MX2007000502A - Ciclosporinas para tratar enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Abstract

Las ciclosporinas de enlace de ciclofilina no inmunosupresoras son utiles como agentes neuroprotectores, por ejemplo en la prevencion o el tratamiento de condiciones patologicas asociadas con la secrecion y/o produccion de A??.

Description

CICLOSPORINAS PARA TRATAR ENFERMEDAD DE ALZHEIMER La presente invención se refiere a usos novedosos de ciclosporinas, y en particular a nuevos usos farmacéuticos de las ciclosporinas de enlace de ciclofilina no inmunosupresoras. La ciclosporina A (CsA) se enlaza con las proteínas de inmunofilina, tales como las ciclofilinas (CyP), mientras que el FK506 y la rapamicina, ambos compuestos de enlace de inmunofilina, se enlazan con las proteínas de enlace de FK506 (FKBP). Aunque se requiere el enlace de inmunofilina, no es suficiente para la actividad inmunosupresora de estos fármacos. Se observan efectos biológicos después de la interacción de los complejos de fármaco/inmunofilina con una tercera proteína efectora. Por ejemplo, los complejos de CyP-CsA y FKBP-FK506 inhiben la actividad de fosfatasa de serina/treonina de la calcineurina, bloqueando de esta manera la producción de citoquinas, tales como la interleucina-2. Por otra parte, el complejo de FKBP-rapamicina inhibe a una quinasa denominada como FRAP (también conocida como RAFT ó mTOR), que está involucrada en la proliferación de células-T mediada por el receptor de interleucina-2. Se ha aislado una nueva clase de compuestos, denominados como sanglifehrinas, a partir de Streptomyces sp. A92-3081 10. Entre las 20 diferentes sanglifehrinas aisladas hasta ahora, la sanglifehrina A (SFA) es el compuesto más abundante, y exhibe una potente actividad inmunosupresora. La SFA representa un tipo novedoso de inmunosupresor, cuyo modo de acción es diferente de aquél de todos los demás compuestos de enlace de inmunofilina conocidos, es decir, CsA, FK506, y rapamicina. Se ha demostrado que SFA se enlaza directamente con la proteína de inmunofilina, la ciclofilina D (CyD), en un sitio distinto de otra inmunofilina, la ciclofilina A (CpA), en el complejo de poro de transición mitocondrial (MTP), e inhibe la abertura de MTP. Las ciclosporinas de enlace de ciclofilina no inmunosupresoras, y su uso en el tratamiento y prevención de SIDA y trastornos relacionados con el SIDA, se describen en la Patente Europea Número 484281 , la cual incluye una descripción general de la clase de compuestos de ciclosporina, su nomenclatura, y su modo de acción. La divulgación de la Patente Europea Número EP 0,484,281 B, en particular la descripción general referida anteriormente y otras partes de la descripción referidas posteriormente en la presente, se incluyen por referencia en la enseñanza de la presente solicitud. De una manera sorprendente, ahora se ha encontrado que las ciclosporinas que se enlazan a la ciclofilina, pero que no son inmunosupresoras, son útiles como agentes neuroprotectores para tratar las condiciones patológicas asociadas con la producción y/o secreción de Aß, incluyendo, pero no limitándose a, Enfermedad de Alzheimer ("AD"). La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la acumulación extracelular de placas amiloide en el cerebro, compuestas primordialmente de los péptidos de aminoácidos 40 ó 42 Aß. La acumulación extracelular de estos péptidos es una patolog ía distintiva de la enfermedad (Seikoe, 1999). El péptido Aß se genera mediante la disociación endoproteolítíca de la proteína precursora amiloide (APP), una proteína transmembrana tipo I que se expresa de una forma ubícuita (Seikoe, 1999; Sisodia, 2000). Las dos enzimas que disocian la proteína precursora amiloide en la senda amilogénica se denominan como secretasas-ß y -?, las cuales disocian la proteína precursora amiloide de los términos N y C, respectivamente. En esta senda, la secretasa-ß (BACE1 ) es la primera enzima que disocia la proteína precursora amiloide, produciendo un fragmento sAPPß secretado, y un fragmento C-terminal asociado con membrana (CTF, C99) (Vassar, Bennett y colaboradores, 1999). El fragmento C99 es el sustrato para el complejo de secretasa-? (GACE), que disocia la C99 para producir Aß y AICD (dominio intracelular de la proteína precursora amiloide). La AICD enlaza un complejo con Tip60 y Fe65, que reprime la KAI 1 (una molécula de superficie celular de traspanina), un gen en la senda de N F?