MX2007008182A - Composiciones para inmunizar contra micobacteria. - Google Patents

Abstract

Un metodo para generar una respuesta inmune de celulas T en un huesped implica administrar una vacuna vectorizada que comprende un vector viral sin replicacion o de replicacion deficiente que expresa el producto de traduccion de un gen 85A de antigeno micobacteriano. Tambien se proporcionan vacunas vectorizadas y el uso de las mismas. Tambien se proporciona un metodo para inducir una respuesta de celulas T de memoria CD8 y CD4 contra un antigeno que utiliza un vector de adenovirus que expresa un antigeno o un fragmento inmunogenico del mismo.

Description

COMPOSICIONES PARA INMUNIZAR CONTRA MICOBACTERIA La presente invención se refiere a un método para generar una respuesta inmune a la célula T en un huésped. El método incluye la etapa de administrar una vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen del antígeno micobacteriano 85A (también referido en la presente como gen "Ag85A"). Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan en su totalidad mediante la referencia. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La tuberculosis es causada por el patógeno respiratorio Mycoba cteri um tuberculosis y mata a 2 millones de personas cada año, predominantemente en el mundo desarrollado (http: //www. who . mt/gtb/publications/globrepOl/index-html) . La única vacuna autorizada contra M, tuberculosis, el bacilo Calmette-Guépn (BCG) (Calmette, A., C. Guérin. (1924) Ann. Inst. Pasteur 38:371), es una cepa atenuada de Mycobacteri um. bovis, que en países en desarrollo se administra típicamente de manera intradérmica como una dosis única a infantes recién nacidos. La revisión de muchos estudios sugiere que la vacunación BCG es protectora contra tuberculosis meningeal infantil y formas sistémicas de la enfermedad. Sin embargo, su eficacia protectora es variable (variando de 0-80%) (Colditz, G.A., et al., (1994). JAMA 271:698) contra la enfermedad pulmonar en adultos, la principal causa mundial de mortalidad por tuberculosis, y disminuye con el tiempo (Sterne J.A., et al., (1998) Int. J. Tuberc. Lung Dis., 2:200). La base de la variabilidad es incierta. No obstante, el 80% de los infantes en todo el mundo reciben la BCG cada año (http://www.who.int/inf-fs/en/factl04.html). El Mycobacteri um tuberculosis es un patógeno intracelular, cuya eficacia protectora contra el cual se asocia con el mantenimiento de una fuerte respuesta a la infección mediada por células que involucran células T, tanto CD4+ como CD8+ y la capacidad para responder con citocinas tipo Thl, particularmente IFN-? (FIynn, J.L., J. Chan., (2001) Annu. Rev. Immunol . , 19:93). La vacunación BCG induce células T secretoras de IFN-?, predominantemente del fenotipo de célula T CD4+, que reaccionan de manera cruzada con proteínas M. tuberculosis (Launois P. et al., (1994) Infection and Immunity 62 ( 9) : 3679-87 ) . Estudios recientes sugieren que la BCG suministrada parenteralmente puede fallar para inducir respuestas inmunes de la célula T en la mucosa pulmonar, lo cual puede ser crítico para la protección contra enfermedad pulmonar. En consecuencia, existe la necesidad de desarrollar vacunas adicionales contra la enfermedad micobacteriana.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN De manera sorprendente, se ha encontrado que los vectores virales que expresan el antígeno micobacteriano 85A (Ag85A) pueden inducir una respuesta inmune por células T en un paciente humano al administrarse como una composición inmunogénica. En consecuencia, la invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune por células T contra un antígeno micobacteriano en un paciente humano, que comprende la etapa de administrar una composición inmunogénica que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano, en el paciente. Preferentemente, la composición inmunogénica es una vacuna vectorizada. Este nuevo procedimiento de vacunación mejora significativamente la magnitud y duración de la respuesta inmune por célula T. Preferentemente, la respuesta de las células T es una respuesta de células T de memoria. El antígeno 85A (Ag85A) (Nos. de acceso CAA17868 y BX842584) es un miembro del complejo Ag 85. Esta es una familia de proteínas que comprende Ags 85A, 85B y 85C secretadas por M. tuberculosis, BCG, y muchas otras especies de micobacterias (Harth, G. et al., (1996) Infect. Immun. 64:3038-3047). El antígeno 85A (Ag85A) es altamente conservado entre todas las especies micobacterianas y es imnunodominante en estudios en animales y humanos. El Ag 85A (Ag85A) se codifica por el gen fbpA. El antígeno 85A (Ag85A) de Mycojacte iuffl tuberculosis se encuentra listado en las SEQ ID NOs 1 y 2 en la presente. Las estrategias recientes para inducir respuestas mejoradas de célula T en la investigación de vacunas de tuberculosis, han explotado la tecnología de ADN recombinante, utilizando vectores de plásmido, bacterianos o virales y proteínas recombinantes para expresar antígenos de M. tuberculosis . La vacunación de ratones con ADN de Ag85A reforzada con un vector MVA que expresa Ag85A, ha mostrado producir un grado de protección equivalente a la BCG después del reto con M. tuberculosis (McShane, H. et al., (2002) Infect. Immun. 70:1623-1626). Sin embargo, fueron débiles las respuestas inmunes generadas por inmunización única o repetida con el vector MVA recombinante solo. Para la protección a largo plazo contra una enfermedad micobacteriana tal como tuberculosis, se considera importante mantener las "células T de memoria", que pueden continuar estimulando la inmunidad protectora por décadas. Las respuestas inmunes de memoria se atribuyen clásicamente a la reactivación de linfocitos T longevos específicos de antígeno que surgen directamente de células T efectoras diferenciadas y persisten en un estado uniformemente quiescente. Se considera que las células T efectoras y de memoria se distribuyen a todos los tejidos en el cuerpo, particularmente a superficies epitelilales (tales como la piel y el intestino) en donde es probable el reencuentro de patógenos. Las células T de memoria han demostrado ser heterogéneas y comprender al menos dos subconjuntos dotados con diferente capacidad migratoria y función efectora (Reinhardt, R.L., et al., (2001) Nature 410, 101-105). Las células del primer subconjunto se asemejan a las células efectoras generadas en la respuesta primaria, en que carecen de los receptores de alojamiento de nodulos linfáticos L-selectina y CCR7 y en que expresan los receptores para la migración hacia tejidos inflamados. Al reencuentro con el antígeno, estas "células T de memoria efectora" (TEM) pueden producir rápidamente IFN-? o IL-4 o liberar perforina pre-almacenada. Las células del segundo subconjunto expresan L-selectina y CCR7 y carecen de la función efectora inmediata. Estas "células T de memoria central" (TCM) tienen un bajo umbral de activación y, al reestimularse en órganos linfoides secundarios, proliferan y se diferencian a efectoras (Iezzi, G. et al., (2001) J. Exp. Med. 193, 987-994). Los presentes inventores han encontrado que un vector viral deficiente de replicación Ag85A (Ag85A) (en este caso ejemplificado con "MVA85A") puede inducir altos niveles de células T de memoria específicas de antígeno que secretan interferón-?, células T tanto de memoria efectora como de memoria central, al utilizarse solas en voluntarios sanos na?ve a BCG. Se han establecido nuevos análisis inmunológicos para medir y cuantificar las respuestas de la célula T en los últimos 10 años. Los presentes inventores utilizaron el análisis ELISPOT de interferón-gamma (IFN-?) como la principal lectura inmunológica para pruebas clínicas con MVA85A, debido a que la secreción del IFN-? a partir de células T específicas de antígeno es la mejor correlación disponible de protección contra M. tuberculosis . Además, el análisis ELISPOT es un método muy reproducible y sensible para cuantificar el número de células T específicas de antígeno que secretan IFN-?. Los presentes inventores utilizaron dos análisis ELISPOT: el análisis ELISPOT ex vivo (fresco), en donde se incuban células mononucleares de sangre periférica (PBMC) durante 18 horas con antígeno para determinar los niveles de células T efectoras circulantes CCR7, y el análisis ELISPOT cultivado, en donde se incuban PBMC con antígeno durante 10-14 días para medir los niveles de células T de memoria central CCR7+ (Godkin et al., Jl, 2002). Los inventores de la presente han encontrado que la vacunación con MVA85A induce una fuerte respuesta de células T de memoria central específica para el antígeno 85A (Ag85A) que es detectable aún 3 semanas después de la vacunación, cuando la respuesta de la célula T efectora circulante es casi indetectable . Esta es la primera demostración de que puede aumentarse significativamente la población de células T de memoria central a largo plazo en un paciente mediante la administración de una composición inmunogénica que expresa un antígeno micobacteriano. Como se utiliza en la presente, el término "célula T de memoria" pretende incluir ambas subpoblaciones de células T, CCR7- (células T de memoria efectora) y CCR7+ (células T de memoria central) . Esta definición incluye también tanto células T de memoria CD4 restringidas a la clase II como células T de memoria CD8 restringidas a la clase I. Preferentemente, las células T de memoria inducidas por las vacunas vectorizadas de la invención se caracterizan por la expresión de superficie celular de CCR7+. Estas se refieren en la presente como células T de memoria central. Preferentemente, la respuesta a la célula T de memoria inducida por las composiciones inmunogénicas de la invención es una respuesta protectora de la célula T. la respuesta inmune protectora puede medirse mediante el inmunoanálisis de la secreción de IFN-?, preferentemente a partir de células T específicas de antígeno. Preferentemente, la respuesta de la célula T de memoria es de larga duración y persiste durante al menos 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25 o más años. De mayor preferencia, la respuesta inmune protectora es de por vida. Preferentemente, el gen Ag85A se expresa en un vector viral. Preferentemente, el gen Ag85A se expresa en un vector viral deficiente no replicante o de replicación. El término "vacunas vectorizadas" es muy conocido en la técnica. el vector utilizado en el método de acuerdo con la invención es un vector viral deficiente no replicante o de replicación. El término "no replicante" o "de replicación deteriorada" como se utiliza en la presente, significa no capaz de replicación en cualquier grado significativo en la mayoría de las células humanas normales. Los virus que son no replicantes o de replicación deteriorada pueden haberse hecho así naturalmente (i.e., pueden ser aislados como tales naturalmente) o artificialmente, e.g., mediante cultivo in vitro o mediante manipulación genética, por ejemplo por supresión de un gen critico para la replicación. Generalmente, existirá uno o algunos tipos celulares en los cuales pueden cultivarse los virus, tales como células CEF para el virus Ankara modificado (MVA) . En general, el vector viral debe ser capaz de estimular una respuesta de la célula T. Ejemplos de vectores virales útiles en este contexto son los vectores de virus de vacunas tales como MVA y NYVAC. Un vector viral preferido es la cepa MVA de vacuna o una cepa derivada de MVA. Alternativas a vectores de vacunas incluyen otros vectores del virus de viruela incluyendo vectores de viruela aviar tales como vectores de viruela de aves de corral o de canario. Es particularmente adecuado como un vector de viruela aviar una cepa de viruela de canario conocida como ALVAC (comercialmente disponible como Kanapox) , y cepas derivadas de ALVAC, y también una cepa de viruela de aves de corral conocida como FP9. Alternativas adicionales son los vectores alfavirus, vectores adenovirales, vectores de herpes viral, vectores flavivirus, vectores retrovirales y vectores de influenza viral. Por ejemplo, el vector puede ser un vector de adenovirus no humano. Se ha descubierto de manera sorprendente que el uso de un vector de adenovirus induce una respuesta muy fuerte de células T de memoria CD8 además de una respuesta muy fuerte de célula T de memoria CD4. Es probable que la inducción de una respuesta de células T de memoria tanto CD8 como CD4 mediante la misma vacuna sea benéfica tanto en la profilaxis como en el tratamiento de una enfermedad micobacteriana. Por consiguiente, también se encuentra, incluido dentro del alcance de esta invención un método para inducir una respuesta de células T de memoria CDd y CD4 contra un antigeno, utilizando un vector de adenovirus que expresa el antigeno o un fragmento inmunogénico del mismo. El antigeno expresado por el vector de adenovirus es preferentemente un antigeno micobacteriano como se describió anteriormente, más preferentemente Ag85A, pero alternativamente puede ser cualquier otro antígeno adecuado. También se encuentra dentro del alcance de la invención el uso de un vector de adenovirus que expresa un antígeno o un fragmento inmunogénico del mismo en la elaboración de un medicamento para inducir una respuesta de célula T de memoria CD8 y CD4 contra el antígeno. Preferentemente, la invención proporciona el uso de un vector de adenovirus que expresa un antígeno micobacteriano o un fragmento inmunogénico del mismo en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad micobacteriana. El antígeno es preferentemente un antígeno micobacteriano como se describió anteriormente, más preferentemente Ag85A, pero alternativamente puede ser cualquier otro antígeno adecuado. Se prefiere que el vector viral sea incapaz de ocasionar