 , -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30 y lo similar), receptores de interleucina (por ejemplo, receptor IL-1 , receptor IL-4, y lo similar), enzimas (por ejemplo, glucocerebrosidasa, iduronato-2-sulfatasa, alfa-galactosidasa-A, agalsidasa alfa, beta- o alfa- L-iduronidasa, butírilcolinasterasa, quitinasa, glutamato decarboxilasa, imiglucerasa, lipasa, uricasa, acetilhídrolasa del factor de activación de plaquetas, endopeptidasa neutra, mieloperoxidasa y lo similar), proteínas de unión a interleucina o citosina (por ejemplo, IL-18bp, proteínas de unión a TNF), factores de activación de macrófago, péptidos de macrófago, factores de células B, factores de células T, proteína A, inhibidores de alergia, glicoproteína de necrosis celular, toxinas inmunes, toxinas de linfa, factores de necrosis tumoral, factores de supresión del tumor, factores del crecimiento de transición, antitripsina alfa-1 , albúmina, alfa-lactalbúmína, apolipoproteína-E, eritropoyetina, erítropoyetina altamente glicosilada, angiopoyetina, hemoglobina, trombina, péptidos de activación del receptor trombina, trombomodulina, factor sanguíneo Vil, factor sanguíneo Vlla, factor sanguíneo VIII, factor sanguíneo IX, factor sanguíneo XIII, factor de activación de plasminógeno, péptidos de unión a fibrina, urocinasas, estreptocinasas, hirudina, proteína C, proteínas reactivas C, inhibidores de rennina, inhibidores de colagenasa, dismutasas de superóxido, leptina, factor de crecimiento originado por plaquetas, factor de crecimiento epitelial, factor de crecimiento epidérmico, angiostanina, angiotensina, factor de crecimiento de mielofoíesís, factor de estimulación de mielofoiesis, calcitonina, insulina, atriopeptina, inductor de cartílago, elcatonina, factor de activación de tejido de articulación, inhibidor de trayectoria de factor de tejido, hormona de estimulación de folículo, hormona de formación de progesterona, hormona de liberación de hormona de formación de progesterona, factores de crecimiento del nervio (por ejemplo, factor de crecimiento del nervio, factor neurotrófíco ciliar, factor 1 de axogénesis, péptido cerebro-natriurético, factor neurotrófico derivado de glial, netrina, factor inhibidor neurófilo, factor neurotrófico, neuturina y lo similar), paratormona, relaxina, cicretina, somatomedina, factor de crecimiento similar a insulina, hormonas adrenocorticales, glucagonas, colecistocinina, polipéptidos pancreáticos, péptido de liberación de gastrina, factor de liberación de corticotropina, hormona de estimulación de tiroides, autotaxina, lactoferrina, miostatina, receptores (por ejemplo, TNFR(P75), TNFR(P55), receptor IL-1 , receptor VEGF, receptor del factor de activación de célula B y lo similar), antagonistas del receptor (por ejemplo, IL-1-Ra y lo similar), antígenos de superficie celular (por ejemplo, CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11 b, 18, 19, 5 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 y lo similar), antígenos de vacuna de virus, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 y Fd), antígenos de vacuna originados de virus, factores de crecimiento (por ejemplo, EGF, PDGF, FGF y lo similar), proteína de fusión de anticuerpo, proteína de fusión de fragmentól o anticuerpo, y lo similar. Los fármacos de proteína que requieren una administración frecuente a un paciente, tales como interferones, eritropoyetinas, factor de estimulación de granulocito-colonia, y hormonas de estimulación de folículo (FSH), se pueden emplear ventajosamente en la presente solicitud. Las 15 composiciones de liberación sostenida que contienen uno de estos fármacos de proteína, que se preparan de acuerdo a la presente invención, producen liberación sostenida del fármaco de proteína en su nivel de suero efectivo por más de 7 días. (Ejemplos experimentales 7 y 8). El término "nivel de suero efectivo" o "concentración efectiva", 20 como se emplea aquí significa una concentración de un fármaco en la sangre de un sujeto, en o arriba donde un cambio fisiológico propuesto en un sistema biológico ocurre. Los valores del nivel de suero efectivo varían con el tipo de fármaco usado y el sujeto.

La composición de la presente invención, la cual comprende un sustrato portador y un fármaco de proteína incorporado en el sustrato portador se puede producir por varios métodos conocidos de producción de composiciones farmacéuticas sólidas. Por ejemplo, se pueden producir en la forma de una película, una pella, un filamento, un cilindro, una barra o en micropartículas. Si es necesario, los excipientes farmacéuticamente aceptables se pueden usar para la producción de las composiciones. Los tipos y cantidades de los excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. La composición preferiblemente se formula en micropartículas.

