ES2558933T3 - Composición de vacuna a base de un virus que presenta una proteína con uno o varios restos de dedo de zinc, su procedimiento de preparación y su utilización - Google Patents

Abstract

Composición para su utilización como vacuna a base de al menos una cepa de virus que presenta al menos una proteína PZ con uno o varios restos de dedo de zinc, que comprende estos virus en un estado inactivado, estando estos virus completos y presentando después de la inactivación una envolvente viral intacta, caracterizada por que dicho zinc de dicha proteína PZ ha sido expulsado de dicha al menos una proteína PZ por una reacción de oxidorreducción con azodicarbonamida y por que dicha composición comprende además biurea formada a partir de azodicarbonamida durante dicha reacción de oxidorreducción, así como posiblemente un remanente de azodicarbonamida sin reaccionar.

Description

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DESCRIPCION

Composicion de vacuna a base de un virus que presenta una protema con uno o varios restos de dedo de zinc, su procedimiento de preparacion y su utilizacion

La presente invencion se refiere a una composicion para su utilizacion como vacuna, a base de al menos una cepa de virus que presenta al menos una protema PZ con uno o varios restos de dedos de zinc, que comprende dichos virus en estado inactivado, estando estos virus enteros y presentando una envolvente viral intacta despues de la inactivacion (vease Mordock et al., Journal of Virology, Feb 2005, pp. 1533-1542, y su procedimiento de preparacion.

Hasta la fecha se conoce un gran numero de virus que presentan al menos una protema con uno o varios restos denominados "de dedo de zinc". Estas protemas se denominan abreviadamente protemas PZ.

Como virus que presentan dichas protemas PZ, se pueden citar principalmente retrovirus, arenavirus, filovirus, hepavirus, papilomavirus y herpesvirus. Entre las protemas PZ conocidas llevadas por estos virus se pueden citar, entre otras las protemas NCp7, Tax, NS5A, VP30, IE63, ORF4, UL69, BMLF1, U42, ORF57, ORF3, BICP27, UL54, M69, Z y E6.

La estructura de dedo de zinc de estas protemas PZ es indispensable de una u otra manera para la replicacion de los virus patogenos que las contienen. Por tanto, estas protemas representan una diana de eleccion para moleculas capaces de expulsar atomos de zinc, porque se produce entonces una modificacion irreversible de su estructura que inactiva el virus atacado y abole completamente su poder infeccioso.

Se han analizado numerosas moleculas y han demostrado un poder de expulsion de atomos de zinc fuera de las estructuras de dedos de zinc de las protemas PZ, principalmente la protema NCp7 del virus VIH. Estas moleculas estan enumeradas, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 2003/060098 y un de ellas es la azodicarbonamida (ADA) (vease tambien WG Rice et al., Nature Medicine 3, 341-345 (1997)).

La azodicarbonamida (= azobisformamida) se conoce desde hace mucho tiempo (1892) en forma de una sustancia qmmica cristalina (vease The Merck Index 13rd Ed., 2001, p. 918). Esta sustancia es poco soluble en agua y en la mayona de los disolventes organicos, con la excepcion de N,N-dimetilformamida y dimetilsulfoxido (DMSO). Por ADA se entiende en el sentido de la presente invencion, cada uno de los isomeros cis y trans de esta sustancia, asf como su mezcla racemica.

Esta sustancia se utilizo como adyuvante en harina alimenticia y como agente de hinchamiento en la fabricacion de productos plasticos y de caucho.

La actividad potencial de ADA se observo durante algun tiempo en diversas campos terapeuticos, en particular como agente terapeutico activo contra infecciones virales, ciertas afecciones cancerosas y trastornos resultantes de una produccion patologica de citoquinas (vease, por ejemplo los documentos de patentes europeas EP-B- 0524961, EP-B-0941098, EP-B-1032401 y el documento de patente US-A-5585367). Esta actividad se revelo igualmente frente al virus del SIDA (vease por ejemplo Vandevelde M. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 1996, 12, 567 o Erik De Clercq, Institute for Medical Research, KUL, Leuven 2001).

Otras investigaciones han demostrado la actividad de ADA contra los arenavirus (vease, por ejemplo, C.C. Garda et al., J. Gen. Virol 2006 May 87 (Pt 5): 1217-1228), herpesvirus (vease por ejemplo el documento WO 2003/060098), virus de la estomatitis vesicular VSV (vease el documento US-A-5585367), numerosos retrovirus (vease Rice WG, Conf. Retroviruses Opportunistic Infect ., Jan 1997), virus responsables del cancer de cuello uterino (seres humanos) VPH (vease Beerheide W., Journal of the National Cancer Institute, July 21, 1999), virus que provocan inmunodeficiencia en el mono macaco y en chimpances (VIS) (National Institute of Allergy and Infectious Diseases [NIAID] HIV/OI Searchable Chemical Database

http://chemdb2.niaid.nih.gov/struct_search/all/url_search.asp?aids_no=029805).

Numerosos investigadores tambien se han implicado en la investigacion de vacunas para combatir las infecciones causadas por estos virus portadores de protemas PZ, en particular en el campo de la vacunacion contra la inmunodeficiencia humana.

En la patente EP-B-0658119, se propone utilizar peptidos procedentes de cepas naturales del virus VIH para constituir vacunas terapeuticas y profilacticas. Sin embargo, estas protemas separadas de su soporte membranal viral no poseen la actividad antigenica buscada. Segun la solicitud de patente WO 2005/076001, se propone utilizar un polipeptido derivado de la protema GP41, que da lugar al mismo inconveniente que en la propuesta anterior. Por otra parte, se ha observado que los virus inactivados por formaldeddo o por la accion del calor no indudan, en preparaciones de vacunas, mas que una respuesta modesta en terminos de anticuerpos debido a la modificacion de las protemas inmunogenicas de la envolvente viral.

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En la solicitud de patente US-A-2003/228329 se describe el desarrollo de un vector viral (adenovirus) que lleva restos de VIH. Desafortunadamente, fueron decepcionantes los datos de los ensayos clmicos con la vacuna experimental.

En la solicitud de patente WO 2006/038124, se prevefa una composicion que contema un virus VIH entero, inactivado por un tratamiento qmmico con alditiol-2 (AT-2), utilizandose esta composicion en la preparacion de una vacuna. El proposito de este tratamiento era inactivar el virus manteniendo al mismo tiempo la estructura natural de sus protemas. Sin embargo, se sabe que el AT-2 es capaz de crear puentes de disulfuro entre los cromosomas de celulas linfocitarias humanas. Por otro lado, durante la inactivacion del virus VIH, el AT-2 se descompone en 2-tiopiridona que se comporta de forma impredecible con los grupos SH de las otras protemas. Estudios espectrofotometricos han demostrado que la 2-tiopiridona se asocia de forma no covalente con protemas que llevan grupos SH, reducidos o no.

Por ultimo, cabe senalar que el experto en la tecnica se enfrenta a una dificultad particular. Se deduce de un analisis efectuado por el laboratorio molecular del National Institute for Health (NIH) de Estados Unidos que el genoma humano contema informaciones muy utiles para la produccion de varios centenares de protemas con uno o varios restos de dedos de zinc.

El problema a resolver es pues cuadruple: Es necesario proporcionar una composicion en la que el virus este inactivado, y por lo tanto, haya perdido su poder infeccioso, permitiendo dicho virus sin embargo simultaneamente la estimulacion de anticuerpos por el sujeto al que se administra la composicion. Ademas, la composicion debe ser completamente aceptable en terminos de toxicidad y el tratamiento de inactivacion del virus debe presentar criterios estrictos de selectividad, es decir, no debe tener consecuencias para las protemas PZ utiles del sujeto al que se administra la composicion.

Para resolver este problema, se ha previsto segun la invencion, una composicion de vacuna a base de al menos una cepa de virus que presenta al menos una protema PZ con uno o varios restos de dedo de zinc, caracterizada por que dicho zinc de dicha protema PZ ha sido expulsado de dicha al menos una protema PZ por una reaccion de oxidorreducion con azodicarbonamida y por que dicha composicion comprende ademas biurea formada a partir de la azodicarbonamida en el curso de dicha reaccion de oxidorreducion, asf como posiblemente un remanente de azodicarbonamida sin reaccionar

Por virus entero es necesario entender, en el sentido de la presente invencion, que el virus inactivado contiene todavfa la totalidad de su envolvente o membrana viral, su nucleocapsida y su material genetico. Por envolvente o membrana viral intacta, se entiende que las protemas que la constituyen no fueron ni qmmica ni ffsicamente modificadas por la inactivacion, y por tanto, que los restos antigenicos que llevan esten inalterados, presentando la envolvente viral una conformacion y una actividad fusiogenica conservadas.

Una medida del estado de inactivacion del virus se puede efectuar de acuerdo principalmente con la ensenanza, contenida en el texto "HIV: A Practical Approach" de Jonathan Karn, publicado por Oxford University Press, 1995, pp.120-125.

