MX2007004028A

MX2007004028A - Vacunas con virus enteros inactivados con subtipo coincidente para tratar pacientes con infeccion por vih.

Info

Publication number: MX2007004028A
Application number: MX2007004028A
Authority: MX
Inventors: Jean-Marie Andrieu; Louis Wei-Lu
Original assignee: Biovaxim Ltd
Priority date: 2004-10-04
Filing date: 2005-10-04
Publication date: 2007-09-11
Also published as: DE602005008264D1; CN101056977A; RU2007115549A; EP1797175B1; JP2008515795A; ATE401392T1; IL182440A; CA2582426A1; AU2005290930B2; AU2005290930A1; EP1797175A1; US20060093623A1; IL182440A0; ES2310848T3; WO2006038124A1; RU2396346C2; BRPI0516314A; CN101056977B

Abstract

Se usa VIH entero inactivado de un subtipo particular para preparar vacunas y composiciones farmaceuticas que contienen las vacunas. Las vacunas pueden usarse para tratar individuos infectadosde manera cronica con VIH, induciendo una respuesta inmunitaria celular protectora en individuos contra el mismo subtipo de VIH usado para producir la vacuna.

Description

VACUNAS CON VIRUS ENTEROS INACTIVADOS CON SUBTIPO COINCIDENTE PARA TRATAR PACIENTES CON INFECCIÓN POR VIH Campo de la invención Esta invención se refiere al campo de vacunas para el tratamiento de infección viral, en particular para el tratamiento de infección por VIH en seres humanos. Antecedentes de la invención Veinte años después del descubrimiento del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), aún no existe disponible una vacuna preventiva o terapéutica. Las proyecciones recientes de la Organización Mundial de la Salud y del Programa Conjunto de las Naciones Unidas sobre VIH/SIDA indican que si la pandemia avanza a su tasa actual, habrá 45 millones de infecciones nuevas para el año 201 O1. Si bien se ha logrado progreso significativo al extender la supervivencia de las personas infectadas por el VIH y en la reducción de la transmisión del VIH materno hacia el recién nacido mediante la terapia anti retroviral, hay un número en aumento de pacientes que desarrollan resistencia al fármaco y/o efectos adversos graves relacionados con el fármaco con la terapia anti retroviral a largo plazo. Por ello, se necesitan estrategias terapéuticas alternativas adicionales urgentemente, para proteger del avance de la enfermedad a los individuos infectados por el VIH. En una prueba de fase lll en seres humanos en gran escala, una vacuna candidata dirigida a desencadenar la inmunidad humoral para neutralizar el VIH ha fallado recientemente en demostrar su eficacia2. Esta carencia de protección no se puede mantener con la incapacidad bien conocida de los diseños de vacuna actuales para producir anticuerpos neutralizantes (Nab) efectivos contra el VIH in vivo3. Esta incapacidad para aumentar los Nab de manera eficiente, probablemente está determinada por la naturaleza del agente infeccioso. Por ejemplo, hasta ahora no hay vacuna preventiva exitosa para infecciones crónicas tales como infección con el virus de tuberculosis, de lepra, y de hepatitis C. En contraste, las vacunas exitosas previenen las enfermedades infecciosas agudas, tales como polio, sarampión, difteria, tétano o viruela mediante la inducción de Nab, las cuales también pueden ser transferidas por, vía trans placentaria o por medio de la leche para proteger al feto o al neonato de infecciones. Es bien reconocido que la inmunidad celular de larga duración puede controlar potencialmente enfermedades en situaciones en donde el agente infeccioso no está erradicado, tal como en infecciones crónicas con tuberculosis, lepra, virus de hepatitis B o C, y VI H. A este respecto, se demostró que las respuestas enérgicas específicas para el virus de las células T auxiliares de tipo 1 (Th 1 ) CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) efectores (perforina+) están asociadas con el control de viremia y con el no avance a largo plazo de la viremia en individuos con infección crónica por VIH4"10. Además, la intervención temprana con la terapia anti retroviral altamente activa (HAART) durante o poco después de una infección aguda, se asoció con las respuestas de las células Th1 CD4+ específicas para VIH-111,12. En contraste, en una etapa posterior, la HAART condujo a la disminución de respuestas de las células Th1 CD4+ y CTL específicas para VIH-15,13,14, lo que sugiere que las capacidades funcionales de las células presentadoras de antígeno (APC) para capturar el VIH-1 (las cuales son requeridas para la inducción de la respuesta inmunitaria) se pierden progresivamente a lo largo del curso de la infección15"18. En este contexto, una vacuna terapéutica dirigida a producir respuestas inmunitarias celulares de larga duración específicas para VIH, podría ser factible bajo las dos condiciones que son requisito previo: 1) el descubrimiento de un inmunógeno apropiado capaz de producir una inmunidad celular protectora fuerte, amplia y prolongada; y 2) la reconstitución de la función disminuida de las APC in vivo ya sea mediante la transferencia adoptiva de las APC activadas ex vivo (es decir, estrategia de reemplazo) o mediante una activación directa in vivo de DC menos disminuidas (tales como células de Langerhans) por medio de una combinación simultánea del inmunógeno y de las citocinas o adyuvantes apropiados. El objetivo final de una vacuna terapéutica exitosa es reducir sustancialmente la carga viral de los pacientes infectados por VIH-1 en el nivel más bajo que sea posible. Esto podría protegerlas del avance de la enfermedad, y reducir así el requerimiento de fármacos anti retrovirales dañinos y costosos. Más aún, la reducción prolongada de la carga viral del VIH podría reducir al mínimo su riesgo de transmitir sexualmente el virus a personas sanas19. Una respuesta inmunitaria protectora inducida por vacuna puede diferir sustancialmente, dependiendo de la naturaleza del inmunógeno. Las vacunas aten uadas vivas desencadenan respuestas inmunitarias h umorales y celulares, mientras que las vacuas de virus muertos y de proteínas sintéticas purificadas preferiblemente desencadenan la respuesta h umoral (anticuerpo) . En u na prueba clínica en múltiples centros dirigida a disparar el brazo celular del sistema inmun itario , los investigadores no estuvieron de acuerdo en que solamente 20% de 205 voluntarios inmunizados con una vacuna experimental elaborada de ADN bacteriano q ue contenía genes de VI H tuvo una respuesta celu lar inmunitaria específica para VI H (si bien la sensibilización con ADN no funciona bien en experimentos con ratones)20. En este contexto, los inventores de la presente (y otros) han descubierto recientemente que el V1 H-1 entero inactivado, en el cual la estructura conformacional de la proteína de envoltura gp 120 está conservada (lo que ocurre por ejemplo en el caso cuando el virus se trata con aldritiol-2 [AT-2]) , puede ser procesado y presentado por las células dend ríticas (DC, las APC más potentes) para inducir una respuesta potente de CTL restringida por H LA-I in vitro2 '1 , 22. Varios estudios también han demostrado que la transferencia adoptiva de DC autólogas cargadas in vitro con VI H-1 entero inactivado, indujo inmunidad antiviral protectora al VI H-1 en ratones hu-PB L-SC I D23"24.