-B (Baek, Ohgi y colaboradores, 2002). El complejo GACE se forma de cuatro componentes primarios, presenilina 1 (PS1 ), nicastrina (NCSTN), Aph 1 , y Pen2 (Edbauer, Wínkler y colaboradores, 2003; Kimberly, LaVoie y colaboradores, 2003). El homólogo funcional de PS1 , la presenilina 2 (PS2) contribuye con aproximadamente el 20 por ciento de Aß producido en la célula (Kimberly, Xia y colaboradores, 2000). Aunque estos cuatro componentes son necesarios y suficientes para reconstituir la actividad de GACE, existe evidencia de una disociación no mediada por GACE de la proteína precursora amiloide, que da como resultado la producción de Aß (Tesco, Koh y colaboradores, 2003), (Nunan, Shearman y colaboradores, 2001 ). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La elucidación de genes novedosos involucrados en la senda de la proteína precursora amiloide es un paso crítico en la determinación de la etiología completa de la enfermedad, así como para desarrollar un mejor entendimiento del complejo mecanismo que impulsa la producción de Aß. La determinación de nuevos genes y sendas que regulen a Aß, ayuda a desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento del progreso de la enfermedad . Varios enlaces genéticos y regiones cromosómicas se han asociado específicamente con la Enfermedad de Alzheimer de establecimiento tardío (LOAD) (>65 años del establecimiento) (Ertekin-Taner, Graff-Radford y colaboradores, 2000), (Bertram, Blacker y colaboradores, 2000), (Scott, Hauser y colaboradores, 2003). Un subconjunto de genes asociados con LOAD, así como los genes novedosos involucrados en el procesamiento de la proteína precursora amiloide, se describen en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Pendiente con Número de Serie , la cual incluye una descripción del rastreo funcional a gran escala para probar los clones de ADNc con el fin de determinar su capacidad para modular la producción de Aß en células CHO K1 . La descripción de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie , en particular la identificación de los genes que modifican la secreción de Aß y otras partes de la descripción referidas posteriormente en la presente, se incluyen por referencia en la enseñanza de la presente solicitud. El descubrimiento de los genes que se encuentran en la senda de inmunofilina que sirven como reguladores críticos de la producción de Aß en las células, proporciona objetivos de fármaco adecuados en la enfermedad de Alzheimer. Algunos de los ADNcs descubiertos en el rastreo funcional que están implicados en la senda de inmunofilina, incluyen la quinasa Map 4, calmodulina, ceramidasa de ácido, y TOB3, una AAA-ATPasa. Las quinasas de proteína activadas por mitógeno (MAPKs), también conocidas como quinasas reguladas por señal extracelular (ERKs), son una familia de quinasas de proteína serína/treonina que fosforilan y regulan de una manera positiva o negativa los sustratos objetivos, iniciando los eventos de la cascada de señalización. Las ERKs transducen las señales desde la membrana celular hasta el núcleo en respuesta a un gran número de estímulos, y tienen un papel importante en la modulación de la expresión genética, la mitosis, la proliferación, la movilidad , el metabolismo, y la apoptosis (Wada y Penninger, 2004) . Se demuestra que los inhibidores de la actividad de MEK y ERK inhiben el catabolismo de la proteína precursora