Las micropartículas pueden estar en una forma esférica, no esférica o irregular. Los tamaños promedio de la micropartícula puede estar en la escala de aproximadamente 1 µm a aproximadamente 500 µm. Para el propósito de inyección, las micropartículas preferiblemente pueden tener un tamaño promedio de aproximadamente 100 µm o menos. Las micropartículas se pueden producir por varios métodos conocidos por un experto en la técnica. Se puede emplear el secado por congelamiento o secado por aspersión. Por ejemplo, una solución acuosa de un ácido hialurónico o sus sales, un aminoácido, y óxido de polialquilo se mezclan con una solución de fármaco de proteína, y la mezcla resultante se somete a secado por congelamiento o secado por aspersión para producir micropartículas, en las cuales se incorpora el fármaco de proteína en un sustrato portador. Una mezcla de solución homogénea de un fármaco de proteína, un ácido hialurónico o sus sales, un óxido de polialquilo y un aminoácido se puede aplicar a un secador por aspersión para la evaporación del agua de las gotitas finas rociadas de la solución homogénea. Las micropartículas secas tienen la misma composición de la solución original, pero las moléculas de fármaco se atrapan en las micropartículas resultantes. El secado por aspersión se puede usar preferiblemente debido a que produce micropartículas esféricas homogéneas, las cuales fácilmente se dispersan en un dispersante. Las micropartículas esféricas homogéneas también se administran fácilmente a un sujeto por medio de varios métodos de inyección tales como subcutáneo, intramuscular, intralesional o intravenoso. El término "incorporado" o "incorporado en un sustrato portador", como se emplea aquí con respecto a la estructura de la composición de la presente invención, significa que un fármaco de proteína se atrapa en un sustrato portador resultante, que puede, por ejemplo, preferiblemente estar en la forma de micropartículas. El término "atrapado" significa que una molécula está confinada en un espacio tridimensional por cualquiera de los medios tales como una matriz de sustrato portador por si misma o uniones iónicas/no iónicas entre el fármaco y la matriz. La composición de liberación sostenida de la presente invención se puede administrar a través de varias vías. El término "administración" como se emplea aquí, significa una introducción o suministro de un cierto material en un paciente a través de varias vías. Cualquiera de las vías se puede usar siempre y cuando permitan un suministro de un fármaco a un tejido objetivo.

Por ejemplo, se puede emplear la administración intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracutánea, tópica, intranasal, pulmonar, y rectal. Las administraciones inyectadas se pueden emplear ventajosamente. Se prefiere la administración subcutánea. La composición de la presente invención también se puede administrar a través de otras vías tales como vías inhalacional, endoscópica o laparoscópica. La composición de la presente invención además puede comprender portadores adicionales dependiendo de las formas de dosificación o vías de administración. Se puede usar un estabilizador de un fármaco de proteína. El estabilizador puede formar un enlace covalente o un enlace coordinado con el fármaco de proteína, e incluye, pero no se limita a, azúcares tales como sacarosa, lactosa, o glucosa, polioles tales como un manitol o glicerol, agentes tensioactivos tales como Tweens, lecitina, fosfatos, y sales inorgánicas. El estabilizador se puede usar de forma individual o como mezclas. Un experto en la técnica tendrá la capacidad de determinar los tipos y las cantidades del estabilizador. Los inventores presentes encuentran que las composiciones de interferón-alfa de acuerdo a la presente invención exhiben una liberación sostenida por un periodo de tiempo extendido aún más cuando no contienen un estabilizador que cuando contienen un estabilizador. En un experimento que usa una composición que comprende lecitina como un estabilizador y otra composición sin lecitina, ambas composiciones producen liberaciones sostenidas de interferón-alfa por más de 7 días. De manera interesante, la composición sin lecitina produce una liberación sostenida más larga. (Ejemplo experimental 6). Este resultado es contrario a lo descrito por las publicaciones en la técnica. Por ejemplo, la publicación de solicitud de E.U.A. 2003/0064105 describe una composición de liberación sostenida de micropartículas de ácido hialuronico, en la cual las micropartículas se recubren con un material lipofílico tal como lecitina para aumentar la capacidad de dispersión de las micropartículas hialurónicas y posteriormente la liberación sostenida. La composición de la presente invención se puede administrar por varias vías de inyección. Para este propósito, la composición se puede dispersar en un portador de solución inyectable. El portador de solución inyectable puede incluir, pero sin limitarse a, una solución para inyección acuosa tal como agua destilada o reguladores de pH inyectables; solución para inyección no acuosa tal como aceite de maíz, aceite de sésamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de soya, aceite de cacahuate, mono-, di-, y triglicérido, aceite mineral, escualeno o mezclas de los mismos. Si es necesario, la formulación para inyección además puede comprender un dispersante, un agente antiséptico, un agente anestésico, un regulador de pH, o un preservativo. La dosis exacta y el régimen para administración de la composición necesariamente dependerán de las necesidades del sujeto individual a ser tratado, el tipo de tratamiento, las vías de administración, la edad, el género y el peso del cuerpo del sujeto individual, el grado de aflicción o necesidad y el juicio del practicante médico asi como el grupo del fármaco. La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, los cuales no están construidos como limitantes de la invención en el alcance o esencia para los procedimientos y composiciones específicos descritos en estos.

EJEMPLO 1 Preparación de micropartículas de interferón-aifa Una solución de interferón-alfa se prepara mediante la disolución de interferón-alfa en regulador de pH de acetato 10 mM a una concentración de 1 -2 mg/ml. Se disuelven leucina (3 mg/ml), metionina (1.5 mg/ml), y PEG 20,000 (1.5 mg/ml) en agua pura. Se disuelve hialuronato de sodio (PM 3,000,000 Da) (3 mg/ml) en la solución resultante. Se añade la solución de interferón-alfa a la solución de leucina, metionina, PEG e hialuronato de sodio a una concentración final de 0.015 g/ml para obtener una solución. Se introduce la solución a un secador por aspersión (Mobile Minor™, Niro) a un caudal de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura del aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm.

EJEMPLO 2 Preparación de micropartículas de interferón-alfa Se prepara una solución de inteferón-alfa mediante la disolución de interferón-alfa en regulador de pH de acetato 10 mM a una concentración de 1 -2 mg/ml. Se hidrata la lecitina con agua pura a una concentración de 5 mg/ml y después se pasa a través de un microfluídizador (Microfluidizer™, Microfluidics Corporation) para producir una dispersión de lecitina. Las partículas de lecitina tienen un tamaño que varía de 50 nm a 100 nm. Se disuelve lecitina (3 mg/ml) y PEG 20,000 (1.5 mg/ml) en agua pura. Se disuelve hialuronato de sodio con un peso molecular de 3,000,000 Da (3 mg/ml) en la solución resultante. Se añade la dispersión de lecitina a la solución que contiene leucina, PEG 20,000 e hialuronato de sodio obtenido anteriormente a una concentración de 0.525 mg/ml y se mezcla homogéneamente. La solución de interfeón-alfa se añade a una concentración final de 0.075 mg/ml para obtener una solución. Se introduce la solución resultante a un secador por aspersión (Mobile Minor™, Niro) a una tasa de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura del aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm.