una infección seria en el paciente humano. La replicación de un virus se mide generalmente de dos maneras: 1) síntesis de ADN y 2) titulación viral. Más precisamente, el término "no replicante o de replicación deteriorada" como se utiliza en la presente y como se aplica a virus de viruela, significa virus que satisfacen cualquiera o ambos de los siguientes criterios: 1) exhibir una reducción de 1 log (10 veces) en la síntesis de ADN en comparación con la cepa de Copenhague del virus de vacuna en células MRC-5 (una línea celular humana) ; 2) exhibir una reducción de 2 log en la titulación viral en células HELA (una línea celular humana) en comparación con la vacuna de Copenhague del virus de vacuna . Ejemplos de virus de viruela que recaen dentro de esta definición son virus MVA, NYVAC y viruela aviar, aunque un virus que recae fuera de esta definición es la cepa atenuada de vacuna M7. La invención proporciona también el uso de una composición inmunogénica que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedad micobacteriana en un paciente humano. Preferentemente, la composición inmunogénica es una vacuna vectorizada. La composición inmunogénica y la vacuna vectorizada actúan induciendo una respuesta inmune de la célula T en el paciente. Las vacunas, de acuerdo con la invención pueden ser ya sea profilácticas (i.e., para prevenir la infección), post-exposición (i.e., para tratamiento después de la infección pero antes de la enfermedad) o terapéuticas (i.e., para el tratamiento de la enfermedad) pero típicamente serán profilácticas o post-exposición. Las enfermedades micobacterianas que pueden tratarse o prevenirse mediante la vacuna vectorizada de la presente invención incluyen: tuberculosis, lepra, infección por Mycobacterium avium, infección micobacteriana no tuberculosis, úlcera Buruli, infección o enfermedad por Mycobacterium Bovis, infección o enfermedad relacionada con Mycobacterium paratuberculosis . Otras enfermedades (i.e., enfermedades no micobacterianas) incluyen enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, enfermedad autoinmune, cáncer, cáncer de vejiga, viruela y viruela símica . Pueden utilizarse construcciones de vector viral especializadas para facilitar la preparación y utilidad de la vacuna vectorizada. Todas las construcciones de vector descritas en la presente forman los aspectos de la invención. Las vacunas vectorizadas que comprenden estas construcciones virales también se encuentran abarcadas como aspectos de la invención. Por ejemplo, uno o más genes de antígeno pueden truncarse en la C-terminal o en la N-terminal del gen. Esto puede tener el efecto de facilitar la clonación y la construcción de la vacuna vectorizada y alternativa o adicionalmente, puede conducir a una eficacia incrementada.

Los métodos para truncado serán conocidos por los expertos en la técnica. El modo más simple para efectuar los truncados de este tipo es el uso de varias técnicas muy conocidas de la ingeniería genética para suprimir selectivamente la secuencia de ácido nucleico de codificación en cualquier extremo del gen antígeno, y después insertar la secuencia de codificación deseada en el vector viral. Por ejemplo, los truncados de la proteína candidato se crean utilizando estrategias de 3' y/o 5' exonucleasa selectivamente para erosionar los extremo 3' y/o 5' del ácido nucleico de codificación, respectivamente. Preferentemente, la secuencia del gen de tipo silvestre se trunca de tal manera que el antígeno expresado se trunca por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos en relación con el antígeno de origen. Más preferentemente, el gen antígeno Ag85A que se encuentra truncado por 15 aminoácidos en la C-terminal en relación al antigeno Ag85A de tipo silvestre (SEQ ID NO: 3, el producto de expresión de la SEQ ID NO: 4). Los antígenos adecuados para su uso en la invención también incluyen fragmentos del antígeno de origen, siempre que esos fragmentos tengan una determinante o epítope antigénico en común con, o sean inmunológicamente identificables con el antígeno de origen. Los polinucleótidos que codifican para estos fragmentos son también adecuados para su uso en las composiciones inmunogénicas y vacunas vectorizadas de la invención. Como se utiliza en la presente, el término "fragmento" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que es la misma, como parte de, pero no toda, la secuencia de aminoácidos del antígeno de origen del cual se deriva o uno de sus equivalentes funcionales. Los fragmentos deben comprender al menos n aminoácidos consecutivos de la secuencia y, dependiendo de la secuencia particular, n es preferentemente 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o más). Pequeños fragmentos pueden formar una determinante antigénica. Los genes de antígeno de la invención también pueden codificar las variantes de los equivalentes funcionales del antígeno de origen. Tal molécula de ácido nucleico puede ser una variante de origen natural tal como una variante alélica de origen natural, o la molécula puede ser una variante conocida por presentarse naturalmente. Tales variantes no de origen natural de la molécula de ácido nucleico pueden producirse mediante técnicas de mutagénesis, incluyendo aquellas que se aplican a moléculas de ácido nucleico, células u organismos. Entre las variantes a este respecto se encuentran las variantes que difieren de las secuencias de gen antígeno antes mencionadas por sustituciones, supresiones o inserciones de nucleótido. Las sustituciones, supresiones o inserciones pueden implicar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden alterarse en regiones de codificación o no codificación o en ambas. Las alteraciones en las regiones de codificación pueden producir sustituciones, supresiones o inserciones conservadoras de aminoácidos. Alternativamente o adicionalmente al uso de un truncado de gen, el gen que codifica para el antígeno puede comprender un ácido nucleico que codifica para un polipéptido marca de manera que este se encuentre covalentemente enlazado al antígeno a la traducción. Preferentemente, el polipéptido marca se selecciona del grupo que consiste de una marca PK, una marca FLAG, una marca MYC, una marca polihistidina o cualquier marca que pueda detectarse por un anticuerpo monoclonal. Otros ejemplos serán claros para la persona experta en la técnica. Si se utiliza, la marca PK tiene preferentemente la secuencia Pro-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Asp. Una marca de este tipo puede facilitar la detección de la expresión de antígeno, y clones que expresan el antígeno, y alternativamente o adicionalmente, puede conducir al incremento en la eficacia. El ácido nucleico que codifica para el polipéptido marca puede colocarse de tal manera que, después de traducción, la marca se encuentre ubicada en la C terminal o en la N terminal del antigeno expresado o pueda encontrarse interna al antigeno expresado. Preferentemente, la marca se ubica en la C terminal del antigeno expresado. Los nucleótidos que codifican para una secuencia de enlace pueden insertarse entre el ácido nucleico que codifica para el polipéptido marca y el ácido nucleico que codifica para el antigeno expresado. Preferentemente, la secuencia de enlace, al expresarse, comprende los aminoácidos Gly-Ser-Ile. Más preferentemente, los aminoácidos Gly-Ser-Ile se encuentran insertados entre la secuencia de antigeno de N terminal y la marca del antigeno expresado. Más preferentemente, el antigeno expresado es Ag85a (Ag85A) y una marca PK se encuentra ubicada en la C terminal del gen Ag85a (Ag85A) . Un gen que codifica para un antigeno también puede incluir una secuencia guia. La secuencia guia puede afectar el procesamiento de la transcripción primaria a ARNm, la estabilidad o la eficiencia de traducción del ARNm. Preferentemente, la secuencia guía mejora la expresión y/o la inmunogenicidad del antígeno. La inmunogenicidad aumentada puede determinarse a través de, e.g., análisis ELISPOT cultivados y ex vivo. El aumento en el nivel de expresión puede determinarse, e.g., utilizando un anticuerpo monoclonal para detectar la cantidad de proteína producida. Preferentemente, la expresión y/o la inmunogenicidad aumentan por 2 veces, 3 veces o más en comparación con el antígeno expresado sin la secuencia guía. Un ejemplo de una secuencia guía adecuada es t-PA (activador de plasminógeno en tejido) (Malin A.S. et al., (2000) Microbes Infect., 2000 Nov. 2 (14) :1677-85) . Preferentemente, la construcción del vector viral comprende una secuencia truncada en la C terminal de Ag85A fusionada a una secuencia guía TPA. Aún en una modalidad preferida, el vector viral de la invención expresa una secuencia truncada en la C terminal de Ag85A fusionada a una secuencia guía TPA y a una secuencia de marca PK. Preferentemente, la secuencia guía se fusiona a la N terminal del antígeno y la secuencia de marca se fusiona ya sea internamente o a la C terminal de la proteína. En una modalidad especialmente preferida, la construcción del vector viral comprende un polinucleótido que codifica para Ag85a (Ag85A) truncado en la C terminal por 15 aminoácidos fusionados a una secuencia TPA y con una marca PK de la C terminal de la secuencia Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp en donde los residuos de aminoácido Gly-Ser-Ile se encuentran presentes entre la secuencia Ag85A y la marca PK (SEQ ID NO: 5) . Preferentemente, el producto de expresión del vector viral tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. Se ha descubierto que el efecto protector de la célula T notado por los inventores es particularmente potente en pacientes humanos que se han expuesto previamente a un antígeno micobacteriano. Las estrategias de inmunización heteróloga de primer refuerzo inducen más altos niveles de respuestas de célula T efectora en animales y humanos que el refuerzo homólogo con la misma vacuna (Schneider J. et al., (1998) Nat. Med. 4, 397-402. McShane, H. et al., (2001) Infect. Immun. 69, 681-686). El mecanismo que subyace en la pérdida gradual de efectividad de BCG a medida que el individuo (neonatalmente inoculado) alcanza los 10 a 15 años de edad es poco comprendido. Una presunción posible es que la inmunidad generada por BCG ha desaparecido y el individuo se convierte en un equivalente a un huésped naíve que puede vacunarse con una nueva vacuna candidato diseñada para inducir una inmunidad primaria. Aunque la vacunación repetida con BCG no parece mejorar adicionalmente la protección contra TB (ref. Rodríguez L. et al., Lancet 2005), la incorporación de BCG en un régimen de primer refuerzo heterólogo retiene los efectos protectores de BCG. La inmunogenicidad y la eficacia protectora del refuerzo de BCG con vectores virales que expresan el antígenos 85A (Ag85A) en diversos modelos animales se ha documentado previamente (Goonetilleke, N.P. et al., (2003) J. Immunol. 171, 1602-1609; Williams A. et al., Infection and Immunity (73 ( 6) : 3814-6) , pero la inducción de una respuesta protectora de la célula T de memoria no se documentó . En consecuencia, la invención proporciona también un método para elevar la respuesta inmune de la célula T en un paciente humano, que comprende la etapa de administración de al menos un antígeno micobacteriano a un paciente en combinación con una vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen 85a micobacteriano (Ag85A) . Preferentemente, la respuesta inmune de la célula T es una respuesta inmune de célula T de memoria . La invención proporciona también el uso de: (a) al menos un antígeno micobacteriano; y (b) una vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen 85a micobacteriano (Ag85A) , en la elaboración de un medicamento para la administración a un paciente, para inducir una respuesta inmune de la célula T. La vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen 85a micobacteriano (Ag85A) y el (los) antígeno (s) micobacteriano (es) puede administrarse simultáneamente, secuencialmente o por separado. Por ejemplo, el (los) antígeno (s) micobacteriano (es) puede (n) administrarse para preparar al paciente antes o después de la administración de la vacuna vectorizada para reforzar la respuesta inmune del paciente a la vacuna vectorizada. Además, la invención proporciona también un método para inducir una respuesta inmune de la célula T en un paciente humano que comprende la etapa de administrar una composición inmunogénica que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano al paciente humano, en donde el paciente se ha expuesto previamente a al menos un antigeno micobacteriano. Preferentemente, la respuesta inmune de la célula T es una respuesta inmune de célula T de memoria. La invención proporciona también el uso de una composición inmunogénica que comprende una vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen 85a micobacteriano (Ag85A) , en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad micobacteriana en un paciente humano que se ha expuesto previamente a un antígeno micobacteriano. El antígeno micobacteriano puede ser de M. tuberculosis y/o puede ser de uno o más de otras micobacterias tales como M. avium-intracellulare, M. kansasii, M. marinum y/o M. ulcerans. Cuando el paciente se ha expuesto previamente a solo un antígeno, el antígeno puede ser un antígeno que confiere una respuesta inmune protectora contra la infección micobacteriana. En una modalidad de la invención, el antígeno al cual se ha expuesto previamente el paciente no es Ag85A. Alternativamente o adicionalmente, el paciente puede haberse expuesto previamente a una o más micobacterias por sí mismo. Por ejemplo, la exposición previa de un paciente a al menos un antígeno micobacteriano puede comprender exposición previa a M. tuberculosis .

