MX2007007075A

MX2007007075A - Composiciones y metodos para reducir la transmisividad de enfermedades.

Info

Publication number: MX2007007075A
Application number: MX2007007075A
Authority: MX
Inventors: Richard A Rosenbloom
Original assignee: The Quigley Corp
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2005-12-14
Publication date: 2007-09-04
Also published as: KR20070102487A; CA2590340A1; AU2005317104A1; US20070104808A1; EP1825007A4; EP1825007A2; CN101111608A; IL183840A0; WO2006065889A3; NZ555778A; US20050147697A1; WO2006065889A2; US7166435B2; ZA200704718B; JP2008523153A; US7405046B2

Abstract

Se describen metodos para usos profilacticos y anti-transmision de una composicion antimicrobiana; el metodo comprende el paso de administrar a un mamifero o a un ave, una cantidad de una composicion que tiene un primer ingrediente que se obtiene del jengibre; un segundo ingrediente que se obtiene del te verde; un tercer ingrediente opcional que se obtiene de curcuma; y un portador aceptable; cuando se administra la composicion es efectiva para reducir la incidencia de contraer una enfermedad o para evitar profilacticamente la transmision de una enfermedad; tambien se describen composiciones de aspersion nasal y de garganta para utilizarse en metodos de la invencion.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA REDUCIR LA TRANSMISIVIDAD DE ENFERMEDADES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso profiláctico de una composición para reducir la incidencia de contracción de enfermedad causada por organismo microbiano. Muy particularmente, la presente invención se refiere a métodos para tratar, reducir o prevenir uno o más síntomas o efectos adversos de una infección microbiana y a métodos para reducir la infectividad o transmisión de infecciones microbianas.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA La patogénesis viral es el método por el cual los virus producen enfermedad en el hospedero. La patogénesis de virus se centra en los mecanismos de lesión viral a poblaciones discretas de células en órganos particulares para producir signos y síntomas de enfermedad en un hospedero particular. Para iniciar una infección, el virus debe entrar a la célula hospedero. Las vías de entrada dependen de los virus e incluyen la piel, ojos, tracto respiratorio, gastrointestinal y urogenital así como el sistema circulatorio. Algunos virus localizan su lesión de tejido en estrecha proximidad a su sitio de entrada, particularmente los virus que infectan el tracto respiratorio superior tales como influenza, parainfluenza, rinovirus y coronavirus. Una vez que la partícula viral ha invadido la célula, las proteínas codificadas virales dirigen a la célula para replicar el genoma viral y producir proteínas específicas virales. Estas proteínas se ensamblan en viriones completos junto con el genoma viral y son liberadas. En el caso de virus de envoltura, los viriones adquieren una membrana lipídica e insertarán a través de esta membrana lipídica glicoproteínas específicas virales. Las familias de virus con envoltura incluyen Herpesviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Flaviviridae, Togaviridae y Coronaviridae. Los rinovirus son miembros de Picornaviriade, que no tienen envoltura. Los virus han evolucionado un número de mecanismos para introducirse a una célula hospedero e iniciar la infección. Para fusionarse a la membrana celular, los virus tienen una glicoproteína de membrana con actividad de fusión de membrana. Muchos virus con envoltura inducen una endocitosis mediada por receptor después de unirse al receptor de superficie de la célula, haciendo que la célula forme una vesícula endosomal. Una vez dentro de la vesícula, la partícula del virus pasa por el proceso de desprendimiento de la envoltura. Esto asegura que el pH óptimo para el genoma viral se mantenga y que el genoma viral sea protegido de nucleasas celulares.