EJEMPLO COMPARATIVO 1 Preparación de micropartículas de interferón-alfa sin PEG y aminoácido Se prepara una solución de interferón-alfa mediante la disolución de interferón-alfa en regulador de pH de acetato 10 mM a una concentración de 1 -2 mg/ml. Se hidrata la lecitina con agua pura a una concentración de 5 mg/ml y después se pasa a través de un microfluidizador (Microfluidizer™, Microfluidics Corporation) para producir una dispersión de lecitina. Las partículas de lecitina tienen un tamaño que varía de 50 nm a 100 nm. Se disuelve hialuronato de sodio (peso molecular de 3,000,000 Da) en agua pura a una concentración de 3 mg/ml. Se añade la dispersión de lecitina a la solución de hialuronato de sodio a una concentración de 0.51 mg/ml y se mezcla homogéneamente. Se añade la solución de interferón-alfa a una concentración final de 0.15 mg/ml para obtener una solución. Se introduce la solución a un secador por aspersión (Mobile Minor™, Niro) en una tasa de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura del aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm.

EJEMPLO COMPARATIVO 2 Preparación de micropartículas de interferón-alfa sin PEG Se prepara una solución de interferón-alfa mediante la disolución de interferón-alfa en regulador de pH de acetato 10 mM a una concentración de 1 -2 mg/ml. Se hidrata la lecitina con agua pura a una concentración de 5 mg/ml y después se pasa a través de un microfluidizador (Microfluídizer™, Microfluidics Corporation) para producir una dispersión de lecitina. Las partículas de lecitina tienen un tamaño que varía de 50 nm a 100 nm. Se disuelve leucina en agua pura a una concentración de 3 mg/ml, a la cual se disuelve hialuronato de sodio (peso molecular 3,000,000 Da) a una concentración de 3 mg/ml. Se añade la dispersión de lecitina a la solución que contiene leucina e hialuronato de sodio a una concentración de 0.5025 mg/ml y se mezcla homogéneamente. Se añade la solución de interferón-alfa a una concentración final de 0.075 mg/ml para obtener una solución. Se introduce la solución a un secador por aspersión (Mobile Minor™, Niro) a una tasa de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura del aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm.

EJEMPLO COMPARATIVO 3 Preparación de micropartículas de interferón-alfa sin aminoácido Se prepara una solución de interferón-alfa mediante la disolución de interferón-alfa en regulador de pH de acetato 10 mM a una concentración de 1 -2 mg/ml. Se hidrata lecitina con agua pura a una concentración de 5 mg/ml y después se pasa a través de un microfluidizador (Microfluidizer™, Microfluidics Corporation) para producir una dispersión de lecitina. Las partículas de lecitina tienen un tamaño que varía de 50 nm a 100 nm. Se disuelve PEG 20,000 en agua pura a una concentración de 1.5 mg/ml, a la cual se disuelve hialuronato de sodio (peso molecular 3,000,000 Da) a una concentración de 3mg/ml. Se añade la dispersión de lecitina a la solución que contiene PEG e hialuronato de sodio a una concentración de 0.5025 mg/ml y se mezcla homogéneamente. Se añade la solución de interferón-alfa a una concentración final de 0.075 mg/ml para obtener una solución. Se introduce la solución a un secador por aspersión (Mobile Minor™, Niro) en una tasa de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura del aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm.

EJEMPLOS 3-5 Preparación de microparticulas de interferón-alfa con PEG de diferentes pesos moleculares Se prepara una solución de interferón-alfa mediante la disolución de interferón-alfa en regulador de pH de acetato 10 mM a una concentración de 1 -2 mg/ml. Se hidrata lecitina con agua pura a una concentración de 5 mg/ml y después se pasa a través de un microfluidizador (Microfluidizer™, Microfluidics Corporation) para producir una dispersión de lecitina. Las partículas de lecitina tienen un tamaño que varía de 50 nm a 100 nm. Se disuelven leucina y PEG (pesos moleculares de 8,000 (ejemplo 3), 20,000 (ejemplo 4), ó 35,000 (ejemplo 5)) en agua pura a una concentraciones como se muestra en el cuadro 1 posterior. Se disuelve hialuronato de sodio (peso molecular de 3,000,000 Da) en la solución resultante a las concentraciones como se muestra en el cuadro 1. Se añade dispersión de lecitina a la solución que contiene leucina, PEG e hialuronato de sodio a una concentración de 0.5025 mg/ml y se mezcla homogéneamente. Se añade la solución de interferón-alfa a las concentraciones finales como se muestra en el cuadro 1. Se introduce la solución resultante a un secador por aspersión (Mobile Minor™, Niro) a una tasa de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura de aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm.