En esta aplicacion lo importante es precisar el poder contaminante del virus despues del tratamiento.

El tttulo inicial del virus se expresa como el numero de dosis infecciosas (numero predeterminado de partmulas infecciosas para cada especie) para un cultivo por mililitro de plasma.

Para esto se utilizan habitualmente diluciones en serie y se comprueba despues en cada dilucion el poder contaminante de los virus sobre cultivos de celulas humanas hasta que la dilucion ya no permite obtener una dosis de virus suficiente para la infeccion.

Los resultados se expresan en DICT50 (dosis infecciosa en cultivo de tejidos para el 50% de los pocillos). Una DICT50 en el caso del virus VIH, es aproximadamente equivalente a una partmula viral por mL de plasma.

Teniendo en cuenta las reducciones de los tttulos obtenidos en los diferentes experimentos fue posible determinar la dosis de reduccion decimal (D10). Una cantidad de 3 pg/mL de ADA disminuye en 100.000 veces el tttulo infeccioso (reduccion: 5 log (mas poder infeccioso detectado) despues de 2 horas de exposicion a 37°C.

Ventajosamente, la inactivacion se realiza con ayuda de ADA micronizada. Por ADA micronizada, se entiende que esta sustancia se presenta en forma de partmulas de un tamano suficientemente pequeno para poder atravesar la envolvente viral sin necesitar una disolucion en un vehmulo y esto de manera que se mantenga la envolvente viral intacta. Sin embargo, la ADA micronizada puede penetrar en el virus estando en suspension y parcialmente en solucion en la fase acuosa del medio de cultivo de este ultimo, lo que permite no tener que introducir en la composicion disolventes farmaceuticamente poco recomendables, cuando no inaceptables. De hecho, del DMSO utilizado hasta ahora en experimentos sobre virus con ADA se sabe que es capaz de interactuar con las protemas de la membrana del virus (Tjernberg et al., J. Biomol. Screen, 2006), tambien se sabe que es un agente

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que desestructura eficazmente las membranas celulares para favorecer la penetracion de un medio dado en su interior. Esta es entre otras una de las razones por la que es ampliamente utilizado como vehmulo para numerosos medicamentos que deben pasar por via transmembranal. Es aceptable una utilizacion de DMSO a una concentracion igual o inferior a 0,5%, preferiblemente inferior a 0,3% en volumen.

Segun una forma de la invencion, la azodicarbonamida micronizada se presenta en forma de partmulas que estan desprovistas de aditivo, es decir, en particular, sin adyuvante tensioactivo ni recubrimiento, y que presentan un tamano inferior a 10 pm, preferiblemente a 8 pm, en particular a 5 pm. Ventajosamente, dichas partmulas presentan un tamano medio d50 inferior a 2 pm y un dgo inferior a 4 pm.

Esta estrecha granulometna permite una reproducibilidad muy acusada de los resultados obtenidos. Se puede por ejemplo preparar una ADA de este tipo segun la ensenanza de la solicitud de patente WO 2007/048820.

Durante la reaccion de oxidorreducion antes mencionada la ADA en presencia de protones procedentes de protemas PZ se descompone en biurea de la siguiente manera:

NH2-CO-N=NCO-NH2 + 2H+ ^ NH2-CO-NH-NH-CO-NH2

Por ejemplo, en el caso del virus VIH y de su protema de la nucleocapsida, NCp7, que comprende un dedo de zinc, la ADA penetra en las partmulas virales a traves de la envolvente del retrovirus e interactua con la protema NCp7 (vease Rice WG et al.; Nat. Med. March 1997).

La protema NCp7 contiene dos copias de un fragmento peptfdico que presenta la siguiente secuencia: Cys-X2- Cys-X4- His-X4-Cys (tambien llamado abreviadamente CCHC) coordinado con un ion metalico de zinc (II). De esto resulta una conformacion tridimensional de la protema NCp7 con dos dedos de zinc. Cada dedo de zinc presenta tres enlaces Zn-S y un enlace Zn-N, contribuyendo los cuatro a la conformacion tridimensional de los dedos de zinc.

Al ser la azodicarbonamida un donador de electrones gracias a su enlace N=N, permite desestabilizar el enlace Zn-S. Esto da como resultado la formacion de un puente disulfuro entre los dos atomos de azufre adyacentes de la estructura tridimensional y la eliminacion de un grupo molecular tiolato correspondiente, fuera del sitio de enlace al ion metalico, asf como una expulsion del zinc.

Despues de haber dado sus electrones del enlace N=N la azodicarbonamida se reduce a biurea por aceptacion de dos protones, que transforman el grupo -N=N- en un grupo -NH-NH-.

En este contexto, las reacciones de ADA con NCp7 conducen a una desestabilizacion de la esfera de coordinacion del zinc en la NCp7 que va seguida por la inhibicion del VIH (I. A. Topol et al., J. Phys. Chem. B 2001, 105, 11341-11350).

La protema NCp7 es cntica para la replicacion viral y, por lo tanto, la modificacion de su conformacion tridimensional ya no permite a la protema NCp7 reconocer la enzima transcriptasa inversa (RT) y ya no es posible la replicacion del virus.

Puesto que la azodicarbonamida no tiene mas que un efecto sobre la protema NCp7 que se encuentra en la nucleocapsida de las partmulas virales del virus VIH, se conserva la conformacion inicial del virus (exterior y general), asf como la actividad fusiogenica de la protema de la envolvente GP120 al mismo tiempo que el zinc es expulsado de la protema PZ desprotonizada.

Un fenomeno similar se ha observado en otras protemas, tales como las protemas E6, NS5A, IE63 durante la accion de la ADA, entre otros sobre los virus VPH, VCH y VSH.

La biurea es el unico catabolito de la ADA in vivo (Concise International Chemical Assesment Document 16; Organizacion Mundial de la Salud: Ginebra, 1999). Ademas, en las condiciones experimentales correspondientes al cuerpo humano (pH neutro, temperatura de 37°C, medio serico humano) parecfa que la reaccion antes indicada era irreversible. Por otra parte, esta actualmente verificada la transformacion rapida de la ADA en biurea en presencia de celulas o de sangre y de ello se puede deducir que el remanente de ADA sin reaccionar durante la oxidorreducion se va descomponer en biurea en muy poco tiempo y de manera irreversible en el cuerpo del sujeto al cual se ha administrado la composicion. Tan pronto como ha tenido lugar esta rapida descomposicion del remanente de ADA en biurea, ya no subsiste de la composicion administrada ningun agente susceptible de interactuar con las protemas PZ utiles que estan presentes en el cuerpo del sujeto tratado. Finalmente, parecfa despues de multiples ensayos con animales y con voluntarios sanos, que la absorcion de la ADA y de biurea no podfa poner de manifiesto los problemas de toxicidad o de tolerancia mas que a concentraciones anormal e inutilmente elevadas. Actualmente se dispone de datos toxicologicos de la azodicarbonamida, concernientes en particular a su unico catabolito, la biurea, que son suficientes para la administracion a voluntarios sanos o enfermos.

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La composicion segun la invencion comprende por lo tanto, ademas de virus completos inactivados en los que el zinc ha sido expulsado de dicha al menos una protema PZ y la envolvente viral esta intacta, biurea asf como posiblemente, un remanente de azodicarbonamida en exceso y que por lo tanto no ha reaccionado. La biurea se encuentra dentro de la envolvente viral, puesto que en la composicion segun la invencion, la ADA penetra facilmente dentro de ella para ser allf reducida. Sin embargo, la ADA en exceso, puede encontrarse incluso en el exterior y/o interior de las envolventes virales.

Segun una forma de realizacion ventajosa de la invencion, la composicion contiene ademas un donador de protones farmaceuticamente compatible, en un estado desprotonizado que es tambien farmaceuticamente compatible y que resulta de una reaccion de oxidorreduccion adicional con dicho remanente de azodicarbonamida sin reaccionar, asf como posiblemente un resto del donador de protones sin reaccionar.

Con el fin de evitar la presencia incluso temporal de la ADA en el cuerpo del sujeto tratado, y de impedir por tanto cualquier riesgo de ataque de protema PZ util para una remanente de ADA en la composicion segun la invencion, se introduce en la misma, antes de la administracion, dicho donador de protones en una cantidad suficiente para descomponer el remanente de ADA en biurea. La composicion de vacuna de la invencion esta entonces desprovista de ADA. Ventajosamente, el donador de protones es un reductor fisiologico, preferiblemente una protema que exhibe al menos un grupo sulfhidrilo libre, elegida por ejemplo, del grupo que consiste en cistema, glutation, fosfato de nicotinamida y sus derivados y mezclas, y en el que el donador de protones desprotonizado es respectivamente cistina, glutation oxidado o NADP+ (forma oxidada del fosfato de nicotinamida) o uno de sus derivados.

Preferiblemente, el donador de protones es cistema o uno de sus derivados, por ejemplo, N-acetil-L-cistema, y el donador de protones desprotonizado es cistina o uno de sus derivados. La cistema y la cistina son aminoacidos bastante corrientes en protemas del cuerpo humano o animal y por lo tanto no presentan ningun peligro en terminos de toxicidad y tolerancia.