Los virus de la influenza pertenece a la familia de virus Orthomyxoviridae y son virus con envoltura que contienen genomas de ARN de cadena negativa con ocho segmentos. El ARN viral codifica 10 proteínas específicas virales. El inicio del ciclo infeccioso requiere la unión de la envoltura viral a los receptores de superficie de la célula hospedero seguido por endocitosis mediada por receptor y la fusión de las membranas viral y endosomal. El proceso de fusión permite la liberación del genoma viral en el citoplasma, en donde puede migrar al núcleo, en donde el genoma viral inicia la transcripción y replicación del virus. La proteína responsable de la unión de receptor de influenza y la fusión de membrana es la proteína de hemaglutinina (antígeno HA o H). Para la mayoría de las cepas, la proteína HA es la glicoproteína más abundante sobre la superficie del virión. La proteína HA es también el objetivo para anticuerpos neutralizantes. Existen tres serotipos de virus de la influenza: A, B y C. Los serotípos A y B causan la mayoría de las enfermedades clínicas. La influenza A ocurre muy frecuentemente, es más virulenta y es responsable de la mayoría de las epidemias y pandemias. La influenza A puede ser además subtipificada con base en los antígenos de superficie HA y neuraminidasa (antígeno N) y los antígenos H y N son los principales determinantes antigénicos. Las cepas también se clasifican con base en la ubicación geográfica del primer aislamiento, número de serie y año de aislamiento. La neuraminidasa es una enzima que facilita la liberación de nuevas partículas virales de la célula hospedero infectada. Una tercera proteína, proteína M (proteína de matriz), es una proteína de canal de membrana y se conoce como M2 en las cepas A y NB en las cepas B. Estas glicoproteínas de membrana viral de superficie son los objetivos contra los cuales reacciona el sistema inmune. Las partículas vírales de influenza se unen a células epiteliales en el tracto respiratorio superior e inferior, en donde invaden la célula, liberan su genoma y utilizan la maquinaria de replicación de la célula hospedero para reproducir proteínas y ácido nucleico virales. Las partículas virales maduras son liberadas por lisis de la célula hospedero. Las ramas resultantes en el epitelio respiratorio dan por resultado un incremento en susceptibilidad a la infección secundaria. La influenza es transmitida principalmente por secreciones respiratorias y esas secreciones son diseminadas al toser y estornudar. La influenza también es diseminada por contacto directo cuando las manos contaminadas con el virus entran en contacto con los pasajes nasales o los ojos. El período de incubación es de 1 a 4 días y las personas infectadas son generalmente infecciosas un día o dos antes de que aparezcan los síntomas y pueden permanecer infecciosas durante 5 días después del inicio de la enfermedad. Los niños y los inmunocomprometidos comparten virus durante períodos más largos. La influenza está sujeta a cambios menores (es decir, mutaciones puntuales) a uno o ambos de los antígenos de superficie principales durante la replicación. Esos cambios se deben en parte a la falta de mecanismos de revisión y corrección de errores en el aparato de transcripción de virus. La llamada deriva antigénica es responsable de la epidemia estacional debido a que puede permitir que el virus infecte a personas sólo con inmunidad parcial por una exposición previa al virus. Los virus con influenza A son especialmente susceptibles a deriva antigénica. Los cambios principales en los antígenos H y N dan por resultado desplazamiento unigénico. El desplazamiento antigénico da por resultado un nuevo subtipo viral y pueden causar epidemias y pandemias mayores debido a inmunidad de población mínima. La influenza se ha establecido como una seria aflicción humana que puede causar epidemias localizadas y pandemias globales de infecciones respiratorias agudas. Cada año, el virus de la influenza es responsable de 20,000 a 40,000 muertes y de hasta 300,0000 casos de hospitalización en los Estados Unidos. (Sandha y Mossad, Influenza in the Older Adult. Indications for the Use of Vaccine and Antiviral Therapy, Geriatrics 56:43-51 , 2001 , Oxford et al, In: Antigenic Variation, Ed. Craig & Scherf, Academic Press, London pp. 53-83, 2003). En la pandemia de 1918 se cree ampliamente que un exceso de 40 millones de personas murieron. Aunque los niños y adultos jóvenes experimentan los casos de infección, la enfermedad severa es más común en las personas de edad avanzada o individuos inmunocomprometidos con enfermedad crónica tal como asma, diabetes, insuficiencia renal y enfermedad cardiaca. La epidemia anual va de noviembre a marzo en el hemisferio norte y de abril a septiembre en el hemisferio sur. La influenza aviar es causada por cepas de virus de la influenza de tipo A. La influenza aviar ocurre en todo el mundo. Las aves infectadas pueden desplegar una amplia gama de síntomas, desde enfermedad ligera hasta una enfermedad mortal altamente contagiosa. La enfermedad altamente contagiosa es causada por cepas de virus de la influenza especialmente virulento. La infección por esta cepa está asociada con el inicio súbito de síntomas severos, tales como falta de energía, producción de huevos reducida, huevos con cascarón blando, hinchamiento de la cabeza, párpados, etc., escurrimiento nasal, tos o diarrea, dando por resultado la muerte (WHO, 2004). En la actualidad, se han identificado 15 subtipos que pueden infectar aves pero sólo los subtipos H7, H5 y H9 están asociados con brotes epidémicos. Los brotes epidémicos actuales en Asia y Columbia Británica son causados por las cepas H5N1 y H7N3, respectivamente. Como se describió antes, los virus de la influenza son una preocupación pública debido a que esos virus carecen de un mecanismo para previsión de la replicación de ácido nucleico así como de un sistema de reparación para corregir dichos errores. Por lo tanto, el virus de la influenza son especialmente susceptibles a una tasa de mutación alta durante la transcripción. Además, los virus de la influenza pueden intercambiar o trocar material genético de otros subtipos de especies diferentes, permitiendo así que subtipos crucen la barrera de especies que normalmente evita la infección cruzada de virus específicos de especie de una especie a otra especie no relacionada. Esta barrera de especies normalmente evita que cepas de virus de la influenza aviar infecten a humanos pero ocasionalmente nuevas cepas pueden tener material genético tanto de cepas de virus de influenza aviar como humana. Este intercambio de material genético ocurre cuando hay una estrecha proximidad entre humanos y aves domésticas y cerdos. Los cerdos pueden actuar como un reservorio para cepas humanas y aviares. Por lo tanto, los cerdos actúan como una incubadora natural a la emergencia de nuevas cepas que puede infectar a humanos así como especies aviares. Existen cuatro fármacos antivirales disponibles en E.U.A. para tratamiento de influenza: amantadina, rimatadina, zanamivir (Zanamivir (Relenza™) y Oseltamivir (Tamiflu™). Amantadina y rimatadina son efectivos solo contra influenza A. Amantadina, rimatadina y oseltamivir están aprobados para profilaxis. La profilaxis está indicada únicamente para personas no vacunadas en alto riesgo durante un brote de influenza. Los agentes antivirales tienen uso limitado debido a baja tolerancia y la aparición de resistencia. Actualmente, amantadina es principal compuesto antiviral usado contra infección de influenza, pero su actividad está restringida a virus de la influenza A. Los inhibidores de anti-neuraminidasa tales como Zanamivir y Oseltamivir son una nueva clase de agentes antivirales autorizados para usarse en el tratamiento tanto de infecciones de influenza A como B (Carr et al., Influenza Virus Carrying Neuraminidase with Reduced Sensitivity to Oseltamiver Carboxylatehas Altered Properties In Vitro and is Compromised for Infectivity and Replicative Ability In Vivo, Antiviral Res. 54:79-88, 2002). Por lo tanto, el desarrollo de nuevos y efectivos fármacos antivirales contra influenza A y B es de gran importancia clínica (Bamford, Neuraminidase Inhibitors as Potential Anti-lnfluenza Drugs, J. of Enzyme Inhibition, Review 10:1-16, 1995). Las vacunas contra influenza se usan generalmente antes del inicio de la estación de influenza y se dan típicamente al segmento de la población que se considera que está en alto riesgo. Las vacunas están en varias formas y tienen la finalidad de prevenir o por lo menos reducir los síntomas de la enfermedad. Las vacunas se dan antes de la exposición del virus para generar anticuerpos neutralizantes contra la cepa que es más probable que cause epidemias o pandemias de amplia diseminación. Sin embargo, las vacunas pueden ser costosas y los abastecimientos de la vacuna pueden agotarse rápidamente. También, las vacunas pueden no contener el componente viral causante. En otras palabras, la producción de vacuna depende de estimar qué cepa surgirá como la cepa dominante. Por lo tanto, en cualquier año dado, sólo hay una protección limitada contra las demás cepas de influenza. Además, el método típico de proveer una vacuna mediante inyección es desagradable para muchas personas. Los tratamientos de profilaxis, por otra parte, se usan para prevenir la infección o reducir la severidad de la enfermedad después de la exposición al virus. Oseltamivir™ así como zanamivir o Relenza™ (Glaxo Wellcome, antiviral de segunda generación) son inhibidores de neuraminidasa que bloquean la liberación de partículas virales maduras y por lo tanto previenen la infección de células vecinas. Los inhibidores de neuraminidasa reducen los síntomas de infección de influenza y acortan la duración de la enfermedad. La profilaxis se debe dar dentro de una ventana de 48 horas del inicio de los síntomas para ser efectiva y existe un riesgo de que surjan cepas resistentes. El síndrome respiratorio agudo severo (SARS) es la primera nueva enfermedad infecciosa mayor del siglo 21. Los primeros casos aparecieron en noviembre de 2002 en Guangdong, China pero se reconoció como una nueva enfermedad en marzo de 2003. La diseminación de la enfermedad se aceleró por viajes aéreos internacionales de tal manera que se reportaron casos en 22 países. Sin embargo, con las tecnologías de comunicación modernas y un esfuerzo de colaboración global la enfermedad se contuvo dentro de cuatro meses de ser identificada. La enfermedad causó morbidez alta y tasas de mortalidad altas con síntomas que incluían fiebre elevada, dolor de cabeza, mialgia y tos seca. La tasa de mortalidad excedió 60% en el grupo de más de 60 años de edad (Peiris JS et al., 2003). SARS se identificó como ser causada por un nuevo virus a través de varias técnicas de laboratorio que involucraban propagación de virus en cultivo de tejido y estudios de microscopía electrónica. Esto se confirmó apenas unos días después cuando la secuencia del genoma completo se determinó indicando que fue un nuevo Coronavirus el que fue responsable. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos antimicrobianos para usarse contra este tipo de enfermedad infecciosa es de gran importancia. Otros microorganismos que causan enfermedad incluyen las bacterias gram-positivas y gram-negativas tales como Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Pseudomonas, y Haemophilus así como infecciones nicóticas incluyendo la levadura C. albicans. Aunque la infección activa con esos microorganismos se trata principalmente con antibióticos, algunos pacientes no toleran bien los antibióticos. Otros pueden desear aumentar un tratamiento de antibióticos con un régimen de tratamiento que reduzca o elimine los síntomas de infección bacteriana o nicótica tales como dolor de garganta. Otros pueden desear prevenir o reducir la severidad de infecciones por uno de esos organismos bacterianos o fúngales mediante tratamiento profiláctico antes, durante o después de la exposición. El interés de la investigación se ha enfocado recientemente en varias hierbas, que contienen compuestos antioxidantes potentes que pueden proveer protección significativa contra enfermedades crónicas y tienen actividad antimicrobiana o antitumoral. Las sustancias antioxidantes tales como flavonoides se pueden encontrar en una variedad de hierbas tales como diente de león, jengibre, té verde y romero. Recientemente se reportó que el extracto de té verde (GTE) inhibió el crecimiento de virus de la influenza A y B en células de riñon canino Madin-Darby (MDCK) y en otro estudio, Epigallocatechin-3-galato (EGCG), uno de los componentes de té verde, inhibió la replicación de cepas de VIH-1 (1 1 1 B) y Bal VIH en linfocitos de sangre periférica. Estas sustancias han probado ser útiles en el campo de tratamiento de varias enfermedades; sin embargo no ha habido ningún progreso en la creación de un método profiláctico para usarse como sustancias antioxidantes. Por lo tanto, existe la necesidad en el campo para proveer un método profiláctico para la reducción de la incidencia de contraer una enfermedad causada por un organismo microbiano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, un objeto de ciertas modalidades de la invención es proveer un método para reducir la incidencia de contraer una enfermedad causada por un organismo microbiano. En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para el uso profiláctico de una composición antimicrobiana para reducir la incidencia de contraer una enfermedad. El método comprende el paso de administrar a un mamífero o un ave que ha sido, o será, expuesta a una enfermedad causada por un microbio, una cantidad de una composición antimicrobiana que tiene un primer ingrediente obtenible de jengibre, un segundo ingrediente obtenible del té verde; y un vehículo aceptable. La cantidad de composición antimicrobiana es efectiva, cuando se administra, para reducir la incidencia de contraer la enfermedad. En un segundo aspecto de la invención, una composición antimicrobiana profiláctica que tiene un primer ingrediente obtenible de jengibre, un segundo ingrediente obtenible de té verde; y un vehículo aceptable se describe. La composición antimicrobiana es efectiva, cuando se administra como una aspersión nasal o como una aspersión de la garganta a un mamífero o un ave que ha sido, o será expuesto a una enfermedad causada por un microbio, para reducir la incidencia de contraer dicha enfermedad. Estas y algunas otras ventajas y características de novedad que caracterizan la invención se indican con particularidad en las reivindicaciones anexas a la misma y que forman parte de la misma. Sin embargo, para entender mejor la invención, las ventajas y los objetos obtenidos para su uso, se debe hacer referencia al material descriptivo anexo, en el cual se describe una modalidad preferida de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición. La composición de la presente invención incluye ingredientes que se pueden obtener de jengibre, té verde y cúrcuma. Como se usa aquí, el término "sabores" incluye sabores tanto de frutas como botánico. Como se usa aquí, el término "edulcorantes" incluye azúcares, por ejemplo, glucosa, sacarosa y fructosa. Los azúcares también incluyen sólidos de jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, azúcar invertido, alcoholes de azúcar incluyendo sorbitol y mezclas de los mismos. Los edulcorantes artificiales también se incluyen dentro del alcance del término "edulcorantes". Como se usa aquí, el término "aceptable" significa un componente que es adecuado para usarse con humanos y/o animales sin efectos colaterales adversos no deseados (tales como toxicidad, irritación y respuestas alérgicas) en proporción con una relación de riesgo/beneficio razonable. Además, como se usa aquí, el término "cantidad segura y efectiva" se refiere a la cantidad de un componente, que es suficiente para producir una respuesta terapéutica deseada sin efectos colaterales adversos no deseados (tales como toxicidad, irritación o respuestas alérgicas), en proporción con una relación de riesgo/beneficio razonable usada de la manera descrita aquí. El término "inhibición" de un microbio, como se aquí, se refiere para reducir o prevenir el crecimiento adicional del microbio, o prevenir que el microbio se fije a células normales, y/o la eliminación de algunas o todas las partículas infecciosas de un ser humano o animal que está siendo tratado. Métodos adecuados para determinar la inhibición de microbios se describen en los ejemplos. El término "transmisividad", como se usa aquí, se refiere a la transferencia de un microbio de un hospedero a otro. Todos los compuestos activos usados en la presente invención se pueden obtener de otras fuentes, si están disponibles. Por lo tanto, la frase "que se puede obtener de" o la frase "que puede ser obtenido de" significa que abarca compuestos o composiciones que son obtenibles de cúrcuma, jengibre o té verde y por lo tanto abarca formas sintéticas de los mismos compuestos y/o composiciones así como los mismos compuestos y/o composiciones obtenidos de otras fuentes. En una primera modalidad, la composición de la presente invención incluye un primer ingrediente obtenible de jengibre, y un segundo ingrediente obtenible de té verde, en una cantidad segura y efectiva para proveer uno o más de los efectos benéficos descritos aquí. El primer ingrediente de la composición de la presente invención se puede obtener de jengibre (Zingiber officinale, también comúnmente llamado raíz de jengibre). Nativo de sur de Asia, el jengibre es una planta perenne de 0.61 a 1.22 metros que produce hojas similares al pasto de hasta 0.30 metros de longitud y casi 2.54 cm. de ancho. La raíz de jengibre, como se llama en las tiendas de abarrotes, realmente consiste del tallo subterráneo de la planta, cuya cubierta exterior en forma de corteza es raspada. Los compuestos activos de jengibre que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, 1 ,8-cineol, 10-deshidrogingerdion, 10-gingerol, 6-gingerdiona, 6-gingerol, 6-shogaol, 8-ß-17-epoxi-?-trans-12-eno-15,16-diol, 8-gingerol, 8-shogaol, 9-oxo-nerolidol, acetaldehído, ácido acético, alanina, ácido a-linolénico, ácido a-linolénico, a-felandreno, a-pieno, a-terpineno, a-terpineol, a-zingibereno, ar-curcumeno, arginina, ácido ascórbico, asparagina, ß-bisabolol, ß-caroteno, ß-elemeno, ß-eudesmol, ß-ionona, ß-mirceno, ß-felandreno, ß-pineno, ß-selineno, ß-sesquifelandreno, ß-sitosterol, ß-tujona, acetato de bornilo, boro, ácido cafeico, calcio, alcamfeno, alcanfor, ácido cáprico, ácido caprílico, capsaicina, cariofileno, cavicol, ácido clorogénico, cromio, citral, citronelal, citronelal, cobalto, cobre, eumeno, curcumina, cistina, delfinidina, d-cadineno, elemol, acetato de etilo, miristato de etilo, farnesal, fameseno, ácido ferúlico, furfural, ácido ?-aminobutírico, ?-terpineno, geranial, geraniol, acetato de geranilo, gingerenona, ácido glutámico, glicina, hexahidrocurcumina, histidina, isogingerenona-B, isoleucina, alcanferol, lecitina, limoneno, ácido linoleico, magnesio, manganeso, metionina, mufa, mireceno, miricetin, ácido mirístico, neral, nerol, nerolidol, niacina, níquel, ácido oleico, ácido oxálico, ácido p-coumárico, p-cimeno, ácido p-hidroxi-benzoico, ácido palmítico, ácido pantoténico, paradol, alcohol de pachulí, fenilalanina, quercetin, riboflavin, selenio, ácido shiquímico, terpinen-4-ol, tiamina, triptofano, ácido vanílico, vanillina, zinc, y zingerona. También se pueden utilizar mezclas de dos o más de estos compuestos activos. El primer ingrediente de la composición de la presente invención, que se puede obtener del jengibre, se puede incorporar en la composición de la presente invención en muchas formas diferentes incluyendo extractos tales como extractos de polvo de jengibre, extractos de fluido de jengibre, polvo de jengibre que incluye polvo de raíz de jengibre, y uno o más compuestos activos de jengibre, partes de o plantas enteras de jengibre, tinturas de los mismos y mezclas de los mismos. Preferiblemente, el primer ingrediente de la composición de la presente invención se selecciona de extracto de jengibre y polvo de raíz de jengibre. Cada gramo de la composición de la presente invención preferiblemente contiene aproximadamente 1 mg a aproximadamente 150 mg de polvo de raíz de jengibre. Muy preferiblemente, cada gramo de la composición contiene aproximadamente 6 mg a aproximadamente 110 mg de polvo de raíz de jengibre. Estos intervalos usan, como una línea basal, el uso de polvo de raíz de jengibre, por ejemplo, Stryka Botanics en la formulación ingerida y Ginger Extract K (Aquaresin® Ginger), por ejemplo, Kalsec®, Inc. de Kalamazoo, Michigan en la formulación de aspersión. Las cantidades de varios ingredientes se dan aquí en términos de una forma del ingrediente, es decir, polvo de raíz de jengibre. Si ese ingrediente está presente en otra forma, entonces la cantidad que se ha de utilizar es aquella cantidad que proveerá la misma cantidad de uno o más compuestos activos que la cantidad del ingrediente dado aquí. Por ejemplo, si se utiliza una tintura de jengibre, la cantidad de la tintura utilizada será la cantidad que provea las mismas cantidades de uno o más compuestos activos que se proveerían por las cantidades de polvo de raíz de jengibre anteriormente especificado. Esto se aplica a todos los ingredientes para los cuales las cantidades se dan aquí para una forma en particular de ese ingrediente. El segundo ingrediente de la composición de la presente invención se puede obtener de té verde. El segundo ingrediente obtenido de té verde puede tener un efecto antioxidante. El té verde son las hojas secas y retoños de hojas del arbusto Camellia sinensis. Es principalmente producido en China y Japón. Las hojas de té verde están compuestas principalmente de compuestos fotoquímicos conocidos como polifenoles (aproximadamente 36%), principalmente flavonoles (incluyendo catequinas), flavonoides y flavondioles. Las hojas también contienen alcaloides vegetales (aproximadamente 4%), incluyendo cafeína, teobromo y teofilina. Las actividades farmacológicas de té verde se deben principalmente a sus compuestos activos. Los compuestos activos del té verde útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, flavonoles, catequinas, flavonoides, flavondioles, alcaloides vegetales, cafeína, teobromo, teofilina, ácidos fenólicos, proteínas, carbohidratos y minerales. El segundo ingrediente que se puede obtener del té verde se puede incluir en la composición en forma de polvo de té verde, extractos de té verde tales como extractos de polvo de té verde, extractos de fluido de té verde y uno o más compuestos activos de té verde, parte de o plantas de té verde enteras, hojas de té verde, tinturas de los mismos o mezclas de los mismos. Preferiblemente, el segundo ingrediente de la composición de la presente invención se selecciona de hojas de té verde, polvo de té verde y extracto de té verde. Muy preferiblemente, el segundo ingrediente de la composición de la presente invención es extracto de té verde. Cada gramo de la composición de la presente invención preferiblemente contiene aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg de extracto de té verde. Muy preferiblemente, cada gramo de la composición contiene aproximadamente 4 mg a aproximadamente 15 mg de extracto de té verde. Estos intervalos usan, como una línea basal, el uso de té verde, por ejemplo, Stryker Botanics en la formulación ingerida y Green Tea Extract, por ejemplo, Phytoway, Inc., ChanSha, P.R. China, en la formulación en aspersión. Los ingredientes de la composición de la presente invención, que se pueden obtener de jengibre y té verde y cúrcuma, se pueden usar en formas de polvo de cúrcuma, polvo de jengibre y polvo de té verde, cada uno de los cuales puede ser molido desde el rizoma de cúrcuma, raíz de jengibre y hojas de té verde, respectivamente. Para un compuesto activo particular de jengibre, té verde o cúrcuma, para el cual se conoce una vía sintética, se puede sintetizar el compuesto activo. Los extractos de plantas, si se desea, se pueden preparar como se describe más adelante. Alternativamente, el polvo de cúrcuma, polvo de té verde y/o uno o más de los compuestos activos contenidos en los mismos se pueden comprar de fuentes comerciales tales como Kelsec®, Inc. de Kalamazoo, Ml. Los extractos vegetales, v.gr., extracto del cúrcuma, extracto de jengibre, extracto de té verde y extracto de rábano picante se pueden usar en las composiciones de la invención, pueden ser producidos usando procedimientos de extracción comunes. Alternativamente, los extractos se pueden comprar de fuentes comerciales tales como Kelsec®, Inc. Kalamazoo, Ml. Los procedimientos para la preparación de extractos vegetales farmacológicamente o biológicamente activos en una forma de dosis administrable conveniente de cualquiera de las plantas mencionadas anteriormente, son bien conocidos en la técnica. La composición de la presente invención se puede usar para tratar infección viral, ya que la composición de la presente invención tiene propiedades antimicrobianas significativas como se demuestra por los ejemplos de esta solicitud. La composición de la presente invención también se puede usar en una composición terapéutica para tratar uno o más síntomas de una infección viral, incluyendo dolor de garganta, congestión, laringitis, mucositis y/o inflamación de membrana mucosa al administrar a un paciente que padece uno o más de estos síntomas o padecimientos. La composición de la presente invención también se puede utilizar para reducir la incidencia de contraer una enfermedad. En esta aplicación de la composición de la presente invención, una cantidad segura y efectiva de la composición de la presente invención se administra a un mamífero o ave que ha sido o será expuesto a una enfermedad causada por un microbio, para reducir la incidencia de contener dicha enfermedad, en relación con un mamífero o un ave que ha sido o será expuesto a una enfermedad causada por un microbio al cual la composición de la presente invención no se ha administrado. Preferiblemente, la composición de la presente invención se puede formular en cualquier forma de dosis aceptable incluyendo, pero sin limitarse a cápsulas, tabletas, pastillas, trociscos, caramelos duros, polvos, aspersiones, geles, elíxires, jarabes y suspensiones o soluciones. La composición de la presente invención también se puede administrar en forma de un complemento nutricional, en cuyo caso la composición de la invención puede ser el complemento nutricional o puede formar parte de un complemento nutricional que contiene ingredientes adicionales. La composición de la presente invención también se puede formular con un vehículo aceptable. El vehículo aceptable puede incluir, pero no se limita a: (a) carbohidratos incluyendo edulcorantes, muy preferiblemente, fructosa, sacarosa, azúcar, dextrosa, almidón, lactosa, maltosa, maltodextrinas, sólidos de jarabe de maíz, sólidos de miel, complementos nutricionales en tabletas comerciales incluyendo Emdex™, Mor-Rex™, Royal-T™, Di-Pac™, Sugar-Tab™, Sweet-Rex™, y New-Tab™; (b) alcoholes de azúcar incluyendo manitol, sorbitol y xilitol; y (c) varios excipientes relativamente insolubles incluyendo fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, carbonato de calcio, celulosa microcristalina y otros ingredientes formadores de tabletas. Pastillas, tabletas y trociscos de esta invención pueden diferir en forma, tamaño y técnica de fabricación. En el caso de tabletas, para uso oral, el vehículo aceptable puede incluir además lactosa y almidón de maíz. Los agentes lubricantes también se pueden añadir a las tabletas, incluyendo, por ejemplo, estearato de magnesio, lauriisulfato de sodio y talco. Las tabletas también pueden contener excipientes tales como citrato de sodio, carbonato de calcio y fosfato de calcio. También se pueden utilizar desintegrantes tales como almidón, ácido algínico y silicatos en complejo. Las tabletas también pueden incluir agentes aglutinantes tales como polivinilpirrolidona, gelatina, PEG-8000 y goma acacia. En el caso de trociscos para uso oral, el vehículo aceptable común puede incluir además un aglutinante tal como PEG-8000. Preferiblemente, las pastillas pesan aproximadamente 0.1 a aproximadamente 15 gramos para proveer una tasa de disolución adecuada cuando se toma oralmente. Muy preferiblemente, las pastillas pesan aproximadamente 1 a aproximadamente 6 gramos. La producción de pastillas es bien conocida en la técnica y cualquier experto en la técnica puede producir fácilmente pastillas con las composiciones de la presente invención. La composición es preferiblemente almacenada en un contenedor hermético al aire y en un lugar oscuro frío. Las tabletas y trociscos se pueden fabricar usando procedimientos conocidos en la técnica con cambios menores en los ingredientes opcionales. Dichos cambios están dentro del alcance de un experto en la técnica. Alternativamente, la composición de la presente invención se puede formular en forma líquida, tal como jarabes, enjuagues bucales o aspersiones, con un solvente o dispersante tal como agua, u otros líquidos y opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, para suministro repetido de la composición a membranas mucosas orales y orofaríngeas durante un período sostenido. Preferiblemente, el tiempo de tratamiento es de aproximadamente 5 a 60 minutos, y muy preferiblemente de aproximadamente 20 a 30 minutos, para permitir un contacto prolongado de la composición con tejido de boca y garganta. Alternativamente, dicha formulación puede estar en una forma concentrada adecuada para diluirse con agua u otros materiales antes de usarse. Las composiciones también se pueden formular en formas masticables tales como un caramelo blando, goma, gotas, caramelos rellenos de líquido y bases de goma masticables, o en forma de productos dentales tales como pastas dentales y enjuagues bucales. Durante el uso, la composición masticable es preferiblemente retenida en la boca durante un período sostenido de preferiblemente aproximadamente 5 a 60 minutos, y muy preferiblemente de aproximadamente 20 a 30 minutos. Los productos dentales se pueden usar de la manera ordinaria de uso de dichos productos. La composición de la invención se puede formular en forma de cápsula, con o sin diluyentes. Para cápsulas, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se utilizan suspensiones, se pueden utilizar agentes emulsionantes y/o de suspensión en las suspensiones. Además, las composiciones sólidas incluyen uno o más de los ingredientes de las pastillas descritas anteriormente se pueden utilizar en cápsulas de gelatina blanda y dura. La composición de la presente invención también se puede formular en una composición de aerosol nasal o inhalante. Dicha composición se puede preparar usando técnicas bien conocidas. Para esos tipos de formulaciones, vehículos adecuados pueden incluir los siguientes ingredientes: solución salina con uno o más conservadores, promotores de absorción para incrementar la biodisponibilidad, fluorocarbonos, y/o agentes solubilizantes o de dispersión convencionales.