CUADRO 1 (Unidad: mg/ml) EJEMPLOS 6-10 Preparación de micropartículas de interferón-alfa con varias cantidades de PEG Se hidrata lecitina con agua pura a una concentración de 5 mg/ml y después se pasa a través de un microfluidizador (Microfluidizer™, Microfluidics Corporation) para producir una dispersión de lecitína. Las partículas de lecitina tienen un tamaño que varía de 50 nm a 100 nm. Se prepara una solución de interferón-alfa mediante la disolución de interferón-alfa en regulador de pH de acetato 10 mM a una concentración de 1-2 mg/ml Se disuelve leucina y PEG 20,000 en agua pura a las concentraciones como se muestran en el cuadro 2 posterior. Se disuelve hialuronato de sodio (peso molecular de 3,000,000 Da) en la solución resultante a las concentraciones como se muestran en el cuadro 2. Se añade la dispersión de lecitina a la solución que contiene leucina, PEG e hialuronato de sodio a las concentraciones como se muestran en el cuadro 2 y se mezcla homogéneamente. Se añade la solución de interferón-alfa a las concentraciones finales como se muestra en el cuadro 2. Se introduce la solución a un secador por aspersión (Mobile Minor™, Niro) a una tasa de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura del aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm.

CUADRO 2 (Unidad: mg/ml) *Las cantidades de PEG se basan en el peso seco de la composición.

EJEMPLOS 11-14 Preparación de micropartículas de interferón-alfa con varios aminoácidos Se hidrata lecitina con agua pura a una concentración de 5 mg/ml y después se pasa a través de un microfluídizador (Microfluídizer™, Microfluidics Corporation) para producir una dispersión de lecitina. Las partículas de lecitina tienen un tamaño que varía de 50 nm a 100 nm. Se prepara una solución de inerferón-alfa mediante la disolución de interferón-alfa en regulador de pH de acetato 10 mM a una concentración de 1-2 mg/ml. Se muestran varios aminoácidos en el cuadro 3 y se disuelve PEG 20,000 en agua pura a las concentraciones como se muestran en el cuadro 3 posterior. Se disuelve hialuronato de sodio (peso molecular de 3,000,000 Da) en la solución resultante a las concentraciones como se muestra en el cuadro 3. Se añade la dispersión de lecitina a la solución que contiene un aminoácido, PEG e hialuronato de sodio a las concentraciones que se muestran en el cuadro 3 y se mezcla homogéneamente. Se añade solución de interferón-alfa a las concentraciones finales como se muestran en el cuadro 3. Se introduce la solución a un secador por aspersión (Mobíle Minor™, Niro) a una tasa de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura del aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm.

CUADRO 3 (Unidad: mg/ml) EJEMPLOS 15-19 Preparación de micropartículas de interferón-alfa Se hidrata lecitina con agua pura a una concentración de 5 mg/ml y después se pasa a través de un microfluidízador (Microfluidizer™, Microfluidícs Corporation) para producir una dispersión de lecitina. Las partículas de lecitina tienen un tamaño que varía de 50 nm a 100 nm. Se prepara una solución de interf erón-alf a mediante la disolución de interferón-alfa en regulador de pH de acetato 10 mM a una concentración de 1-2 mg/ml. Se disuelven un aminoácido (leucina o metionína) y PEG 20,000 en agua pura a las concentraciones mostradas en el cuadro 4. Se disuelve hialuronato de sodio (peso molecular de 3,000,000 Da) en la solución resultante a las concentraciones como se muestran en el cuadro 4. Se añade la dispersión de lecitina a la solución que contiene un aminoácido, PEG e hialuronato de sodio a las concentraciones que se muestran en el cuadro 4 y se mezcla homogéneamente. Se añade la solución de interferón-alfa a las concentraciones finales como se muestra en el cuadro 4. Se introduce la solución resultante a un secador por aspersión (Mobile Minor™, Niro) a una tasa de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura del aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm. El cuadro 4 muestra las cantidades de cada ingrediente de las micropartículas obtenidas, con base en el peso seco de las micropartículas.

CUADRO 4 (Unidad: % en peso) Ejemplo HA Interferón-a PEG Leucína Metionina Lecitina 15* 42.7 0.14 14.3 35.7 7.16 0 16 33.2 0.17 16.7 33.2 16.73 0 17 37.1 0.93 18.6 37.1 0 6.27 18 38.6 0.2 19.8 38.6 2.8 19 37.5 0.1 18.7 28 9.4 6.3 *En el ejemplo 15, se emplea isoleucina en lugar de leucina EJEMPLO 20 Preparación de micropartículas de eritropoyetina Se hidrata lecitina con agua pura a una concentración de 5 mg/ml y después se pasa a través de un microfluidizador (Microfluídizer™, Microfluidics Corporation) para producir una dispersión de lecitina. Las partículas de lecitina tienen un tamaño que varía de 50 nm a 100 nm. Se prepara una solución de eritropoyetina recombinante humana al disolver la eritropoyetina recombinante humana en regulador de pH de acetato 10 mM a una concentración de 1-2 mg/ml.

Se disuelve leucina y PEG 20,000 en agua pura a las concentraciones de 3 mg/ml y 1.5 mg/ml, respectivamente. Se disuelve hialuronato de sodio (peso molecular de 3,000,000 da) en la solución resultante a la concentración de 3 mg/ml. Se añade la dispersión de lecitina a la solución que contiene leucina, PEG e hialuronato de sodio a la concentración de 0.502 mg/ml y se mezcla homogéneamente. Se añade solución de eritropoyetina recombinante humana a la concentración de 0.075 mg/ml. Se introduce la solución resultante a un secador por aspersión (Mobile Minor™, Niro) a una tasa de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura de aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm.