Segun incluso otra forma de realizacion de la invencion, la composicion contiene ademas al menos un adyuvante farmaceuticamente aceptable, tal como el adyuvante completo o incompleto de Freund, alumbre o incluso otros compuestos tales como los descritos en el trabajo de Vermount et al., Ann. Med. Vet 2003, 147, pp. 393-401.

De esta manera, la composicion de vacuna segun la invencion es susceptible de desencadenar una respuesta inmunitaria mejorada por la presencia de adyuvantes, cuando se administra a un paciente.

En una forma de realizacion ventajosa, la composicion de vacuna de la invencion comprende ademas celulas inmuno- competentes aisladas que tienen posiblemente al menos parcialmente internalizados dichos virus inactivados.

Por celulas inmunocompetentes se puede entender segun la invencion, por ejemplo celulas dendnticas, maduras o inmaduras, celulas de Langerhans, fagocitos (monocitos y macrofagos) o incluso celulas endoteliales o epiteliales que expresan moleculas del complejo principal de histocompatibilidad (CMH) de clase 2. Estas celulas pueden estar en varios estados de diferenciacion conocidos per se que no se detallaran en la presente memoria.

En el sentido de la invencion, cuando la composicion de vacuna segun la invencion comprende ademas celulas inmunocompetentes aisladas, es posible que los virus inactivados se encuentren en dichas celulas inmunocompetentes aisladas, si ya ha tenido lugar la internalizacion del virus, o no se encuentran todavfa en estas celulas si esta internalizacion todavfa no se ha producido

La presente invencion se refiere ademas a un procedimiento de preparacion de una composicion segun la invencion, que comprende:

- Una puesta en contacto de al menos una cepa de virus que presenta al menos una protema PZ con uno o varios restos de dedo de zinc con azodicarbonamida micronizada,

- Una penetracion de la azodicarbonamida micronizada a traves de la envolvente viral de dicho virus dejandola intacta y

- Una inactivacion de los virus por una reaccion de oxidorreduccion entre la azodicarbonamida micronizada y dicha al menos una protema PZ, que da como resultado la expulsion del zinc de dicha protema PZ y a una descomposicion al menos parcial de la azodicarbonamida en biurea.

Segun una realizacion preferida de realizacion de la invencion, este procedimiento comprende ademas,

- Una puesta en contacto de los virus inactivados con un donador de protones farmaceuticamente aceptable, que tambien es farmaceuticamente aceptable en el estado desprotonizado, y

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- Una reaccion de oxidorreduccion adicional entre el donador de protones y un posible remanente de de azodicarbonamida sin reaccionar, lo que desprotoniza dicho donador de protones y descompone dicho remanente de biurea.

Segun que un modo ventajoso de realizacion del procedimiento, este comprende ademas una eliminacion del zinc expulsado, por cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la tecnica, por ejemplo por centrifugacion. Se puede prever a continuacion un aislamiento de los virus inactivados, por cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la tecnica, por ejemplo por ultracentrifugacion, de modo que se elimine al maximo de la composicion cualquier componente distinto de los virus inactivados.

En una forma ventajosa del procedimiento segun la invencion, el procedimiento comprende ademas una impulsion de celulas inmunocompetentes aisladas por dicha composicion que contiene virus inactivados por azodicarbonamida, un cultivo ex vivo de las celulas impulsadas y una expresion en su superficie de los antigenos espedficos de dichos virus inactivados.

La invencion se refiere tambien a la utilizacion de una composicion de vacuna segun la invencion como vacuna profilactica o terapeutica contra al menos una infeccion por al menos no de dichos virus que presentan al menos una protema con uno o varios dedos de zinc. La vacuna producida se administra ventajosamente por inyeccion o por via transmucosal, oral, genital o rectal.

La composicion segun la invencion o producida por un procedimiento de acuerdo con la invencion se puede utilizar tal cual como vacuna. El virus inactivado puede ser autologo o no. La vacuna puede estar formada tambien por un coctel de diferentes virus inactivados.

Una vacuna terapeutica a base de virus inactivado, preferiblemente autologo, y que presenta segun la invencion una conformacion intacta permite amplificar, por el virus inactivado, la respuesta inmunitaria deficiente de un paciente frente a la infeccion y por lo tanto luchar eficazmente contra dicha infeccion, puesto que los componentes del sistema inmunitario que podran luchar eficazmente contra el virus inactivado podran luchar igualmente contra el virus activo.

La vacuna profilactica es en sf misma mas bien preventiva y su objetivo principal es inducir la produccion por el organismo de anticuerpos y celulas citotoxicas dirigidas hacia los elementos que tengan el resto antigenico. Por tanto, es esencial que los restos antigenicos del virus inactivado de la vacuna segun la invencion se conserven despues de tratamiento de inactivacion para asegurar que las defensas inmunitarias orientadas hacia sus restos antigenicos espedficos puedan reconocer tambien los restos antigenicos de los virus infecciosos y neutralizar asf la infeccion por este mismo virus por la cascada del complemento del sistema inmunitario y/o por la destruccion de las celulas infectadas que presentan en su superficie dichos restos antigenicos gracias a los linfocitos citotoxicos (LCT).

Ventajosamente, la vacuna producida es una vacuna administrable por inyeccion lo que permite intensificar las defensas de la persona ya portadora del virus o por via transmucosal, oral, genital o rectal.

La induccion de una fuerte respuesta inmunitaria en la via de entrada al encuentro con el agente infeccioso parece ser la via mas adecuada para prevenir una infeccion por los agentes virales, el virus del papiloma humano, de la hepatitis, VIH, herpes etc. Por lo tanto, la estrategia que permite inducir una respuesta inmunitaria protectora al nivel de la mucosa es un aspecto cntico del desarrollo de nuevas vacunas.

Ovulos vaginales preparados segun las reglas farmaceuticas (pH, tiempo de disolucion, color, perfume), asf como supositorios espedficos para la proteccion de la mucosa tienen mas probabilidades de ser protectores. En combinacion con una administracion por inyeccion subcutanea la via mucosal es la mas proxima al fenomeno fisiologico infeccioso..

La utilizacion segun la invencion puede por lo tanto comprender un impulso de celulas inmunocompetentes aisladas, tomadas previamente de un sujeto portador del virus o de un sujeto sano, por dicha composicion que contiene virus inactivados por azodicarbonamida, un cultivo ex vivo de las celulas impulsadas, en presencia principalmente de citoquinas de activacion, y una expresion en su superficie de los antfgenos espedficos de dicho virus inactivados.

Las celulas inmunocompetentes asf cultivadas ex vivo en presencia de virus inactivado segun la invencion internalizan el virus inactivado y se denominan entonces cargadas o estimuladas y listas para ser reinyectadas por via de administracion subcutanea, intradermica o intralinfatica. Estas celulas inmunocompetentes se activan preferiblemente por la accion de citoquinas y expresan en su superficie antfgenos (peptidos) espedficos del virus inactivado internalizado que les ha permitido estimularlas.

Las celulas inmunocompetentes actuan sobre los linfocitos T citotoxicos (Tc) y T auxiliares (Th) activandolos y teniendo una papel sobre su proliferacion gracias a una cascada de reacciones de la respuesta inmunitaria

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desencadenada por una multitud de moleculas expresadas por celulas inmunocompetentes. Estas celulas son entonces excelentes celulas activadoras espedficas de los linfocitos T citotoxicos del virus inactivado segun la invencion, por ejemplo para un paciente sano, pero tambien para un paciente infectado.

En el caso de sujetos infectados, existe un efecto de amplificacion de la reaccion inmunitaria frente al virus inactivado segun la invencion, que permite igualmente luchar contra la infeccion presente. De hecho, en el portador del virus o paciente infectado, las celulas dendnticas estan generalmente en numero reducido y la mayor parte del tiempo, estas celulas inmunocompetentes ya son portadoras de virus infecciosos. La utilizacion de celulas dendnticas previamente tratadas con la composicion de vacuna segun la invencion permite introducir celulas inmunocompetentes que no estan infectadas y que permiten amplificar por el virus inactivado la respuesta inmunitaria frente a dicho virus activo.

Es por esto, por lo que en el caso del virus VIH, las celulas dendnticas se obtienen de monocitos que no presentan receptores CD4 (via de entrada para el virus). Por tanto, estas celulas son sanas y por una cascada de estimulacion, los monocitos se diferencian a continuacion en celulas dendnticas sanas que luego se cargaran con virus inactivado.

La invencion se refiere igualmente a un metodo de tratamiento de un individuo infectado con un virus que presenta al menos una protema PZ con uno o varios restos de dedo zinc, comprendiendo dicho metodo una administracion, en forma de una vacuna terapeutica, de una composicion segun la invencion o de celulas inmunocompetentes tratadas con una composicion segun la invencion.