Otros materiales que se pueden incluir opcionalmente en la composición de la presente invención, incluyen resveratrol (trihidroxistilbeno), inositol, otras vitaminas del complejo B y antiinflamatorios adicionales. También, ingredientes tales como edulcorantes, saborizantes, agentes colorantes, tintes, conservadores, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes de fusión, excipientes, demulcentes y solventes o diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y varias combinaciones de los mismos se pueden incluir en la composición de la presente invención. En una modalidad opcional, la composición de la presente invención incluye uno o más ingredientes obtenibles de cúrcuma, en una cantidad segura y efectiva para proveer uno o más de los efectos benéficos descritos aquí. Cúrcuma (Cúrcuma tonga), o Haldi in Hindi, se usa muy ampliamente como medicina así como ingrediente común en la cocina india. El rizoma de cúrcuma se usa en medicina y alimento como un polvo fino. El pigmento amarillo del rizoma de cúrcuma está compuesto de tres compuestos conocidos como curcuminoides. Los tres curcuminoides son curcumina (diferuloilmetano), desmetoxicurcumina (hidroxicinamoil feruloilmetano), y bis-desmetoxicurcumina (dihidroxidicinamoilmetano) (véase Drug Análisis, Chromatography and Microscopy, p. 169, Ann Arbor Science Inc., 1973). Los aceites esenciales de cúrcuma (Cúrcuma longa) están compuestos principalmente de los siguientes compuestos: d-alcanfor (aproximadamente 1 %), ciclo-isoprenomirceno (aproximadamente 85%), y p- tolilmetilcarbinol (aproximadamente 5%), (véase E. Gunther, The Essential Oil, pp. 123-4, Van Nostrand Co., 1955). El ingrediente de la composición de la presente invención, obtenido a partir de cúrcuma, preferiblemente incluye curcuminoides, tales como curcumina (diferuloilmetano), desmetoxicurcumina (hidroxicinamoil feruloilmetano), y bis-desmetoxicurcumin (dihidroxidicinamoil metano), y mezclas de dos o más de estos curcuminoides. Los métodos para aislar curcuminoides de cúrcuma son conocidos (véase Janaki y Bose, An Improved Method for the Isolation of Curcumin From Turmeric, J. Indian Chem. Soc. 44:985, 1967).

Alternativamente, los curcuminoides para usarse en la presente invención se pueden preparar por métodos sintéticos. El ingrediente, que se puede obtener de cúrcuma, se puede incorporar en la composición de la presente invención en una variedad de diferentes formas. Estas formas diferentes preferiblemente incluyen extractos de cúrcuma tales como extractos de polvo de cúrcuma, extractos de fluido de cúrcuma, uno o más de los compuestos curcuminoides y polvo de cúrcuma, partes de plantas o plantas enteras de cúrcuma, tinturas del mismo y mezclas de los mismos. Muy preferiblemente, el ingrediente opcional obtenible de cúrcuma es un extracto de cúrcuma. Cuando el ingrediente obtenible de cúrcuma se usa, cada gramo de la composición de la presente invención preferiblemente contiene aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg de extracto de polvo de cúrcuma. Muy preferiblemente, cada gramo de las composiciones contiene de aproximadamente 6 mg a aproximadamente 15 mg de extracto de polvo de cúrcuma. Estos intervalos se basan en el uso de extracto de cúrcuma 95%, por ejemplo, Pharmline, Inc. en la formulación ingerida y extracto de raíz de cúrcuma (Oleoresin Turmeric), por ejemplo, Kalsec®, Inc., Kalamazoo, Michigan, en la formulación de aspersión. También, la composición de la presente invención puede incluir uno o más ingredientes obtenibles de raíz de rábano picante, en una cantidad segura y efectiva para proveer uno o más de los efectos benéficos descritos aquí. El ingrediente opcional obtenible de raíz de rábano picante puede incluir extractos de Cochlearia Armoracia. El rábano picante contiene aceites volátiles que son similares a aquellos encontrados en la mostaza. Estos incluyen glucosinolatos (glucósidos de aceite de mostaza), gluconasturtina, y sinigrina, que producen isotiocinato de alilo cuando se rompen en el estómago. Etanol, propilenglicol y glicerina y varias combinaciones de los mismos, se pueden incluir opcionalmente en la composición de la presente invención, hasta aproximadamente 10% en peso del total como ingredientes activos adicionales. Muy preferiblemente, hasta aproximadamente 10% en peso total de etanol se añade como un ingrediente activo. Muy preferiblemente, 2.5 a 7% de etanol se añade. Los edulcorantes opcionales se pueden usar en la composición de la presente invención incluyen pero no se limitan a sacarina, aspartame, ciclamatos, acesulfame K, neohesperidindihidrocalcone, otros super-edulcorantes y mezclas de los mismos, que se pueden añadir al vehículo en cantidades suficientemente bajas para un para no interactuar químicamente con los ingredientes principales de la composición. Los saborizantes opcionales que se pueden usar en la composición de la presente invención incluyen pero no se limitan a menta, menta-mentol, eucaliptol, gaulteria, orozuz, clavo, canela, hierbabuena, cereza, limón, naranja, lima, mentol y varias combinaciones de los mismos. Preferiblemente, los ingredientes principales descritos anteriormente, que se pueden suministrar de jengibre, té verde y, opcionalmente, cúrcuma, constituyen de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 90% en peso de la composición total. Muy preferiblemente, los ingredientes principales constituirán aproximadamente 10 a aproximadamente 70% en peso de la composición total. Muy preferiblemente, los ingredientes principales pueden constituir aproximadamente 20% a aproximadamente 40% en peso de la composición total. Los ingredientes de la composición que no son vehículo, incluyendo los ingredientes obtenibles de cúrcuma, jengibre y té verde como se describió antes, se pueden incrementar o reducir proporcionalmente en la composición de la presente invención dependiendo de la cantidad de vehículo usado en la composición, sin afectar sustancialmente la efectividad de la composición para su uso destinado.

La reducción o prevención de la transmisión se refiere a prevenir o reducir la diseminación de un microbio de un paciente (infectado) a otro paciente (no infectado). Algunos pacientes pueden ser considerados portadores de la infección. Los portadores son individuos que activamente comparten microbios pero no padecen de una infección aguda. Se puede decir que esos portadores son persistentemente (o crónicamente) infectados con el microbio. Además del portador persistentemente infectado, otros individuos infecciosos pueden ser aquellos que son activamente infectados, y particularmente aquellos en las etapas tempranas o tardías de una infección aguda. Un aspecto de la invención se refiere a la administración a un mamífero o un ave infectado con un microbio, una composición de la presente invención, para prevenir la diseminación de la enfermedad a otros mamíferos o aves y/o reducir los síntomas de la enfermedad en el mamífero o ave infectado. El tratamiento profiláctico está destinado a un paciente que pronto será expuesto a un microbio o recientemente ha sido expuesto a un microbio. Dicho tratamiento profiláctico puede ser efectivo ya sea solo o para aumentar una vacuna. El tratamiento profiláctico también se puede usar contra microbios para los cuales aún no hay una vacuna disponible. En el caso de tratamiento profiláctico, la composición de la invención se administra a un paciente que será expuesto a un microbio o que recientemente ha sido expuesto a un microbio para el propósito de reducir la incidencia de infección activa por el microbio en ese paciente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para reducir, tratar o prevenir por lo menos un síntoma o efecto adverso de infección viral al administrar, a un paciente infectado con un virus, una composición de la presente invención, incluyendo ingredientes que se pueden obtener a partir de jengibre y té verde. En el método, el paciente puede ser un humano, un sistema de células in vitro o un animal. Preferiblemente, el paciente es un mamífero, muy preferiblemente un humano. En el método, el virus que puede ser inhibido por la administración de la composición de la presente invención incluye, entre otros virus, rinovirus, virus de la influenza, virus del Nilo occidental, virus de herpes simple, VIH-1 , VIH-2, adenovirus, comavirus, virus de la influenza, virus de rubéola, virus de fiebre amarilla y virus de sincicios respiratorios (RSV). En una modalidad preferida, los virus que pueden ser inhibidos por la administración de la composición incluye por lo menos rinovirus humano 16, virus de herpes 1 (HSV-1 ), Influenza A/Moscow/10/99, influenza aviar A (H5N1 ), y B/Guangdong/120/00. Alternativamente, el paciente puede ser un miembro de las especies de aves (aviar), que incluye las aves de corral comerciales comunes: pavos, patos, gansos y pollos, menos comúnmente el avestruz así como otras especies de aves que comúnmente se mantienen como mascotas, por ejemplo canarios y pericos. La composición se puede administrar rociando directamente la composición del pasaje nasal del ave o la composición se puede administrar creando una niebla a través de la cual también en las aves.

Por lo tanto, la composición se puede dar profilácticamente para actuar como un virucida o de alguna manera virustática. Alternativamente, la composición se puede usar para reducir la transmisividad del virus. Los síntomas causados por una infección viral, que se puede tratar, reducir o por lo menos parcialmente prevenir por este método de la presente invención, pueden incluir uno o más de dolor de cabeza, dolor de articulaciones, fiebre, tos, estornudo, dolor muscular, catarro, boca reseca, mareo y otros síntomas relacionados con infección viral. En aves, estos síntomas incluyen una falta de energía, reducción de ojos disminuida, huevos con cascarón blando, una hinchazón de la cabeza, párpados, etc., escurrimiento nasal, tos o diarrea. En el método, los microorganismos que pueden ser inhibidos por administración de la composición de la presente invención incluyen bacterias gram-positivas tales como Streptococcus, Staphylococcus, bacterias gram-negativas tales como E. coli, Pseudomonas, Haemophilus y hongos tales como Histoplasma y Blastomycosis y levaduras tales como C. albicans y Crytococcus. La cantidad efectiva de la composición variará dependiendo de factores tales como el paciente que está siendo tratado, el modo particular de administración, la actividad de los ingredientes activos particulares utilizados, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente, tiempo de administración, tasa de excreción, la combinación particular de ingredientes utilizados, el contenido total del ingrediente principal de la composición, y la severidad de la enfermedad por síntoma. Está dentro del alcance del experto en la técnica dar razón de estos factores. La composición se puede administrar aproximadamente 1 a aproximadamente 15 veces al día, según sea necesario, muy preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 12 veces al día, según sea necesario, o muy preferiblemente, aproximadamente 6 a aproximadamente 10 veces al día, según sea necesario. La composición de la presente invención se puede administrar en cualquier forma de dosis aceptable, como se describió antes, incluyendo pero sin limitarse a tabletas, cápsulas, pastillas, trociscos y caramelos, polvos, aspersión oral, aspersiones nasales, geles, elíxires, jarabes, composiciones masticables, productos dentales, suspensiones y soluciones. Cada dosis de la composición contiene una cantidad segura y efectiva de la composición de la presente invención. Una cantidad efectiva de cada administración terapéutica contiene un total de aproximadamente 0.1 gramo a aproximadamente 1 gramo de los ingredientes, que se pueden obtener de jengibre y té verde. Muy preferiblemente, una cantidad efectiva de la composición para cada administración terapéutica contiene un total de aproximadamente 0.2 gramos a aproximadamente 0.5 gramos de los ingredientes que se pueden obtener de jengibre y té verde. Las cantidades de los diversos ingredientes de la composición administrada de conformidad con el método de la presente invención son las mismas que se dieron anteriormente para la composición de la presente invención.

Preferiblemente, durante cada administración oral de la composición, la composición se mantiene en la boca por lo menos durante aproximadamente 5 a aproximadamente 60 minutos para permitir que los ingredientes principales de la composición entran en contacto con el tejido bucal o garganta antes de que se disuelvan completamente. Muy preferiblemente, la composición se mantiene en la boca por lo menos aproximadamente 15 a aproximadamente 30 minutos. Cuando la administración se administra como una aspersión, las cantidades de cada uno de los ingredientes activos se puede reducir a medida que la composición de aspersión suministra los ingredientes activos más directamente en el lugar en donde se necesitan en comparación con, por ejemplo, la pastilla o cápsula. Los siguientes intervalos definidos definen composiciones de conformidad con la invención que son adecuados para administrarse en una formulación de aspersión de conformidad con los métodos de la invención. Cada gramo de la composición administrada en una aspersión de conformidad con los métodos de la presente invención preferiblemente contienen aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg de jengibre aquaresin®. Muy preferiblemente, cada gramo de la composición contiene aproximadamente 3 mg a aproximadamente 7 mg de jengibre aquaresin®. Cada gramo de la composición administrada en aspersión de conformidad con los métodos de la presente invención preferiblemente contienen aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg de extracto de hojas de té verde. Muy preferiblemente, cada gramo de la composición contiene aproximadamente 4 mg a aproximadamente 15 mg de extracto de hojas de té verde.

Cada gramo de una modalidad opcional de una composición administrada en una aspersión de conformidad con los métodos de la presente invención preferiblemente contiene aproximadamente 1 mg a aproximadamente 12 mg de cúrcuma de oleorresina soluble. Muy preferiblemente, cada gramo de la composición contiene aproximadamente 4 mg a aproximadamente 9 mg de cúrcuma de oleorresina soluble.

La invención se ilustrará además mediante los ejemplos que se dan a continuación que no deben considerarse como limitantes de la invención de ninguna manera. El alcance de la invención se ha de determinar por las reivindicaciones anexas a la misma.