EJEMPLO 21 Preparación de micropartículas de la hormona de estimulación de folículo (FSH) Se hidrata lecitina con agua pura a una concentración de 5 mg/ml y después se pasa a través de un microfluidizador (Microfluidizer™, Microfluidics Corporation) para producir una dispersión de lecitína. Las partículas de lecitina tienen un tamaño que varía de 50 nm a 100 nm. Se disuelve leucina y PEG 35,000 en agua pura a las concentraciones de 3 mg/ml y 1.5 mg/ml, respectivamente. Se disuelve hialuronato de sodio (peso molecular de 3,000,000 Da) en la solución resultante a la concentración de 3 mg/ml. Se añade la dispersión de lecitina a la solución que contiene leucina, PEG e hialuronato de sodio a la concentración de 0.51 mg/ml y se mezcla homogéneamente. Se añade un FSH derivado de orina (PM de 40,000) a la concentración de 0.1 mg/ml. La solución resultante se introduce a un secador por aspersión (Mobile Minor™, Niro) a una tasa de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura de aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm.

EJEMPLO 22 Preparación de micropartículas de eritropoyetina Se prepara una solución de eritropoyetina recombinante humana mediante la disolución de erítropoyetina recombinante humana en regulador de pH de acetato 10 mM a una concentración de 1 -2 mg/ml. Se disuelve leucina, metionína y PEG 20,000 en agua pura a las concentraciones de 3 mg/ml, 1.5 mg/ml y 1.5 mg/ml, respectivamente. Se disuelve hialuronato de sodio (peso molecular de 3,000,000 Da) en la solución resultante a la concentración de 3 mg/ml. Se añade la solución de eritropoyetina recombinante humana obtenida anteriormente a la solución de leucina, metionina y PEG 20,000 a la concentración de 0.015 mg/ml. Se introduce la solución final a un secador por aspersión (Mobile Minor™, Niro) a una tasa de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura del aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm.

EJEMPLO 23 Preparación de micropartículas de hormona de estimulación de f olí ícelo (FSH) Se disuelven leucina, metionina y PEG 35,000 en agua pura a las concentraciones de 3 mg/ml, 1.5 mg/ml y 1.5 mg/ml, respectivamente. Se disuelve híaluronato de sodio (peso molecular de 3,000,000 Da) en la solución resultante a la concentración de 3 mg/ml. Se añade a la solución que contiene leucina, metionina, PEG, e hialuronato de sodio, FSH recombinante humano (PM cerca de 40,000) a la concentración de 0.015 mg/ml. Se introduce la solución final a un secador por aspersión (Mobile Minor™, Niro) a una tasa de 20 ml/min para producir micropartículas. La temperatura del aire en la entrada es de 100°C. Los diámetros de las micropartículas producidas se encuentran entre 2 µm y 200 µm.

EJEMPLO EXPERIMENTAL 1 Liberación sostenida de micropartículas de la invención Se analizan las mícropartículas de interferón-alfa para determinar su liberación sostenida de interferón-alfa mediante el uso de ratas. Las micropartículas de ¡nterferón-alfa del ejemplo 1 ó ejemplo comparativo 1 se dispersan en un triglicérido de cadena media (MCT) (Myglyol 812, Sasol) a una concentración de 336 µg IFNa/ml para proporcionar dispersiones para inyección. Se usa un regulador de pH de acetato 10 mM que comprende interferón-alfa (24 µg/ml) como un control. Cada una de las dispersiones de micropartículas y el control (0.5 ml) se inyecta subcutáneamente a ratas Sprague Dawley (macho, de 7-8 semanas de edad). Se colectan las muestras de sangre 8 horas después de la inyección y después en una base diaria durante una semana. Se separa suero de las muestras de sangre y los niveles de sangre de interferón-alfa se miden usando en Ensayo Inmunoabsorbente unido a Enzima (ELISA) (Biotrak ELISA System (RPN 2789), Amersham Biosciences). Los resultados se muestran en la figura 1. Como se muestra en la figura 1 , el nivel de sangre de interferón-alfa de la rata inyectada con la dispersión de las micropartículas del ejemplo 1 es superior a 1 x 102 pg/ml en el día 7. El nivel de sangre del interferón-alfa de la rata inyectada con la dispersión de las micropartículas del ejemplo comparativo 1 disminuye abruptamente en el día 2 y llega a ser ¡ndetectable en el día 4. El control libera la mayor parte del interferón-alfa en el día 1.

EJEMPLO EXPERIMENTAL 2 Liberación sostenida de micropartículas de la invención Las micropartículas de interferón-alfa del ejemplo 2 ó ejemplos comparativos 1 , 2 ó 3 se dispersan en un triglicérido de cadena media (Myglyol 812, Sasol) a una concentración de 336 µg IFNa/ml para proporcionar dispersiones para inyección. Cada una de las dispersiones de micropartículas (0.5 ml) se inyecta subcutáneamente a ratas Sprague Dawley (macho, de 7-8 semanas de edad). Se colectan las muestras de sangre una vez al día durante una semana. Se separa el suero de las muestras de sangre y los niveles (pg/ml) de interferón-alfa se miden usando ELISA. Los resultados se muestran en el cuadro 5.

CUADRO 5 * ND = No detectado Como se muestra en el cuadro 5, el nivel de sangre de interferón-alfa de la rata inyectada con la dispersión de las micropartículas del ejemplo 2 es superior a 1 x 102 pg/ml en el día 7. El nivel de sangre de interferón-alfa de la rata inyectada con la dispersión de las micropartículas del ejemplo comparativo 1 disminuye abruptamente en el día 2 y es inferior a 1 x 102 pg/ml a partir del día 3. Los niveles de sangre de interferón-alfa en la rata administrada con la dispersión de las micropartículas del ejemplo comparativo 2, que comprende hialuronato de sodio y un aminoácido, sin PEG, se mantienen arriba de 1x102 pg/ml hasta el día 3. Los niveles de sangre de interferón-alfa en la rata administrada con la dispersión de las micropartículas del ejemplo comparativo 3, que comprende hialuronato de sodio y PEG, pero no un aminoácido, se mantienen arriba de 1 x 102 pg/ml por aproximadamente cinco (5) días.