Se puede prever tambien de acuerdo la invencion un metodo de tratamiento de un individuo sano que comprende una administracion, en forma de una vacuna profilactica, de una composicion segun la invencion o de celulas inmunocompetentes aisladas tratadas con una composicion de vacuna segun la invencion.

Otras particularidades relativas a la composicion, el procedimiento y la utilizacion de la invencion se indican en las reivindicaciones.

La invencion se describira con mas detalle con ayuda de los ejemplos que figuran a continuacion y con referencia a la unica figura anexa de dibujos, que ilustra la evolucion de la concentracion media en plasma de biurea en el curso del tiempo.

Ejemplos

En los ejemplos, la azodicarbonamida utilizada fue producida segun el protocolo descrito en la solicitud de patente WO 2007/048820 a nombre de la firma solicitante.

Ejemplo 1.- Analisis de la toxicidad de la ADA y de la biurea (BIU) obtenida durante la degradacion de la ADA.

Antes de poder determinar la toxicidad de los compuestos, se trata de validar un metodo de valoracion de la biurea.

1.1 Metodo de valoracion

El metodo siguiente de determinacion de las proporciones de biurea en muestras de plasma heparinizado, asf como en muestras de orinas para concentraciones que vanan de 0,2 a 20 pg/mL se considero de acuerdo con las recomendaciones de la OCDE (Organizacion para la Cooperacion y el Desarrollo Economicos), con las buenas practicas de laboratorios (GLP) y con el libro "Guidance for Industry: Bionalytical Method Validation".

Los productos de separacion (analitos) de las muestras de plasma u orina se detectan por espectrometna de masas (MS-MS). El lfmite inferior de deteccion (LOQ) de la biurea es 0,2 pg/mL, mientras que el lfmite superior de la degradacion (LOD) es 20 pg/mL. Las curvas de calibrado son lineales de 0,2 a 20 pg/mL con un coeficiente de determinacion (r2) de 0,99.

No aparecio ninguna variacion de concentraciones de biurea en las muestras de plasma o de orina despues de 55 horas de conservacion a temperatura ambiente.

Las concentraciones iniciales de biurea se encuentran en muestras de plasma o de orina conservadas a -20° C durante 3 meses, y pueden experimentar al menos tres ciclos de congelacion/descongelacion.

1.2 .-Transformacion de ADA en BIU

La rapida transformacion de la ADA en BIU en presencia de celulas o sangre es conocida desde mucho tiempo y se confirmo en ensayos con diferentes componentes sangumeos expuestos a ADA radiomarcada. Solo se encontro BIU como derivado de esta ADA radiomarcada.

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Ademas, dosis crecientes de azodicarbonamida en suspension en un hidrogel de carboximetilcelulosa (CMC) al 0,5% se administraron por v^a oral a grupos de 3 ratones (peso medio: 20 g). Un grupo de control recibio el vehmulo CMC y las muestras de sangre se tomaron 30, 60 y 120 minutos despues de la administracion.

Tabla 1

Grupo

[ADA] administrada [ADA] despues de 30 minutos [ADA] despues de 60 minutos [ADA] despues de 120 minutos [BIU]despues de 60 minutos

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1,25 mg, es decir 62,5 mg/kg nada nada nada 3 jg/mL

2

2,50 mg, es decir 125 mg/kg nada nada nada 5 jg/mL

3

5,00 mg, es decir 250 mg/kg nada nada nada 8 jg/mL

4

10 mg, es decir 500 mg/kg nada nada nada 10 jg/mL

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0 mg nada nada nada nada

A continuacion, se realizo el mismo ensayo en ratas para determinar si la conversion de ADA en biurea era diferente en funcion del sexo del animal y no se observo ninguna diferencia debida al sexo.

1.3 Precauciones previas: ensayos preclmicos

En la fase preclmica se llevaron a cabo muchos ensayos de azodicarbonamida con referencia en cada caso a un grupo de control que recibio solo el vehmulo y se pudieron extraer las conclusiones siguientes:

1. No se observaron diferencias significativas entre los animales tratados y de control en materia de peso corporal, siendo identicas la cantidad de alimentos absorbidos por los animales.

2. Se vigilo la toxicidad ocular para descartar un posible deposito de cristales de BIU y no se observaron diferencias entre los grupos tratados y de control.

3. Puesto que las protemas con un resto de dedo de zinc pueden desempenar un papel en la aparicion de la diabetes, en particular la protema "ZAC", se estudiaron los efectos sobre los indices de glucosa en sangre y de insulina durante este penodo. El ensayo de tolerancia a la glucosa no difena entre el grupo ADA y el grupo de control tanto en lo que se refiere a las valoraciones de glucosa como de insulina.

4. Puesto que el aparato reproductor de los mairnferos es extremadamente sensible a todas las protemas PZ, un estudio preclmico analizo igualmente el mdice de fertilidad (numero de informes necesarios para lograr la fecundacion), el mdice de gestacion (numero de individuos por camada), el mdice de supervivencia (numero de individuos recien nacidos que sobreviven cuatro dfas o mas), el mdice de lactancia (numero de individuos nacidos que sobreviven cuatro dfas o mas en la camada conservada) y esto para tres generaciones. No se observaron efectos en materia de reproduccion.

5. Igualmente se evaluo el efecto de la ADA que implicaba una concentracion de BIU en sangre superior a 20 |jg/mL sobre la presion arterial, la frecuencia cardfaca y el electrocardiograma. Las concentraciones en sangre de BIU superiores a 20 jg/mL no indudan ninguna diferencia significativa sobre los parametros estudiados.

6. Tambien se evaluo el efecto de la ADA que implicaba una concentracion en sangre de BIU superior a 20 jg/mL sobre la presion arterial y el sistema respiratorio (frecuencia, maximo volumen de inspiracion, maximo volumen de espiracion, tiempo de inspiracion y expiracion, variacion de volumen despues de la administracion de dosis crecientes de ADA). Estas dosis no inducen ninguna diferencia significativa en los parametros estudiados.

7. Se evaluo en el sistema nervioso central el efecto de la ADA que implicaba una concentracion de BIU en sangre superior a 20 jg/mL (lfmite de deteccion del metodo) por la batena de observaciones estandarizadas "Irwin", asf como la temperatura corporal. Estas concentraciones de BIU en sangre no indudan diferencias significativas en los parametros estudiados.

8. Se midieron las interacciones potenciales de la BIU con el citocromo P450 3A humano y la BIU no inhibio ninguna de las enzimas citocromo P450 3A(CYP3A) hasta una dosis de 100 jM.

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9. Se analizo igualmente la biurea en el contexto de un ensayo de mutacion inversa de cepas de Salmonella typhimurium H-histidina y Escherichia coli WP2 (uvrA) (pkM 101). Los resultados fueron negativos.

1.4 Estudio del efecto de dosis unicas y crecientes en voluntarios humanos sanos

El metodo de valoracion de biurea (BIU) en sangre ha sido validado para concentraciones superiores a 20 pg/mL por dilucion en serie.

La farmacocinetica de la biurea (BIU), como marcador despues de la ingestion de dosis crecientes de azodicarbonamida (ADA), se estudio en 18 voluntarios sanos (sexo masculino: edades de 18 a 45 anos) divididos en varios grupos de los cuales dos grupos ingirieron placebo.

Durante el primer penodo, los voluntarios se dividieron en grupos de 6 personas (4 con ingrediente activo, 2 con placebo por grupo) que recibieron: Grupo A, una dosis de 150 mg (2,15 mg/kg); Grupo B, una dosis de 600 mg (8,5 mg/kg); Grupo C una dosis de 3000 mg (42,5 mg/kg).

Durante el segundo periodo (7 dfas sin tratamiento ("wash-out") dichos voluntarios fueron divididos en grupos de 6 personas (4 con ingrediente activo, 2 con placebo por grupo) que recibieron: Grupo A1, una dosis de 300 mg (4,3 mg/kg); grupo B1 una dosis de 1200 mg (17 mg/kg); grupo C1 una dosis de 6000 mg (85 mg/kg).

Como se puede ver en la figura, se alcanzaron las concentraciones plasmaticas maximas individuales de BIU a las 4 horas despues de la toma de la dosis, con valores de «tmax» medio entre 2,1 y 3,2 horas para niveles de dosis diferentes; el tiempo de separacion y la diferencia entre el tiempo de la ingestion y el tiempo de concentracion maxima disminuyen con la importancia de la cantidad de ADA absorbida.

Los valores medios de la concentracion maxima de BIU en sangre se ilustran en la Tabla 2

Tabla 2

Grupo

Concentracion maxima de BIU en sangre

A (150 mg de ADA)

0,648 pg/mL

A1 (300 mg de ADA)

1,556 pg/mL

B (600 mg de ADA)

2,144 pg/mL

B1 (1200 mg de ADA)

4,89 pg/mL

C (3000 mg de ADA)

5,182 pg/mL

C1 (6000 mg de ADA)

8,995 pg/mL

La biurea en la concentracion serica dentro de los lfmites de 0,648 pg/mL a 8,995 pg/mL fue muy bien tolerada y ha demostrado ser segura despues de la evaluacion de los datos clmicos y de laboratorio, incluyendo los valores de metahemoglobina, los signos vitales, comprendiendo electrocardiogramas (espacio QT) y todos los datos analtticos relativos a la funcion renal.