Alternativamente o adicionalmente, la exposición previa de un paciente a al menos un antígeno micobacteriano puede comprender la exposición previa a micobacterias ambientales tales como M. avium-intracellulare, M. kansasii, M. marinum y/o M. ulcerans . Preferentemente, el paciente se encuentra infectado de manera latente con las micobacterias. Por ejemplo, el paciente puede haberse expuesto previamente a M. tuberculosis y encontrarse latentemente infectado con tuberculosis. Cuando el medicamento es para el tratamiento de un paciente que se encuentra latentemente infectado con la micobacteria, el tratamiento erradica preferentemente la infección micobacteriana. Alternativamente o adicionalmente, la exposición previa puede comprender vacunación neonatal o previa con BCG. Los presentes inventores han descubierto que, en voluntarios que se habían vacunado previamente con BCG y que recibieron entonces una dosis de refuerzo de la vacuna vectorizada de la presente invención, se indujeron niveles sustancialmente más altos de células T que secretan interferón-? específico de antígeno, y a las 24 horas posteriores a la vacunación estos niveles fueron de 5-30 veces mayores que en vacunados administrados con una sola vacunación de BCG. En consecuencia, este aspecto de la invención proporciona un método para la inducción de una respuesta inmune de célula T en un paciente humano, que comprende las etapas de exponer al paciente a al menos un antígeno micobacteriano, y reforzar la respuesta inmune administrando una composición de refuerzo que comprende una composición inmunogénica que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen 85a micobacteriano (Ag85A) . Este aspecto de la invención se refiere también a un método para generar una respuesta inmune de la célula T en un paciente humano, que comprende las etapas de: i) exponer al paciente a al menos un antígeno micobacteriano; ii) administrar a dicho paciente al menos una dosis de una composición de refuerzo que comprende una vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen 85a micobacteriano (Ag85A) . En una modalidad de la invención, cuando el paciente se expone solo a un antígeno micobacteriano en la etapa i) , el antígeno es un antígeno que confiere una respuesta inmune protectora, pero no es Ag85A. La etapa i) puede llevarse a cabo en el paciente a cualquier edad, por ejemplo, neonatal, durante la infancia, durante la adolescencia o durante la madurez. Preferentemente, el paciente se expone neonatalmente a el al menos un antígeno micobacteriano. La administración de la composición inmunogénica puede presentarse al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más semanas o 0.25, 0.5, 0.75, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 o más años después de la exposición previa a el al menos un antígeno micobacteriano. Preferentemente, cuando la etapa i) se lleva a cabo en la infancia del paciente, la etapa ii) se lleva a cabo durante la infancia o la adolescencia. Cuando la etapa ii) comprende la administración de más de una dosis de una composición de refuerzo al paciente, las más de una dosis pueden administrarse durante un corto período de tiempo o durante un largo período de tiempo. Por ejemplo, las dosis de la composición de refuerzo pueden administrarse durante un período de horas, días, semanas, meses o años. Por ejemplo, la segunda dosis de refuerzo puede administrarse entre 0.5 y 24 horas después de la primera dosis de refuerzo, entre 1 día y 7 días después de la primera dosis de refuerzo, entre 1 semana y 1 mes después de la primera dosis de refuerzo, entre 1 mes y 6 meses después de la primera dosis de refuerzo, entre 6 meses y 1 año después de la primera dosis de refuerzo, o entre 1 a 2, 2 a 5, 6 a 10, o más de 10 años después de la primera dosis de refuerzo. Estos intervalos de tiempo se aplican también preferentemente mutatis mutandis al período entre cualquier dosis subsecuente. En un segundo aspecto de la invención, además de la respuesta inmune inducida contra el antígeno 85a (Ag85A) , el vector viral estimula una respuesta a la célula T específica al vector. De acuerdo con este aspecto de la invención, la administración de la vacuna vectorizada de la invención promueve una respuesta inmune de la célula T contra el virus del cual se deriva el vector viral. Por ejemplo, el uso de un vector MVA en la vacuna vectorizada de la invención promueve una respuesta inmune de la célula T contra el virus de vacuna. Preferentemente, esta respuesta de la célula T es una respuesta protectora de la célula T. No se ha reportado previamente un efecto de este tipo y es claramente ventajoso en que la vacuna vectorizada tiene un doble papel; primeramente en la protección contra enfermedades micobacterianas y segundo en la protección contra una enfermedad mediada por virus relacionados con el vector. En el caso del vector MVA, tal enfermedad es viruela. Las enfermedades viralmente derivadas que pueden tratarse o prevenirse mediante la vacuna vectorizada de la presente invención serán claras para los expertos en la técnica; los ejemplos incluyen viruela, viruela símica e infección diseminada por vacuna. En consecuencia, este aspecto de la invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune de la célula T contra un antígeno micobacteriano y un virus en un paciente humano, que comprende la etapa de administrar una composición inmunogénica que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano al paciente humano. Preferentemente, la respuesta inmune de la célula T es una respuesta de la célula T de memoria. Este aspecto de la invención proporciona también el uso de una composición inmunogénica de un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano en la elaboración de un medicamento para la inducción de una respuesta inmune de la célula T contra un antígeno micobacteriano y un virus en un paciente humano. Las vacunas de la invención suministran una cantidad inmunológicamente efectiva de al menos un antígeno a un paciente. Por "cantidad inmunológicamente efectiva", se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, es efectiva para tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y la condición física del individuo que va a tratarse, la edad, la capacidad del sistema inmune del individuo, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica del doctor que lo trata y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad recaiga en un rango relativamente amplio que pueda determinarse a través de pruebas de rutina. En un tercer aspecto de la invención, el vector viral puede expresar además el producto de traducción de uno o más genes de antígeno adicionales que pueden utilizarse para inducir una respuesta inmune específica de antígeno contra tales antígenos adicionales. La respuesta inmune puede ser una respuesta de CD8+. CD4+ y/o anticuerpo. Preferentemente, los uno o más genes de antígeno adicionales se derivan de M. tuberculosis, Plasmodium sp, virus de influenza, VIH, virus de hepatitis C, citomegalovirus, virus de papiloma humano, malaria, parásitos de leishmania o, preferentemente cualquier micobacteria spp. Preferentemente, los uno o más genes de antígeno adicionales codifican para un antígeno seleccionado del grupo que consiste de: un antígeno de la familia del antígeno 85 de cualquier micobacteria o cualquier antígeno expresado por la micobacteria spp; más preferentemente uno o más antígenos de latencia tales como el antígeno de 16 kDa de hemaglutinina de unión heparina (HBHA) o ESAT6 o la proteína de fusión conocida como 72F. También se contempla que el antígeno adicional puede derivarse de manera endógena de tal manera que la respuesta inmune inducida se dirija contra un tumor. Los antígenos derivados de manera endógena que son adecuados para su uso con la presente invención son: proteínas humanas de choque térmico y antígenos asociados al tumor tales como CEA, PSA, Muc-1, Her2meu. El vector viral puede diseñarse para expresar el gen Ag85A y los uno o más genes de antígeno adicionales como una cadena de epítopes. Ventajosamente, los epítopes en una cadena de epítopes múltiple se encuentran enlazados entre sí sin secuencias de intervención a fin de evitar material innecesario de ácido nucleico y/o de aminoácido. La creación de una cadena de epítopes puede lograrse preferentemente utilizando una construcción de ADN recombinante que codifica para la secuencia de aminoácidos de la cadena de epítopes, con el ADN codificando para el Ag85A en el mismo marco de lectura que el ADN que codifica para el (los) antígeno (s) adicional (es) . Alternativamente, el Ag85A y el (los) antígeno (s) adicional (es) pueden expresarse como polipéptidos separados. Este aspecto de la invención también proporciona el uso de una vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano y el producto de traducción de al menos un antígeno adicional o gen de epítope en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención tanto de una enfermedad micobacteriana como de al menos una enfermedad adicional en un paciente humano induciendo una respuesta de la célula T en el paciente. De acuerdo con este aspecto de la invención, la vacuna vectorizada puede utilizarse para protección tanto contra la enfermedad micobacteriana como contra una o más enfermedades seleccionadas del grupo que consiste de VIH, malaria, y viruela al inducir una respuesta inmune de la célula T en un paciente humano, preferentemente una respuesta inmune de la célula T de memoria. Aunque la vacuna vectorizada de la presente invención puede utilizarse en el aislamiento, también puede combinarse con otros regímenes de vacunación o terapéuticos para el tratamiento o prevención de una enfermedad adicional. En consecuencia, además de proporcionar las vacunas vectorizadas descritas anteriormente, la invención proporciona una composición que comprende una vacuna vectorizada de la invención y uno o más antígenos o epítopes adicionales derivados de un agente que ocasiona la enfermedad. Los antígenos y epítopes adecuados para su uso en las composiciones de la invención pueden ser de origen bacterial o viral. Los antígenos adecuados pueden clasificarse adicionalmente como antígenos de proteína, antígenos de carbohidrato o antígenos de glicoconjugado . Las composiciones de la invención pueden incluir uno o más antígenos o epítopes