EJEMPLO EXPERIMENTAL 3 Efectos de los pesos moleculares de PEG en la liberación sostenida Se evalúa un efecto del peso molecular de PEG en las micropartículas en el perfil de liberación sostenida de las micropartículas. Las micropartículas de interferón-alfa de los ejemplos 3, 4 o 5 se dispersan en un triglicérido de cadena media (Myglyol 812, Sasol) a una concentración de 336 µg IFNa/ml para proporcionar dispersiones para inyección. Cada una de las dispersiones de micropartículas (0.5 ml) se inyecta subcutáneamente a ratas Sprague Dawley (macho, de 7-8 semanas de edad). Se colecta una muestra de sangre en una base diaria durante una semana. Se separa el suero de las muestras de sangre y los niveles (pg/ml) de interferón-alfa se miden usando ELISA. Los resultados se muestran en el cuadro 6.

CUADRO 6 Como se muestra en el ejemplo 6, el nivel de sangre de interferón-alfa de la rata inyectada con la dispersión de las micropartículas del ejemplo 3 es superior a 1 x 102 pg/ml por aproximadamente el día 5. Contrarío a esto, los niveles de sangre de interferón-alfa de la rata administrada con la dispersión de las micropartículas de los ejemplos 4 y 5 se mantienen en o arriba de 1 x 102 pg/ml durante 7 días o más después de la administración. Las micropartículas del ejemplo 4, que comprenden PEG 20,000, muestran la liberación sostenida más larga de interferón-alfa. Esto indica que la composición de la presente invención muestra las liberaciones sostenidas más preferidas de un fármaco de proteína cuando emplea PEG que tiene un peso molecular similar a, o sustancialmente igual a aquel del fármaco de proteína. Los resultados del cuadro 6 muestran que la composición produce una liberación más larga de un fármaco de proteína cuando el peso molecular del óxido de polialquilo es similar a, o mayor que aquel del fármaco de proteína, y más preferiblemente aproximadamente 1 :1.

EJEMPLO EXPERIMENTAL 4 Efectos de las cantidades de PEG en la liberación sostenida Se evalúa un efecto de las cantidades de PEG en las micropartículas en el perfil de liberación sostenida de las micropartículas. Las micropartículas de interferón-alfa de los ejemplos 6-10 se dispersan en un triglicérido de cadena media (MCT, Mygiyol 812, Sasol) a una concentración de 336 µg IFNa/ml para proporcionar dispersiones para inyección. Cada una de las dispersiones de micropartículas (0.5 ml) se inyecta subcutáneamente a ratas Sprague Dawley (macho, de 7-8 semanas de edad). Se colecta una muestra de sangre una vez al día durante una semana. Se separa el suero de las muestras de sangre y los niveles (pg/ml) de interferón-alfa se miden usando ELISA. El cuadro 7 muestra los niveles de sangre de interferón-alfa en el día 7 (C7) y las cantidades de PEG en las micropartículas al mismo tiempo de la inyección.

CUADRO 7 Como se muestra en el cuadro 7, los niveles de sangre de interferón-alfa de la rata, en el día 7, son superiores a 1 x 102pg/ml, cuando los contenidos de PEG en las micropartículas es aproximadamente 10% (p/p) o más.

EJEMPLO EXPERIMENTAL 5 Efectos de los tipos de aminoácidos Este experimento analiza los efectos de los tipos de aminoácidos contenidos en las micropartículas de la presente invención en la liberación sostenida. Las micropartículas de interferón-alfa de los ejemplos 11 -14 se dispersan en un triglicérido de cadena media (MCT, Mygiyol 812, Sasol) a una concentración de 336 µg IFNa/ml para proporcionar dispersiones para inyección. Cada una de las dispersiones de micropartícula (0.5 ml) se inyecta subcutáneamente a ratas Sprague Dawley (macho, de 7-8 semanas de edad) Se colecta una muestra de sangre una vez al día durante una semana. Se separa el suero de las muestras de sangre y los niveles (pg/ml) de interferón-alfa se miden usando ELISA. El cuadro 8 muestra niveles de sangre de interferón-alfa en el día 7 (C ).

CUADRO 8 Como se observa en el cuadro 8, las ratas administradas con la dispersión de micropartículas que comprenden histidina, ácido aspártico o metionina mantienen su nivel de sangre de interferón-alfa arriba de 1 x 102 pg/ml, en los días 1 -7. Los niveles de sangre de la rata inyectada con la dispersión de microparticulas que comprenden treonina son aproximadamente 13 pg/ml de interferon-alfa en el día 7 La treonina es altamente soluble en agua Se especula que las microparticulas que contienen treonina absorben rápidamente fluidos corporales en el cuerpo del sujeto y la liberación de un interferon-alfa es mas rápida, comparada con aquellas que contienen aminoácidos hidrófobos tales como histidina, ácido aspártico o metionina EJEMPLO EXPERIMENTAL 6 Micropartículas de interferón-alfa con o sin lecitina Este experimento analiza los efectos de un excipiente (lecitina) contenido en las micropartículas de la presente invención en la liberación sostenida de inte ríe ron-alfa Las microparticulas de interferón-alfa de los ejemplos 15-19 se dispersan en un trig cépdo de cadena media (MCT, Mygiyol 812, Sasol) a una concentración de 336 µg IFNa/ml para proporcionar dispersiones para inyección Cada una de las dispersiones de micropartícula (0 5 ml) se inyecta subcutáneamente a ratas Sprague Dawley (macho, de 7-8 semanas de edad) Se colecta una muestra de sangre una vez al día durante una semana Se separa el suero de las muestras de sangre y los niveles (pg/ml) de interferon- alfa se miden usando ELISA El cuadro 9 muestra niveles de sangre de interferon-alfa en el día 7 (C7) CUADRO 9 Todas las dispersiones de los ejemplos 15-19 comprenden un aminoácido en una cantidad de 30% en peso o más en las micropartículas. Como se puede observar en el cuadro 9, todas las dispersiones analizadas liberan el interferón-alfa en una concentración más alta que 1 x 102 pg/ml en el día 7. De manera interesante, las dispersiones de los ejemplos 15 y 16, que no contienen lecitina, liberan una cantidad mayor de interferón-alfa que las dispersiones de los ejemplos 17-19, que contienen lecitina, en el día 7.