Los inventores de la presente h ab ían demostrado previamente que una vacu na terapéutica elaborada de DC cargadas con la cepa mac251 del virus de inmunodeficiencia del simio (VISmac251 ) -condujo, en ausencia de cualq uier otra terapia antiviral , a supresión viral marcada en monos Rhesus chinos inmunizados dos meses antes de la infección con VISmac25125. Tomados j untos, estos hallazgos sugieren que el virus entero inactivado por AT podría usarse como una eficiente vacu na inmunógena para desencadenar respuestas protectoras de CTL específicas para VI H-1 en personas con infección crónica por VI H-1 . Sin embarg o, la variabilidad global extensiva del VI H-1 es u n arg u mento contra el concepto del uso farmacéutico de una preparación con virus entero inactivado de grado G M P como una vacuna terapéutica universal para el VI H-1 . Breve descripción de la invenci ón Esta invención proporciona una vacuna que contiene VI H entero inactivado de un subtipo específico, opcionalmente con un adyuvante . La vacuna se puede usar para tratar individuos infectados crónicamente con VI H , induciendo una respuesta inmunitaria celular protectora contra el mismo subtipo de VI H utilizado para producir la vacuna. La invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene una vacuna que contiene VIH entero inactivado de un subtipo específico y un portador aceptable farmacéuticamente. La invención proporciona además el uso de VI H entero inactivado de un subtipo específico para producir u n medicamento para tratar a un individuo infectado crón icamente con VI H . El medicamento se puede usar para tratar individuos infectados crónicamente con VI H , induciend o una respuesta inmunitaria celular protectora contra el mismo su btipo de VIH utilizado para producir la vacuna. La invención proporcion a todavía un método para tratar a un individuo infectado crónicamente con VI H, q ue comprende administrar una vacuna q ue contiene VI H entero inactivado de un subtipo específico al individuo , opcionalmente con un adyuvante, de tal forma que se induce en el individuo una respuesta inmunitaria celular protectora contra el mismo subtipo de VI H utilizado para produci r la vacuna . En una modalidad, el VI H inactivado se carga ex vivo en células presentadoras de antígeno (APC), las cuales luego son administradas al individuo. Breve descri pción de las figu ras La figura 1 muestra la actividad eliminadora de linfocitos T citotóxicos (CTL) de las vacunas de la invención . La fig ura 2 m uestra los efectos de inmunización ¡ntradérmica con mac 251 de VIS en la carga viral en plasma de macacos infectados crónicamente con VISmac251 . Los datos representan la media geométrica de copias de ARN de VIS por mililitro de plasma antes y después de la inmunización . El valor P representa el análisis estadístico de los datos apareados antes, y en el mes 3 o 6 después de la inmunización por la prueba Wilcoxon .