adicionales. Los ejemplos son: un antígeno o epítope micobacteriano diferente, un antígeno o epítope de VIH. un antígeno o epítope de plasmodium. un antígeno o epítope de malaria. un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae. un antígeno de proteína de S. pneumoniae (e.g., de PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 y Spl33) . un antígeno o epítope de virus de hepatitis A, tal como un virus inactivado. un antígeno o epítope de virus de hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o de núcleo. un antígeno o epítope del virus de hepatitis C. un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae tipo b. antígeno (s) o epítopes de polio tales como IPV. vacuna de difteria o sus epítopes o antígenos o toxoides constituyentes. Vacuna del tétanos o sus epítopes o antígenos o toxoides constituyentes. antígenos o epítopes de sarampión, paperas y/o rubéola . antígeno (s) o epítopes de influenza tales como las proteínas de superficie de hemaglutinina y/o neuraminidasa. El antígeno de gripe puede seleccionarse de una cepa pandémica, e.g., de gripe aviar, e.g., cepa H5N1. un antígeno o epítope de Staphylococcus aureus. un antígeno o epítope de cáncer. Cuando se utiliza un antígeno sacárido, preferentemente se conjuga a un vehículo a fin de mejorar la inmunogenicidad. Los antígenos de proteína tóxica pueden destoxificarse si es necesario, e.g., mediante medios químicos y/o genéticos. Los antígenos sacáridos se encuentran preferentemente en forma de conjugados. Las proteínas vehículo preferidas para conjugados son toxinas bacterianas o toxoides, tales como toxoide de difteria o toxoide de tétanos. El mutante CRM197 de la toxina de difteria es un vehículo particularmente preferido, como lo es en toxoide de difteria. Otras proteínas vehículo adecuadas incluyen la proteína N. meningitidis de membrana externa, péptidos sintéticos, proteínas de choque térmico, proteínas de tosferina, citocinas, linfosinas, hormonas, factores de crecimiento, proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopes humanos de célula T CD4+ de varios antígenos derivados de patógeno tales como la proteína N19, proteína D de H. influenzae, proteína de superficie de pneumococo PspA, pneumolisina, proteínas de absorción de hierro, toxina A o B de C. difficile, etc. Típicamente se encontrarán presentes antígenos adicionales en la composición en una concentración de al menos 1 ug/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para emitir una respuesta inmune contra el antígeno. Como una alternativa al uso de antígenos de proteína adicionales en la mezcla, puede utilizarse el ácido nucleico que codifica para el antígeno. Los componentes proteínicos de la mezcla pueden reemplazarse por tanto, por el ácido nucleico (preferentemente ADN, e.g., en forma de un plásmido) que codifica para la proteína. De manera similar, las composiciones de la invención pueden comprender proteínas que imitan antígenos sacárido, e.g., mimotopos o anticuerpos anti-idiotipo . Además, la invención proporciona también una composición que comprende una vacuna vectorizada de la invención y uno o más compuestos antimicrobianos. Ejemplos de antimicrobianos adecuados para su uso en la composición de la invención, son los quimioterapéuticos antituberculosis tales como rifampicina, isoniazida, etambutol, pirizinamida, etc. En consecuencia, la invención proporciona un método para elevar la respuesta inmune de la célula T contra al menos un antígeno en un paciente humano, que comprende la etapa de administrar al paciente de una vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano (Ag85A) , en combinación con al menos un antígeno y/o antimicrobiano adicional. Esta invención también proporciona el uso de: (a) una vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano (Ag85A) ; y (b) al menos un antígeno y/o microbial adicional, en la elaboración de un medicamento para administración a un paciente humano para inducir una respuesta inmune de la célula T. La vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano) (Ag85A) y el (los) antígeno (s) y/o antimicrobial (es) adicional (es) pueden administrarse de manera simultánea, secuencial o por separado. Por ejemplo, la vacuna vectorizada puede administrarse para preparar al paciente antes de la administración de el (los) antígeno (s) /antimicrobial (es) o después de la administración de el (los) antígeno (s) para reforzar la respuesta inmune del paciente a ese antígeno. La vacuna vectorizada y el (los) antígeno (s) /antimicrobial (es) se administran preferentemente en mezcla. La invención proporciona también el uso de al menos un antígeno y/o antimicrobiano en la elaboración de un medicamento para inducir una respuesta inmune de la célula T en un paciente, en donde el medicamento se administra con una vacuna vetorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano (Ag85A) . De manera similar, la invención proporciona el uso de una vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano (Ag85A) en la elaboración de un medicamento para inducir una respuesta inmune de la célula T en un paciente, en donde el medicamento se administra con al menos un antígeno y/o antimicrobiano adicional . La invención también proporciona el uso de al menos un antígeno y/o antimicrobiano en la elaboración de un medicamento para inducir una respuesta inmune de la célula T en un paciente, en donde el paciente se ha tratado previamente con una vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano. La invención también proporciona el uso de una vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano en la elaboración de un medicamento para inducir una respuesta inmune de la célula T en un paciente, en donde el paciente se ha tratado previamente con al menos un antígeno y/o antimicrobial . La presente invención puede utilizarse para inducir o aumentar una variedad de respuestas inmunes, como se describió anteriormente. En particular, un propósito de esta invención es identificar un medio efectivo de inmunización contra enfermedades en donde se encuentran implicadas micobacterias. Tales enfermedades incluyen, enfermedad de Hansen, tuberculosis, osteomielitis, enfermedad de Crohn, lepra, linfadenitis, enfermedad de Johne . Los aspectos de la invención anteriormente descritos son aplicables a una variedad de diferentes pacientes, incluyendo, por ejemplo, niños, pacientes que tienen VIH, SIDA, que se encuentran inmunocomprometidos/inmunosuprimidos, o que han experimentado transplantes de órganos, transplantes de médula espinal, o que sufren de inmunodeficiencias genéticas. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el paciente puede ser un niño (e.g., un infante o niño entre 1-5 años), un niño mayor o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el paciente es preferentemente un adulto. Una vacuna pretendida para niños también puede administrarse a adultos, e.g.', para establecer seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende (1) una composición inmunogénica de la invención y (2) un vehículo farmacéuticamente aceptable . La invención proporciona un método para la preparación de un farmacéutico, que comprende las etapas de: (i) preparar una vacuna vectorizada de la invención; y (ii) mezclar la composición inmunogénica con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. El vehículo (2) puede ser cualquier sustancia que por sí misma no induce la producción de anticuerpos dañinos al paciente que recibe la composición, y que puede administrarse sin toxicidad indebida. Los vehículos adecuados pueden ser grandes macromoléculas lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, y partículas de virus inactivos. Tales vehículos son muy conocidos para los de experiencia ordinaria en la técnica. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir líquidos tales como agua, salina, glicerol y etanol. También pueden encontrarse presentes en tales vehículos sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias de amortiguador de pH, y lo similar. También pueden encontrarse presentes agentes de estabilización tales como trehalosa o sustancias que permiten la formación de azúcar glasé soluble en agua a temperatura ambiente. Las últimas incluyen el uso de tecnología de estabilización de glasé soluble mezclado en formato de microesferas suspendidas en líquidos de perfluorocarbono. Los liposomas también son vehículos adecuados. Un amplio tratado de vehículos farmacéuticos se encuentra disponible en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, ISBN: 0683306472. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden utilizarse profilácticamente, e.g., en una situación en donde se espera el contacto con microbios y en donde debe prevenirse el establecimiento de la infección. Por ejemplo, la composición puede administrarse previo a cirugía . La composición farmacéutica es preferentemente estéril. Se encuentra preferentemente libre de pirógenos. Se encuentra preferentemente amortiguada, e.g., entre un pH 6 y pH 8, generalmente un pH de aproximadamente 7. Preferentemente, la composición es sustancialmente isotónica con humanos. Las composiciones de la invención pueden administrarse a través de una variedad de vías. Ciertas vías pueden ser favorables para ciertas composiciones, resultando en la generación de una respuesta más efectiva, o siendo menos probable que induzcan efectos secundarios, o siendo de más fácil administración. Por ejemplo, las composiciones utilizadas en esta invención pueden administrarse por medio de un número de vías incluyendo, pero sin limitarse a, medios orales, intravenosos, intramusculares, intra-arteriales, intramedulares, intratecales, intraventriculares, aplicaciones transdéricas o transcutáneas, subcutáneos, intraperitoneales, intranasales, entérales, tópicos, sublinguales, intravaginales o rectales. Las composiciones pueden prepararse para administración intranasal, como aspersión nasal, gotas nasales, gel o polvos, como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos previo a la inyección. El suministro directo de las composiciones se logrará generalmente mediante inyección de manera subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, intranasal, o el suministro al espacio interstitial de un tejido. El tratamiento de dosis puede ser un programa de una sola dosis o un programa de dosis múltiple.