EJEMPLO EXPERIMENTAL 7 Micropartículas de eritropoyetina Se analiza la liberación sostenida de eritropoyetina de las micropartículas de la presente invención. Las micropartículas de erítropoyetína del ejemplo 20 se dispersan en un triglicérido de cadena media (MCT, Mygiyol 812, Sasol) a una concentración de 85 µg EPO/ml para proporcionar dispersiones para inyección. Cada una de las dispersiones de micropartículas (0.5 ml) se inyecta subcutáneamente a ratas Sprague Dawley (macho, de 7-8 semanas de edad). Se colecta una muestra de sangre una vez al día durante una semana. Se separa el suero de las muestras de sangre y los niveles (mlU/ml) de eritropoyetina se miden usando ELISA (Catálogo # DEPOO, R & D Systems, The ELISA guidebook, Humana Press, John R. Crowther, 2001 ). Los resultados se muestran en la figura 2. Los resultados en la figura 2 indican que las composiciones de la presente invención efectivamente producen una liberación sostenida de más de 7 días cuando se aplican a eritropoyetina.

EJEMPLO EXPERIMENTAL 8 Micropartículas de FSH Se analiza la liberación sostenida de FSH de las micropartículas de la presente invención. Las micropartículas de la hormona de estimulación de folículo (FSH) del ejemplo 21 , se dispersan en un triglicérido de cadena media (MCT, Mygiyol 812, Sasol) a una concentración de 53 µg FSH/ml para proporcionar dispersiones para inyección. Cada una de las dispersiones de micropartículas (0.5 ml) se inyecta subcutáneamente a ratas Sprague Dawley (macho, de 7-8 semanas de edad). Se colecta una muestra de sangre una vez al día durante una semana. Se separa el suero de las muestras de sangre y los niveles (mlU/ml) de FSH se miden usando ELISA (ELISA, catálogo # RE52121 , IBL, The ELISA Guidebook, Humana Press, John R. Crowther, 2001 ). Los resultados se muestran en la figura 3.

Como se puede observar en la figura 3, se detecta la FSH en las ratas en el día 7.

EJEMPLO EXPERIMENTAL 9 Micropartículas de interferón-alfa Se analizan las micropartículas de interferón-alfa para determinar su liberación sostenida de interferón-alfa al usar un mono. Las micropartículas de interferón-alfa del ejemplo 1 se dispersan en un triglicérido de cadena media (MCT, Mygiyol 812, Sasol) a una concentración de 110 µg IFNa/ l para proporcionar dispersiones para inyección. La dispersión de micropartículas (1.5 ml) se inyecta subcutáneamente a monos Cynomolgus (macho). Se colecta una muestra de sangre una vez al día durante una semana. Se separa el suero de las muestras de sangre y los niveles de sangre (pg/ml) de interferón-alfa se miden usando un ensayo CPE (Inhibición de Efecto Citopátíco) y ELISA (Sistema ELISA de IFN-alfa de alta sensibilidad (Amersham, RPN2789), The ELISA Guidebook, Humana Press, John R. Crowther, 2001 ). Los niveles de sangre de interferón-alfa en los días 5, 6 y 7 (C5, Cß y C7, respectivamente) se muestra en el cuadro 10 y la figura 6.

CUADRO 10 El CPE es un ensayo para medir la actividad de proteína. Un MDBK línea celular se asesina por medio del ataque de VSV (virus de estomatitis vesicular). Este fenómeno se llama "efecto citopático". Se inhibe el efecto citopático, es decir, la célula se protege del ataque letal del virus, cuando la célula que contiene interferón-alfa en el momento en el cual el virus ataca la célula. La actividad fisiológica de interferón-alfa se puede determinar al medir de la inhibición. Se cultivan las células MDBK en una placa de micro-valoración de 96 pozos durante 24 horas. Las soluciones diluidas de interferón-alfa en concentraciones predeterminadas se añaden a los pozos y se realiza un cultivo durante 24 horas. Se lavan los pozos con D-PBS para remover el interferón-alfa y se recibe VSV. Las células se desarrollan adicionalmente y se tiñen, seguido por una medición de su densidad óptica (OD). La farmacopea europea "solución concentrada de interferón-alfa-2" pp1812-1815, 2005, diario de virología, 37(2), pp 755-758 (1981 ). Como se muestra en el cuadro 10, la prueba ELISA muestra que el nivel de sangre de ¡nterferón-alfa se mantiene arriba de 100 mg/ml en los días 5, 6 y 7. Los resultados de CPE, que son substancialmente los mismos a aquellos de los resultados de ELISA, indican que el interferón-alfa en el cuerpo del mono mantiene su actividad fisiológica en el día 7. Los resultados muestran que la composición de la presente invención produce liberaciones sostenidas de interferón-alfa activo fisiológicamente por un periodo extendido de tiempo, por ejemplo, 7 días y más allá. Por lo tanto, la composición de liberación sostenida de interferón-alfa de acuerdo a la presente invención es adecuada para formulaciones de interferón-alfa de liberación sostenida de 7 días.