Descripción detallada de la invención Hay dos grupos principales de VI H (VI H-1 y VI H-2) y muchos subgrupos debido a que el genoma del VIH muta constantemente. La diferencia principal entre los g rupos y subg rupos es la envoltura viral. El VI H se clasifica en el subg rupo principal (M) y un décimo subgrupo extremo (O) , en el cu al el subg rupo M está dividido en nueve subtipos (ciados) denominados A hasta J28'29. La variación genética observada en el genoma del VI H es el resultado de mutación , recombinación, inserción y deleción . Las vacunas contra el VI H de acuerdo con la invención , preferiblemente subtipos de VI H como los subtipos A, B , C , o E, mostraron alta actividad eliminadora de CTL con cepas virales coincidentes con el subtipo, mientras q ue solamente se observó poca actividad eliminadora en subtipos cruzados. Si bien la actividad eliminadora en subtipos cruzados fue observada en casos individuales, la eficiencia de eliminación de CTL varió ampliamente en las cepas virales, con subtipos no coincidentes comparada con la de las cepas virales con subtipos coincidentes (véase el ejemplo 1 y la figura 1 , más adelante) . Así, la invención proporciona una vacuna terapéutica específica para el subtipo, para el VIH , elaborada con una preparación de VIH entero inactivado de un subtipo dado . Las vacunas de la invención se pueden usar para tratar a un individ uo con una infección crónica de VI H , en donde las vacunas inducen una respuesta inmunitaria celular protectora contra el mismo subtipo de VI H utilizado para prod ucir la vacuna.