La incidencia de efectos secundarios es la misma que en el grupo placebo.

Ejemplo 2.- Irreversibilidad de la reaccion de reduccion de la azodicarbonamida a biurea

Se evaluo por voltametna dclica el comportamiento redox de l ADA y la BIU a niveles de electrodos solidos.

La BIU se oxida en medio acido a potenciales positivos bastante elevados (superiores 1 voltio respecto a Ag/AgCl KCl 3M) con produccion de ADA, mientras que la ADA es reducible a pH neutro a potenciales proximos a 0,2 V a Ag/AgCl KCl 3 M.

La biurea se puso en contacto con sistemas oxidantes experimentales de peroxidasa de rabano silvestre (HRP)/H2O2, mieloperoxidasa/CI7H2O2, y citocromo P450/NADH para estudiar la re-oxidacion posible de la biurea en azodicarbonamida. Las mediciones se llevaron a cabo con las enzimas libres en solucion, pero igualmente con las enzimas inmovilizadas en un electrodo solido.

En las siguientes condiciones experimentales: pH neutro, 37°C y medio serico humano, la transformacion de ADA en BIU es irreversible, incluso en presencia de las enzimas antioxidantes mas potentes.

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Ejemplo 3.- Degradacion de ADA en BIU por adicion de un donador de protones.

Se exploto la electro-actividad de ADA (0,2 V) en electrodos solidos con el fin de seguir, en tiempo real, por un crono-ampenmetro, su rapida desaparicion en contacto con un fluido biologico.

No siendo perturbada la medicion electroqmmica por la turbidez del medio (plasma, cultivo celular), fue posible trabajar directamente con muestras biologicas sin su tratamiento (mas que una simple dilucion). Un electrodo de carbono vttreo polarizado a -0,2 V situado en el medio de medicion permitio el seguimiento crono-amperometrico de la ADA.

Las sustancias que consumen ADA provocan una cafda de la corriente de reduccion. Esta cafda de corriente es proporcional al compuesto anadido. Se estudio el efecto de una serie de agentes reductores fisiologicos: un derivado de cistema, N-acetil-cistema, fosfato de nicotinamida y glutation.

3.1 Efecto de las sustancias reductoras sobre la concentracion de ADA

Como se acaba de mencionar anteriormente, las sustancias que consumen ADA provocan una cafda de corriente de reduccion proporcional al compuesto anadido. En la Tabla 3, se recogen los efectos de la cistema, mas particularmente un derivado de la cistema, N-acetil-cistema y glutation.

Se utilizo un tampon de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4 para realizar las mediciones amperimetricas y una concentracion de ADA de 2.10"5 molar. A continuacion se anadieron concentraciones crecientes de cistema y glutation para obtener respectivamente una concentracion final de 1.10-5 molar, 2.10"5 y 3.10"5 molar de cistema y glutation.

Tabla 3

Composicion

Corriente de reduccion (despues de 1 minuto) Composicion Corriente de reduccion (despues de 1 minuto)

PBS sola (control negativo)

0,15 mA PBS sola (control negativo) 0,05 mA

PBS + ADA (control positivo)

0,6 mA PBS + ADA (control positivo) 0,42 mA

PBS + ADA + 1.10"5 molar de Cys

0,4 mA PbS + Ada + 1.10"5 molar de GSH 0,27 mA

PBS + ADA + 2.10"5 molar de Cys

0,25 mA PBS + ADA + 2.10"5 molar de GSH 0,17 mA

PBS + ADA + 3.10"5 molar de Cys

0,17 mA PBS + ADA + 3.10"5 molar de GSH 0,10 mA

Sorprendentemente, es la adicion de cistema la que da como resultado la reduccion mas rapida y mas fuerte de AdA a BIU (H-PharULB-Institut de Pharmacie Prof. Kauffman 2007).

3.2 Efecto de la cistema sobre ADA en condiciones fisiologicas "in vitro"

Se utilizo un tampon de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4 para realizar las mediciones amperimetricas y la concentracion de ADA 10"3 molar. Con el fin de reproducir en las mejores condiciones el medio sangumeo en el cual se degrada rapidamente ADA de manera natural, se anadieron 50 pL de globulos rojos (aproximadamente 5000 celulas). Se anadieron luego 10" 4 moles de cistema. La mediciones de las corrientes de reduccion se muestran en la Tabla 4 a continuacion.

Tabla 4

N°

Composicion Corriente de reduccion

1

PBS sola (control negativo) 0,05 mA

2

PBS + ADA + Globulos rojos (control positivo t = 0) 0,6 mA

3

PBS + ADA + Globulos rojos (t = 5 minutos) 0,32 mA

4

PBS + ADA + Globulos rojos (t = 5 minutos + cistema) 0,05 mA

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Como se puede ver, entre las muestras N° 2 y 3, la corriente de reduccion disminuyo de 0,6 a 0,32 mA que ilustra la degradacion natural de ADA en el torrente sangumeo. La concentracion de cistema anadida en la muestra 4 permitio recuperar el valor de la corriente de reduccion de 0,05 mA (valor del tampon fosfato (PBS) solo), mostrando claramente que todo la ADA se habfa degradado.

3.3 Efecto de la concentracion de la cistema en la degradacion de ADA en la sangre

Se utilizo un tampon de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4 para realizar las mediciones amperimetricas y una concentracion de ADA 2.10-5 molar. Se anadieron a continuacion concentraciones crecientes de cistema para obtener respectivamente una concentracion final de 1.10-5 molar, 2. 10-5 molar, y 3.105 molar de cistema. La mediciones de la corriente de reduccion se muestran en la Tabla 5 a continuacion.

Tabla 5

N°

Composicion Corriente de reduccion despues de 1 minuto

1

PBS sola (control negativo) 0,15 mA

2

PBS + ADA (control positivo) 0,6 mA

3

PBS + ADA + 1.10-5 molar de Cys 0,4 mA

4

PBS + ADA + 2.10-5 molar de Cys 0,25 mA

5

PBS + ADA + 3.10-5 molar de Cys 0,17 mA

Como se puede ver en la Tabla 4, para la relacion de 3 moleculas de cistema por 2 moleculas de ADA, el paso de corriente en la solucion es vuelto a llevar a su punto inicial en el minuto posterior a la adicion de cistema, lo que confirma el modelo teorico que sugiere que se necesitan dos moleculas de cistema para obtener una reduccion completa de una molecula de ADA.

Ejemplo 4.- Produccion del virus VIH inactivado por ADA micronizada

4.1 Produccion de virus VIH en cultivo a pequena escala:

El virus se obtiene por cultivo de partmulas virales recogidas durante una extraccion de sangre segun un protocolo estandar, tal como el descrito por Goebel et al., (AIDS 2001 vol.15 - pp. 33-45) bajo el tttulo "Ex vivo HIV-1 cultures".

Se extrajeron virus del paciente que iba a tratar gracias a un co-cultivo de sus propios linfocitos T CD4+ infectados en presencia de monocitos perifericos (celulas PBMC) obtenidos de la muestra de sangre del paciente. A continuacion los linfocitos CD4+ infectados se activaron por fitohemaglutinina (Sigma, St. Louis, Mo. USA).

Cada 7 dfas se tomo una muestra del lfquido sobrenadante para medir la proporcion de p24 y por lo tanto evaluar el crecimiento viral. Cuando la proporcion de p24 era 50 pg/mL, el cultivo celular se centrifugo y el lfquido sobrenadante se conservo en lotes madres de virus a -80°C de manera que se obtuvieran despues de ultracentrifugacion 2.1010 partmulas virales por mL.

4.2 Produccion de virus VIH inactivado

La solucion madre de partmulas virales congelada a -80°C se trato durante 2 horas a 37°C, con una concentracion 0,5 mM de azodicarbonamida (ADA) micronizada (HPH116 de la comparMa H-Phar Belgica) que, como se describio anteriormente, destruyo la protema con dedo de zinc n° 7 de la nucleocapsida viral. La composicion viral se trato de manera que la cantidad de virus desactivado por ADA implicaba la presencia de 200 ng/mL de p24 procedente del virus VIH ya sea espedfico para el paciente cuando se usa el virus VIH obtenido en el apartado 4.1 o ya sea el virus VIH cultivado cuando se utiliza el virus cultivado como en el apartado 4.2. La cantidad de p24 se determino utilizando el «rHIV-1 p24 Coulter Assay (Beckman Coulter, FL)», e indico la presencia de 200 ng/mL de p24.

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La solucion as^ obtenida se centrifugo a continuacion a baja velocidad y el sedimento se desecho para eliminar el zinc expulsado y precipitado. El lfquido sobrenadante que contema el virus inactivado se conservo para las etapas posteriores.