amiloide. En adición, la MAPK puede activar la J NK y desencadenar la apoptosis, un proceso que se sabe que aumenta la producción de Aß (Tesco, Koh y colaboradores, 2003) . Aunque no deseamos obligarnos por la teoría, el ADNc de MAPK4 podría estar actuando a través del catabolismo de la proteína precursora amiloide o la activación de la apoptosis. También, el fragmento del dominio intracelular de APP (AICD) interactúa con la quínasa N-terminal cJun (JNK) que enlaza la senda de la quinasa MAP con el procesamiento de la proteína precursora amiloide (Scheinfeld, Roncarati y colaboradores, 2002). La MAPK4 es una ERK que activa JNK, y por consiguiente, la sobre-expresión de MAPK4 podría conducir a la hiper-activación de J NK, la cual podría aumentar las interacciones de JNK-AICD, conduciendo a una mayor producción de Aß. También es posible que la activación de JNK pueda inducir apoptosis. De una manera alternativa, la MAPK4 podría alterar el estado de fosforilación de la proteína precursora amiloide, que se ha demostrado que afecta a su procesamiento preferencial mediante la secretasa-ß y -a, afectando el tráfico de la proteína precursora amiloide, e interrumpiendo las interacciones de PS1 /catenina-ß (Hung y Seikoe, 1994), (Walter, Capell y colaboradores, 1997). Adicionalmente, también se ha demostrado que el estado de fosforilación de las células es crítico para la actividad de PS1 (Seeger, Nordstedt y colaboradores, 1997). La activación de JNK y la fosforilación de proteína son también otras diferentes sendas en donde la MAPK4 podría estar actuando para aumentar la producción de Aß. Otro gen identificado en el rastreo es la calmodulina. La calmodulina es una proteína de enlace de Ca2+ de ciclo-hélice-ciclo, que transduce las señales de Ca2+ mediante su interacción con proteínas objetivas específicas, incluyendo CaMKI I , CaMKIV, calcineurina , espectrina A2, p21 , y la sintasa de óxido nítrico neuronal (Means 1981 ). Cuando el Ca2+ se enlaza con la calmodulina, sufre un cambio de conformación que le permite enlazarse con las proteínas objetivas y estimular o inhibir sus actividades. Se ha demostrado que la calmodulina regula la producción de Aß en las preparaciones sin células y en las células intactas, utilizando los antagonistas de calmodulina W-7 y trifluoperazina. Estos inhibidores conocidos de la actividad de la calmodulina también pueden inhibir la producción de Aß (Desdouits, Buxbaum y colaboradores, 1996). Por consiguiente, las concentraciones intracelulares de Ca2+ y/o las proteínas objetivas de calmodulina, pueden afectar al procesamiento de la proteína precursora amiloide. Estos datos de los compuestos validan el hecho de que se observa un aumento en la producción de Aß cuando se sobre-expresa la calmodulina. La mala regulación de Ca2+, en particular una caída en los niveles de Ca2+ citoplásmícos, es concomitante con un aumento en la producción de Aß asociado con las mutaciones de PS1 FDA (Yoo, Cheng y colaboradores, 2000). Las mutaciones de PS1 FAD pueden atenuar de una manera significativa la entrada capacitativa de calcio (CCE), y almacenar las corrientes activadas por el agotamiento, sugiriendo que una CCE reducida puede aumentar la generación de Aß (Yoo, Cheng y colaboradores, 2000). La sobre-expresión del gen de calmodulina encontrado en el rastreo, también podría provocar una caída en los niveles de calcio intracelular, y podría impedir una CCE adecuada. Es probable que la disminución en el Ca2+ intracelular podría aumentar la actividad de PS1 , ya sea directa o indirectamente, dando como resultado una mayor secreción de Aß a partir de las células. Los datos descritos con detalle más adelante sugieren que la SfA inhibe potentemente la producción de Aß40 y Aß42, e inhibe la C99 y la disociación de Muesca, sugiriendo que la actividad de la gamma-secretasa está ligada a la homeostasis de Ca2+ a través de la proteína inmunofilina CyD. Otro