Como se usa aquí, el término "vacuna" se refiere a una composición que se administra para producir o para aumentar artificialmente la inmunidad hacia una enfermedad en particular. Preferiblemente, las vacunas se producen con un subtipo de VIH que no es autólogo para el individuo que está siendo tratado. De hecho, los inventores han demostrado que inesperadamente una vacuna con un subtipo de VIH que no sea autólogo para el individuo que va a ser tratado, permite disminuir significativamente la carga viral de dicho individuo. De acuerdo con la invención, se puede tratar una infección crónica con cualquier subtipo de VIH, por ejemplo las infecciones crónicas con el virus del VIH se seleccionan de uno de los subtipos A, B, C o E (y otros) del grupo M, así como también del grupo de VIH-2 y el sub grupo de VIH O. En una modalidad, la composición de la invención puede contener varios subtipos de VIH inactivados - por ejemplo, dos, tres, cuatro o más subtipos diferentes de VIH inactivado-. Como se usa aquí, "tratar" a un individuo con una infección crónica de VIH significa que los síntomas de infección por VIH son prevenidos, reducidos o inhibidos; la carga viral (en particular la carga viral en plasma) es reducida después de administrar la vacuna; y/o se induce la respuesta de CTL contra el VIH en el individuo. Se entiende que "tratar" a un individuo por una infección crónica no requiere la erradicación completa del VIH en el individuo. Como se usa aquí, "individuo con una infección crónica por VI H" significa un individuo ai cua l se le puede diagnosticar q ue está infectado con VIH. Como se usa aq uí, "VI H entero inactivado" significa una partícu la de VI H completo, q ue ha sido inactivado , y que ya no es infeccioso . En la práctica de la invención, el VI H de un subtipo específico puede ser inactivado mediante cualq uier técnica apropiada conocida por u na persona entrenada en la técnica, tal como irradiación u ltravioleta, calor o tratamiento qu ímico , como formaldeh ido , paraformaldehído, propiolacteno o tratamiento con AT-2. Preferiblemente, el VI H de un sub tipo específico es inactivado exponiendo el VI H a un tratamiento qu ímico, y más preferiblemente a tratamiento con AT-2. I nesperadamente, tal inactivación con AT-2 permite mantener la estructu ra conformacional de las proteínas del VI H , y la inducción de respuesta real potente de CTL con no autólogos . Se puede usar inmunógenos del virus entero inactivado específico para el subtipo ya sea para carga "ex vivo" (también denominada "pulsación") o en células presentadoras de antígeno (APC), tales como células dend ríticas maduras o inmaduras (DC) o células de Langerhans (LC) para producir una vacuna terapéutica basada en APC, o para una inyección directa ¡ntradérmica in vivo que permita la carga in vivo de LC para producir una vacuna libre de células. En una modalidad , las vacu nas libres de 'células de la invención se pueden administrar, por ejemplo, mediante suministro directo (preferiblemente libre de aguja) del VI H inactivado específico para el subtipo (por ejemplo, mediante una inyectadora intradérmica) a la piel del paciente, mediante métodos dentro de las capacidades de la técnica. Los dispositivos libres de aguja para la administración de vacunas intradérmicas son bien conocidos para los hábiles en la técnica, e incluyen como ejemplo, los dispositivos descritos en la patente estadounidense número 6,933,319 y en la solicitud de patente internacional WO 2004/1 0125, las cuales están incorporadas aquí mediante referencia. La vacunación a través de la piel (administración intradérmica) es particularmente ventajosa, dado que la epidermis alberga grandes cantidades de LC. Se sabe que las LC son la forma inmadura de las DC, las cuales están localizadas en proximidad cercana a la capa más superficial de la piel, el stratum corneum. Estas LC representan una red de células inmunitarias que subyacen 25% del área superficial de la piel26 y permanecen intactas funcionalmente durante la fase temprana asintomática de la infección crónica por el VIH/VIS27. Los inventores han demostrado que esta administración intradérmica de las vacunas libres de células de la invención posibilita significativamente la disminución de la carga viral del VIS. En otra modalidad, las vacunas basadas en APC de la invención, pueden ser administradas, por ejemplo, por suministro directo de las APC cargadas con VI H inactivado específico para el subtipo (por ejemplo, mediante una inyectadora subcutánea), al paciente por métodos que están dentro de las capacidades de la técnica. En una modalidad , el método comprende un paso previo de determinar el subtipo de VI H que infecta al paciente que va a ser tratado antes de la administración de la composición de la invención. Esta determinación se puede hacer por métodos bien conocidos en la técnica, como genotipeaje del área específica de la secuencia de VIH mediante análisis del VI H presente en una muestra de sangre de dicho paciente. Preferiblemente , este paso de determinación del subtipo de VI H es seguido por la administración de las vacunas libres de células basadas en APC , de la invención , que contienen el mismo subtipo de VI H que el q ue está infectando al paciente que va a ser tratado. En otra modalidad, se trata a un individ uo con APC cargadas con VI H inactivado de un subtipo específico. Las APC se cargan primero con el VI H inactivado ex vivo, y luego se administran las APC cargadas el paciente mediante cualquier técnica apropiada. Preferiblemente, el APC cargado se le inyecta al individuo por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular, preferiblemente mediante una inyección subcutánea . Más preferiblemente, las APC se obtienen por un muestreo previo de PB MC del individuo que va a ser tratado, con el fin de aislar los monocitos (CD 14+) , los cuales luego son transformados con citocinas conocidas en células dendríticas inmaduras y luego mad uras. Estos métodos son bien conocidos