Ahora, se describirán en mayor detalle varios aspectos y modalidades de la presente invención a manera de ejemplo con referencia a las siguientes figuras: BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: respuestas medias de IFN-? ELISPOT después de la vacunación en cada grupo de vacunación: BCG solo; MVA85A solo; preparado con BCG-reforzado con MVA85A. (a) línea de tiempo para vacunación (semanas) en cada grupo; (b) respuestas del derivado de proteína purificada de tuberculina (PPD); (c) respuestas de la proteína de antígeno 85 purificado (Ag85A) ; (d) respuestas del péptido depositado sumado; (e) para cada uno de los tres antígenos medidos, las respuestas entre cada grupo de vacunación en cada punto se tiempo se compararon utilizando la estadística Mann-Whitney. Se indican las comparaciones estadísticamente significativas; (f) despliegue del epítope de célula T después del refuerzo con MVA en individuos vacunados con BCG. Todas las respuestas de péptido individual se abrogaron completamente mediante agotamiento de célula T CD4+; Figura 2: respuestas de visualización de ELISPOT en cultivo sanguíneo a M.tb PPD; M. avium PPD y antígeno recombinante 85A (Ag85A) ; de 4 voluntarios en el estudio con MVA85A solo previo a la vacunación. Cada voluntario se identifica mediante un código TXXXXXX, en donde las primeras tres X corresponden al número de prueba y las últimas tres X corresponden al número de voluntario, e.g., T002022 significa que T002 es el número de prueba y 022 es el número de voluntario; Figura 3: respuestas de ELISPOT en cultivo ("cultivo" marcado) y ex vivo a grupos de péptidos Ag85A (marcados con letras en la casilla superior) en cinco voluntarios (cada uno identificado por un código TXXXX, en donde XXXX es un número de cuatro dígitos, correspondiendo el dígito 1 al número de prueba y los dígitos dos, tres y cuatro correspondiendo al número de voluntario, e.g., T2003 significa que T2 es el número de prueba y 003 es el número de voluntario (T2 es lo mismo que T002 en la Figura 3 anterior) ) tres semanas después de la administración de una sola inmunización con MVA85A. las respuestas post vacunación son muy altas y más altas que las respuestas pre-vacunación . Los voluntarios no se vacunaron previamente con BCG; Figura 4 : seguimiento de respuestas de la célula T a MVA-Lac-z utilizado como el antígeno en un análisis ELISPOT ex vivo en voluntarios sanos inmunizados con MVA-85A inmunizados una vez en la semana 1. Los voluntarios se vacunaron previamente con BCG; Figura 5 (a): respuestas medias ELISPOT a depósitos de PPD, antígeno recombinante 85A (Ag85A) y péptido de antígeno 85A sumado (Ag85A) después de una sola vacunación con MVA85A en sujetos latentemente infectados con M.tb; Figura 5 (b) : comparación de respuestas de péptido depositado inducido por antígeno 85A sumado (Ag85A) en sujetos preparados con BCG (T005, i.e., prueba 5; ver ejemplo 1) y sujetos latentemente infectados con M.tb (T007, i.e., prueba 7 ) ; Figura 5 (c) : comparación de respuestas de antígeno recombinante 85A (Ag85A) inducido con MVA85A en sujetos preparados con BCG (T005) y sujetos latentemente infectados con M.tb (T007); Figura 6a: persistencia de las respuestas inmunes inducidas por MVA85A durante al menos 1 año después de la vacunación en un grupo de sujetos con un largo (más de 10 años) intervalo entre preparación (BCG) y refuerzo (MVA85A) ; Figura 6(b): persistencia de las respuestas inmunes inducidas por MVA85A durante al menos 1 año después de la vacunación en un grupo de sujetos con un intervalo corto (1 mes) entre preparación (BCG) y refuerzo (MVA85A) ; Figura 7 (a) : carencia de correlación entre el intervalo entre la vacunación BCG y MVA85A y respuestas de la célula T 1 semana después de MVA85A a grupos de péptidos sumados del antígeno 85A (Ag85A) ; Figura 7 (b) : carencia de correlación entre el intervalo entre la vacunación BCG y MVA85A y respuestas de la célula T 24 semanas post MVA85A a grupos de péptidos sumado del antígeno 85A (Ag85A) ; La Figura 8a muestra los niveles medios de IFN-? post vacunación; La Figura 8b muestra los niveles medios de IFN-? post reto; La Figura 9 (a) muestra las respuestas de IFN-? ELISPOT ex vivo a MVA85A en voluntarios na?ve de BCG del Reino Unido; y La Figura 9 (b) muestra las respuestas de IFN-? ELISPOT ex vivo a MVA85A en voluntarios na?ve de BCG de Gambia. Ejemplos Ejemplo 1 La vacuna MVA85A La construcción del MVA85A se ha descrito previamente (McShane H. et al., (2002) Infect. Immun . 70, 1623-1626) . El MVA85A de grado clínico se produjo en un buen estándar de la práctica de elaboración por Impfstoffwerke Dessau-Tornau. Se expidió un Doctors and Dentists Exemption Certifícate de la Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency, Londres, para el uso de MVA85A en pruebas clínicas . Pruebas Clínicas Se reclutaron voluntarios para estudios de inmunización bajo los protocolos aprobados por el Oxfordshire Research Ethics Commitee y se enrolaron solo después de obtener un consentimiento escrito de información. El rango de edades para su inclusión fue de 18-55 y todos los voluntarios probaron seronegativo para VIH, VBH y VCH en visualización. Se llevó a cabo hematología y bioquímica de laboratorio de rutina previo a la vacunación y todos los valores se encontraron entre los limites normales. Todos los voluntarios fueron seguidos durante 6 meses, tomando muestras de sangre en puntos de tiempo regulares. Aquellos que recibieron inmunizaciones con MVA85A llenaron una tarjeta diaria registrando los efectos secundarios locales y sistémicos y la temperatura corporal durante 7 dias después de la vacunación. Vacunaciones Los primeros dos estudios se condujeron en voluntarios sanos na?ve de BCG según se determinó utilizando la prueba Heaf. La prueba Heaf implica colocar un derivado de proteina purificada de tuberculina (PPD) en la piel y después utilizar una aguja para producir múltiples punciones. Una reacción positiva es de más de 4 pápulas en los sitios de punción a las 72 horas. Una prueba de piel positiva es indicativa de infección de tuberculosis activa o vacunación BCG previa. Los voluntarios con una prueba Heaf negativa (grado 0) (equivalente a una prueba en piel de tuberculina de 9 mm) se vacunaron ya sea con BCG (una sola inmunización con cepa Glaxo de BCG, 100 ul administrada de manera intradérmica, n=ll) o con MVA85A (5 x 107 pfu administrada de manera intradérmica, 2 inmunizaciones dadas con 3 semanas de separación, n=14). En el tercer estudio, los voluntarios previamente vacunados con BCG se reclutaron (n=17). El tiempo medio entre la vacunación con BCG y la inmunización con MVA85A fue de 18 años (rango 0.5-38 años) . Los voluntarios con una prueba Heaf no mayor que grado II (equivalente a la prueba en piel de tuberculina de < 15 mm) en fuerza, se enrolaron en el estudio y se inmunizaron con una sola dosis de 5 x 107 pfu de MVA85A de manera intradérmica en la piel que subyace el deltoides en el brazo colateral a la vacunación con BCG. En total, se vacunaron 31 voluntarios sanos con MVA85A. 11 de los 14 voluntarios na?ve de BCG recibieron 2 inmunizaciones, dadas con 3 semanas de separación. Los 3 restantes recibieron una sola inmunización. Todos los 17 voluntarios preparados con BCG recibieron una sola inmunización con MVA85A. Todos los voluntarios completaron el periodo de seguimiento de 6 meses y no se presentaron eventos adversos serios o severos en ninguno de estos estudios. Mediciones de inmunogenicidad La medida inmunológica principal utilizada para determinar la inmunogenicidad fue el análisis de IFN-? ELISPOT ex vivo. Este se llevó a cabo en sangre tomada en los siguientes puntos de tiempo: en la visualización previa a la prueba en piel de tuberculina, y después a 1, 4, 12 y 24 semanas después de la vacunación. Estas mediciones se efectuaron en PBMCs frescas utilizando PPD tuberculina (20 ug/ml, SSI), complejo de antígeno 85 (Ag85A) purificado (10 ug/ml) y 7 depósitos de 9-10 péptidos de 15 mer, sobrepuestos por 10 aminoácidos (10 ug/ml concentración final de cada péptido en pozos ELISPOT) . Brevemente, 300,000 PBMCs por pozo en 100 ul de RIO (RPMI más suero fetal de ternera al 10%) se colocaron en placas directamente sobre la placa de ELISPOT (MAIP S4510, Millipore) en presencia de antigeno, y se incubaron durante 18 horas. Se utilizó estreptoquinasa (250 U/ml) /estreptodornasa (12.5 U/ml) y fitohemaglutinina (10 ug/ml) en todos los análisis como controles positivos. Los análisis se llevaron a cabo en duplicado y se promediaron los resultados. Mapeo del Epitope Las respuestas a péptidos individuales se probaron ya sea en la primera muestra o en la subsecuente después de la vacunación. Se efectuaron agotamientos de perla magnética (Dynal) en respuestas del péptido individual. Se llevaron a cabo agotamientos de célula T CD4+ y CD8+ por 30 minutos de incubación con anticuerpos monoclonales para CD4 y CD8 conjugados a perlas ferrosas a una relación de 5 perlas: 1 célula utilizando M-450 (Dynal, Oslo, Noruega) en 200 ul de RIO en hielo. Las células recubiertas con anticuerpo se removieron utilizando un imán (Dynal) . Las muestras se analizaron de acuerdo con grupos no agotados, agotados con CD4+ y agotados con célula T CD8+. Los agotamientos celulares se confirmaron mediante exploración FACS y fueron siempre de >90% para las células T CD8+ y de >97% para células T CD4+ (datos no mostrados) . Análisis de inmunogenicidad Los datos ELISPOT se analizaron sustrayendo el número medio de puntos en el medio y de células solas en pozos de control de las cuentas medias de puntos en pozos con antigenos o grupos de péptidos, y células. Las cuentas menores que 5 puntos/pozo no se tomaron en cuenta. Un pozo se consideró positivo si la cuenta fue de al menos dos veces la de los pozos de control negativo y de al menos 5 puntos más que los pozos de control negativo. Para los pozos de depósito de péptido, los resultados se sumaron a través de todos los pozos de péptido para cada voluntario en cada punto de tiempo. Por ejemplo, cuando existen 7 grupos de péptidos, conteniendo cada uno 9-10 péptidos, cada depósito se prueba en duplicado. Se calcula la media de este duplicado para cada pozo y se sustrae la media del pozo de control negativo para dar el resultado para ese depósito. Los resultados para los 7 depósitos individuales se agregan entre si. Esto contará potencialmente dos veces una célula