EJEMPLO 1 Una composición de la presente invención Una composición de la presente invención formulada en la forma de pastillas se preparó usando el procedimiento descrito anteriormente. Los ingredientes de la pastilla se listan a continuación: Azúcar 1 g Corteza de olmo norteamericano 118 mg Extracto de cúrcuma (5% de curcumina) 18 mg Raíz de jengibre 140 mg Raíz de rábano picante 70 mg Extracto de hoja de té verde (30% de catecina y polifenoles) 14 mg EJEMPLO 2 Tratamiento de dolor de garganta Cada uno de siete pacientes, que padecían dolor de garganta, ingirieron una pastilla formulada de conformidad con el ejemplo 1 cada dos horas sosteniendo la pastilla en su boca durante 15-30 minutos hasta que la pastilla se disolvió por completo. Ningún paciente requirió más de 10 pastillas en algún día dado. Los pacientes que se trataron reportaron alivio completo de los síntomas de dolor de su garganta después de ingerir de 2 a 20 pastillas. También se encontró que cada pastilla puede proveer alivio de dolor de garganta hasta durante 6 horas.

EJEMPLO 3 Prueba in vitro de actividad virucida de la composición El protocolo de prueba in vitro para actividad virucida utilizada en este ejemplo usa rinovirus humano 16 (de aquí en adelante "HRV-16") como el virus objetivo, y la línea de células MRC-5 relacionada con tejidos humanos descritos por Jacobs et al., Characteristics of Human diploid MRC-5, Nature (London), 227:168-170 (1970) como la célula hospedero para los virus HRV-16. Infectividad de virus residual después de la incubación de las sustancias de prueba con el virus se tituló sobre la línea de células MRC-5 para el crecimiento de rinovirus marcando visualmente el efecto citopático (CPE) inducido por replicación de virus a través de observación microscópica. De manera más específica, CPE observando formación de balón/redondeo de células en el cultivo de MRC-5. Para determinar la actividad virucida, la composición del ejemplo 1 (de aquí en adelante "sustancia 1 "), se utilizó en una dilución inicial de 1/20 y después se diluyó adicionalmente mediante diluciones en serie en solución salina. Las composiciones diluidas se incubaron con HRV-16 durante un período de tiempo fijado y después la reacción se terminó ajustando a un pH neutro con un medio de infección de células. La solución resultante se tituló después sobre células MRC-5 a una dilución de 1/10 a través de una placa de prueba para llevar a cabo la infección de las células. Cada placa alojó un control de virus que contenía sólo células MRC-5 infectadas con HRV-16, y un control de células, que contenía solo células MRC no infectadas. Las placas se incubaron además durante 4 días después de la infección. La infectividad viral residual se midió usando la prueba descrita anteriormente. A partir de los resultados mostrados en los cuadros 1 -4, todos los controles sobre la placa funcionaron bien. A partir de la prueba, se concluyó que la sustancia 1 , en la dilución 1/20, fue efectiva para producir una reducción log viral de HRV-16 de 1 .50 (-log10 TCID50) en el período de incubación de 1 minuto. Una dilución de 1 /40 de la sustancia 1 produjo una reducción log de 1.00 (-log10 TCID50) también en un período de incubación de 1 minuto. Después de los períodos de incubación de 2 minutos y 5 minutos, reducciones A log en título de HRV-16 se lograron. Por lo tanto, estos resultados tienden a indicar y un tipo de contacto de 1 minuto entre la sustancia 1 y HRV-16 produciría la reducción de título viral más efectiva. El cuadro 1 muestra los títulos de virus residuales y reducciones log de rinovírus infeccioso 16 sobre células MRC-5 en un punto de tiempo de terminación, de la sustancia 1 a diferentes diluciones.

CUADRO 1 Los cuadros 2-4 muestran los resultados de un segundo ensayo sobre títulos de virus residuales y las reducciones log de HRV-16 infecciosos sobre células MRC-5 en tres puntos de tiempo de terminación diferentes, de la sustancia 1 a diferentes diluciones.

CUADRO 2 CUADRO 3 CUADRO 4 Pruebas virucidas similares se han llevado a cabo para la sustancia 1 usando otros virus, incluyendo virus de herpes 1 (HSV-1 ) usando células Vero como la célula hospedero, Influenza A/Moscow/10/99, y B/Guangdong/120/00 usando células MDCK como la célula hospedero.

Resultados sobre estas pruebas virucidas se resumen a continuación en los cuadros 5-13.

Los cuadros 5-7 muestran los títulos de virus residuales y reducciones log de HSV-1 sobre células Vero en tres puntos de tiempo de terminación diferentes, de la sustancia 1 a diferentes diluciones.

CUADRO 5 Diluciones de Título de control 1 minuto de incubación sustancia 1 de HSV-1 (-log10 Título de HSV-1 Reducciones log TCIDso) residual (-logio de HSV-1 (-log10 TCIDSQ) TCIDSQ) 1/40 3.80 0.00 3.80 1/80 3.80 0.00 3.80 1/160 3.80 2.80 1.00 1/320 3.80 2.80 1.00 1 /640 3.80 2.80 1 .00 CUADRO 6 Diluciones de Título de control 2 minutos de incubación sustancia 1 de HSV-1 (-logio Título de HSV-1 Reducciones log TCID50) residual (-logio de HSV-1 (-log10 TCID50) TCID50) 1/40 3.80 0.00 3.80 1/80 3.80 0.00 3.80 1 /160 3.80 1 .80 2.00 1 /320 3.80 2.80 1 .00 1 /640 3.80 2.80 1 .00 CUADRO 7 Diluciones de Título de control 5 minutos de incubación sustancia 1 de HSV-1 (-logio Título de HSV-1 Reducciones log TCID50) residual (-log-io de HSV-1 (-log10 TCID50) TCID50) 1/40 3.80 0.00 3.80 1 /80 3.80 0.00 3.80 1/160 3.80 1.80 2.00 1/320 3.80 2.80 1.00 1 /640 3.80 2.80 1.00 Los cuadros 8-10 muestran los títulos de virus residuales y reducciones log de influenza A/Moscow/10/99 en tres puntos de tiempo de terminación diferentes, de sustancia 1 a diferentes diluciones.

CUADRO 8 Diluciones de Título de virus 1 minuto de incubación sustancia 1 A/Moscow Título A/Moscow Reducciones log (-log10 TCID50) residual (-logio de A/M seo w TCID50) (-log10 TCID5o) 1/10 2.80 0.00 2.80 1/20 2.80 0.00 2.80 1/40 2.80 1.80 1.00 1/80 2.80 1.80 1.00 1/160 2.80 1.80 1.00 1/320 2.80 1.80 1.00 1 /640 2.80 1.80 1.00 Regulador de pH de 2.80 1.80 1.00 citrato CUADRO 9 Diluciones de Título de virus 2 minutos de incubación sustancia 1 A/Moscow Título A/Moscow Reducciones log (-log10 TCID50) residual (-log10 de A/Mscow TCIDSQ) (-logio TCIPso) 1/10 2.80 0.00 2.80 1/20 2.80 0.00 2.80 1/40 2.80 1.80 1.00 1/80 2.80 1.80 1.00 1/160 2.80 1.80 1.00 1/320 2.80 1.80 1.00 1/640 2.80 1.80 1.00 Regulador de pH de 2.80 1.80 1.00 citrato CUADRO 10 Diluciones de Título de virus 5 minutos de incubación sustancia 1 A/Moscow Título A/Moscow Reducciones log (-log10 TCID50) residual (-log10 de A/Mscow TCID50) (-log10 TCID5o) 1/10 2.80 0.00 2.80 1/20 2.80 0.00 2.80 1/40 2.80 1.80 1.00 1/80 2.80 1.80 1.00 1/160 2.80 1.80 1.00 1/320 2.80 1.80 1.00 1/640 2.80 1.80 1.00 Regulador de pH de 2.80 0.00 2.80 citrato Los cuadros 11 -13 muestran los títulos de virus residuales y reducciones log de Influenza B/Guangdong/120/00 en tres puntos de tiempo de terminación diferentes, de sustancia 1 a diferentes diluciones.

CUADRO 11 Diluciones de Título de virus 1 minuto de incubación sustancia 1 B/Guangdong Título Reducciones log (-log10TCID50) B/Guangdong de B/Guandong residual (-log10 TCID50) (-log10TCID50) 1/10 1.80 0.00 1.80 1/20 1.80 0.00 1.80 1/40 1.80 1.80 0.00 1/80 1.80 1.80 0.00 1/160 2.30 1.80 0.50 1/320 2.30 1.80 0.50 1/640 1.80 2.30 -0.50 Regulador de pH de 1.80 0.00 1.80 citrato CUADRO 12 Diluciones de Título de virus 2 minutos de incubación 1/20 1.80 0.00 1.80 1/40 1.80 1.80 0.00 1/80 1.80 1.80 0.00 1/160 2.30 1.80 0.50 1/320 2.30 1.80 0.50 1/640 1.80 2.80 -1.00 Regulador de pH de 1.80 0.00 1.80 citrato CUADRO 13 Diluciones de Título de virus 5 minutos de incubación 1/40 1.80 1.80 0.00 1/80 1.80 1.80 0.00 1/160 2.30 1.80 0.50 1/320 2.30 1.80 0.50 1/640 1.80 2.80 -1.00 Regulador de pH de 1.80 0.00 1.80 citrato Como se puede ver a partir de los resultados anteriores, la sustancia 1 es efectiva para inhibir o exterminar el virus de la influenza y rinovirus humano. Como resultado, la sustancia 1 puede ser efectiva para tratar influenza y resfriados comunes.

EJEMPLO 4 Prueba in vitro de actividad virustática de la composición El protocolo de prueba in vitro para actividad virucida utilizada en este ejemplo usó rinovirus humano 16 (HRV-16) como el virus objetivo, y la línea de células Hela sensible a rinovirus relacionada con tejidos humanos descrita por Conant et al., (Basis for a Numbering system. I. Hela for Propagation and Serologic Procedure, J. Immunol., 100:107-113, 1968) como la célula hospedero para el virus HRV-16. La sustancia 1 se disolvió en un medio de infección a las siguientes diluciones: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320. Estas diluciones se incubaron sobre placas de células MRC-5 durante 30 minutos a 37°C (5% CO2). Después de el período de incubación, cada dilución de la sustancia 1 con células MRC-5 en un pozo de las placas se sometió a HRV-16 a un título conocido de 2.30 (-logio TCID50). Cada placa alojó un control de virus (las células Hela infectadas con virus HRV-16 y sin sustancia 1 ), un control de células (únicamente células Hela) y los controles de compuesto de prueba a diferentes diluciones (células Hela con la sustancia de prueba únicamente). Todas las otras muestras sobre la placa contenían las células Hela infectadas con virus HRV-16 y sustancia 1 a diferentes diluciones. Las placas después se incubaron durante 4 días después de la infección. La infectividad de virus residual después de la incubación de la sustancia 1 con el virus se tituló sobre la línea de células Hela para crecimiento de rinovirus midiendo el efecto citompático (CPE) inducido por el virus usando el siguiente procedimiento. Las células Hela viables restantes después de la incubación con la sustancia 1 se tiñeron con solución de cristal violeta. El exceso de cristal violeta se removió lavando y las células teñidas con cristal violeta se solubilizaron usando una mezcla de metanol y ácido acético. La absorbancia de la solución se midió después a 540 nm con lector de placa ELISA. El nivel de CPE inducido por virus fue inversamente proporcional a la absorbancia.

Los resultados generados a partir de la prueba de cristal violeta permitieron que la concentración tóxica y la concentración efectiva de la sustancia 1 se determinarán mediante ajuste de una ecuación, y = mx + c, en donde x corresponde a la disolución de la sustancia 1 y y corresponde a porcentaje de toxicidad de la sustancia 1 a las células. A partir de esta ecuación, la CT50 (concentración a la cual la sustancia 1 indica 50% de toxicidad a las células) es a una dilución de 1/571 de la sustancia 1. Este resultado se correlaciona bien con el porcentaje de células supervivientes a varias diluciones de la sustancia 1 , que también se midió usando la prueba de cristal violeta, como se muestra en el cuadro 14 siguiente.

CUADRO 14 Usando la misma ecuación en donde x aún corresponde a la dilución de la sustancia 1 y y corresponde al por ciento de eficacia de la sustancia 1 en presencia del virus, la CE50 (concentración a la cual la sustancia de prueba indica 50% de eficacia en la presencia de virus) se determinó que estaba a una dilución de 1/19 de la sustancia 1. Este resultado se correlaciona bien con el porcentaje de las células viables a varias diluciones de la sustancia 1 medidas usando la prueba de cristal violeta, como se muestra en el cuadro 15 siguiente.

CUADRO 15 En los cuadros 14 y 15, el % de células sobrevivientes = (únicamente compuesto/únicamente célula) x 100; y % de células viables = (únicamente células - compuesto + virus) / (únicamente células - únicamente virus) x 100. "Únicamente compuesto" denota los resultados de medición para los pozos que contienen únicamente células Hela y sustancia 1 a una dilución predeterminada. "Únicamente células" denota los resultados de medición para los pozos que contienen únicamente células Hela no infectadas. "Compuesto + virus" denota los resultados de medición para los pozos que contienen las células Hela infectadas con virus de HRV-16 y sustancia 1 a una dilución predeterminada. "Únicamente virus" denota los resultados de medición para los pozos que contienen las células Hela infectadas únicamente con HRV-16.

EJEMPLO 5 Una pastilla antimicrobiana de la presente invención Una pastilla antimicrobiana se hizo de conformidad con la formulación expuesta a continuación. 1 ) Dextrosa 865.0 mg 2) Corteza de olmo norteamericano 150.0 mg 3) Acido esteárico 75.0 mg 4) Raíz de jengibre 105.0 mg (niños) o140.0 mg (adulto) 5) Raíz de rábano picante 70.0 mg 6) Sabor de miel natural 40.0 mg 7) Cúrcuma (5% de curcumina) 15.0 mg 8) Extracto de hoja de té verde (36% de C&P) 14.0 mg 9) Dióxido de silicón 14.0 mg 10) Estearato de magnesio 12.0 mg 11 ) Sucralosa/Splenda 4.0 mg Peso de la tableta: 1364.0 mg Nota: C&P como se usa aquí significa "catecoles y fenoles" EJEMPLO S Una aspersión antimicrobiana de la presente invención Una aspersión antimicrobiana se hizo de conformidad con la formulación expuesta a continuación. (1 ) Extracto de corteza de olmo norteamericano 18.52 mg (2) Oleoresin Turmeric, Soluble (-8.5% de curcumina) 8.82 mg (3) Aquaresin® Ginger 7.0 mg (4) Sabor de rábano picante WONF 0.62 mg (5) Hoja de té verde PE 50% colorimétrico 14.0 mg (6) Sabor de miel natural 40.0 mg (7) Etanol (95%) @ 5% 68.2 mg (8) Glicerina 603.42 mg (9) Agua destilada 603.42 mg Peso total: 1364.0 mg EJEMPLO 7 Prueba in vitro de pastilla antimicrobiana La pastilla antimicrobiana del ejemplo 5 se probó para actividad virucida y virustática contra infección de células MDCK con virus de la influenza de las cepas A/NewCaledonia/20/99 (HINI), A/Panama/2007/99 (H3N2), y B/Guangdong/120/00.

Al determinar la actividad virucida, la pastilla se probó a diluciones de 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640. La pastilla se diluyó con solución isotónica salina (Normasol). Cada dilución se probó en puntos de terminación de 1 , 2 y 5 minutos después de que la pastilla entró en contacto con cada virus. La reacción se terminó con 1.8 ml de medio de células de FBS al 0%.

Las reducciones log en este ejemplo se reportan como — logio TCID50 y se calcularon usando la ecuación de Karber.