4.3 Degradacion de la ADA por cistema.

La composicion viral as^ obtenida que contema una concentracion de p24 de 200 ng/mL se trato luego con una concentracion 0,5 mM de cistema (N-acetil-L-cistema de pureza > 99% (TLC), Sigma Aldrich USA). De esta manera, el posible remanente de ADA fue reducido a biurea por la cistema, que es un donador de protones.

4.4 Medicion de la inactividad de virus tratados con ADA micronizada

La inactividad de los virus se controlada por el metodo de la DICT50 mencionado anteriormente.

Para la solucion que contema los virus inactivados y tratados con cistema, se obtuvo una reduccion del poder infeccioso de 5 logaritmos que ilustra una perdida total del potencial infeccioso de la composicion de virus inactivado segun la invencion.

Ejemplo 5.- Produccion del virus de la hepatitis C inactivado por ADA micronizada

5.1 Produccion de virus de la hepatitis C

Se utilizaron celulas hepaticas sanas procedentes de bancos de organos que proporcionaron tejido hepatico sano para un posible trasplante, pero no se pudieron utilizar por razones tecnologicas, aunque no medicas.

Los lobulos hepaticos encapsulados asf obtenidos se trataron por el metodo de Segnen modificado que permite prever un rendimiento suficiente para disponer de reservas adecuadas de hepatocitos.

Los fragmentos hepaticos (lobulos de 150 g a 500 g) se dotaron de cateteres que permitieran la perfusion de tres a cinco vasos hepaticos.

El fragmento se perfundio luego durante 20 a 30 minutos a 37°C por una solucion salina exenta de calcio, denominada solucion de Hanks (solucion salina equilibrada de Hank (HBSS) NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCh 0,5 mM, MgSO4 0,4 mM, Na2HPO4 0,33 mM, K2HPO4 0,44 mM, D-glucosa 5,5 mM) a la que se habfa anadido acido etilenglicol-tetraacetico (EGTA) 0,5 mM

Siempre a 37°C, la perfusion se reemplazo por el medio segun Leibovitz L-15 (33) que contema 0,05% de colagenasa, durante 30 minutos, provocando asf la digestion de las uniones intercelulares.

Despues de 30 minutos, los cateteres se cortaron y la biopsia se transfirio, siempre esterilmente, a un recipiente en donde se hizo una incision en su capsula. Se agito con precaucion en el medio L15 refrigerado (4°C) sobre hielo a fin de favorecer la dispersion de los hepatocitos.

La suspension celular resultante se filtro luego a traves de tamices de acero inoxidable esteriles para deshacerse de los fragmentos hepaticos demasiado grandes, para obtener un tamano de fragmentos de 100 |jM. La suspension celular obtenida se filtro luego siempre esterilmente por una compresa de nylon para obtener celulas de un tamano de 60 jM. El residuo filtrado en suspension se dividio en fracciones almuotas en tubos de 250 mL y se centrifugo tres veces a 40 g durante 3 minutos a 4°C.

Despues de la ultima centrifugacion, las celulas procedentes de las fracciones almuotas se volvieron a poner en suspension en un medio HypoThermosol-FRS® [Solutions BioLife, Inc.] en un solo tubo y se coloco sobre hielo.

Las celulas en suspension asf obtenidas se centrifugaron de nuevo a 700 revoluciones/minuto (rpm) durante 5 minutos a 4°C, se retiro el lfquido sobrenadante y las celulas se lavaron tres veces con solucion de lavado denominada de Hanks "Hanks Wash" [(0,4 g/L de KCl 53,6 mM; 0,06 g/L de KH2PO4 4,4 mM; 8 g/L de NaCl 1,37 M; 0,048 g/L de Na2HPO4 3,4 mM; 20 mL de CaCh (2 molar)].

Las celulas centrifugadas y lavadas se pusieron de nuevo en suspension en un medio esencial mmimo modificado por Dulbecco (DMEM) para el cultivo en pocillos de placas, de celulas hepaticas (500 mL de DMEM de alto contenido en glucosa (4,5 g/L complementado con 20% de suero bovino fetal).

En placas de 24 pocillos, los pocillos se llenaron a razon de 0,625 x 106 hepatocitos/mL diluidos en aproximadamente 10 mL de colageno tipo 1 (Colagen I, rat tail-BD N° de catalogo 354236) - (en forma de un lfquido que contema acido acetico 0,02 N, concentracion 50 mg/mL) de tal manera que los pocillos y sus tapas estuvieran cubiertos.

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Las placas asf preparadas se mantuvieron durante 1 hora a temperatura ambiente (22°C).

En este momento, se retiro la solucion de colageno y los pocillos se lavaron con una solucion salina tamponada con fosfato (PBS) (Na2HPO410 mM, KH2PO42 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4) y se complemento con el medio de cultivo en placas de hepatocitos (abreviadamente HPM por la expresion inglesa Hepatocyte Plating Culture) al que se habfa anadido 20% de suero de ternera fetal. (Adaptado a los hepatocitos de todas las especies).

Cuando los hepatocitos fueron confluentes (aproximadamente 18 horas) el HPM se sustituyo por un medio espedfico para los hepatocitos: 500 mL de medio esencial modificado por Dulbecco (DMEM) con alto contenido en glucosa (4,5 g/L); 30 mg de L-metionina; 104 mg de L-leucina; 33,72 mg de L-ornitina; 200 mL de dexametasona 5 mM; y 3 mg de insulina).

Se tomaron fracciones almuotas en el centro de los pocillos de manera aleatoria despues de 17 horas y se estimo el numero de hepatocitos no adherentes midiendo la actividad de lactato-deshidrogenasa despues de la lisis de las celulas con solucion salina tamponada con fosfato (PBS), como se describe anteriormente, que contema 0,2% de Triton X-100. Se descartaron los pocillos en los que habfa menos del 85% de celulas adherentes. Del mismo modo, se descartaron los pocillos en los que habfa mas de 5% de celulas en apoptosis, midiendose la apoptosis por el metodo de valoracion de la anexina V, el "anexinn V assay que detectaba extremadamente pronto el proceso de involucion celular porque apareda la fosfatidilserina en la superficie celular. Tambien se descartaron los cultivos que presentaban una tasa de alanina-aminotransferasa (ALT) superior a 3 veces la normal.

El medio de cultivo se cambio cada 72 horas.

Los hepatocitos asf obtenidos fuero infectados por virus naturales de la hepatitis C. En este tipo de cultivo de hepatocitos se puede seguir la cascada replicativa de los virus VCH seleccionados desde el momento 0 hasta tres semanas despues de la infeccion.

72 horas despues de la infeccion la carga viral aumento para estabilizarse en el intervalo entre 100.000 y 1.000.000 de partmulas durante 3 semanas. Las partmulas virales se recuperaron del medio de cultivo por ultracentrifugacion y se congelaron a -80°C a una concentracion, por ejemplo de 2.1010 partmulas virales por mL de medio de congelacion (con alto contenido de DMEM).

5.2 Produccion del virus inactivado

La solucion madre de partmulas virales congeladas a -80°C se trato durante 2 horas a 37°C por una concentracion de de azodicarbonamida (ADA) micronizada 0,5 mM (HPH116 disponible en la comparMa H-Phar Belgica) que, como se ha descrito anteriormente, destrrna la protema con dedo de zinc NS5A que es indispensable para el ciclo replicativo del VCH.

La solucion asf obtenida se centrifugo luego a baja velocidad y el sedimento se desecho para eliminar el zinc expulsado y precipitado. El lfquido sobrenadante que contema el virus inactivado se conservo para las etapas posteriores.

5.3 Degradacion de ADA por cistema.

La composicion viral asf obtenida se trato luego con una concentracion de 0,5 mM de cistema (N-acetil-L- cistema de pureza > 99% (TLC), Sigma Aldrich, USA). De esta manera, el posible remanente de ADA fue reducido a biurea por la cistema.

5.4 Medicion de la inactividad de virus de hepatitis C tratados con ADA micronizada

Se utilizo una lmea celular Huh 7 (hepatoma) (ET) que contema el material genetico de la hepatitis C, el ARN asociado a un control estable de luciferasa (Luc) para medir el efecto de la inactivacion de la azodicarbonamida micronizada (HPH-116 disponible en la comparMa H-Phar Belgica).

El control positivo fue un tratamiento con interferon alfa (PBL Biolabs, New Brunswick, NJ, USA). Las celulas ET se cultivaron en un medio esencia modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero de ternera fetal, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de glutamina, 5 mg/mL de G418 en una incubadora a 37°C bajo una atmosfera que contema 5% de CO2 (todos los reactivos eran de Gibco Life Technologies, USA.). Las celulas fueron triptinizadas (1% de tripsina en EDTA) y distribuidas en placas que conteman 96 pocillos de investigaciones (Costar®). La actividad del gen informador de luciferasa (expresada en unidades Internacionales UI) estaba proporcionalmente asociada con la produccion de ARN de virus de la hepatitis C. La concentracion inhibidora para del 50% de la produccion de ARN era en este modelo de 45 pg/mL de ADA despues de 72 horas del tratamiento.