gen, la ceramidasa de ácido humana, cataliza la hidrólisis de la ceramida hasta esfingosina y ácido graso (Ferlinz, Kopal y colaboradores, 2001 ). La ceramida sirve como el precursor para la mayoría de los esfingolípidos, y es una molécula de señalización que induce apoptosis en un número de tipos de células diferentes, típicamente a través de la activación de la caspasa-3. Los niveles de ceramida acumulados están asociados con la enfermedad de Alzheimer, y se piensa que son parte de la senda neurotóxica oxidativa en el cerebro en envejecimiento con enfermedad de Alzheimer. La sobre-expresión de ceramida aumenta la producción de Aß ligándose con la disociación de ceramidasa hasta Aß. Debido a que la ceramida parece actuar a través de la apoptosis, es probable que la ceramidasa de ácido esté también aumentando la apoptosis. Se ha demostrado que el estado de ceramida de la célula regula tanto la estabilidad de BACE como la biogénesis de Aß (Puglielli, Ellis y colaboradores, 2003). Los estudios anteriores demuestran que los altos niveles de ceramida pueden aumentar la secreción de Aßde una forma independiente de la apoptosis (Puglielli, Ellis y colaboradores, 2003). La sobre-expresión de la ceramidasa disminuiría los niveles de ceramida, y aumentaría los niveles de esfingosina y ácido graso libre (FFA), posiblemente alterando la fluidez de membrana, un proceso que se sabe que altera la fosforilación de tau y la polimerización de Aß (Wilson y Binder, 1997). Aunque el mecanismo es poco claro, podría ser que la ceramidasa pueda afectar los niveles de FFA, conduciendo a un procesamiento alterado de la proteína precursora amiloide, y a más producción y/o secreción de Aß. TOB3 es una AAA-ATPasa que realiza las funciones tipo chaperona que asisten en el ensamble, operación, o desensamble de los complejos de proteína, incluyendo la secreción de proteína (Strausberg , Feingold y colaboradores, 2002). Esta clase de proteínas ayuda a mantener la integridad del retículo endoplásmico (ER), a medida que se procesan constitutivamente las proteínas. En ausencia de la actividad de AAA-ATPasa, hay una acumulación excesiva de proteínas mal plegadas, causando la expansión del retículo endoplásmico y la muerte celular (Kobayashi, Tanaka y colaboradores, 2002). La explicación más probable de la sobre-expresión de TOB3 que aumenta la secreción de Aß está ligada con su capacidad para efectuar el pliegue de proteína y el tráfico en el retículo endoplásmico. Si se estimula este proceso, como con la sobre-expresión de TOB3, es posible que se aumente el procesamiento de la proteína precursora amiloide. Nuestros datos de rastreo han demostrado que la sobre-expresión de TOB3 altera el procesamiento de la proteína precursora amiloide, conduciendo a una mayor producción de Aß, y a menos fragmentos C-termínales C99 y C83. La expresión de TOB3 también disminuye los niveles de APP y de sAPPa en las células N2A hasta un mayor grado que en las células HEKA293 (no se muestran los datos). Esto sugiere que la TOB3 afecta a uno o más componentes de la maquinaria de procesamiento de la proteína precursora amiloide, dando como resultado una mayor disociación de APP y C99. Debido a que la TOB3 está involucrada en el transporte y procesamiento de proteínas, actualmente se está determinando el mecanismo exacto y la especificidad de TOB3 sobre el procesamiento de la proteína precursora amiloide. La carboxipeptidasa Z (CPZ), otro ADNc identificado a partir del rastreo funcional, es un miembro de la familia de genes de metalocarboxipeptidasa, junto con CPE y CPD, que se piensa que funcionan en el procesamiento intracelular de los péptidos bioactivos y las proteínas antes de su secreción. CPZ es una carboxipeptidasa única, debido a que contiene un dominio enredado rico en cisteína N-terminal funcional que se enlaza con Wnt y las proteínas sin alas, las cuales son un componente crítico de la transducción de