CUADRO 16 Títulos de virus residuales y reducciones log de virus de A/New Caledonia/20/99 (H1 N1 ) infecciosos después de un punto de tiempo de terminación de 1 minuto a diferentes diluciones 1 minuto de incubación Título de virus Título de influenza Reducciones log Dilución A/New Caledonia residual (-log10 de virus (-log10 TCIDso) TCID50) (-logio TCIDso) 1/10 2.80 0.00 2.80 1/20 2.80 2.30 0.50 1/40 2.80 1.80 1.00 1/80 2.80 2.30 0.50 1/160 2.80 1.80 1.00 1/320 2.80 1.80 1.00 1/640 2.80 1.80 1.00 Regulador de 2.80 1.80 1.00 pH de citrato CUADRO 17 Títulos de virus residuales y reducciones log de virus de A/New Caledonia/20/99 (H1 N1 ) infecciosos después de un punto de tiempo de terminación de 2 minutos a diferentes diluciones 2 minutos de incubación Título de virus Título de influenza Reducciones log Dilución A/New Caledonia residual (-log10 de virus (-log10 TCIDso) TCID50) (-logio TCID50) 1/10 2.80 0.00 2.80 1/20 2.80 1 .80 1 .00 1 /40 2.80 1 .80 1 .00 1 /80 2.80 1 .80 1 .00 1 /160 2.80 1 .80 1 .00 1/320 2.80 1.80 1.00 1/640 2.80 1.80 1.00 Regulador de 2.80 1.80 1.00 pH de citrato CUADRO 18 Títulos de virus residuales y reducciones log de virus de A/New Caledonia/20/99 (H1N1) infecciosos después de un punto de tiempo de terminación de 5 minutos a diferentes diluciones Título de virus 5 minutos de incubación Título de influenza Reducciones log Dilución A/New Caledonia residual (-log-?0 de virus TCID50) (-logjoTCIDso) 1/10 2.80 0.00 2.80 1/20 2.80 1.80 1.00 1/40 2.80 1.80 1.00 1/80 2.80 1.80 1.00 1/160 2.80 1.80 1.00 1/320 2.80 1.80 1.00 1/640 2.80 1.80 1.00 Regulador de 2.80 1.80 1.00 pH de citrato CUADRO 19 Títulos de virus residuales y reducciones log de virus de A/Panama/2007/99 (H3N2) infecciosos después de un punto de tiempo de terminación de 1 minuto a diferentes diluciones 1 minuto de incubación Título de virus Título de influenza Reducciones log de Dilución A/Panama residual (-log10 virus (-log10 TCIDso) TCID50) (-log10 TCID50) 1/10 4.80 3.80 1.00 1/20 4.80 3.80 1.00 1/40 4.80 4.80 0.00 1/80 4.80 4.30 0.50 1/160 4.80 4.80 0.00 1/320 4.80 4.80 0.00 1/640 4.80 4.80 0.00 Regulador de 4.80 0.00 4.80 pH de citrato CUADRO 20 Títulos de virus residuales y reducciones log de virus de A/Panama/2007/99 (H3N2) infecciosos después de un punto de tiempo de terminación de 2 minutos a diferentes diluciones 2 minutos de incubación Título de virus Título de influenza Reducciones log Dilución A/Panama residual (-logio de virus TCIDso) (-log10 TCID50) 1 /10 4.80 3.80 1 .00 1 /20 4.80 4.30 0.50 1 /40 4.80 4.80 0.00 1 /80 4.80 4.30 0.50 1 /160 4.80 4.80 0.00 1 /320 4.80 4.80 0.00 1/640 4.80 4.80 0.00 Regulador de 4.80 2.30 2.50 pH de citrato CUADRO 21 Títulos de virus residuales y reducciones log de virus de A/Panama/2007/99 (H3N2) infecciosos después de un punto de tiempo de terminación de 5 minutos a diferentes diluciones 5 minutos de incubación Título de virus Título de influenza Reducciones log de Dilución A/Panama residual (-log10 virus TCID50 (-log10 TCIDSQ) 1/10 4.80 3.80 1.00 1/20 4.80 4.30 0.50 1/40 4.80 4.80 0.00 1/80 4.80 4.80 0.00 1/160 4.80 4.80 0.00 1/320 4.80 4.80 0.00 1/640 4.80 4.80 0.00 Regulador de 4.80 2.80 2.00 pH de citrato CUADRO 22 Títulos de virus residuales y reducciones log de virus de B/Guangdong/120/00 infecciosos después de un punto de tiempo de terminación de 1 minuto a diferentes diluciones 1 minuto de incubación Título de virus Dilución B/Guangdong Título de influenza Reducciones log residual (-log10 de virus (-log10 TCID50) TCIDSQ) (-log10 TCID50) 1/10 3.30 1.30 2.00 1/20 3.30 1.80 1.50 1/40 3.30 2.80 0.50 1/80 3.30 2.80 0.50 1/160 3.30 2.80 0.50 1/320 3.30 2.80 0.50 1/640 3.30 2.80 0.50 Regulador de 3.30 0.00 3.30 pH de citrato CUADRO 23 Títulos de virus residuales y reducciones log de virus de B/Guangdong/120/00 infecciosos después de un punto de tiempo de terminación de 2 minutos a diferentes diluciones 2 minutos de incubación Título de virus Título de influenza Reducciones log de Dilución B/Guangdong residual (-log10 virus (-log10 TCID50) TCID50) (-logio TCID50) 1 /10 3.30 1 .80 1 .50 1 /20 3.30 1 .80 1 .50 1 /40 3.30 2.80 0.50 1/80 3.30 2.80 0.50 1/160 3.30 2.80 0.50 1/320 3.30 2.80 0.50 1 /640 3.30 2.80 0.50 Regulador de 3.30 0.00 3.30 pH de citrato CUADRO 24 Títulos de virus residuales y reducciones log de virus de B/Guangdong/120/00 infecciosos después de un punto de tiempo de terminación de 5 minutos a diferentes diluciones 5 minutos de incubación Título de virus Título de influenza Reducciones log Dilución B/Guangdong residual (-logio de virus (-log10 TCID50) TCIDSQ) (-log10 TCIDso) 1/10 3.30 1 .80 1.50 1/20 3.30 1 .80 1 .50 1/40 3.30 2.80 0.50 1/80 3.30 2.80 0.50 1 /160 3.30 2.80 0.50 1 /320 3.30 3.30 0.00 1/640 3.30 1 .80 1 .50 Regulador de 3.30 0.00 3.30 pH de citrato En la prueba virucida, un título conocido de virus de la influenza se usó como el control de virus; este control pasó por los mismos procedimientos que el compuesto de prueba, QR-435. El título de influenza sobre todas las placas fue consistente con un título de control de virus mayor que 2.5 (-log10 TCID50).

EJEMPLO 8 Prueba in vivo de aspersión antimicrobiana El hurón es un modelo animal establecido para estudio de infección de influenza (Boyd y Beeson, 1975; Chen et al., Induction and Relief of nasal Congestión in Ferrets Infected with Influenza, Int. J. Exp. Pathol. 76:55-64, 1995; Scheiblauer et al., Pathogenicity of Influenza A/Seal/Mass/ 1 /80 Virus Mutants for Mammalian Species, Arch. Virol. 140:341 -8, 1995; Sweet and Smith, Pathogenicity of Influenza Virus, Microbiol. Rev. 44:303-30, 1980; Toms et al., The relation of Pyrexia and Nasal Inflammatory Response to Virus Levéis in Nasal Washings of Ferrets Infected with Influenza Viruses of differing Virulence, Br. J. Exp. Pathol., 58:444-58, 1997; Webster et al., Protection of Ferrets Against Influenza Challenge with a DNA Vaccine to haemagglutinin, Vaccine 12:1495-8, 1994). El modelo de hurón ha sido usado antes para determinar la eficacia de las vacunas contra la influenza (Fenton et al., 1981 ; Webster et al., 1994). Estudios de transmisión que utilizaron el modelo animal de hurón no sólo han demostrado diseminación de virus de la influenza de donador a receptor, sino también los efectos de mutación sobre la virulencia del virus (Herlocher et al., Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence changes on the HA1 of type A (H3N2) Virus, J. of Infect. Diseases 184:542-46, 2001 ; Herlocher et al., Influenza virus carrying an R292K Mutation in the Neuraminidase Gene is not Transmitted in Ferrets, Antimicrobial Res. 54:99- 1 1 1 , 2002). Cinco minutos antes de ser infectado con un virus de la influenza de la cepa A/Sydney/5/97 (H3N2), cuatro grupos de seis hurones intactos recibieron dosis intranasales de composiciones experimental o de control. El grupo de control negativo recibió un placebo de solución reguladora de pH de fosfato (PBS). El grupo de control positivo se trató con Tamiflu™ (fosfato de oseltamivir, disponible de Roche Laboratories de Nutley, NJ). Un grupo experimental se trató con aspersión nasal del ejemplo 6, y el otro se trató con una aspersión nasal similar que no incluyó extracto de té verde. Después del desafío inicial, los hurones fueron dosificados con su composición asignada dos veces al día. Los hurones en el grupo de control tratado con PBS mostraron todos los síntomas típicos de hurones infectados con influenza A, incluyendo pérdida de peso, fiebre, conteos de células inflamatorias incrementados, y diseminación de virus en el primer día después de la infección. Los hurones en el grupo de control tratado con Tamiflu™ no experimentaron pérdida de peso, no experimentaron diseminación de virus, una reducción en el aumento de conteo de células inflamatorias y no experimentaron enfermedad febril. Tanto la formulación de prueba del ejemplo 6 como la aspersión nasal similar que no incluyó extracto de té verde proveyeron una reducción intermediaria de nivel bajo en el conteo de células inflamatorias, impidiendo el desarrollo de una enfermedad febril, y retardaron la diseminación del virus de una manera que pueda indicar supresión de virus. Los hurones tratados con aspersión nasal de conformidad con el ejemplo 6, sin embargo, también mostraron alguna reducción de pérdida de peso. Los hurones tratados con aspersión nasal de conformidad con el ejemplo 6 fueron más activos que los hurones tratados con el Tamiflu TM EJEMPLO 9 Transmisividad in vivo y prueba de profilaxis Las propiedades de una aspersión nasal, QR-435, se probaron. La formulación para QR-435 fue como sigue: Formulación QR-435 El estudio exploró la efectividad de la aplicación intranasal mediante aplicación por aspersión para prevenir la transmisión viral a animales que viven en estrecha proximidad a un animal infectado cuando el animal tratado es infectado y la provisión de profilaxis a animales no infectados. Cincuenta hurones (albinos o tudones, de Highgate Faros, Lincoinshire, GB) de aproximadamente 6-8 meses de edad, 700-1200g de peso se dividieron en 6 grupos después de etiquetado electrónico, como se muestra en el cuadro 25. Las puntuaciones de salud se midieron del día 0 al día 6 y el animal apropiado se colocó bajo anestesia para infección intranasal, con 0.25 ml por nostrilo, con abastecimiento alantóico de influenza A/Sydney/5/97 [H3N2].

CUADRO 25 Asignación de distribución de grupo de tratamiento Los grupos 3 y 4 en el protocolo se muestran como el grupo 3 anterior, los grupos 4 y 5 se muestran como el grupo 4 anterior, los grupos 7 y 8 se muestran como el grupo 5 anterior y los grupos 9 y 10 se muestran como el grupo 6 anterior. Los grupos se colocaron en pares y se subdividieron en grupos de 5 por razones de bienestar de los animales únicamente.

CUADRO 26 Estado de infección de los animales donadores # de ID de Grupo Síntomas Síntomas Sero- Diseminahurón nasales sistémicos conversión ción de virus 037284841 Placebo-Transmisión Sí Sí Sí No 034537339 Placebo-Profilaxis Sí Sí Sí No 034543003 QR435 Profilaxis Sí No Sí No 036534054 QR435 Profilaxis Sí Sí Sí No 034540555 QR435 Transmisión Sí Sí Sin muestra Baja 036788799 QR435 Transmisión Sí No Sin muestra Baja 036803821 Tamiflu™ Profilaxis No Sí Sí Baja XXXC Tamiflu™ Profilaxis Sí Sí Sí No XXXD Tamiflu ™ Transmisión Sí Sí Sí No 036800314 Tamiflu ™ Transmisión Sí Sí Sí Baja Estudio de transmisión El objeto del estudio de transmisión pude determinar si el compuesto de prueba podría evitar que un hurón donador transmitiera virus de la influenza a hurones receptores no infectados en el mismo corral. Un hurón por grupo fue inoculado con virus, y aproximadamente 5 minutos después de la inoculación, a los animales no inoculados restantes se les administró ya sea el compuesto de prueba o de control. El volumen de compuesto de prueba o control fue de 0.14 ml por nostrilo para un total de 0.28 ml por tiempo de dosificación. El animal inoculado fue aislado durante 24 horas y después se volvió a introducir al grupo apropiado en día 1. El animal inoculado fue tratado dos veces diariamente con el compuesto de prueba o apropiado. Los hurones restantes no fueron tratados durante el experimento. El día 0 a 6 todos los hurones fueron observados para signos clínicos, pérdida de peso y fiebre. La recolección de lavado ¡ntranasal se realizó en día 6, el volumen de lavado recuperado medido y el peso del lavado nasal se anotó en la libreta de laboratorio. El título viral de los lavados nasales recuperados se determinó usando células MDCK.

Los cuadros 27-31 muestran los resultados del experimento de transmisión. El cuadro 27 muestra el porcentaje de animales con síntomas nasales de influenza.

CUADRO 27 Porcentaje de animales con síntomas nasales de influenza (animales donadores excluidos) Día GRUPO 1 2 3 4 5 • 6 Placebo 0% 0% 0% 100% 75% 50% Tamiflu™ 0% 12.5% 37.5 50% 0% 12.5% QR435 0% 0% 0% 0% 25% 37.5% El cuadro 28 muestra el porcentaje de animales con actividad física reducida.

CUADRO 28 Porcentaje de animales con actividad física reducida (animales donadores excluidos) Día GRUPO 1 2 3 4 5 6 Placebo 0% 0% 0% 100% 0% 0% Tamiflu™ 0% 0% 0% 0% 0% 12.5% QR435 0% 12.5% 0% 0% 12.5% 0% Los diversos criterios para enfermedad de influenza se consideraron y usaron para determinar el porcentaje de animales que mostraron síntomas. Cuando los síntomas nasales se consideraron (cuadro 27), el día 4, 100% (4/4) de los animales en el grupo de placebo tuvo síntomas de influenza, mientras que a diferencia del día 4 únicamente 50% (4/8) de los animales tuvo síntomas en el grupo tratado con Tamiflu™. Ninguno de los animales en el grupo de tratamiento de QR435 tuvo síntomas. El día 6 sin embargo, 37.5% de los animales en el grupo de tratamiento de QR435 tuvo síntomas nasales. No está claro si estos fueron causados por infección de influenza o irritación de la aspersión nasal.

Cuando los signos sistémicos de influenza tales como actividad reducida se consideran, el día 4, todos (4/4) los animales en el grupo de placebo tuvieron síntomas, sin embargo solo un animal (12.5%) mostró signos de enfermedad en cualquier día después de la infección en los grupos de tratamiento activo.