EJEMPLO EXPERIMENTAL 10 Liberación sostenida de eritropoyetina Las micropartículas de eritropoyetina del ejemplo 22 se dispersan en un triglicérido de cadena media (MCT, Mygiyol 812, Sasol) a una concentración de 336 g de EPO/ml para producir una dispersión de inyección. La dispersión se inyecta subcutáneamente (0.5 ml) a ratas Sprague Dawley (macho, de 7-8 semanas de edad). Se colecta una muestra de sangre una vez al día durante una semana. Se separa el suero de las muestras de sangre y los niveles (mlU/ml) de eritropoyetina se miden usando ELISA (Catálogo # DEP00, R & D Systems, The ELISA Guídebook, Humana Press, John R. Crowther, 2001 ). Los resultados se muestran en la figura 4. Los resultados en la figura 4 indican que las composiciones de la presente invención son adecuadas para el uso en formulaciones de liberación sostenida de eritropoyetina.

EJEMPLO EXPERIMENTAL 11 Liberación sostenida de FSH Se determina una liberación sostenida de una composición que contiene FSH, de acuerdo a la presente invención, en ratas. Las micropartículas de FSH del ejemplo 23 se dispersan en un triglicérido de cadena media (Mygiyol 812, Sasol) a una concentración de 336 µg FSH/ml para producir una dispersión de inyección. La dispersión (0.5 ml) se inyecta subcutáneamente a ratas (Rata Sprague Dawley, macho, de 7-8 semanas de edad). Se colecta una muestra de sangre una vez al día durante una semana. Se separa el suero de las muestras de sangre y los niveles (mlU/ml) de FSH se miden usando ELISA (Catálogo # RE52121 , IBL, The ELISA Guidebook, Humana Press, John R. Crowther, 2001 ). Los resultados se muestran en la figura 5. Los resultados en la figura 5 indican que las composiciones de la presente invención son adecuadas para uso en formulaciones de liberación sostenida de FSH.

Aplicabilidad industrial Aunque la presente invención se ha descrito junto con las modalidades específicas expuestas anteriormente, muchas alternativas, modificaciones y variaciones de las mismas serán aparentes para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Todas las alternativas, modificaciones y variaciones mencionadas tienen la intención de encontrarse dentro de la esencia y alcance de la presente invención.

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición de liberación sostenida que comprende un sustrato portador y un fármaco de proteína incorporados en el sustrato portador, dicho sustrato portador consistiendo esencialmente de (a) un ácido hialurónico o sus sales, (b) un óxido de polialquilo, y (c) un aminoácido, en donde una relación de un peso molecular (Da) del fármaco de proteína a un peso molecular (Da) del óxido de polialquilo es aproximadamente 1 :0.5-1 :10.

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque una cantidad total del ácido hailurónico o sus sales, el óxido de polialquilo y el aminoácido es de aproximadamente 50-99.95% en peso con base en el peso seco de la composición.

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la cantidad total del ácido hialuróníco o sus sales, el óxido de polialquilo y el aminoácido es aproximadamente 70-99.95% en peso con base en el peso seco de la composición.

4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el ácido hialurónico o sus sales tiene un peso molecular de por lo menos 1 ,000,000 Da.

5.- La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el ácido hialurónico o sus sales tiene un peso molecular de por lo menos 3,000,000 Da.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el aminoácido es un aminoácido hidrófobo. 1 - La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el aminoácido se selecciona del grupo que consiste de ácido aspártico, asparagina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, triptofano, tirosina y valina, en forma individual o sus mezclas. 8.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el óxido de polialquilo es un polietilen glicol, un polipropilen glicol, un copolímero de los mismos, o una mezcla de los mismos. 9.- La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el óxido de polialquilo es un polietilen glicol. 10.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el óxido de polialquilo tiene un peso molecular de por lo menos 1 ,000 Da. 11.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el fármaco de proteína son interferones, eritropoyetina, u hormonas de estimulación de folículo. 12.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente un estabilizador. 13.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la relación del peso molecular (Da) del fármaco de proteina al peso molecular (Da) del óxido de polialquilo es aproximadamente 1 :1. 14.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se formula en micropartículas, pellas, barras, filamentos cilindros o películas. 15.- Una formulación farmacéutica para inyección, que comprende la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 dispersada en un medio de inyección. 16.- La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque el medio de inyección se selecciona del grupo que consiste de agua destilada para inyección; reguladores de pH para inyección; y aceite de maiz, aceite de sésamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de soya, aceite de cacahuate, mono-, di- y triglicérido, aceite mineral, escualeno, y sus mezclas. 1

7.- Una formulación de aerosol que comprende la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14. 1

8.- Una composición de liberación sostenida que comprende un sustrato portador y un fármaco de proteína incorporado en el sustrato portador, dicho sustrato portador consistiendo esencialmente de (a) un ácido hialurónico o sus sales que tienen un peso molecular de por lo menos 1 ,000,000 Da, (b) un polietilen glicol, y (c) un aminoácido hidrófobo, en donde una relación de un peso molecular (Da) del fármaco de proteína a un peso molecular (Da) del polietilenglicol es de aproximadamente 1 :0.5-1 :5 y el peso molecular del polietilen glicol es de por lo menos 1 ,000 Da. 1

9.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el fármaco de proteína está contenido en una cantidad de 0.05-5% en peso con base en un peso seco de la composición. 20.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el ácido hialurónico o sus sales está contenido en una cantidad de 20-50% en peso con base en un peso seco de la composición. 21.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el óxido de polialquilo está contenido en una cantidad de 5-60% en peso con base en un peso seco de la composición. 22.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el aminoácido está contenido en una cantidad de 10-80% en peso con base en un peso seco de la composición.