señal de Wnt (Moeller, Swindell y colaboradores, 2003). Otro ADNc interesante es la ciclofilina D (CyD, también conocida como CyF. La referencia a la nomenclatura se puede encontrar en Current Medicinal Chemistry, 2003, 10, 1485-1506 1485 Cyclophilin D as a Drug Target, Waldmeier y colaboradores). Se encontró que la CyD está involucrada en la producción de Aß. Las proteínas de ciclofilina, tales como CyD, son isomerasas de peptidil-prolilo involucradas en el tráfico y maduración de las proteínas. Las ciclofilinas se localizan primordialmente en el citoplasma, excepto CyD, que se localiza exclusivamente en la matriz mitocondrial (Waldmeier, Zimmermann y colaboradores, 2003). Cuando se sobre-expresa la CyD, ésta podría estabilizar los fragmentos N-terminales PS1 endógenos (NTFs). Una lesión común en el cerebro de enfermedad de Alzheimer, es la presencia de hebras neurofibrilares intracelulares formadas de tau anormalmente fosforilada, una proteína asociada con microtúbulos (Johnson y Bailey, 2002). Cuando se sobre-expresa con la proteína precursora amiloide, la CyD podría aumentar la actividad de la caspasa-3, indicando un posible mecanismo a través del cual se modula la secreción de Aß. Estos resultados sugieren que, cuando se sobre-expresa, la CyD es un factor importante requerido para la disociación de APP y C99 a través de la senda de secretasa-?. En un aspecto, la CyD es un constituyente integral del poro de transición de permeabilidad mitocondrial que se piensa que se enlaza con el translocalizador del nucleótido adenina, y regula la abertura del poro (Waldmeier, Wimmermann y colaboradores, 2003). La permeabilización de las membranas mitocondrial es una consecuencia de la tensión celular que conduce a la disipación del potencial de membrana mitocondrial, a la liberación de las proteínas apoptogénicas, y culmina en la muerte celular apoptótica (Waldmeier, 2002). Se ha sugerido que la falla mitocondrial tiene un papel significativo en el desarrollo de la neuropatología de la enfermedad de Alzheimer en los pacientes con síndrome de Down, mediante la promoción de un procesamiento aberrante de ß-APP, y la acumulación intracelular de Aß (Busciglio, 2002). También se ha demostrado que los aumentos en los niveles de calcio intracelular provocan la acumulación de Aß intracelular (LaFerla, 2002). De una manera sorprendente, la proteína precursora amiloide de longitud completa no solamente trafica a lo largo de la senda secretora, sino que también se dirige a la mitocondria de las células neuronales corticales cultivadas en el cerebro de un modelo de ratón transgénico para la enfermedad de Alzheimer. La translocalización incompleta y la acumulación progresiva de ß-APP en las membranas mitocondriales, pueden conducir a una disfunción mitocondrial, y también pueden tener un papel en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer (Anandatheerthavarada, Biswas y colaboradores, 2003). Se sabe que la sobre-expresión de las proteínas mitocondriales puede conducir a la formación de agregados insolubles dentro de la matriz (por ejemplo, proteína-3 de desacoplamiento, UCP3). Estos agregados pueden tanto perjudicar la función normal de la mitocondria como aumentar la permeabilidad pasiva de la membrana interna. La CyD puede tener un papel importante en el trato de la mitocondria con un exceso de proteína precursora amiloide, o con el procesamiento del fragmento C-terminal. Se sabe que la CyD es un objetivo de los fármacos inmunosupresores, tales como ciclosporina. Estos compuestos bloquean la transición de permeabilidad mitocondrial (MPT), y previenen la apoptosis (Samantha J . Clarke, 2002; Waldmeier, 2002). También se sabe que los compuestos de FK506 se enlazan con las proteínas de inmunofilina, pero no se enlazan con la CyD (Uchino, 2003). Una ciclosporina se considera como que se enlaza con la ciclofilina si se enlaza con la ciclofilina recombinante humana cuando menos en una quinta parte de como lo hace la Ciclosporina (también referida como ciclosporina A) en la prueba ELISA competitiva descrita por Quesniaux en Eur. J. Immunol. 