El cuadro 29 muestra influenza confirmada en el laboratorio y seroconversión en el grupo de tratamiento. A cada animal se extrajo sangre antes del desafío el día 24, después de la infección de modo que la influenza pudiera ser confirmada por serología. La seroconversión se definió como un aumento de cuatro veces de anticuerpos antiHAI contra A/Sydney/5/97 (H3N2). En el cuadro 29 se muestra que 100% de animales tanto en el grupo de tratamiento de placebo como en el grupo de tratamiento de Tamiflu™ fueron seroconvertidos. Sin embargo, solo 57% (4/7) de esos animales probados fueron seroconvertidos en el grupo de tratamiento QR435. Debido a falla de equipo no se pudo probar una muestra de suero.

CUADRO 29 Influenza confirmada en laboratorio; seroconversión en el grupo de tratamie nto # de animales Porcentaje de animales seroconvertidos seroconvertidos Placebo 4/4 100 QR435 4/7* 57 Tamiflu™ 8/8 100 * un animal fue retirado temprano y no se tomó muestra El cuadro 30 muestra la media de la diseminación de virus de la mucosa nasal el día 6 después de la infección. Los lavados nasales se realizaron el día 6 después de la infección y las muestras se titularon sobre células MDCK para virus de influenza. El cuadro 30 muestra una diferencia sustancial en el número de animales que diseminaron virus entre los dos grupos de tratamiento activo. Sólo un animal en el grupo de tratamiento de QR435 diseminó virus en comparación con todos los animales en el grupo de tratamiento de Tamiflu™. Inesperadamente, sólo un animal en el grupo de placebo (25%) diseminó virus.

CUADRO 30 Influenza confirmada en el laboratorio; diseminación de virus de la mucosa nasal en día 6 después de la infección Grupo # de animales diseminados Porcentaje de animales con virus el día 6 diseminados con virus el día 6 Placebo V 25% QR435 1/7* 14 Tamiflu™ 8/8 100 * un animal fue retirado temprano y no se le tomó muestra La media de la diseminación de virus por el grupo de tratamiento se calculó y las diferencias se compararon por ANOVA. El resultado se encontró que era estadísticamente significativo (p = 0.02). Las pruebas de T se realizaron usando la corrección de Bonferroni para prueba múltiple y el grupo tratado con Tamiflu™ se encontró que diseminó significativamente más virus que el grupo de tratamiento con placebo (p = 0.021 ) y el grupo de tratamiento con QR435 (p = 0.04). El cuadro 31 es la media de la puntuación de salud máxima por el grupo de tratamiento. La media y desviación estándar de la puntuación de salud máxima se calculó como se describió antes en resultados de estudio de profilaxis. Los resultados fueron significativos (p = 0.02). Grupos individuales se compararon como se describió antes y ambos grupos de tratamiento tienen puntuaciones de salud máximas significativamente menores que el grupo de placebo (QR435 p = 0.006 y Tamiflu™ p = 0.003).

CUADRO 31 Media de la puntuación de salud máxima por el grupo de tratamiento Una medición similar a AUG que comprende la suma de puntuaciones de salud después de la infección se calculó para cada animal; las medias y desviaciones estándares del grupo de tratamiento se calcularon y se compararon por ANVOA. El cuadro 32 muestra los resultados y la diferencia entre los grupos de tratamiento fue altamente significativa (p = 0.002). Los grupos individuales se compararon usando pruebas de T y la corrección de Bonferroni para pruebas múltiples, ambos grupos de tratamiento tuvieron puntuaciones de salud total significativamente menores que el grupo de placebo (QR435 p = 0.06 y Tamiflu™ p = 0.03).

CUADRO 32 Media de la puntuación de salud total por el grupo de tratamiento La media del cambio de peso máximo después de la infección se calculó de manera similar y se comparó por ANOVA. Los resultados no fueron significativos (p = 0.90). Ambos grupos de tratamiento tuvieron significativamente menos pérdida de peso que el grupo de placebo (QR435 p = 0.055 y Tamiflu™ p = 0.019). La medición similar a AUC que compara la suma de los cambios en peso después de la infección también se calculó para cada animal y se comparó por ANOVA. La diferencia entre los grupos de tratamiento no fue significativa (p = 0.64).

Estudio de profilaxis El objeto del estudio de profilaxis fue determinar si el tratamiento de hurones receptores no infectados con el compuesto de prueba podrían prevenir la infección viral de un donador infectado. Un hurón por grupo fue inoculado con virus y aproximadamente 5 minutos después de la inoculación, a los animales no inoculados restantes se les administró ya sea el compuesto de prueba o el compuesto de control. El animal inoculado se aisló durante 24 horas y después se volvió a introducir al grupo apropiado el día 1. El animal inoculado no se trató con el compuesto de prueba o control apropiado. Los hurones restantes se trataron con el compuesto de prueba o control apropiado dos veces al día. El volumen del compuesto de prueba o control fue de 0.14 ml por nostrilo durante un total de 0.28 ml por tiempo de dosificación. Los días 0 a 6 todos los hurones fueron observados para signos clínicos, pérdida de peso y fiebre. La recolección de lavado intranasal se realizó el día 6, el volumen de lavado recuperado se midió y el peso de lavado nasal se notó en la libreta de laboratorio. Los títulos virales de los lavados nasales recuperados se determinó usando células MDCK. Se tomó una muestra de sangre a los 24 días para pruebas de control. Cada animal donador fue exitosamente infectado. Debido a los parámetros de los estudios fue importante que cada animal donador fuera exitosamente infectado, y que cada animal donador demostrara signos clínicos de infección y seroconversión. Sin embargo, la diseminación viral no fue detectada en los lavados nasales. No es sorprendente que hubiera poca o nada diseminación viral en los animales donadores ya que la diseminación viral cesa antes del día 6, el día en que se tomaron los lavados. Los cuadros 33-38 muestran los resultados de los experimentos de profilaxis. El cuadro 33 muestra el porcentaje de animales que tuvo síntomas nasales de influenza. El cuadro 34 muestra el porcentaje de animales que tuvo actividad física reducida durante el período de prueba.

CUADRO 33 Porcentaje de animales con síntomas nasales de influenza (animales donadores excluidos) por el grupo de tratamiento Día GRUPO 1 2 3 4 5 6 Placebo 0 0 0 0 75% 75% Tamiflu™ 0 0 25% 0 0% 12.5 QR435 0 0 0 0 25% 25% CUADRO 34 Porcentaje de animales con actividad física reducida (animales donadores excluidos) Día GRUPO 1 2 3 4 5 6 Placebo 0 0 100% 100% 0 0 Tamiflu™ 0 0 0 0 0 0 QR435 0 0 0 0 0 0 Resultados de estudio de profilaxis En el estudio de profilaxis, 75% del grupo de placebo (3/4) tuvo síntomas nasales de infección de influenza el día 5, mientras que el 25% del grupo de Tamiflu™ tuvo síntomas nasales el día 3 y el 25% del grupo de QR435 tuvo síntomas nasales el día 5. Cuando el porcentaje de animales que mostró actividad física reducida se considera los resultados son más drásticos ya que 100% del grupo de placebo mostró actividad física reducida y ninguno de los animales del grupo Tamiflu™ o QR435 mostró signos de actividad reducida. El cuadro 35 muestra la media de la puntuación de salud máxima por grupo de tratamiento. La media y desviación estándar de la puntuación de salud máxima para cada animal se calculó por grupo de tratamiento y después se comparó por ANOVA. Los resultados alcanzaron significancia (p = 0.087).

CUADRO 35 Media de la puntuación de salud máxima por grupo de tratamiento Una medición similar a AUC que comprende la suma de puntuaciones de salud después de la infección se calculó para cada animal; las medias y desviaciones estándar de tratamiento se calcularon y se compararon por ANVOA. El cuadro 35 muestra los resultados y la diferencia entre los grupos de tratamiento fue altamente significativa (p < 0.005). Los grupos individuales se compararon usando pruebas T y la corrección de Bonferroni para pruebas múltiples, ambos grupos de tratamiento tuvieron puntos de salud totales altamente significativamente menores que el grupo de placebo.

CUADRO 36 Media de la puntuación total de salud total por grupos de tratamiento A cada animal se extrajo sangre antes del desafío el día 24, después de la infección, por lo que la infección de influenza pudo ser confirmada por serología. La seroconversión es un incremento de cuatro veces en anticuerpos HAI contra la cepa de inoculación.

CUADRO 37 Influenza confirmada en laboratorio; seroconversión por grupo de tratamiento # de animales Porcentaje de animales seroconvertidos seroconvertidos Placebo 2/2* 100% QR435 0/8 0% Tamiflu™ 8/8 100% El cuadro 38 muestra influenza confirmada de laboratorio y el porcentaje de virus animales diseminados el día 6 después de la infección del grupo de tratamiento. Los lavados nasales se realizaron el día 6 después de la infección y las muestras se titularon sobre células MDCK para el virus de la influenza. El cuadro 38 muestra que hay una diferencia sustancial en el número de animales que diseminan virus entre los dos grupos de tratamiento activo, es decir, para el grupo tratado con QR435 ninguno de los animales diseminó virus en comparación con 75% en el grupo tratado con placebo y 87.5% en el grupo tratado con Tamiflu™.

CUADRO 38 Influenza confirmada en laboratorio; diseminación de virus el día 6 después de la infección por grupo de tratamiento # de animales diseminados Porcentaje de animales con virus el día 6 diseminados con virus el día 6 Placebo % 75% QR435 0/8 0% Tamiflu™ 7/8 87.5% La media de la diseminación de virus por grupo de tratamiento se calculó y las diferencias se compararon por ANOVA. El resultado se encontró que era estadísticamente significativo (p = 0.001 ) Se realizaron pruebas T usando la corrección de Bonferroni para prueba múltiple y el grupo tratado con QR435 se encontró que diseminó significativamente menos virus que el grupo de tratamiento con placebo (0 = 0.004) y el grupo de tratamiento con Tamiflu™ (p = 0.002). La media y desviación estándar del cambio de peso máximo para cada animal se calculó por grupo de tratamiento y después se comparó por ANOVA. Los resultados fueron significativos (p = 0.018). Grupos individuales se compararon usando pruebas T y la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Ambos grupos de tratamiento tuvieron significativamente menos (o muy cerca de) pérdida de peso que el grupo de tratamiento con placebo (QR435 p = 0.055 y Tamiflu™ p = 0.019). Una medición similar a AUC que comprendía la suma de cambios en peso después de la infección se calculó para cada animal; las medias y desviaciones estándar del grupo de tratamiento se calcularon y se compararon por ANOVA. La diferencia entre grupos de tratamiento no fue significativa (p = 0.461 ). La media de cambio de peso máximo después de la infección se calculó de manera similar y se comparó por ANOVA. Los resultados fueron significativos (p = 0.018). Ambos grupos de tratamiento tuvieron significativamente menos pérdida de peso que el grupo de placebo (QR435 p = 0.055 y Tamiflu™ p = 0.019). La medición similar a AUC que compara la suma de los cambios en peso después de la infección también se calculó para cada animal y se comparó por ANOVA. La diferencia entre grupos de tratamiento no fue significativa (p = 0.461 ).

Conclusión El grupo de tratamiento positivo se trató después con Tamiflu™ (fosfato de oseltamivir, administrado a 5 mg/kg dos veces al día) fue generalmente protegido de los síntomas de la influenza tanto en los experimentos de transmisión como de profilaxis. Por otra parte, estos animales fueron infectados como se muestra tanto por diseminación viral como la seroconversión de los animales receptores. Por el contrario, el compuesto de prueba QR-435 fue 100% efectivo en la prevención de la infección y parcialmente efectivo en la prevención de la transmisión. Por lo tanto, el beneficio importante del compuesto es su capacidad para prevenir infección, particularmente la suspensión de la diseminación de partículas virales que reducirían la diseminación de la enfermedad.

EJEMPLO 10 Comparación in vitro de la actividad virucida y virustática contra el virus de SARS Dos composiciones QR439 y QR439(a) se probaron in vitro para actividad vitucida y cirustática contra el virus de SARS. QR439 se formuló como sigue: (1 ) Jengibre Aquaresin® 0.6849 % en peso (2) Oleoresina de cúrcuma 0.6466 % en peso (3) Té verde PE 0.4619 % en peso (4) Glicerina 49.1039 % en peso (5) Agua desionizada 49.1039 % en peso QR439(a) se formuló como sigue: (1 ) Jengibre Aquaresin® 0.6840 % en peso (2) Oleoresína de cúrcuma 0.6466 % en peso (3) Té verde PE 0.4619 % en peso (4) Aceite de rábano picante 0.063192 % en peso (5) Glicerina 49.0723 % en peso (6) Agua desionizada 49.0723 % en peso En la prueba, los compuestos de control positivo fue: 1 % Triton-X 100 (en saliva artificial) [0.1 % de NaHC03, 18% de KH2P04, 0.1 % de mucina gástrica, pH ajustado a 6.0-6.5]) para la prueba virucida y Ribavirin (200µ/ml) en 1 % DMSO (en PBS) para la prueba virustática. El compuesto de control negativo fue saliva artificial (0.1 % de NaHC03, 18% de KH2P04, 0.1 % de mucina gástrica, pH ajustado a 6.0-6.5) para la prueba virucida únicamente. Virus de Urbani SARS se usó en un título de abastecimiento de 105 TCID50/ml. Los compuestos de prueba, QR439 y QR439(a) se diluyeron en Sterets Normasol (Seton Prebbles Ltd) para producir las siguientes diluciones para prueba virucida: 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1 /160, 1/320, y 1/640.

Método de prueba virucida Los títulos de virus residuales se titularon sobre células C1008 (un clon de Vero 76) para crecimiento viral en placas de 96 pozos. Los resultados se analizaron para CPE (efecto citopático) y el título de virus se determinó usando el método de Karber. Los siguientes pasos se condujeron para realizar la prueba virucida. 360 µl del compuesto de prueba se mezcló con 40 µl de virus. La mezcla se agitó y después se incubó durante 30 segundos, 1 , 2, 4 u 8 minutos. La reacción se terminó en un tiempo específico añadiendo 3.6 ml de media de infección (DMEM, 2mM L-glutamina, HEPES, penicilina-estreptomicina). La terminación es causada por el efecto de dilución de la adición del medio de infección debido a que tanto el virus como los compuestos de prueba se diluyeron diez veces en este paso. La infectividad de virus residual se tituló en células C1008 a diluciones de 10 veces a través de la placa de 96 pozos. Las células C1008 se incubaron durante 7-10 días a 37°C. Los resultados se anotaron para CPE y el título del virus se calculó. Las células se examinaron para CPE del día 3, 4 y 5 después de la infección.

Método de prueba de citotoxicidad Una prueba de citotoxicidad sobre células C1008 se llevó a cabo sobre todos los tres compuestos para determinar que diluciones usar para la prueba virustática. 200µl de cada compuesto de prueba, y compuesto de control, se añadió a los primeros pozos (en duplicado) de una placa de 96 pozos y después se tituló a través de la placa siguiendo una serie de dilución de 2 veces. La placa se incubó a 35°C, 5% de C02. Las células se observaron para CPE después de 3 días de incubación.

Método de prueba virustática Las diluciones que se usaron para la prueba virustática fueron las siguientes: QR439 y QR439(a) a las siguientes diluciones: 1/200, 1/300, 1 /400, 1/500, 1/600. Media de infección (DMEM, 2mM L-glutamina, HEPES, penicilina-estreptomicina) se usó para diluir cada compuesto de prueba, según sea apropiado. 100 µl de cada compuesto de prueba diluido, y el control positivo, se añadieron a los pozos de células C1008 (en duplicado) y después se incubaron durante 30 minutos a 35°C, 5% de C02. Después del período de incubación, 10 µl de virus Urbani SARS (a un título de abastecimiento de 105 TCIDso/ml) se añadió a cada pozo de los compuestos de prueba y control positivo. La placa se incubó a 35°C, 5% de C02 durante 3-5 días antes de observar las células para CPE. Una prueba de cristal violeta, que midió la DO (densidad óptica) de las células, se realizó sobre la placa después que se registró el CPE. Los valores de DO se usaron para determinar CT50 y CE50 de los compuestos de prueba.