T que responde a cualquiera de las regiones sobrepuestas de 10 mer que se presentan en dos depósitos con péptidos adyacentes. Análisis estadístico El análisis de variación para las mediciones repetidas utilizando el resultado de la linea base en la visualización como covariante, se llevó a cabo en datos log transformados para compararse entre grupos. Se utilizó entonces una prueba Mann-Whitney para todas las comparaciones entre grupos y se utilizó una prueba Wilcoxon para la comparación por pares de la visualización y muestras de 24 semanas en el grupo preparado con BCG-reforzado con MVA85A. Método ELISPOT en cultivo Para ELISPOT en cultivo, se estimularon 1 x 106 PBMC criopreservadas con 20 ug/ml de M.tb PPD ("PPD-T"), M. avium PPD ("PPD-A") o 10 ug/ml de antigeno recombinante 85a (Ag85A) en placas de 24 pozos. Después de un periodo de incubación de 3 dias en atmósfera de C02 al 5% a +37°C, se retiraron 500 ul del sobrenadante del cultivo celular y se reemplazaron con 5 IU/ml Lymphocult-T (Biotest, Dreieich, Alemania) en RIO. Esto se repitió en el día 7. En el día 9, las células se lavaron tres veces y se dejaron reposar durante la noche en atmósfera de C02 al 5% a V37°C en RIO. En el día 10, las células se lavaron y se resuspendieron en 2 ml de RIO, 50 ul de las células cultivadas (2.5 x 104 de las células inicialmente colocadas en placas) se transfirieron a pozos duplicado de una placa ELISPOT y se estimularon durante 18 horas con PPD-T 20 ug/ml, PPD-A 20 ug/ml y Ag85A 10 ug/ml. La placa ELISPOT se reveló entonces como se describió previamente . Resultados La inmunización con MVA85A fue segura y bien tolerada (Tabla 1). Se compararon la cinética y la magnitud de la respuesta de la célula T especifica de antigeno inducida por la vacunación con BCG solo, MVA85A solo y preparado con BCG-reforzado con MVA85A. Todos los tres regímenes de vacunación inducen respuestas inmunes significativas utilizando ya sea PPD-T, proteína de antigeno 85 (Ag85A) o péptidos sobrepuestos del antigeno 85A (Ag85A) como antigeno en los análisis (Tabla 2, Figura 1). Hubo un efecto principal significativo de la vacuna en el PPD-T (F = 3.624; P = 0.037), antigeno 85 (Ag85A) (F = 16.605; P < 0.001) y el grupo de péptido de antigeno 85A depositado sumado (Ag85A) (F = 39.982; P < 0.001). La inmunización con BCG indujo niveles moderados de células T que secretan IFN-? especifico de antigeno, que llegaron al pico 4 semanas después de la inmunización (Tabla 2, Figura lb-d) . las respuestas a los péptidos del antigeno 85a depositado (Ag85A) fueron de manera sorprendente débiles después de la vacunación con BCG (Figura Id) . Solo 4 de los 11 voluntarios respondieron a cualquiera de los 7 grupos de péptidos en el análisis ELISPOT ex vivo. Estas respuestas del depósito de péptido se atribuyeron todas a los péptidos 12, 13, 27 y 28 y se abrogaron completamente mediante agotamiento de la célula T CD4+. Tabla 1 : Eventos adversos requeridos después de la inmunización con MVA85A No hubo diferencias en la frecuencia o la severidad de los eventos adversos reportados entre los grupos na?ve de BCG y preparados con BCG aTodos los síntomas sistémicos se resolvieron dentro de 7 dias bRango 37.7-38.1°C, todos resueltos de manera espontánea dentro de 24 horas En voluntarios na?ve de BCG, una sola inmunización con MVA85A indujo altos niveles de células T que secretan IFN-? especifico de antigeno que alcanzaron pico 7 dias después de la vacunación en 13/14 voluntarios (Tabla 2, Figura lb-c) . A las cuatro semanas, esta respuesta habia caldo a un nivel justo arriba de la linea base. No se observó ningún efecto de refuerzo de la segunda vacunación con MVA85A, administrada en la semana 3. Un voluntario no desarrolló células T especificas al inserto después de la inmunización con MVA85A, sin embargo, este voluntario desarrolló respuestas especificas de la célula T al vector de MVA a pesar de no tener historia previa de inmunización por vacuna (datos no mostrados) . Las respuestas a MVA-lac-Z en los voluntarios vacunados con MVA85A se investigaron posteriormente efectuando análisis ELISPOT exvivo utilizando antigeno MVA-lac-Z. La metodología del análisis es como se trató anteriormente en "mediciones de inmunogenicidad". Los voluntarios sanos vacunados con MVA85A demostraron fuertes respuestas de la célula T anti-MVA que duraron hasta 24 horas después de la vacunación. En contraste con la vacunación BCG, la vacunación con MVA85A indujo fuertes respuestas a varios grupos de péptidos en todos los 13/14 voluntarios que respondieron (Tabla 2, Figura Id) . Se observaron respuestas para un amplio grupo de péptidos a través de la longitud total del antigeno 85A (Ag85A) . estas respuestas al péptido individual se abrogaron completamente por el agotamiento de la célula T CD4+ (datos no mostrados) . En 16/17 voluntarios en el grupo preparado con BCG-reforzado con MVA85A, se observó un aumento significativo en las células T especificas de antigeno 1 semana después de la vacunación (Tabla 2, Figura 1). La respuesta pico 1 semana después de la inmunización fue significativamente más alta en el grupo preparado con BCG-reforzado con MVA85A que en cualquiera de los grupos de BCG o MVA85A solo, (Figura lb-e) . Estas respuestas se sostuvieron a un nivel significativamente más alto que después de la vacunación ya sea con BCG o MVA85A solo, durante al menos 24 semanas (Figura le) . Las respuestas de linea base al visualizarse fueron más altas en los voluntarios previamente vacunados con BCG que en el grupo na?ve de BCG, como se esperaría. No obstante, las respuestas 24 semanas después de la vacunación con MVA85A en el grupo preparado con BCG-reforzado con MVA85A fueron significativamente mayores que las cuentas de línea base en este grupo para PPD (Wilcoxon z = 3.010, P = 0.003), antígeno 85 (Ag85A) (Wilcoxon z = -3.516, P < 0.001) y los péptidos depositados sumados (Wilcoxon z = -3.408, P = 0.001). El grueso de las respuestas al péptido observadas en el MVA85A solo (no mostrada) y en los grupos preparados con BCG-reforzados con MVA85A (Figura lf) fueron muy similares. Sin embargo, la magnitud de las respuestas fue significativamente más alta en el grupo preparado con BCG-reforzado con MVA85A (Figura le) . Las PBMC de 12 voluntarios en el grupo preparado con BCG-reforzado con MVA85A se analizaron con todos, los 66 péptidos del antigeno 85A (Ag85A) . Varios de estos péptidos fueron reconocidos por más del 50% de los sujetos (Figura lf) , ilustrando el promiscuo reconocimiento de estos péptidos por diferentes moléculas HLA Clase II, como se reportó previamente (Launois P., et al., (1994) Infect. Immun . 62, 3679-3687.

Tabla 2. Media Aritmética (SE) y Mediana (IQR) de las Respuestas ELISPOT a PPD, Antígeno 85 (Ag85A) y Péptidos Agrupados Sumados en cada Grupo de Vacunación en cada Punto de Tiempo. Tiempo después de la vacunación (semanas) Media Media Aritmética (SE) Media Aritmética de Péptidos Grupo de Aritmética Mediana (SE) de Mediana Agrupados Mediana Vacunas Número (SE) de PPD (25-75%) Antígeno 85 (25-75%) Sumados (25-75%) 0 BCG 1 1 15(6) 0(0-28) 6(5) 0(0-0) 15(4) 20(0-22) MVA85A 14 18(17) 0(0-22) 4(4) 0(0-0) 3(3) 9(0-0) BCG- MVA85A 17 129(33) 60(28-218) 24(6) 18(0-37) 26( 1 1) 0(0-50) 1 1 BCG 1 1 173(52) 132(42-249) 79(22) 82(23-122) 38(9) 28(20-52) MVA85A 14 460(93) 434(175-553) 419(98) 338(140-540) 1365(378) 1153(531-1432) BCG- MVA85A 17 917(148) 783(403- 895(150) 707(438- 3248(592) 2455( 1315- 1653) 1653) 5187) 4 BCG 1 1 233(50) 182(104-314) 64(12) 67(37-94) 31(7) 35(13-40) MVA85A 14 107(21 ) 81(53-167) 1 17(42) 65(33-138) 306(95) 156(60-533) BCG- MVA85A 17 362(86) 343(165-421) 341(67) 322(180-405) 1 123(266) 953(609-1219) 12 BCG 1 1 76(25) 47(27-85) 21(8) 15(0-33) 15(9) 0(0-17) MVA85A 14 70(25) 41(22-92) 59(26) 27(18-52) 167(58) 68(21-205) BCG- MVA85A 17 299(83) 223(68-387) 227(72) 92(42-287) 739(199) 390(212-910) 24 BCG 1 1 58(17) 53(10-95) 12(6) 0(0-22) 23(7) 20(0-35) MVA85A 14 62(19) 38(26-63) 32(13) 18(0-45) 1 13(27) 105(32-152) BCG- MVA85A 16 328(89) 249(150-385) 240(77) 1 19(82-293) 669(177) 385(223-1043) La magnitud de las respuestas de la célula T observadas en el grupo de MVA85A sólo es más fuerte por un factor de aproximadamente 10 que aquella observada con otros MVAs utilizados actualmente (McConkey, S.J. et al., "Enhanced T-cell immunogenicity of plasmid DNA vaccines boosted by recombinant modified vaccinia virus Ankara in humans", Nat. Med., 9, 729-735 (2003)); Mwau, M. et al., "A human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) clase A vaccine in clinical triáis; stimulation of HlV-specific T-cell responses by DNA and recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) vaccines in humans", J. Gen. Virol. 85, 911-919 (2004)). Un MVA recombinante que expresa un antigeno de P. falciparum indujo una respuesta media del péptido sumado de 90 SFC/106 PBMC 7 dias después de la vacunación (McConkey, S.J., et al., (2003) Nat. Med. 9, 729-735). En contraste, observamos una respuesta media a los péptidos sumados de 1365 SFC/106 PBMC 7 días después de la vacunación con MVA85A (Tabla 2) . Una explicación para esto es que estos voluntarios tienen alguna inmunidad anti-micobacteriano preexistente que se refuerza mediante inmunización con MVA85A. Utilizamos un análisis ELISPOT cultivado en lugar de ex vivo para investigar esto adicionalmente. El análisis ELISPOT cultivado ha mostrado previamente medir células T de tipo de memoria central, en lugar que las células T efector activadas que se miden mediante ELISPOT ex vivo (Reece W.H., et al., (2004) Nat.

Med. 10, 406-410, Godkin, A.J. et al., (2002) J. Immunol. 169, 2210-2214) . Se llevó a cabo un análisis IFN-? ELISPOT en la pre vacunación que visualiza PBMC de 4 de los voluntarios en el grupo sólo de MVA85A. Las células se cultivaron con M. tb PPD, M. avi um PPD y antígeno recombinante 85A (Ag85A) .

Todos, los 4 voluntarios respondieron a M. avi um PPD, 2/4 respondieron a M. tb PPD y 2/4 respondieron al antigeno recombinante 85A (Ag85A) (Figura 2). Ninguno de estos voluntarios tuvo ninguna respuesta de linea base a ninguno de M. tb PPD o antigeno 85 purificado (Ag85A) en el ELISPOT ex vivo de visualización. Para la investigación adicional de la inducción de una respuesta de la célula T de memoria después de la vacunación con MVA85A, se llevó a cabo un análisis ELISPOT ex vivo y uno cultivado en las PBMC 3 semanas post vacunación.