198, 17, 1359-1365. En esta prueba, la ciclosporina que se vaya a probar se agrega durante la incubación de la ciclofilina con ciclosporina-BSA recubierta, y se calcula la concentración requerida para dar una inhibición del 50 por ciento de la reacción de control sin competidor (IC50). Los resultados se expresan como la Proporción de Enlace (BR), que es el logaritmo para la base 10 de la proporción de la IC50 del compuesto de prueba y la IC50 en una prueba similar utilizando Ciclosporina en lugar de la ciclosporina de prueba. Por consiguiente, una proporción de enlace de 1 .0 indica que el compuesto de prueba se enlaza con la ciclofilina por un factor de 10 menos bien que como lo hace la Ciclosporina, y un valor negativo indica un enlace más fuerte que aquél de la Ciclosporina. Las ciclosporinas activas como agentes neuroprotectores tienen una proporción de enlace menor de 0.7 (debido a que log10 5 = 0.7 aproximadamente), de preferencia igual o menor que cero. Una ciclosporina se considera como no inmunosupresora cuando tiene una actividad en la Reacción de Linfocitos Mixtos (MLR) de no más del 5 por ciento, de preferencia no más del 2 por ciento, de aquélla de la Ciclosporina. La Reacción de Linfocitos Mixtos es descrita por T. Meo en "Immunological Methods", L. Lefkovits y B. Peris, Editores, Academic Press, N . Y. , páginas 227-239 (1979). Las células de bazo (0.5 x 106) de ratones Balb/c (hembras, de 8 a 10 semanas) se co-incuban durante 5 días con 0.5 x 106 células de bazo irradiadas (2000 rads) o tratadas con mitomicina C, a partir de ratones CBA (hembras, de 8 a 10 semanas). Las células alogenéicas irradiadas inducen una respuesta proliferativa en las células de bazo de Balb c, que se puede medir mediante la incorporación del precursor marcado en el ADN. Debido a que las células estimulantes son irradiadas (o tratadas con mitomicina C), no responden a las células de Balb/c con proliferación, pero sí retienen su antigenicidad. La IC50 encontrada para el compuesto de prueba en la MLR se compara con aquélla encontrada para la Ciclosporina en un experimento paralelo. Se ha encontrado que los compuestos que se juzgan como no inmunosupresores en la MLR anterior, con frecuencia son inactivos en un Ensayo de Gen Reportero de IL-2, y por lo tanto, se puede utilizar un Ensayo de Gen Reportero de IL-2 , por ejemplo como un rastreo primario, para la selección de los compuestos de ciclosporina de enlace de ciclofilina no inmunosupresores, para utilizarse en la invención . Los compuestos de ciclosporina de enlace de ciclofilina no inmunosupresores que son activos como agentes para el tratamiento de las condiciones patológicas asociadas con la secreción de Aß, por ejemplo como inhibidores de la acumulación extracelular de las placas amiloides en la enfermedad de Alzheimer, son referidos posteriormente en la presente como los Compuestos Activos. Por consiguiente, los compuestos activos son útiles en el tratamiento de cualquier condición clínica que involucre la secreción del péptido Aß, la expresión de los fragmentos N-terminales de PS1 endógenos (NTFs), o una mayor actividad de gamma-secretasa. Además, los compuestos activos son útiles en el tratamiento de las condiciones involucradas en la apoptosis que aumentan la secreción de Aß. La formación del péptido Aß y la subsecuente acumulación , no son solamente una marca de la enfermedad de Alzheimer, sino que también son una parte integral de otras enfermedades neurológicas, tales como Parkinson , Huntington, y otras amiloidosis sistémicas (Seikoe, 1989; Price, Borchelt y colaboradores, 1993; Citrón , Vigo-Pelfrey y colaboradores, 1994). Está claro, a partir de estos resultados, que la apoptosis y la producción de Aß están integralmente ligadas.