Resultados Los resultados de la prueba de citotoxicidad realizado sobre los compuestos de prueba se muestran en el cuadro 39 más adelante. Cada compuesto no diluido se añadió por duplicado a los pozos en la primera columna de la placa y se diluyó a través de la placa en una serie de dilución de 2 veces. La concentración dentro del intervalo de las diluciones de 1/8 y 1/16 es equivalente a la concentración de los compuestos de prueba que se añadieron a las placas en la prueba virucida. Esto se debe a que los compuestos se diluyeron 1/10 cuando se añadió el medio de terminación.

CUADRO 39 Prueba de citotoxicidad + Ambos pozos mostraron toxicidad - Ambos pozos no mostraron toxicidad +/1 un pozo mostró toxicidad, el otro pozo no mostró toxicidad El cuadro 39 demuestra que ambos compuestos de prueba son tóxicos para las células a la dilución de 1/8 (que es equivalente a la dilución usada en la prueba virucida para los compuestos no diluidos). En las pruebas virucidas y virustáticas, una dilución de más de 1/128 es necesaria para eliminar la toxicidad. Las observaciones de CPE (cuadro 40) muestran que no hubo actividad virustática detectada para ninguno de los compuestos probados.

CUADRO 40 Observaciones de CPE + Infección de virus en ambos pozos - No hubo infección viral en ambos pozos +/- Infección viral en un pozo, no infección en el otro pozo T Toxicidad en ambos pozos ND Prueba virustática no realizada en una sexta dilución en sene * Diluciones usadas para QR439 y QR439(a) son A=1/200, B=1/300, C=1/400, D=1/500, E=1/600 Los resultados de la prueba realizada virucida sobre los compuestos de prueba QR439 y QR439(a) se representan en el cuadro 41 y cuadro 42 respectivamente. Los cuadros indican la reducción en el título viral después de una dilución de 1/10 de los compuestos de prueba, que es equivalente a una dilución de 1/10 del virus no diluido.

CUADRO 41 Reducción log en título viral después del contacto con el compuesto de prueba QR439 * Sin recuperación de virus. Sin embargo usando el método de cálculo de Karber (tomando en cuenta la dilución de 1/10) se obtuvo un título de 0.5 TCIDso/ml.

CUADRO 42 Reducción logarítmica en título viral después del contacto con compuesto de prueba QR439(a) * Sin recuperación de virus. Sin embargo usando el método de cálculo de Karber (tomando en cuenta la dilución de 1/10) se obtuvo un título de 0.5 TCID50/ml.

Los resultados muestran que para QR439, hay una reducción significativa en actividad virucida de diluciones de 1/40 a 1/640 en todos los puntos de tiempo de contacto, con la excepción de 1/320 (30 segundos) y 1/640 (30 segundos, 1 minuto, y 4 minutos). Los resultados muestran que para QR439(a) hay una reducción significativa en actividad virucida de diluciones 1/20 a 1/60 en todos los puntos de tiempo de contacto con la excepción de 1/20 (4 y 8 minutos).

EJEMPLO 11 Eficacia de aspersión nasal antimicrobiana sobre infección de influenza H3N2 Cuarenta hurones fueron infectados con influenza A/Sydney/5/97 [H3N2] y tratados con QR435, como se utilizan en el ejemplo 9 anterior, o compuesto de control diariamente durante 4 días. Los signos clínicos se midieron junto con los pesos, temperaturas rectales, conteos de células y diseminación de virus. El inoculo de virus A/Sydney/5/97 fue virulento y se observaron signos de enfermedad, en donde los hurones tratados con placebo (PBS) mostraron distintos síntomas de infección de influenza A. El control positivo (Tamiflu™) fue efectivo en la reducción de pérdida de peso, fiebre y síntomas clínicos. No se notó reducción de enfermedad en los grupos a los que se administró QR435. La sustancia de prueba fue una aspersión nasal que contenía 1 .8% de compuesto activo con la fórmula como se indica en el ejemplo 9 anterior. La sustancia de control positivo fue Tamiflu™ (fosfato de osletamivir) administrado a 5 mg/kg dos veces al día. También se usó solución salina regulada en su pH con fosfato (como una aspersión nasal) como un control y se administró por vía intranasal cuatro veces al día. El virus de desafío fue A/Sydney/5/97 [3N2] de reposición de virus de Retroscreen. Los hurones fueron exitosamente infectados con influenza y mostraron signos clásicos de la enfermedad asociada en el grupo de tratamiento en el PBS (control negativo). El grupo de tratamiento con Tamiflu™ (control positivo) mostró reducción en la severidad de la enfermedad con reducciones estadísticamente significativas (o casi significativas) en puntuaciones de diseminación de virus, pérdida de peso y enfermedad. Ninguno de los dos grupos de tratamiento de compuesto de prueba (QR435 dos veces al día y QR435 cuatro veces al día) demostró reducción de enfermedad para propósitos de tratamiento. Sin embargo, como se indicó en el ejemplo 9 anterior, QR435 ha probado ser efectivo para anti-transmisividad y usos profilácticos.

EJEMPLO 12 Las propiedades irritantes de la aspersión nasal, pero de retener las propiedades de transmisividad previamente demostradas, la eficacia de concentraciones de rábano picante variables se probaron en el modelo de hurón. La formulación de aspersión de ALS sialorrhea de rábano picante completo con QR-435 fue la siguiente: Formulación de OR-435 Oleoresina de cúrcuma 0.0308 por ciento en peso Jengibre Aquaresin® 0.0326 por ciento en peso Aceite de rábano picante #58 0.00300 por ciento en peso Té verde PE 030725 0.0220 por ciento en peso Glicerina 2.3368 por ciento en peso Agua desionizada 97.5749 por ciento en peso En la formulación de prueba de 50% de rábano picante, el aceite de rábano picante se redujo a 0.0015% en peso y la glicerina y el agua desionizada se incrementó en 0.000075 en peso. De manera similar, en el estudio de 25% de rábano picante, el aceite de rábano picante se redujo a 0.000075 y la glicerina y agua desionizada se incrementó en 0.001125% en peso. El cuadro 43 muestra la distribución de los diversos grupos de hurones y el protocolo de tratamiento en corrales. Cada grupo se dividió en dos corrales estrictamente por razones de logística. Cada grupo consistió de cuatro animales receptores y un animal donador.

CUADRO 43 Distribución de grupos Grupo Número de hurones Tratamiento 1 a 5 Placebo (PBS) QDS 1 b 5 Placebo (PBS) QDS 2a 5 QR435 100% de rábano picante QDS 2b 5 QR435 100% de rábano picante QDS 3 3aa 5 5 QR435 50% de rábano picante QDS 3b 5 QR435 50% de rábano picante QDS 4a 5 QR435 25% de rábano picante QDS 4b 5 QR435 25% de rábano picante QDS 5a 5 Tamiflu™ 5 mg/kg de BDS 5b 5 Tamiflu™ 5 mg/kg de BDS QDS = dosificación de 4 veces al día por vía intranasal BDS = dosificación de 2 veces al día por vía oral Los animales fueron electrónicamente etiquetados usando transpodedores inyectables programables para identificación de animales y monitoreo de temperatura corporal. Las muestras de sangre se tomaron de venas superficiales y la sangre Terminal se obtuvo mediante punción cardiaca. Los hurones donadores fueron dosificados por vía intranasal como sigue: un animal del grupo de cinco fue removido e infectado con 0.5 ml de virus (0.25 ml por nostrilo) mientras que el animal estaba bajo anestesia.

Los animales donadores no fueron tratados con el material de prueba. Los hurones receptores fueron tratados de conformidad con la asignación del grupo del tratamiento como se delinea en el cuadro 43 y el programa de estudio en el cuadro 44. La recolección de lavado nasal se realizó y el volumen de lavado nasal recuperado se midió y se pesó para determinar el volumen de recuperación de lavado nasal.

La prueba de Hl se realizó bajo la muestra contra virus homólogo para determinar la seronegatividad de los hurones así como para determinar el grado de seroconversión, si acaso, después de la infección. Puntuaciones de salud, peso corporal y temperaturas se registraron. Los conteos de células totales sobre la muestra de lavado nasal se determinaron usando azul de tripano a fin de evaluar la respuesta de células inflamatorias recuperadas del epitelio nasal. La diseminación de virus de los lavados nasales se realizaron usando células de MDCK.

CUADRO 44 Progí rama de estud io Día 0 1 2 3 4 5 6 16 Etiquetado electrónico X Anestesia X X Temperatura X X X X X X X Peso corporal X X X X X X X Puntuación de salud X X X X X X X Infección de donador X Aislamiento de donador X Integración de donador X Lavado nasal X Suero para HAI X X Recipiente de X X X X X X X dosificación de artículo de prueba El cuadro 45 muestra los signos clínicos de los animales donadores después de la exposición al virus de la influenza. Como se ve a partir del cuadro, cada animal donador fue infectado exitosamente con virus de la influenza.

CUADRO 45 Signos clínicos del donador Corral* % de pérdida de peso Fiebre Seroconversión (Pico a valle) >1 DE, >2DE, o >3DE 1 a 0.80 >3DE Sí 1 b 2.31 >3DE Sí 2a 2.88 >3DE Sí 2b 0.91 >3DE Sí 3a 1.90 >2DE Sí 3b 1.43 >2DE Sí 4a 2.76 >2DE Sí 4b 1.15 >3DE Sí 5a 2.49 >1 DE Sí 5b 0.93 >2DE Sí * véase cuadro 43 para protocolo de tratamiento La enfermedad relacionada con la influenza en los hurones receptores se determinó usando los siguientes parámetros: pérdida de peso, fiebre, diseminación de virus, seroconversión, signos nasales clínicos y actividad, conteo de células nasales. Los grupos de control (grupos tratados con PBS 1 a y 1 b) mostraron signos típicos de enfermedad de influenza que incluían pérdida de peso, fiebre seroconversión y la presencia de algunos signos clínicos de enfermedad (incluyendo signos de actividad y nasales). Los grupos de tratamiento con Tamiflu™ no mostraron ningunos signos clínicos sobresalientes y no fueron seroconvertidos, por lo tanto el tratamiento con Tamiflu™ se confirmó como efectivo en la enfermedad de la influenza. La comparación del porcentaje de pérdida de peso entre los grupos sugiere que hay una diferencia en enfermedad. En la pérdida de peso se calculó encontrado el peso pico de cada hurón seguido por identificación del valle subsecuente. La diferencia en peso entre el pico y valle se calculó como un porcentaje del peso de línea basal tomado el día cero. Cuando los grupos se compararon para pérdida de peso por tratamiento, varios tratamientos mostraron reducciones significativas en la enfermedad. Los resultados del cuadro 46 indica que el grupo tratado con PBS fue significativamente diferente de todos los otros tratamientos. (PBS vs. 100% de rábano picante p = 0.008; PBS vs. 50% de rábano picante p = 0.022; PBS vs. 25% de rábano picante p = 0.005; PBS vs. Tamiflu™ p = 0.004). Por lo tanto, el compuesto de prueba fue efectivo como el control positivo (Tamiflu™) en la prevención de pérdida de peso en animales infectados con influenza por la vía de transmisión natural de otro hurón.

CUADRO 46A Comparación de resultados Variable dependiente cambio de peso separado en corrales CUADRO 46B Comparación en parejas Variable dependiente cambio de peso separado en corrales a Ajustes para comparaciones múltiples diferencia menos significativa (equivalente a sin ajustes) Hurones individuales que mostraron aumento de temperatura mayores que 3DE (desviaciones estándares) de la medición de temperatura anterior se consideró que tenían una fuerte enfermedad febril. Para cada grupo la DE se calculó a partir de la media de la temperatura de cada grupo el día 1. Debido al uso de anestesia el día 0, y posibles modificaciones subsecuentes de la temperatura del hurón, las temperaturas del día 1 se consideraron más apropiadas para usarse para generar la media y desviación de línea basal. El cuadro 47 es un resumen de fiebre como se define como un movimiento de 3DE a partir de la medición de la temperatura anterior.

CUADRO 47 Comparación de resultados Número de No. de hurones Número de grupo No. de hurones corral* por corral con por grupo con fiebre (aumento fiebre (aumento de >3DE) de >3DE) 1a 2 1 4 1 b 2 2a 1 2 1 2b 0 3a 0 3 1 3b 1 4a 3 4 5 4b 2 5a 0 5 1 5b 1 *Véase cuadro 43 para protocolo de tratamiento en corrales CUADRO 48 Enfermedades febriles ligeras Número de No. de hurones Número de grupo No. de hurones corral* por corral con por grupo con fiebre (aumento fiebre (aumento de >2DE) de >2DE) 1 a 3 1 7 1 b 4 2a 2 2 4 2b 2 3a 1 3 2 3b 1 4a 3 4 5 4b 2 5a 2 5 4 5b 2 *Véase cuadro 43 para protocolo de tratamiento en corrales Usando el análisis de X2 de la fiebre como se define por un aumento de 3DS a partir de la medición de temperatura anterior se determinó lo siguiente: Tratamiento de PBS vs. 50% de rábano picante p = 0.106 (cuadro 49) PBS vs. 10% de rábano picante p = 0.106 (cuadro 50) PBS vs. Tamiflu™ p = 0.106 (cuadro 51 ) El cuadro 48 resume el número de hurones con un aumento de temperatura claro de más de 2DE a partir de la medición de temperatura anterior, que se consideró que tenía una enfermedad febril ligera.

CUADRO 49 Análisis de X2 del número de hurones con fiebre entre tratamiento con PBS y 50% de rábano picante (>3DE de aumento en temperatura a partir de la línea basal) a Calculado sólo para el cuadro de 2X2 b. 2 células (50.0%) han esperado un conteo menor que 5. El conteo máximo esperado es 2 50) CUADRO 50 Análisis de X2 del número de hurones con fiebre entre tratamiento con PBS y 100% de rábano picante (>3DE de aumento en temperatura a partir de la línea basal) a. Calculado sólo para el cuadro de 2X2 b. 2 células (50.0%) han esperado un conteo menor que 5. El conteo máximo esperado es 2.50).

CUADRO 51 Análisis de X2 del número de hurones con fiebre entre tratamiento con PBS y Tamiflu™ (>3DE de aumento en temperatura a partir de la línea basal) Pruebas de Chi cuadrada a. Calculado sólo para el cuadro de 2X2 b. 2 células (50.0%) han esperado un conteo menor que 5. El conteo máximo esperado es 2.50).

Usando el análisis de X2 de la fiebre como se define por un aumento de 2DS a partir de la medición de temperatura anterior se determinó lo siguiente: Tratamiento de PBS vs. 50% de rábano picante p = 0.012 (cuadro 52) PBS vs. 10% de rábano picante p = 0.106 (cuadro 53) PBS vs. Tamiflu™ p = 0.106 (cuadro 54) El cuadro 48 resume el número de hurones con un aumento de temperatura claro de más de 2DE a partir de la medición de temperatura anterior, que se consideró que tenía una enfermedad febril ligera.