para una persona entrenada en la técnica , como ejemplo, un método de este tipo está descrito en el ejemplo 1 . A diferencia de los productos bacterianos, el VI H entero inactivado solo no es tan eficiente para inducir la maduración de las DC25 como para permitir una migración eficiente de estas células a los nodos linfáticos que drenan, en donde ellas ejecutan su función inmunoestimuladora. Por lo tanto, una clase de moléculas potentes conocidas como adyuvantes preferiblemente se combina con el VIH entero ¡nactivado para disparar la maduración óptima de las células inmunitarias, tales como las LC, permitiendo así que se genere una respuesta inmunitaria celular contra el VI H-1 . El término "adyuvante" se refiere a una sustancia añadida a una vacuna para mejorar la respuesta inmunitaria. Los adyuvantes apropiados incluyen adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, saponina, geles minerales tales como hid róxido de aluminio, sustancias activas en superficie, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, aceite o emulsiones de hidrocarburos, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol, productos bacterianos convencionales (tales como toxina del cólera, enterotoxina lábil al calor, BCG (bacilo Calmette-Guerin) atenuado o muerto y Corynebacterium parvum, o proteínas derivadas de BCG) , moléculas bioquímicas (tales como FNT-alfa, I L-1 beta, IL-6, PGE2, o CD40L), u oligonucleótidos que contienen un motivo CpG. Los ejemplos de materiales apropiados para su uso en composiciones de vacuna están descritos, por ejemplo, en Osol, A. , ed., Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980), pp. 1324-1341, el cual está incorporado aquí por completo mediante referencia. Las células dendríticas tienen un papel pivote en la regulación de la diferenciación de monocitos, y más especialmente en la regulación del perfil de CD4-TH1 contra CD4-Th2. Preferiblemente, la composición de vacuna libre de células de la invención contiene adyuvantes capaces de estimular células dendríticas con el fin de inhibir la diferenciación celular en el perfil CD4-Th2, que con frecuencia es inducido en la infección crónica, y simultáneamente es capaz de estimular las células dendríticas con el fin de activar la diferenciación celular en el perfil CD4-Th1. Estos adyuvantes son bien conocidos para una persona entrenada en. la técnica, e incluyen productos bacterianos (tales como algunas proteínas derivadas de BCG como Ag85B) o compuestos químicos como compuestos con actividad anti-COX, y más especialmente con actividad anti-COX2 (tales como VIOX®, CELEBREX®, o RIBAVERIN®). Las vacunas de la invención pueden ser formuladas en composiciones farmacéuticas (también denominadas "medicamentos") para tratar a un individuo infectado crónicamente con VIH. Las composiciones farmacéuticas de la invención preferiblemente son estériles y libres de pirógenos, y también contienen un portador aceptable farmacéuticamente. Los portadores aceptables farmacéuticamente que son apropiados, incluyen agua, soluciones salinas (por ejemplo, salina fisiológica), ajustadores de viscosidad y otros excipientes farmacéuticos convencionales y/o aditivos utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas para su uso en seres humanos . Los excipientes farmacéuticos apropiados incluyen estabilizadores, antioxidantes , agentes aj ustadores de osmolalidad , amortig uadores, y agentes ajustadores de pH. Los aditivos apropiados incluyen amortiguadores biocompatibles fisiológicamente (por ejemplo, clorhidrato de trometamina y similares) , quelantes (por ejemplo, CTPA, DTPA-bisamida y similares) , o complejos de quelato de calcio (por ejemplo, calcio DTPA, CaNaDTPA-bisam ida y similares) u opcionalmente, adiciones de calcio o sales de calcio (por ejemplo, cloruro de calcio, ascorbato de calcio, gluconato de calcio, lactato de calcio y similares). La formulación de composiciones farmacéuticas de la invención está dentro de las habilidades en la técnica, por ejemplo, como las q ue se describen en Remington's Pha rmaceutical Science, 1 7a . Ed. , Mack Publishing Company, Easton Pa (1 985), cuya descripción entera está incorporada aquí mediante referencia. Un régimen típico para tratar a un individuo infectado crónicamente con VI H que puede ser aliviado por una respuesta inmunitaria celular mediante terapia activa, comprende la administración de una cantidad efectiva de una composición en vacuna como la que se describió anteriormente, administrada como un tratamiento simple, o repetido como dosis ampliadas o de refuerzo, durante un periodo desde una semana hasta aproximadamente 24 meses , ambos inclusive. De acuerdo con la presente invención , una "cantidad efectiva" de una composición para vacuna es una que es suficiente para lograr un efecto biológico deseado, en este caso al menos una respuesta inmunitaria celular o humoral al VIH, preferiblemente una respuesta inmunitaria celular. Se entiende que la dosis efectiva será dependiente de la edad, sexo, salud y peso del receptor, tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, frecuencia del tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado. Los rangos de dosis efectivos proporcionadas más adelante no pretenden limitar la invención, y representan rangos de dosis preferidos. Sin embargo, la dosis más preferida será ajustada al sujeto individual, tal como lo entiende y lo puede determinar una persona entrenada en la Xécnica, sin experimentación indebida. Véase, por ejemplo, Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra, Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, Mass (1985), y Katsung (1992), infra, cuyos contenidos y las referencias citadas en ellos están incorporados aquí en su totalidad mediante referencia. En términos generales, la dosis para un adulto humano será desde aproximadamente 106 hasta aproximadamente 1014 partículas de VIH entero inactivado por dosis, con 108-1012 preferido. Cualquiera que sea la dosis utilizada, debe ser