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Ejemplo 6.- Produccion de virus del Ebola inactivado por ADA micronizada

6.1 Produccion de virus del Ebola:

Celulas Vero infectadas por el virus del Ebola se cultivaron en medio esencial modificado por Dubecco (DMEM) complementado con 10% de suero de ternera fetal, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de glutamina, 5 mg/mL de G418 en una incubadora a 37°C en una atmosfera que contema 5% de CO2 (todos los reactivos procedfan de Gibco Life Technologies USA) durante 72 horas.

El virus se recogio del Uquido sobrenadante del cultivo por ultracentrifugacion y se congelo a -80°C a una concentracion, por ejemplo de 2.1010 partmulas virales por mL de medio de congelacion.

6.2 Produccion de virus inactivado

La solucion madre de partmulas virales congeladas a -80°C, se trato durante 2 horas a 37° C, con una concentracion 0,5 mM de azodicarbonamida (ADA) micronizada (HPH116, H-Phar Gosselies, Belgica) que destruyo la protema con dedo de zinc denominada VP30. Se ha demostrado que VP30 es indispensable para la replicacion del virus del Ebola e intolerante a cualquier mutacion de este.

La solucion asf obtenida se centrifugo a continuacion a baja velocidad y el sedimento se desecho para eliminar el zinc expulsado y precipitado. El lfquido sobrenadante que contema el virus inactivado se conservo para las etapas posteriores.

6.3 Degradacion de ADA por cistema.

La composicion viral asf obtenida se trato a continuacion con una concentracion 0,5 mM de cistema (N-acetil-L- cistema, pureza_a = 99% (TLC), Sigma Aldrich, USA). De esta manera, el posible remanente de ADA fue reducido a biurea por la cistema.

6.4 Medicion de la inactividad de los virus del Ebola tratados por ADA micronizada

Se evaluo la actividad del virus inactivado segun la invencion por infeccion de celulas VERO naturales cultivadas segun un protocolo estandar y por infeccion de celulas Vero que expresaban la protema VP30 (transfeccion de celulas VERO por el gen que codifican la protema VP30) como control positivo.

Como era de esperar las celulas VERO normales infectadas no produjeron nuevas partmulas virales, mientras que las celulas VERO transfectadas por el gen de VP30 produjeron virus del Ebola completos.

Ademas, segun la invencion, se preve igualmente valorar el zinc liberado para medir la inactivacion del virus, puesto que cada inactivacion de las protemas con dedo de zinc expulsan un atomo de zinc al medio de tratamiento del virus con ADA micronizada.

Ejemplo 7.- Produccion de arenavirus inactivado por ADA micronizada

7.1 Produccion del arenavirus:

Celulas Vero infectadas con tres diferentes arenavirus, virus LCMV-WE recibido de Peter B. Jahrling (U.S. Army Medical Research Institute for Infectious, Fort Detrick, Frederick, Md.) JUNV y TCRV, se cultivaron por separado en medio esencial modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con l0% de suero de ternera fetal, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de glutamina, 5 mg/mL de G418 en una incubadora a 37°C bajo una atmosfera que contema 5% de CO2 (todos los reactivos procedfan de Gibco Life Technologies, USA.) durante 72 horas, hasta obtener 107 virus/mL de medio de cultivo.

El virus se recogio del lfquido sobrenadante de cultivo por ultracentrifugacion y se congelo a -80°C a una concentracion de por ejemplo 2.1010 partmulas virales por mL de medio de congelacion.

7.2 Produccion de virus inactivado

La solucion madre de partmulas virales congeladas a -80°C, se trato durante 2 horas a 37°C, con una concentracion 0,5 mM de azodicarbonamida (ADA) micronizada (HPH116, H-Phar Gosselies, Belgica), que destruyo la protema denominada PZ con un resto de dedo de zinc. La replicacion de los arenavirus esta condicionada por una protema con restos de dedos de zinc denominada PZ. Las protemas ribosomales de la celula hospedante interactuan con la protema PZ y los ribosomas, estrechamente asociados al genoma viral intervienen en la traduccion de los ARNm virales.

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La solucion as^ obtenida se centrifugo a continuacion a baja velocidad y el sedimento se retiro para eliminar el zinc expulsado y precipitado. El lfquido sobrenadante que contema el virus inactivado se conservo para las etapas posteriores.

7.3 Degradacion de ADA por cistema.

La composicion viral asf obtenida se trato a continuacion con una concentracion 0,5 mM de cistema (N-acetil-L- cistema de pureza > 99% (TLC), Sigma Aldrich, USA). De esta manera, el posible remanente de ADA fue reducida a biurea por la cistema.

7.4 Medicion de la inactividad de arenavirus tratados con ADA micronizada

Se evaluo la actividad del virus inactivado segun la invencion por una medicion de la absorcion de UV. La protema PZ del virus activo presentaba una estructura cmlica en la cual se encontraba el atomo de zinc. Esta protema absorbfa radiacion UV en su estructura cmlica a una longitud de onda de 950 nm. La expulsion del atomo de zinc conduda a la desestabilizacion de la estructura dclica de la protema PZ viral y daba como resultado que la protema PZ ya no absorbfa radiacion UV a la misma longitud de onda. La medicion de la absorcion de UV a una longitud de onda de 200 nm permitio medir la inactividad de la protema PZ.

En este caso, los virus JUNV y TCRV tratados con ADA permitieron obtener respectivamente los valores de CI50 de 7,6 y 5,3 jM, mientras que el virus LCMV-WE tratado con ADA permitio alcanzar valores de CI50 de 27,9 |jM respectivamente.

Ejemplo 8.-Vacuna para administracion directa

8.1 Preparacion de vacuna para administracion directa por inyeccion Vacuna a base de virus autologo

Se tomaron 0,5 mL de virus tales como los obtenidos en el Ejemplo 4.1 (2.1010 partmulas virales/mL) y estos virus se expusieron a una concentracion de 3 jM de ADA micronizada (HPH116) durante 2 horas a 37°C.

A continuacion se anadieron 0,5 mL de adyuvante incompleto de Freund para obtener un volumen final de 1 mL. Esta dosis de vacuna se preparo segun los protocolos bien establecidos en este campo y por supuesto, si es necesario, tambien se pueden anadir excipientes de conservacion. La dosis de 1 mL sera inyectada luego en 4 dosis de 0,25 mL (cuatro inyecciones repartidas en el cuerpo, los hombros y las caderas).

Vacuna a base de una preparacion viral regional

Se cultivaron cepas del VIH-1 naturales de los subtipos A, B y D sobre linfocitos de voluntarios sanos con el fin de obtener en el medio de cultivo RPMI como ya se ha descrito en detalle anteriormente. A continuacion, los linfocitos infectados fueron activados por fitohemaglutinina.

Cada 7 dfas, se tomo una muestra de lfquido sobrenadante para medir la proporcion de p24 y por lo tanto evaluar el crecimiento viral. Cuando la proporcion de p24 era 50 pg/mL, se centrifugo el cultivo celular y el lfquido sobrenadante se conservo en lotes de virus de reserva a -80°C para obtener despues de ultracentrifugacion 2.1010 partmulas virales por mL.

Se tomaron 0,5 mL de los virus asf obtenidos (2.1010 partmulas virales/mL) y estos virus se expusieron a una concentracion de 3 jM de ADA micronizada (HPHl16) durante 2 horas a 37°C .

A continuacion se anadieron 0,5 mL de adyuvante incompleto de Freund para obtener un volumen final de 1 mL. Esta dosis de vacuna se preparo segun los protocolos bien establecidos en este campo y por supuesto, si es necesario, tambien se pueden anadir excipientes de conservacion. La dosis de 1 mL sera inyectada luego en 4 dosis de 0,25 mL (cuatro inyecciones repartidas en el cuerpo, los hombros y las caderas).

Esta preparacion de vacuna tema, por supuesto, un fin profilactico o terapeutico. Preferiblemente, la inyeccion se repitio despues de 4 semanas.

8.2 Preparacion de vacuna para administracion directa intramucosal o intralinfatica

Se preparo una dosis DICT50 de virus VPH inactivado de una manera analoga a la descrita anteriormente y se puso en suspension en un ovulo para introduccion en la vagina. La composicion de los ovulos se muestra en la Tabla 6

Tabla 6.

5

10

15

20

25

30

35

Ingredientes

Cantidad

Virus inactivado segun el ejemplo 4.2

106 para 1 mL

Sal sodica del acido hialuronico

5 mg

Extracto lipfdico de Centella asiatica

60 mg

Extracto lipfdico de Calendula officinalis

60 mg

Extracto lipfdico de Aloe vera

60 mg

Aceite esencial de melaleuca

2 mg

Excipientes

-

Estos excipientes son gliceridos semisinteticos, BHT (butil-hidroxitolueno), isopropil-parabeno, isobutil-parabeno butil-parabeno y analogos. Estos excipientes presentan efectos galenicos particulares: despues de licuacion del ovulo a la temperatura corporal, los virus inactivados se distribuyen uniformemente en la vagina en cuestion de minutos. AlU se depositan formando una pelfcula de gel que se reabsorbe lentamente en 2-3 dfas. La sal sodica del acido hialuronico presenta por su parte una funcion de sustrato en la migracion celular.