Las células se cultivaron con M. tb PPD, M. avi um PPD y antigeno recombinante 85A (Ag85A) . A las 3 semanas la respuesta ex vivo es muy baja o no detectable, sin embargo, en todos, los 5 voluntarios probados hubo fuertes respuestas en el ELISPOT cultivado indicando la inducción por vacunación de las células T de memoria central especificas para el antigeno 85A (Ag85A) (Figura 3) . Ejemplo 2 Datos de seguridad e inmunogenicidad en sujetos infectados de manera latente con M. tb 9 adultos sanos infectados de manera latente con Mycoba cteri um tuberculosis (M.tb) se vacunaron con MVA85A. se midieron los marcadores inflamatorios en suero en intervalos regulares después de la vacunación en cada sujeto antes de la vacunación y 10 semanas después de la vacunación. Estas pruebas se llevaron a cabo a fin de detectar cualquier signo subclinico de inflamación pulmonar. Los resultados de los resultados ELISPOT ex vivo de los 9 voluntarios latentemente infectados se muestran en la Figura 5A. La seguridad del MVA85A en este grupo es idéntica a la observada en las pruebas previas descritas en el Ejemplo 1. No se detectó incremento en los efectos tanto locales como sistémicos ni se encontraron signos de ninguna inflamación pulmonar detectada. Los marcadores inflamatorios no cambiaron después de la vacunación y no hubo inflamación pulmonar detectable mediante la exploración CT posterior a la vacunación. Como comparación, 17 adultos sanos que hablan recibido previamente una inyección de BCG de 0.5 a 37 años antes se reforzaron con vacunación con MVA85A. Los resultados se reciben en el Ejemplo 1. Las respuestas inmunes posterior a la vacunación observadas en el grupo latentemente infectado (prueba 7, "T007") son de una magnitud similar a la observada en el grupo preparado con BCG (prueba 5, "T005"). Los resultados se muestran en las Figuras 5b y 5c. Estos datos son significativos debido a que es importante que cualquier nueva vacuna TB sea segura en sujetos latentemente infectados, dado que prevalece la infección latente en todo el mundo en desarrollo. Adicionalmente, alentar la inmunogenicidad soporta la aplicación de esta vacuna como una vacuna posterior a la exposición, administrada a personas latentemente infectadas, con la ayuda de la erradicación de tal infección latente. Duración de la respuesta inmune Las respuestas de ELISPOT ex vivo en voluntarios preparados con BCG después del refuerzo con MVA85A duran por al menos 1 año después de la vacunación, con un intervalo tanto corto (1 mes) como largo (más de 10 años) entre la preparación (BCG) y el refuerzo (MVA85A) . Los datos de seguimiento a largo plazo en 12 voluntarios vacunados con MVA85A más de 10 años después de la BCG, y en 10 voluntarios vacunados con MVA85A 1 mes después de la BCG, se muestran en la Figura 6. Los datos de ambos grupos de voluntarios muestran que la persistencia de las respuestas inmunes 1 año después de la vacunación se encuentra en la misma magnitud observada 6 meses después de la vacunación. La persistencia de las respuestas inmunes inducidas por vacuna demuestra la inducción de una respuesta de memoria. No se esperarla observar respuestas inducidas por vacuna persistentes 1 año después de la vacunación con una vacuna no replicante, a menos que se haya inducido una respuesta de memoria. Correlación entre el intervalo de preparación-refuerzo y el nivel de la respuesta inmune Los datos presentados en la Figura 3 indican que el refuerzo de las respuestas inmunes inducidas por BCG observado después de la vacunación de refuerzo con MVA85A no depende del intervalo entre la preparación con BCG y el refuerzo con MVA85A. se observó un refuerzo igual con un intervalo de refuerzo corto (1 mes) y uno largo (más de 10 años) . No existe correlación entre el intervalo entre la vacunación de preparación (BCG) y de refuerzo (MVA85A) y las respuestas inmunes ya sea pico (1 semana) o establecidas (6 meses) inducidas con MVA85A (Figura 7). Por consiguiente, la inmunidad micobacteriano de refuerzo ya sea temprana después de la vacunación con BCG (e.g., en la infancia en el mundo en desarrollo), o tardia en un punto posterior ( e . g. , en la adolescencia), es igualmente posible. Tanto el refuerzo en la infancia como el refuerzo en la adolescencia son opciones posibles para pruebas de eficacia e indicaciones potenciales para una vacuna TB de refuerzo . Inmunogenicidad y eficacia protectora de la preparación con BCG-refuerzo con MVA85A en mono rhesus En un experimento de inmunogenicidad y reto, se vacunaron macacos rhesus (grupo de 6) ya sea con i) BCG solo, ii) BCG y después reforzados 9 semanas después con MVA85A, o iii) salina (grupo de control) . Todos los animales se retaron intratraquealmente 18 semanas después de la vacunación con BCG (o vacunación con salina para el grupo de control) y después se siguieron durante 16 semanas antes de eutanizarse. Los resultados de inmunogenicidad se muestran en la Figura 8. La Figura 8a muestra los niveles medios de IFN-? posteriores a la vacunación (medidos por medio de una prueba de estimulación de linfocitos durante 3 dias) en todos los tres grupos dentro de este experimento de reto. Aunque los niveles de IFN-? en respuesta a PPD en el grupo de BCG y de preparación BCG-MVA85A parecieron comparables, las respuestas a Ag85A son claramente más altas en el grupo de preparación con BCG-refuerzo con MVA85A. por consiguiente, existe una elevación significativa en la secreción de IFN-? especifica a Ag85A después de la vacunación con MVA85A (Grupo ii) que no se observa en el grupo de BCG solo (grupo i) (Figura 8a) . La Figura 8b muestra los niveles medios de IFN-? posteriores al reto (medidos por medio de una prueba de estimulación de linfocitos durante 3 dias) en todos los tres grupos dentro de este experimento de reto. Después del desafío con M. tb, el grupo de BCG-MVA85A (grupo ii) tuvo respuestas especificas a AG85A significativamente más altas que el grupo de BCG solo (grupo i) . También las respuestas de ESAT6/CFP10 (proteina objetivo temprana secretada/proteina de filtrado en cultivo 10) , que son las respuestas inmunes especificas a M. tb (la magnitud se refiere a la carga bacterial) son menores en los grupos de BCG-MVA85A en comparación con el grupo de salina. Las respuestas a PPD son comparables entre estos dos grupos. Los resultados de ESAT6/CFP10 son importantes (panel inferior) dado que estos antigenos son específicos a TB y los niveles de respuestas inmunes a estos antígenos se correlacionan con la carga bacterial (i.e., entre más alta sea la carga bacterial (grupo de salina), es mayor la respuesta inmune a ESAT6 y CFP10) . La eficacia protectora de la vacuna se implica por el nivel relativamente menor de la respuesta de ESAT6/CFP10 en los grupos de BCG y BCG-MVA85A en comparación con el grupo de salina. En la autopsia, hubo una patología considerablemente menor observada en el grupo de BCG-MVA85A que en el grupo de BCG solo. La reducción en la carga bacterial en estos 2 grupos fue de 0.97 para el grupo de BCG-MVA85A y de 0.42 para el grupo de BCG solo.

El mono rhesus es un buen modelo de enfermedad humana y este promisorio mejoramiento en la eficacia protectora a pesar del pequeño número de animales sugiere la expectativa de resultados de eficacia similares en humanos. Datos de seguridad e inmunogenicidad a partir de estudios en fase II en adultos en Sudáfrica Se habia iniciado un estudio de seguridad e inmunogenicidad en Fase II en el cabo oeste, Sudáfrica. Esta prueba es en adultos y el objetivo es de 24 sujetos. Los sujetos latentemente infectados" se excluyen de este estudio. A la fecha, se han vacunado 12 sujetos. Todos, los 12 sujetos tuvieron respuestas inmunes significativas, inducidas por MVA85A en su análisis ELISPOT una semana después de la vacunación. El perfil de seguridad a la fecha es el mismo observado en los estudios en el Reino Unido y Gambia. Los resultados de los estudios en el Reino Unido se muestran en la Figura 1 y en la Figura 9a, y los resultados del estudio en Gambia se muestran en la Figura 9b. En total, se vacunaron 11 voluntarios na?ve de BCG y 10 voluntarios preparados con BCG en Gambia. Los resultados de inmunogenicidad del grupo na?ve de BCG (Figura 9b) se asemejan a los resultados de inmunogenicidad del grupo preparado con BCG en el Reino Unido (Figuras Ib, lc, Id), en que permanecen por arriba de la linea base por la duración del seguimiento. Esto probablemente refleja un grado mayor de preparación mediante micobacterias ambientales en la linea base, y también una exposición constante a micobacterias ambientales que mantiene la respuesta. Existe una significativa diferencia entre los grupos na?ve de BCG y los preparados con BCG en Gambia, que se explica como en lo anterior por el mayor grado de preparación ambiental en este grupo. En contraste, en el Reino Unido, los resultados de inmunogenicidad del grupo na?ve de BCG regresaron a la linea base durante el seguimiento (Figura 9a y Figuras Ib, lc, y Id) , mientras que el grupo preparado con BCG permaneció por arriba de la linea base por la duración del seguimiento (Figuras Ib, le y Id). En toda la literatura de BCG, existen muchos ejemplos de amplia variabilidad en la eficacia protectora a través de diferentes paises y continentes. El consistente perfil de seguridad e inmunogenicidad de MVA85A en el Reino Unido, África occidental y Sudáfrica es muy significativo. Inmunogenicidad en ratones del antigeno 85A que expresa adenovirus (Ag85A) Un antigeno 85A (Ag85A) que expresa el adenovirus recombinante (cepa 5 humana, suprimida por El y E3) ha mostrado inducir fuertes respuestas inmunes en ratones cuando se proporciona solo (respuesta CD4 c 800 puntos/millón de esplenocitos; respuesta CD8 c 1200 puntos/millón de esplenocitos). Al administrarse a ratones que han recibido previamente BCG, este antigeno 85A (Ag85A) que expresa adenovirus estimula una respuesta incluso más fuerte (respuesta CD4 c 1400 puntos/millón de esplenocitos; respuesta CD8 c 2500 puntos/millón de esplenocitos). Por consiguiente, este vector de adenovirus, notablemente, muestra en la presente inducir, además de CD4, respuestas muy fuertes a célula T CDd y es probable que la inducción de éstas por medio de la misma vacuna sea benéfica tanto en la profilaxis como en el tratamiento de la enfermedad micobacteriana. Previamente, se han observado los vectores adenovirus como un buen medio para inducir respuestas de la célula T CD8, pero en la presente se muestra que ambas respuestas CD4 y CD8 se inducen poderosamente. Estos datos sugieren que los vectores adenovirales pueden ser un poderoso refuerzo para respuestas de la célula T preparada con BCG. La invención se ha descrito anteriormente solo a modo de ejemplo. Se apreciará que pueden efectuarse modificaciones de detalles sin apartarse del alcance de la invención. SECUENCIAS ESPECÍFICAS DE AG85A SEQ ID NO: 1 (SECUENCIA DE POLIPÉPTIDOS AG85A) MQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMG RDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSG DINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSD WYQPACGKAGCQTYK ETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQF VYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNT RVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEY GAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGA SEQ ID NO 2 (SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS AG85A) atgcagcttgttgacagggttcgtggcgccgtcacgggtatgtcgcgtcgactcgtg gtcggggccgtcggcgcggccctagtgtcgggtctggtcggcgccgtcggtggcacg gcgaccgcgggggcattttcccggccgggcttgccggtggagtacctgcaggtgccg tcgccgtcgatgggccgtgacatcaaggtccaattccaaagtggtggtgccaactcg cccgccctgtacctgctcgacggcctgcgcgcgcaggacgacttcagcggctgggac atcaacaccccggcgttcgagtggtacgaccagtcgggcctgtcggtggtcatgccg