una cantidad segura y efectiva, según se determine mediante métodos conocidos, tal como se describe aquí también. La invención será ilustrada ahora mediante los siguientes ejemplos no limitativos. Ejemplos. Eiemplo 1 Métodos Muestras de virus y células Se obtuvieron cepas de VIH-1 mediante cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) agotadas en CD8, de pacientes infectados con VIH-1, subtipos A (n=10), B (n = 10), C (n=10), o E (n=10). Estas cepas de VIH (subtipos A, B, C, o E), fueron inactivadas luego mediante AT-2 (Sigma, St. Louis, Missouri), según se describe en 21, cuya descripción completa está incorporada aquí mediante referencia. Se prepararon DC derivadas de monocitos de cada paciente, mediante un cultivo estandarizado de 7 días25, bajo condiciones de GMP. De manera resumida, se sometieron las PBMC recién recolectadas a adherencia plástica a una densidad de 106 células/cm2 en la presencia de 0.5% de albúmina de suero humana para uso clínico (LBF, Les Ulis, Francia). Después de 2 horas de incubación a 37 °C en 5% de CO2, se eliminaron las células no adherentes enjuagando con solución amortiguadora de PBS. Las células adherentes fueron cultivadas luego durante 5 días en medio completo que contenía medio DC CelIGro de clasificación clínica (CellGenix, Freiburg, Alemania), complementado con 2000 U/mL de GM-SCF (Schering-Plough, Brinny, Irlanda) y 50 ng/mL de IL-4 de clasificación clínica (CellGenix). El día 5, se expusieron las DC a virus autólogo inactivado por AT-2 (109 partículas virales/mL) a 37 °C durante 2 horas. Después de 2 lavados para eliminar ei virus no fijado inactivado, se cultivaron las células durante 2 días más en el medio completo complementado con citocinas IL-1ß de clasificación clínica (10 ng/mL) (CellGenix), IL-6 (100 mg/mL) (CellGenix), y FNT-a (50 ng/mL) (CellGenix). En el día 7, se realizó el control de calidad (QC) de DC mediante citometría de flujo25, cuya descripción completa está incorporada aquí mediante referencia. Las DC viables aprobadas por el QC se utilizaron entonces para expandir las CTL autólogas específicas para el virus mediante un procedimiento de co-cultivo como se describe en 21, supra. Análisis citotóxico Se pulsaron las células DC con AT-VIH- (109/mL) durante 90 min, luego se marcaron con CFSE (Molecular Probes, PoortGebouw, Países Bajos) (10 nM) durante 15 min y se lavaron dos veces. Se marcaron las DC no pulsadas con CSFE como control de especificidad. Se colocaron en placas las CTL específicas para el subtipo de cepa del VIH-1, en Micro Tubes-Bulk (Bio-Rad, Hercules, CA), en la presencia de células dendríticas (DC) pulsadas con AT-2-VIH-1 marcadas con CFSE, de subtipo coincidente o no coincidente, en una proporción E:T de10:1 durante 4 horas a 37 °C. Al final de la incubación, se le añadió 10 µL de yoduro de propidio (Pl, Sigma) (20 µg/mL) a cada tubo. Se analizó la citólisis objetivo en un aparato FACSCalibur (BD lmmunocytometry System, San José, CA). Se determinó la actividad citolítica calculando el porcentaje de DC con tinción para CFSE/PI después de la sustracción de la tinción no específica para CFSE/PI de las DC no pulsadas. Análisis estadístico Se compararon los datos alterados entre las actividades de eliminación celular del VIH-1 con subtipos conicidentes y con subtipos no coincidentes mediante la prueba de Mann-Whitney. Resultados Las vacunas de acuerdo con la presente invención específicas para los subtipos A, B, C, o E del VIH mostraron alta actividad eliminadora de CTL in vitro (28-37%) con cepas virales coincidentes en subtipo (n = 10), mientas que solamente se observó baja actividad eliminadora con subtipo cruzado (5-17%) (P < 0.001). A pesar de que se observó actividad eliminadora de subtipo cruzado en casos individuales, la eficiencia de eliminación de CTL varió ampliamente en las cepas virales con subtipos no coincidentes (DS/media > 50%), comparada con la de las cepas virales con subtipos coincidentes (DS/media < 20%) (P < 0.001) (Fig. 1). Estos hallazgos indican que se puede elaborar una vacuna terapéutica farmacéutica específica para el subtipo de VIH, mediante la preparación de virus entero inactivado de clasificación GMP. Eiemplo 2 .Se identificaron individuos infectados crónicamente con VIH, y se determinó el subtipo de VIH con el cual estaba infectado el individuo. La carga viral de plasma se determina para cada individuo antes del tratamiento con una vacuna de la invención. Se obtuvo el VIH del mismo subtipo que el subtipo con el cual están infectados los individuos, se cultivó y se inactivo con AT-2 como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Se administraron los subtipos de VIH inactivado a un grupo infectado crónicamente mediante suministro intradérmico sin aguja, y se midió la carga viral en plasma. Se espera que la carga viral en plasma en los individ uos infectados crónicamente será red ucida significativamente con la administración de las vacunas de la presente. A otro g rupo de individuos infectados crónicamente se les administran células dendríticas que han sido cargadas con VI H inactivado con AT-2 como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 . Las células dendríticas cargadas con VI H se administran a los individuos. Se espera que la carga viral en plasma en los individuos infectados crónicamente será red ucida significativamente con la administración de las célu las dendríticas cargadas. Eiemplo 3 40 macacos infectados crónicamente (> 1 año) con VISmac251 , con una carga viral en plasma > 1 000 copias/m L fueron aleatorizados para recibir ya sea una inyección intradérmica mensual (25 cm2 en la espalda) del VI Sac LA2.1 (2.5 mL de solución de NaCI al 0.9% que conten ía 1 01 0 VI Smac251 inactivados con AT-2) du rante 5 meses usando una pistola para inyección automática (AKRA DERMOJ ET, Pau , Francia) (1 00 µ L/cm2/inyección) (n=20) ; o bien , recibieron una inyección intradérmica de placebo (2.5 mL de solución de NaCI al 0.9% sola) durante 5 meses (n=20) . Las muestras de plasma fueron recolectadas desde la línea de base y cada mes después de eso hasta los 6 meses y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Finalmente, se midió la carga en plasma de ARN de VIS mediante un análisis de RT-PCR cuantitativo (M UPROVAMA) . Resultados Las vacunas libres de células de acuerdo con la presente invención , y específicas para u n subtipo de VIS inducen cerca de 30% de red ucción (Fig . 