CUADRO 52 Análisis de X2 del número de hurones con fiebre entre tratamiento con PBS y Tamiflu™ (>2DE de aumento en temperatura a partir de la línea basal) a. Calculado sólo para el cuadro de 2X2 b. 4 células (100.0%) han esperado un conteo menor que 5. El conteo máximo esperado es 3.50).

CUADRO 53 Análisis de X2 del número de hurones con fiebre entre tratamiento con PBS y 100% de rábano picante (>2DE de aumento en temperatura a partir de la línea basal) a. Calculado sólo para el cuadro de 2X2 b. 4 células (50.0%) han esperado un conteo menor que 5. El conteo máximo esperado es 2.50).

CUADRO 54 Análisis de X del número de hurones con fiebre entre tratamiento con PBS y Tamiflu™ (>2DE de aumento en temperatura a partir de la línea basal) a. Calculado sólo para el cuadro de 2X2 b. 4 células (50.0%) han esperado un conteo menor que 5. El conteo máximo esperado es 2.50).

Conclusiones Aunque todos los hurones tratados con sustancia de prueba fueron seroconvertidos, QR-435 con 100% y 50% de componentes de rábano picante se encontró que reducían ya sea significativamente o casi significativamente la enfermedad sistémica como se mide por peso y temperatura. Sin embargo, los otros signos clínicos de enfermedad no fueron anulados por ningún tratamiento. Los grupos de control desplegaron signos clínicos de enfermedad de influenza. Los grupos tratados con PBS mostraron los signos típicos de infección de influenza: pérdida de peso, fiebre y seroconversión así como signos clínicos bajos de enfermedad, actividad reducida y signos nasales. Los grupos tratados con Tamiflu™ no tuvieron pérdida de peso, signos clínicos bajos, diseminación de virus, severidad reducida de fiebre y ausencia de seroconversión significativos. En los grupos de tratamiento de prueba, la severidad de la enfermedad se definió por fiebre y pérdida de peso. Todas las dosis de tratamiento redujeron significativamente la severidad de la pérdida de peso cuando se compararon con el grupo de PBS. Cuando la fiebre se definió como un aumento de 2DE en temperatura, un grupo de tratamiento con 50% de rábano picante mostró reducciones significativas en la incidencia de fiebre. El grupo de tratamiento con 100% de rábano picante también anuló la fiebre y se encontró que era casi igual de significativo. Cuando la fiebre se definió como un aumento de 3DE en la temperatura, el grupo de tratamiento con 100% y 50% de rábano picante tuvieron reducciones casi significativas en la incidencia de fiebre, pero el tratamiento con 25% de rábano picante no anuló la fiebre. Por lo tanto, los tratamientos con 100% y 50% de rábano picante se encontró que reducían los signos sistémícos a un grado mayor que el tratamiento con 25% de rábano picante. Esto sugiere una fuerte dependencia de la dosis que requiere 50% o más de rábano picante para anular tanto la fiebre como la pérdida de peso. El tratamiento con 50% o más de rábano picante puede reducir el título de virus transmitido del donador al receptor reduciendo así la severidad de los síntomas de enfermedad. También es posible que el tratamiento con 50% o más de rábano picante anule la enfermedad al actuar de una manera terapéutica.

EJEMPLO 13 El primer caso documentado de una infección humana con una cepa aviar fue la infección de Hong Kong H5N1 de 1997 de 18 personas que dieron por resultado 6 muertes. Un brote más reciente ha ocurrido en el sur de Asia dando por resultado numerosas muertes como se muestra en el cuadro 55.

CUADRO 55 Casos de influenza H5M1 (Aviar) humanos confirmados en el sureste de Asia (WHO 2004) País No. total de casos No. de fallecimientos Vietnam 22 15 Tailandia 12 8 Total 34 23 Este estudio investigó la eficacia de las formulaciones dadas en los cuadros 56-57 siguientes, contra un aislado humano de un virus de la influenza de cepa aviar A/Vietnam/1194/04, H5N1. El control negativo fue DMEM-DMSO 1 % mientras que el control positivo en la prueba vírustática fue amatadina a 0.37 µM. El control positivo para la prueba virucida fue 1 % de Tween-20/20% de ETOH/PBS (concentración final). Además, se usaron controles positivos con células únicamente y virus únicamente. El control por células únicamente uso sólo medio de mantenimiento. Ara el control por virus únicamente, los procedimientos de prueba fueron idénticos excepto que se uso un medio de mantenimiento de células en lugar de los compuestos de prueba. Los cuadros 56-57 despliegan formulaciones que fueron probadas.

CUADRO 56 Fórmula I CUADRO 57 Fórmula II El punto final de la prueba virucida fue determinada por observación visual de los efectos citopáticos (CPE) y el título viral residual se determinó por el método de Karber. La reducción del título de virus expuesto a los compuestos de prueba se determinó mediante comparación con el control con virus únicamente. La actividad antiviral es una reducción de 1 -log?0 TCID50/ml (véase, Oxford, J.S., et al., "Sodium deoxycholate exerts a direct destructive effect on HIV and Influenza viruses in-vitro and inhibits retrovirus-induced pathology in an animal model." Antiv. Chem. Chemother., 5(3): 176-181 (1994)). El punto final de la prueba virustática también se determinó mediante puntuaciones de CPE vísuals. La actividad viral estuvo representada por la presencia o ausencia de infección.

Prueba virustática En la prueba virustática ambas formulaciones l-ll fueron diluidas 1 /10 (101), 1/100 (102) y 1/1000 (103). Además, formulaciones no diluidas l-ll (10°) se probaron. En la prueba virustática, células de riñon canino de Mardin-Darby (MDCK) se sembraron en placas de 96 pozos (100 µl/pozo) y se incubaron durante 2 días a 37°C con 5% de CO2. Después de 2 días, las células se lavaron dos veces con 100 µl/pozo de PBS después se expusieron a 100 µl/pozo de medio de infección. Una dilución de 1/103 de abastecimiento viral neto se añadió a las células y se dejó fijar durante 1 a 2 horas bajo condiciones de incubadora estándares (es decir, 37°C con 5% de CO2). Cada formulación de prueba (diluida y no diluida) se añadió después a los pozos infectados a 50 µl/pozo. Las placas se incubaron durante 3 días bajo condiciones de incubadora estándares. La observación de CPE y la tinción con cristal violeta determinaron el punto final de la prueba. Además, se realizó una prueba de hemaglutinación (HA) siguiendo una serie de dilución de 2 veces. Bajo tinción con cristal violeta, se observó alguna actividad virustática cuando la formulación I se uso no diluida y para la dilución 1/101. La concentración efectiva, CE50 se calculó que era 1/101 88 (es decir, una dilución entre 1/101 y 1/102). En esta prueba, CPE se observó en todos los pozos de prueba para todas las diluciones de la formulación II. Bajo tinción con cristal violeta, no se observó actividad virustática con la formulación II.

El cuadro 58 despliega los datos de prueba de HA a partir de la prueba virustática.

CUADRO 58 Actividad de prueba virustática Título HA (HAU) Dilución (10 ) Formulación I Formulación nueva II 0 64 <2* -1 32 <2* -2 256 128 -3 256 256 * El valor de HAU (unidades HA) registrado aquí es probable que se deba a la toxicidad del compuesto y no a la actividad antiviral.

El titulo de HA para amatadina varió de 16 a 32 HAU indicando poca actividad contra la cepa AA/ietnam/1194/04.

Prueba virucida En la prueba virucida tanto la formulación I como II se diluyeron 1 /10 y 1/80. En la prueba virucida, células de riñon canino de Mardin-Darby (MDCK) se sembraron en placas de 96 pozos (100 µl/pozo) y se incubaron durante 2 días a 37°C con 5% de CO2. Después de 2 días, las células se lavaron dos veces con 100 µl/pozo de PBS después se expusieron a 100 µl/pozo de medio de infección. Una dilución de 1/1000 de abastecimiento viral neto (40 µl/pozo) se añadió a cada compuesto de prueba (360 µl) y se dejó incubar a temperatura ambiente durante ya sea 30 segundos o 5 minutos. La reacción se terminó mediante la adición del medio de infección (3.6 ml). la terminación de la reacción fue causada por la dilución de 1 :10. La mezcla de terminación se añadió por duplicado (111 µl) a la primera hilera de las placas de 96 pozos y se tituló a través de la placa siguiendo una serie de diluciones de 10 veces. Las placas se incubaron durante 3 días bajo condiciones de incubadora estándares y CPE se calificó. Una prueba de hemaglutinación (HA) se realizó siguiendo una serie de diluciones de 2 veces.

El cuadro 59 despliega datos de HA a partir de la prueba virucida usando la formulación I.

( UADRO 59 Actividad virucida de la formulación 1 Formulación 1 (HAU) 1/10 1/80 Dilución (10x) Tiempo (minutos) 0.5 5 0.5 5 0 <2 <2 64 <2 -1 <2 <2 <2 <2 -2 <2 <2 <2 <2 -3 <2 <2 <2 <2 -4 <2 <2 <2 <2 Control de célula <2 <2 <2 <2 Control de virus 64 64 64 32 Los datos indican que hay actividad virucida para la formulación I después de una incubación de 5 minutos y para la dilución de 1/10 únicamente después de una incubación de 30 segundos.

El cuadro 60 despliega datos de HA de la prueba virucida usando la formulación II.

CUADRO 60 Actividad virucida de la formulación II Formulación II (HAU) 1/10 1/80 Dilución (10x) Tiempo (minutos) 0.5 5 0.5 5 0 256 256 32 256 -1 <2 <2 16 32 -2 <2 <2 <2 <2 -3 <2 <2 <2 <2 -4 <2 <2 <2 <2 Control de célula <2 <2 <2 <2 Control de virus 32 64 64 64 El cuadro 60 muestra que hay alguna actividad virucida detectable con la formulación II pero reducida cuantitativamente cuando se compara con la observada para la formulación I. El control positivo para ambas pruebas virucidas fue 1 % de Tween-20/20% de ETOH/PBS. El control positivo tuvo un <2 HAU consistente sobre todas las placas demostrando así buena actividad antiviral contra la cepa A?/ietnam/1194/04.

Conclusión La formulación I tuvo actividad antiviral detectable cuando se probó en una prueba virustática. La actividad se clasificó como moderada con aproximadamente una reducción de 10 veces en replicación de virus. Sin embargo, algunos cambios no específicos se observaron en la monocapa de células cuando se incubó con las formulaciones QR, por lo tanto la contribución precisa de los efectos anticelulares versus antivirales no se pudo cuantificar. Ciertos antivirales novedosos se han diseñado para ejercer actividad inhibidora viral mediante un efecto sobre la función celular. Es posible que los diferentes componentes de la mezcla de QR estén ejerciendo diferentes efectos anticelulares y antivirales. La actividad virucida se detectó en la formulación II, pero la formulación II tuvo una eficacia menor que la formulación I. Un posible estudio futuro podría ser investigar la contribución de cada constituyente del compuesto completo. Hasta la fecha, los bloqueadores de NI (inhibidores de neuramidasa) han mostrado que inhiben la cepa H5N1 de influenza aviar, mientras que se ha mostrado que la amantadina es relativamente inactiva contra cepas H5N1 aviar. Sin embargo, cabe entender que aun cuando numerosas características y ventajas de la presente invención se han expuesto en la descripción anterior, son solamente ilustrativas. Se pueden hacer cambios para lleva a cabo los métodos y a las composiciones de la invención anteriormente expuestas sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Se pretende que todo el material contenido en la descripción anterior se interprete como ilustrativo y no en un sentido limitante. El alcance de esta invención está determinado a partir de las reivindicaciones anexas a la presente.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de una cantidad segura y efectiva de una composición que incluye: un primer ingrediente seleccionado de extracto de jengibre, polvo de jengibre, por lo menos una parte de una planta entera de jengibre, una tintura de jengibre o uno o más compuestos contenidos en el jengibre y mezclas de los mismos; un segundo ingrediente seleccionado de polvo de té verde, extracto de té verde, por lo menos una parte de una planta entera de té verde, tinturas de té verde, uno o más compuestos contenidos en té verde, y mezclas de los mismos; un vehículo aceptable, para la fabricación de un medicamento para reducir una incidencia de contraer un microbio o para reducir uno o más de severidad de una enfermedad, severidad de síntomas de la enfermedad e incidencia de síntomas de la enfermedad en un mamífero o un ave que no había contraído la enfermedad en el tiempo de administración del medicamento.

2.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la enfermedad es causada por un microbio seleccionado de un virus, una bacteria, un hongo y una levadura.

3.- El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el microbio es un virus seleccionado de virus de herpes, virus de VIH, virus de SIDA, virus de influenza, virus de influenza H5N1 , rinovirus, el virus de SARS y virus de sincicios respiratorios.

4.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde la composición está adaptada para administrarse en una forma seleccionada de una tableta, una cápsula, una pastilla, un trocisco, un caramelo duro, una composición masticable y un producto dental.

5.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde la composición está adaptada para administrarse como una aspersión nasal o como una aspersión para la garganta.

6.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde el primer ingrediente se selecciona de extracto de polvo de jengibre y extracto de fluido de jengibre; y el segundo ingrediente se selecciona de extracto de polvo de té verde y extracto de fluido de té verde. 7 '.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde el primer ingrediente es polvo de raíz de jengibre y el segundo ingrediente es extracto de té verde. 8.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en donde la composición incluye además un tercer ingrediente seleccionado de extracto de cúrcuma, uno o más compuestos curcuminoides, uno o más de otros compuestos contenidos en cúrcuma, polvo de cúrcuma, por lo menos una parte de la planta entera de cúrcuma, una tintura de cúrcuma, y mezclas de los mismos. 9.- El uso como se reclama en la reivindicación 8, en donde el tercer ingrediente se selecciona de extracto de polvo de cúrcuma y extracto de fluido de cúrcuma. 10.- El uso como se reclama en la reivindicación 8, en donde el tercer ingrediente es extracto de cúrcuma. 11.- El uso como se reclama en la reivindicación 8, en donde la composición contiene de 1 mg a 20 mg de extracto de polvo de cúrcuma. 12.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 8-11 , en donde la composición incluye además un cuarto ingrediente seleccionado de raíz de rábano picante y extracto de rábano picante. 13.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, en donde la composición incluye además uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste de etanol, resveratrol, propilenglicol y glicerina. 14.- El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde la composición incluye etanol. 15.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, en donde la composición incluye 0.032 a 15 por ciento en peso del primer ingrediente, basado en el peso total de la composición. 16.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, en donde la composición incluye 0.0326 a 15 por ciento en peso del primer ingrediente, basado en el peso total de la composición. 1

7.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 -16, en donde la composición incluye 0.0032 a 2 por ciento en peso del segundo ingrediente, basado en el peso total de la composición. 1

8.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde la composición incluye 0.0220 a 2 por ciento en peso del segundo ingrediente, basado en el peso total de la composición. 1

9.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 8-12 y 13-18, cuando dependen de las reivindicaciones 8-12, en donde la composición incluye de 0.004 a 2 por ciento en peso del tercer ingrediente, basado en el peso total de la composición. 20.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 8-12 y 13-18, cuando dependen de las reivindicaciones 8-12, en donde la composición incluye 0.0308 a 2 por ciento en peso del tercer ingrediente, basado en el peso total de la composición. 21.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde cada gramo de la composición contiene de 1 mg a 20 mg de extracto de té verde y de 1 mg a 150 mg de polvo de raíz de jengibre.