gtgggtggccagtcaagcttctactccgactggtaccagcccgcctgcggcaaggcc ggttgccagacttacaagtgggagaccttcctgaccagcgagctgccggggtggctg caggccaacaggcacgtcaagcccaccggaagcgccgtcgtcggtctttcgatggct gcttcttcggcgctgacgctggcgatctatcacccccagcagttcgtctacgcggga gcgatgtcgggcctgttggacccctcccaggcgatgggtcccaccctgatcggcctg gcgatgggtgacgctggcggctacaaggcctccgacatgtggggcccgaaggaggac ccggcgtggcagcgcaacgacccgctgttgaacgtcgggaagctgatcgccaacaac acccgcgtctgggtgtactgcggcaacggcaagccgtcggatctgggtggcaacaac ctgccggccaagttcctcgagggcttcgtgcggaccagcaacatcaagttccaagac gcctacaacgccggtggcggccacaacggcgtgttcgacttcccggacagcggtacg cacagctgggagtactggggcgcgcagctcaacgctatgaagcccgacctgcaacgg gcactgggtgccacgcccaacaccgggcccgcgccccagggcgcctag SEQ ID NO: 3 (SECUENCIA DE POLIPÉPTIDOS TRUNCADOS AG85A DE 15 AMINOÁCIDOS) MQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMG RDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSG DINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSD WYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAAS'SALTLAIYHPQQF VYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNT RV VYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEY GAQLNAMKPDLQR SEQ ID NO: 4 (SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS TRUNCADOS AG85A DE 15 AMINOÁCIDOS) atgcagcttgttgacagggttcgtggcgccgtcacgggtatgtcgcgtcgactcgtggtcgg ggccgtcggcgcggccctagtgtcgggtctggtcggcgccgtcggtggcacggcgaccgcgg gggcattttcccggccgggcttgccggtggagtacctgcaggtgccgtcgccgtcgatgggc cgtgacatcaaggtccaattccaaagtggtggtgccaactcgcccgccctgtacctgctcga cggcctgcgcgcgcaggacgacttcagcggctgggacatcaacaccccggcgttcgagtggt acgaccagtcgggcctgtcggtggtcatqccggtgggtggccagtcaagcttctactccgac tggtaccagcccgcctgcggcaaggccggttgccagacttacaagtgggagaccttcctgac cagcgagctgccggggtggctgcaggccaacaggcacgtcaagcccaccggaagcgccgtcg tcggtctttcgatggctgcttcttcggcgctgacgctggcgatctatcacccccagcagttc gtctacgcgggagcgatgtcgggcctgttggacccctcccaggcgatgggtcccaccctgat cggcctggcgatgggtgacgctggcggctacaaggcctccgacatgtggggcccgaaggagg acccggcgtggcagcgcaacgacccgctgttgaacgtcgggaagctgatcgccaacaacacc cgcgtctgggtgtactgcggcaacggcaagccgtcggatctgggtggcaacaacctgccggc caagttcctcgagggcttcgtgcggaccagcaacatcaagttccaagacgcctacaacgccg gtggcggccacaacggcgtgttcgacttcccggacagcggtacgcacagctgggagtactgg ggcgcgcagctcaacgctatgaagcccgacctgcaacgg SEQ ID NO :5 La secuencia de nucleótidos 1176 del inserto es como sigue (secuencia expresada en el caso superior, secuencia que codifica Ag85A subrayada) : tctgtacgggcccgtacggtaccgagctcggatctgcgcgccgccaccATGGATGCA ATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCC AGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGATCTATGCAGCTTGTTGACAGGGTT CGTGGCGCCGTCACGGGTATGTCGCGTCGACTCGTGGTCGGGGCCGTCGGCGCGGCC CTAGTGTCGGGTCTGGTCGGCGCCGTCGGTGGCACGGCGACCGCGGGGGCATTTTCC CGGCCGGGCTTGCCGGTGGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGTGAC ATCAAGGTCCAATTCCAAAGTGGTGGTGCCAACTCGCCCGCCCTGTACCTGCTCGAC GGCCTGCGCGCGCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGACATCAACACCCCGGCGTTCGAG TGGTACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTC TACTCCGACTGGTACCAGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGG GAGACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGGGGTGGCTGCAGGCCAACAGGCACGTCAAG CCCACCGGAAGCGCCGTCGTCGGTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTG GCGATCTATCACCCCCAGCAGTTCGTCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGAC CCCTCCCAGGCGATGGGTCCCACCCTGATCGGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGC TACAAGGCCTCCGACATGTGGGGCCCGAAGGAGGACCCGGCGTGGCAGCGCAACGAC CCGCTGTTGAACGTCGGGAAGCTGATCGCCAACAACACCCGCGTCTGGGTGTACTGC GGCAACGGCAAGCTGTCGGATCTGGGTGGCAACAACCTGCCGGCCAAGTTCCTCGAG GGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCAAGTTCCAAGACGCCTACAACGCCGGTGGCGGC CACAACGGCGTGTTCGACTTCCCGGACAGCGGTACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGC GCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAACGT GGATCCATTCCAAACCCTTTGCTGGGATTGGACtgactgcagatatccatcacactg SEQ ID NO: 6 MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQEIHARFRRGSMQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAV GAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALY LLDGLRAQDDFSG DINTPAFE YDQSGLSVVMPVGGQSSFYSD YQPACGKAGCQT YKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSG LLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDM GPKEDPAWQNDPLLNVGKLIANNTRV V YCGNGKLSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEY WGAQLNAMKPDLQRGSI PNPLLGLD

Claims (38)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para inducir una respuesta inmune de la célula T contra al menos un antigeno en un paciente humano, caracterizado porque comprende la etapa de administrar al paciente una composición inmunogénica que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano.
2. 2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la composición inmunogénica es una vacuna vectorizada.
3. 3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque la respuesta inmune por células T es una respuesta de CCR7+.
4. 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el vector viral deficiente no replicante o de replicación se selecciona del grupo que consiste de virus de viruela, adenovirus, virus de herpes, virus alfa, flavivirus y virus de influenza.
5. 5. El método de la reivindicación 4, caracterizado porque el vector viral no replicante es MVA.
6. 6. El método de la reivindicación 4, caracterizado porque el vector viral no replicante es un vector adenoviral.
7. 7. El método de cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el vector viral expresa Ag85A con una marca PK del C-terminal.
8. 8. El método de cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el vector viral expresa Ag85A con una secuencia guía TPA.
9. 9. El método de cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el vector viral expresa Ag85A con una C-terminal truncada.
10. 10. El método de cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el vector viral expresa el producto de traducción de la SEQ ID NO: 5.
11. 11. El método de cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el vector viral expresa además, el producto de traducción de al menos un gen (es) de antigeno adicional de una especie micobacteriana.
12. 12. El método de cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la composición inmunogénica se administra con al menos un antigeno y/o antimicrobiano adicional .
13. 13. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el al menos un antigeno y/o antimicrobiano adicional se administra de manera simultánea, separada o secuencial.
14. 14. El método de cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la respuesta es una respuesta inmune especifica de antigeno.
15. 15. El método de cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la respuesta es terapéutica o profiláctica.
16. 16. El uso de una composición inmunogénica que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad micobacteriana en un paciente, al inducir una respuesta inmune por células T en el paciente.
17. 17. El uso de una composición inmunogénica que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano y el producto de traducción de al menos un gen adicional, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención tanto de una enfermedad micobacteriana como de al menos una enfermedad adicional en un paciente, al inducir una respuesta por células T en el paciente.
18. 18. El uso de la reivindicación 16 o la reivindicación 17, en donde la composición inmunogénica induce además una respuesta inmune por células T contra el virus del cual se deriva el vector viral.
19. 19. El uso de una composición inmunogénica que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de al menos una enfermedad en un paciente, al inducir una respuesta inmune por células T, en donde el medicamento se administra con al menos un antigeno adicional .
20. 20. El uso de un antigeno en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un paciente al inducir una respuesta inmune de la célula T, en donde el medicamento se administra con una composición inmunogénica que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de un gen Ag85A micobacteriano.
21. 21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque la respuesta por células T es protectora contra una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de tuberculosis, lepra, infección por Mycobacteri um avi um, infección micobacteriana no tuberculosis, úlcera Buruli, infección o enfermedad por Mycoba cteri um bovis, viruela, viruela simica, infección por Mycoba cteri um para tuberculosis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, enfermedad autoinmune, cáncer y cáncer de vejiga.
22. 22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque el paciente se selecciona del grupo que consiste de niños, pacientes que tienen infección por VIH o SIDA, que se encuentran inmunocomprometidos o que han experimentado transplante de órgano .
23. 23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque el paciente se ha expuesto previamente a micobacterias.
24. 24. El método de la reivindicación 23, caracterizado porque el paciente se ha expuesto previamente a M. tuberculosis .
25. 25. El método de la reivindicación 23 o la reivindicación 24, caracterizado porque el paciente se encuentra latentemente infectado con micobacterias.
26. 26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque el paciente se ha tratado previamente con BCG.
27. 27. Una vacuna vectorizada que comprende un vector viral deficiente no replicante o de replicación que expresa el producto de traducción de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4.
28. 28. La vacuna vectorizada de la reivindicación 27, caracterizada porque el vector viral expresa el producto de traducción de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4 que incluye adicionalmente una marca PK en el C-terminal.
29. 29. La vacuna vectorizada de la reivindicación 27 o la reivindicación 28, caracterizada porque el vector viral expresa el producto de traducción de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4 que incluye adicionalmente una secuencia guia TPA.
30. 30. La vacuna vectorizada de la reivindicación 29, caracterizada porque el vector viral expresa el producto de traducción de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.
31. 31. La vacuna vectorizada de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, caracterizada porque el vector viral deficiente no replicante o de replicación se selecciona del grupo que consiste de virus de viruela, adenovirus, virus de herpes, virus alfa, flavivirus y virus de influenza.
32. 32. La vacuna vectorizada de la reivindicación 31, caracterizado porque el vector viral no replicante es MVA.
33. 33. La vacuna vectorizada de la reivindicación 31, caracterizada porque el vector viral no replicante es un vector adenoviral.
34. 34. La vacuna vectorizada de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, caracterizada porque el vector viral expresa además, el producto de traducción de al menos un gen (es) de antigeno adicional de una especie micobacteriana .
35. 35. Un método para inducir una respuesta por células T de memoria CD8 y CD4 contra un antigeno, utilizando un vector de adenovirus que expresa un antigeno o un fragmento inmunogénico del mismo.
36. 36. El uso de un vector de adenovirus que expresa un antigeno o un fragmento inmunogénico del mismo, en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta por células T de memoria CDd y CD4 contra el antigeno.
37. 37. El uso de la reivindicación 36, en donde el medicamento es para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad micobacteriana.
38. 38. Un método de acuerdo con la reivindicación 35 o el uso de acuerdo con la reivindicación 36 o la reivindicación 37, caracterizado porque el antigeno es Ag85A.