2) en la carga viral en sangre a los 3 meses (P = 0.037) , y a ios 6 meses (P = 0.01 3). Estos hallazgos indican q ue una vacu na terapéutica farmacéutica específica para el subtipo de VIS puede elaborarse mediante la preparación de virus entero inactivado de clasificación G M P. Eiem plo 4 140 macacos infectados crónicamente (> 1 año) con VISmac251 con una carga viral en plasma > 1 000 copias/m L fueron aleatorizados para recibir ya sea una inyección intradérmica mensual (25 cm2 en la espalda) del VI Sac LA2.1 (2.5 mL de solución de NaCI al 0.9% que conten ía 1 01 0 VISmac251 inactivados por AT-2) con diferentes adyuvantes (1 Ó5 U FC de BCG muertos por calor, Ag85B recombinante derivado de BCG) d urante 5 meses usando una pistola para inyección automática (AKRA DERMJET, Pau , Francia) (1 00 µ L/cm2/inyección) con o sin administración oral diaria de 200 mg de CELEBREX® durante 4 semanas (n=20 para cada grupo); o bien, recibieron una inyección intradérmica de placebo (2.5 m L de solución de NaCI al 0.9% sola) durante 5 meses (n=20). Las muestras de plasma fueron recolectadas desde la línea de base y cada mes después de eso hasta los 6 meses, y se almacenaron a -80 °C hasta su uso . Finalmente, se midió la carga en plasma de ARN de VIS mediante un análisis de RT-PCR cuantitativo (MUPROVAMA). Referencias 1. Stover, J. eí al. Can we reverse the HIV/ AIDS pandemic with an expanded response? Lancet 360, 73-7 (2002). 2. Cohén, J. HIV/AIDS. Vaccine results lose significance under scrutiny. Science 299, 1495 (2003). 3. Srivastava, I.K., Ulmer, J.B. & Barnett, S. W. Neutralizing antibody responses to HIV: role in protective immunity and challenges for vaccine design. Expert Rev Vaccines 3 Supl. 1, S33-52 (2004). 4. Rosenberg, E.S. et al. Vigorous HIV-1-specific CD4+ T cell responses associated with control of viremia. Science 278, 1447-50 (1997). 5. Pitcher, CJ. er al. HIV-1-specific CD4+ T cells are detectable in most individuáis with active HIV-1 infection, but decline with prolonged viral suppression. Nat Med 5, 518- 25 (1999). 6. Zaunders, JJ. et al. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-l long-term non-progressor and in CMV infection. Blood (2003). 7. Boaz, M.J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, PJ. y Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-I infection. J Immunol 169, 6376-85 (2002). 8. Younes, S.A. er al. HIV-1 viremia prevenís the establishment of interleukin 2- producing HlV-specific memory CD4+ T cells endowed with proliferative capacity. J Exp Med 198, 1909-22 (2003). 9. Harari, A., Petitpierre, S., Vallelian, F. y Pantaleo, G. Skewed representation of functionally distinct populations of virus-specific CD4 T cells in HIV-1-infected subjects with progressive disease: changes after antiretroviral therapy. Blood 103, 966- 72 (2004). 10. Hess, C. er al. HIV-I specific CD8+ T cells with an effector phenotype and control of viral replication. Lancet 363, 863-6 (2004). 11. Malhotra, U. et al. Effect of combination antiretroviral therapy on T-cell immunity ¡n acute human immunodeficiency virus type 1 infection. J Infect Dis 181, 121-31 (2000). 12. Oxenius, A. et al. Eariy highly active antiretroviral therapy for acute HIV-I ¡nfection preserves immune function of CD8+ and CD4+ T lymphocytes. Proc Nati Acad Sci U S A 97, 3382-7 (2000). 13: Gray, CM. et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuáis receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol 162, 1780-8. (1999). 14. Kalams, S.A. et al. Levéis of human immunodeficiency virus type 1-specific cytotoxic T- lymphocyte effector and memory responses decline after suppression of viremia with highly active antiretroviral therapy. J Virol 73, 6721-8. (1999). 15. Mcllroy, D. et al. Low CD83, but normal MHC class II and costimuiatory molecule expression, on spieen dendritic cells from HIV+ patients. AIDS Res Hum Retroviruses 14, 505-13. (1998). 16. Grassi, F. et al. Depletion in blood CDI Ic-positive dendritic cells from HlV-infected patients. Aids 13, 759-66. (1999). 17. Donaghy, H. eí al. Loss of blood CDI lc(+) myeloid and CDI lc(-) plasmacytoid dendritic cells in patients with HIV-I infection correlates with HIV-1 RNA virus load. Blood 98, 2574-6. (2001). 18. Pacanowski, J. eí al. Reduced blood CD123+ (lymphoid) and CDl lc+ (myeloid) dendritic cell numbers ¡n primary HIV-I infection. Blood 98, 3016-21. (2001). 19. Quinn, T.C. eí al. Viral load and heterosexual transmission of human immunodeficiency virus type 1. Rakai Project Study Group. N Engl J Med 342, 921-9 (2000). 20. Cohén, J. AIDS vaccines. HIV dodges one-two punch. Science 305, 1545-7 (2004). 21. Lu, W. & Andrieu, J.M. In vitro HIV eradication by autoiogous CD8+ T cells expanded with inactivated-virus-pulsed dendritic cells. J Virol 75, 8949-56 (2001). 22. Buseyne, F. eí al. MHC-l-restricted presentation of HIV-I virion antigens without viral replication. Nat Med 1, 344-9. (2001). 23. Lapenta, C. eí al. Potent immune response against HIV-I and protection from virus challenge in hu-PBL-SCID mice immunized with inactivated virus-pulsed dendritic cells generated in the presence of IFN-alpha. J Exp Med 198, 361-7 (2003). 24. Yoshida, A. eí al. Induction of protective immune responses against R5 human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection in hu-PBL-SCID mice by intrasplenic immunization with HIV-1-pulsed dendritic cells: possible involvement of a novel factor of human CD4(+) T-cell origin. J Virol 77, 8719-28 (2003). 25. Lu, W., Wu, X., Lu, Y., Guo, W. y Andrieu, J.M.