Luego dichos virus son absorbidos por las celulas dendriticas de la paciente y las proporciones de anticuerpos en sangre que aperecen para el VPH confirman la vacunacion.

Ejemplo 9. Preparacion de una vacuna con ayuda de celulas dendriticas aisladas.

9.1. Cultivo de celulas dendriticas

Despues de la extraccion de sangre a un sujeto infectado con VIH y la transferencia a tubos tratados con citrato se aislaron monocitos circulantes por el metodo de centrifugacion en gradiente de densidad segun el metodo de Ficoll-Hypaque (Eurobio, les Ulis, Francia) (celulas mononucleares de sangre periferica (abreviadamente PBMC, por la expresion inglesa Peripheral Blood Mononuclear Cells)).

Estos monocitos se lavaron a continuacion 4 veces sucesivamente con una solucion tampon de Hanks.

A continuacion se realizo una inmunoseleccion negativa utilizando un kit comercial (Dynal, Great Neck, New York, USA) para aislar los monocitos que llevaban el receptor CD14+. El 90% de los monocitos aislados eran 90% de las celulas que llevaban el receptor CD14+ (celulas CD14+ puras en el 90%).

A continuacion, se distribuyeron en matraces (Nunc, Roskilde, Dinamarca) a razon de 10® celulas/mL en un medio libre de suero "serum-free AIM-Vmedium" (Life Technologies, Great Island, New York, USA.).

Estas celulas se cultivaron asf durante 5 dfas en el medio AIM-V complementado con 250 ng del factor de estimulacion de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF) (R & D Systems, Minneapolis, USA) y 100 ng de interleuquina 4 (IL-4) (R & D Systems, Minneapolis, USA) por mililitro.

Despues de este tratamiento y 5 dfas de cultivo, se identificaron las celulas no adherentes, siendo mas del 90% celulas dendriticas (DC) inmaduras, en base a su morfologfa (observacion microscopica) y a los receptores de membrana expresados (CD1a, CD11c, CD40, CD80, CD86, CD4 y HLA-DR como se pone de manifiesto por inmunofluorescencia directa en citometria de flujo).

9.2 Induccion de una respuesta especifica al virus del paciente por las celulas dendriticas del paciente

Las celulas CD inmaduras asf obtenidas (1.10-6 celulas/mL) fueron sometidas a impulsos por el VIH autologo inactivado por ADA obtenido en el Ejemplo 4 (apartado 4.2) (50 ng de p24) segun una relacion de 50 ng de p24/106 celulas) durante 2 horas a temperatura ambiente.

Las celulas CD asf impulsadas por el anrigeno del VIH autologo inactivado (CD-VIH-impulsados) se lavaron luego tres veces consecutivas con la solucion tampon de Hanks.

Las CD-VIH-impulsadas se cultivaron (37°C - 5% de CO2) en medio AIM-V complementado con 100 ng de GM- CSF, 5 ng de IL-4, 50 ng de TNF-a (r & D Systems USA) y 1000 unidades de interferon alfa 2b (IFN-a-2b) (Schering-Plough, Brinny, Irlanda) por mililitro durante tres dfas.

Las celulas dendnticas asf cultivadas en presencia de virus inactivados segun la invencion internalizaron el virus inactivado y por tanto se denominan cargadas o estimuladas y listas para ser reinyectadas por la v^a de administracion subcutanea, intradermica o intralinfatica. Estas celulas dendnticas fueron activadas por la accion de citoquinas y expresaron en su superficie antfgenos (peptidos) espedficos del virus inactivado internalizado a 5 los que se habfa permitido estimularlas.

Se entiende que la presente invencion de ningun modo esta limitada a las formas descritas anteriormente y que se pueden hacer muchas modificaciones sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Por ejemplo, en lugar de utilizar virus autologo, cultivado o no, para preparar una vacuna con virus inactivado, es tambien posible utilizar un cultivo del virus VIH a gran escala. En este caso, el virus se obtiene por una 10 produccion por celulas. Por ejemplo, el virus VIH se puede cultivar a gran escala como se describe en la patente EP0524961. El virus cultivado sera igualmente recuperado por ultracentrifugacion del lfquido sobrenadante de cultivo y congelado a -80°C a una concentracion, por ejemplo de 2.1010 partfculas virales por mL de medio de congelacion.

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   REIVINDICACIONES

   1. Composicion para su utilizacion como vacuna a base de al menos una cepa de virus que presenta al menos una protema PZ con uno o varios restos de dedo de zinc, que comprende estos virus en un estado inactivado, estando estos virus completos y presentando despues de la inactivacion una envolvente viral intacta,

   caracterizada por que dicho zinc de dicha protema PZ ha sido expulsado de dicha al menos una protema PZ por una reaccion de oxidorreduccion con azodicarbonamida y por que dicha composicion comprende ademas biurea formada a partir de azodicarbonamida durante dicha reaccion de oxidorreduccion, asf como posiblemente un remanente de azodicarbonamida sin reaccionar.
2. 2. Composicion para su utilizacion segun la reivindicacion 1, caracterizada por que contiene ademas un donador de protones farmaceuticamente compatible, en particular un agente reductor fisiologico que esta presente en un estado desprotonizado, que es igualmente farmaceuticamente compatible, y que resulta de una reaccion de oxidorreduccion adicional con dicho remanente de azodicarbonamida sin reaccionar, asf como posiblemente un resto de donador de protones sin reaccionar.
3. 3. Composicion para su utilizacion segun la reivindicacion 2, caracterizada por que el donador de protones se elige del grupo que consiste en cistema, glutation, fosfato de nicotinamida (NADPH) y sus derivados y mezclas, y por que el donador de protones desprotonizado es respectivamente cistina, glutation oxidado, NADP+ o uno de sus derivados.
4. 4. Composicion para su utilizacion segun una u otra de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que dicha al menos una cepa del virus se elige del grupo de retrovirus, arenavirus, filovirus, hepavirus, papilomavirus y herpesvirus, que presentan protemas PZ.
5. 5. Composicion para su utilizacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que comprende ademas celulas inmunocompetentes aisladas que posiblemente tienen al menos internalizados dichos virus inactivados.
6. 6. Procedimiento para la preparacion de una composicion de vacuna segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende:

   - una puesta en contacto de al menos una cepa de virus, que presenta al menos una protema PZ con uno o varios restos de dedos de zinc, con azodicarbonamida micronizada,

   - una penetracion de la azodicarbonamida micronizada a traves de la envolvente viral de dichos virus, dejandola intacta,

   - una inactivacion de los virus por una reaccion de oxidorreduccion entre la azodicarbonamida micronizada y dicha al menos una protema PZ, lo que da como resultado una expulsion del zinc de la protema PZ, y una descomposicion al menos parcial de la azodicarbonamida en biurea,

   - una puesta en contacto de los virus inactivados con un donador de protones farmaceuticamente aceptable, en particular un reductor fisiologico, que es tambien farmaceuticamente aceptable en el estado desprotonizado, y

   - una reaccion de oxidorreduccion adicional entre dicho donador de protones y un posible remanente de azodicarbonamida sin reaccionar, lo que desprotoniza dicho donador de protones y descompone dicho remanente en biurea.
7. 7. Procedimiento segun la reivindicacion 6, caracterizado por que el donador de protones se elige del grupo que consiste en cistema, glutation, fosfato de nicotinamida y sus derivados y mezclas, y por que el donador de protones desprotonizado es respectivamente cistina, glutation oxidado o NADP+ o uno de sus derivados.
8. 8. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, caracterizado por que la azodicarbonamida micronizada se presenta en forma de partmulas que estan desprovistas de aditivos y que tienen un tamano inferior a 10 pm, preferiblemente a 8 pm, en particular a 5 pm.
9. 9. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado por que comprende, ademas, un eliminacion del zinc expulsado.
10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, caracterizado por que comprende ademas un aislamiento de los virus inactivados.
11. 11. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado por que comprende ademas una impulsion de celulas inmunocompetentes aisladas por dicha composicion que contiene virus inactivados por azodicarbonamida, asf como un cultivo ex vivo de las celulas impulsadas y una expresion en su superficie de antfgenos espedficos de dichos virus inactivados.
12. 12. Utilizacion de una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la fabricacion de una vacuna profilactica o terapeutica contra al menos una infeccion por al menos uno de dichos virus que presenta al menos una protema PZ con uno o varios restos de dedos de zinc.
13. 13. Utilizacion segun la reivindicacion 12, en la cual la vacuna producida es una vacuna administrate 5 por inyeccion o por via transmucosal, oral, genital o rectal.