Therapeutic dendritic-cell vaccine for simian AIDS. Nat Med 9, 27-32 (2003). 26. Yu, R.C., Abrams, D. C, Alaibac, M. & Chu, A.C. Morphological and quantitative analyses of normal epidermal Langerhans cells using confocal scanning láser microscopy. Br J Dermatol 131, 843-8 (1994). 27. Zimmer, M.l. eí al. Disrupted homeostasis of Langerhans cells and interdigitating dendritic cells in monkeys with AIDS. Blood 99, 2859-68. (2002).. 28. Hu eí al., JAMA 275:210-216. (1996). 29. Korber eí al., Science 280:1868-1871. (1998). Todos los documentos a los cuales se hace referencia en esta solicitud, incluyendo los enumerados aquí anteriormente, están incorporados aquí mediante referencia en su totalidad. Una variedad de modificaciones a las modalidades descritas anteriormente será evidente para los entrenados en la técnica a partir de la descripción que se proporciona aquí. Así, la invención puede ser incorporada en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o atributos esenciales de la misma.

Claims

REIVINDICACIONES

1 . El uso de H IV entero de un subtipo específico inactivado mediante tratamiento con alditriol 2 (AT-2) para producir una vacuna libre de células para tratar a un individuo infectado crónicamente con VIH , mediante administración intradérmica, caracterizado además porque el medicamento induce una respuesta inmunítaria celular protectora en el individuo contra el mismo subtipo de VIH utilizado para producir el medicamento.

2. El uso de la reivindicación 1 , caracterizado además porque el VI H entero inactivado de un subtipo específico no es autólogo para el individuo que está siendo tratado por infección crónica.

3. El uso de la reivindicación 1 , caracterizado además porque el VIH entero inactivado de un subtipo específico se selecciona del grupo de subtipos M , grupo VI H-2 y sub grupo VIH O.

4. El uso de la reivindicación 3, caracterizado además porque el subtipo del grupo M es A, B, C o E.

5. El uso de la reivindicación 1 , que además contiene un adyuvante.

6. El uso de la reivindicación 5, caracterizado además porque el adyuvante estimula la maduración de las células dendríticas.

7. El uso de la reivindicación 5, caracterizado además porque el adyuvante es capaz de estimular las células dendríticas con el fin de activar la diferenciación celular en el perfil CD4-Th2.

8. El uso de la reividicación 7, caracterizado además porque el adyuvante es capaz de estimu lar las células dend ríticas con el fin de activar la diferenciación celular en el perfil CD4-Th 1 .

9. El uso de la reivindicación 6, caracterizado además porque la célula dendrítica es una célu la de Langerhans. 1 0. Un método para tratar a un individuo infectado crónicamente con VI H , que comprende administrar al individuo mediante sumin istro intradérmico, una vacu na libre de células que contiene VI H entero de un subtipo inactivado mediante tratamiento con alditriol 2 (AT-2) caracterizado porque se ind uce en el individuo una respuesta inmu nítaria protectora contra el mismo subtipo de VIH utilizado para prod ucir la vacuna . 1 1 . El método de la reivindicación 1 0, que además comprende administrar un adyuvante al individuo. 12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 0 u 1 1 , caracterizado además porq ue el adyuvante estimula la mad uración de células dendríticas. 1 3. El método de la reivindicación 12, caracterizado además porque la célula dendrítica es un a célula de Langerhans. 14. El método de la reivindicación 10, caracterizado además porque el adyuvante es capaz de estimular las células dendríticas con el fin de inhibir la diferenciación celular en el perfil CD4-Th2. 1 5. El método de la reivindicación 1 0, caracterizado además porque el adyuvante es capaz de estimular las células dendríticas con el fin de activar la diferenciación celular en el perfil CD4-Th 1 . 16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 hasta 15, caracterizado además porque el VI H entero inactivado de un subtipo específico se selecciona de subtipos del grupo M, grupo VIH-2 y subgrupo VIH O. 17. El método de la reivindicación 16, caracterizado además porque el subtipo del grupo M es A, B, C o E. 18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 0 hasta 17, caracterizado además porque el suministro intradérmico es mediante suministro directo sin aguja. 19. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 hasta 18, caracterizado además porque el VI H entero inactivado de un subtipo específico no es autólogo para el individuo que está siendo tratado por infección crónica por VIH. 20. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 hasta 19, que comprende un primer paso de determinar el subtipo de VIH que está infectando al individuo que va a ser tratado. 21 . El método de la reivindicación 20, caracterizado además porque el VIH inactivado administrado y el VIH que infecta al individuo que va a ser tratado tienen el mismo subtipo.