Los compuestos activos también tienen utilidad para modular los "modificadores de Aß periféricos" no expresados en el cerebro. En los fenotipos tales como la amiloidosis cardíaca y dermatológica, puede resultar una amiloidosis periférica (Yamaguchi, Yamasaki y colaboradores, 1992), (Seikoe, 1989). Si se encuentra un regulador clave de la Aß periférica, también es posible derivar productos terapéuticos novedosos, tales como para estos objetivos, que prevengan la necesidad de penetrar en la barrera hematocefálica. Se ha demostrado que una caída en los niveles periféricos de Aß disminuye los niveles de Aß en el cerebro de ratón transgénico, dando como resultado menos formación de placa (Bohrmann, Tjemberg y colaboradores, 1999; DeMattos, Bales y colaboradores, 2002). Se encuentra que muchos de los Compuestos Activos tienen estructuras diferentes de aquélla de la Ciclosporina, específicamente en las posiciones 4 y/o 5. Otras posiciones en las cuales pueden diferir las estructuras de los Compuestos Activos de aquélla de la Ciclosporina, son las posiciones 6 y 7. Un grupo de Compuestos Activos son las ciclosporinas en donde el grupo MeLeu en la posición 4 es reemplazado por un aminoácido N-metilado diferente, por ejemplo ?-hidroxi-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Me Tyr ó MeTyr(O-PO(OH)2), ó Pro. En adición a Melle y MeThr, también se pueden utilizar las halo-formas de Mealle y Mea Thr. En la halo-forma, la estereoquímica en la posíción-ß tiene la configuración opuesta a aquélla del aminoácido natural, de tal manera que la forma normal y la alo-forma constituyen un par de diaestereoisómeros. Un grupo adicional de Compuestos Activos es aquél en donde Val en la posición 5 es reemplazada por un aminoácido de N-alquilo, de preferencia N-metilo. De una manera preferible, el aminoácido que está N-alquilado es Val ó Leu. Preferiblemente, el hidrógeno del grupo imino de [Val]5 es reemplazado por un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono no ramificado, de preferencia metilo, etilo, o propilo normal, en particular metilo. El último grupo preferido de Compuestos Activos es todo novedoso. Adicionalmente o de una manera alternativa, ciertos Compuestos Activos pueden diferir de la Ciclosporina en las posiciones 1 , 2, 3, y/o 6. Una clase particular de Compuestos Activos para utilizarse en la presente invención , son los derivados de Ciclosporina de la Fórmula A: en donde B es un residuo de aminoácido de la Fórmula B: S-Alk-R en donde a denota el enlace con el residuo aAbu en la posición 2 ; b denota el enlace con el residuo C en la posición 4; Alk representa alquileno de cadena recta o ramificada que contiene de 2 a 6 átomos de carbono, o cicloalquileno q ue contiene de 3 a 6 átomos de carbono, y R representa : un radical de carboxilo o alquiloxi-carbonilo; un radical de -N R1 R2, en donde Ry y R2 son iguales o diferentes, y representa n hidrógeno, alquilo, alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, cicloalq uilo de 3 a 6 átomos de carbono, fenilo (opcionalmente sustituido por halógeno, alcoxilo, alcoxi-carbonilo, amino, alquil-amino, ó d ialquil-amino) , o un radical de bencilo o de heterociclilo satu rado o insaturado q ue contiene 5 ó 6 átomos del anillo y de 1 a 3 heteroátomos , o en donde R T y R2 forman , junto con el átomo de nitrógeno con el que están unidos, un heterociclo satu rado o ¡nsaturado q ue contiene de 4 a 6 átomos del anillo, y que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre, y opcionalmente sustituido por alq uilo, fenilo, o bencilo; u n radical de la Fórmula : en donde R-i y R2 son como se definen anteriormente, R3 representa hid rógeno o un radical de alquilo, y n es un número entero de 2 a 4, y en donde alq uilo denota alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de 1 a 4 átomos de carbono; C es MeLeu ó 4-hidroxi-MeLeu; y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Esta clase de derivados de Ciclosporina se describe adicionalmente en las Solicitudes de Patentes Internacionales Publicadas Números WO 98/28328, WO 98/28329, y WO 9828330. Un compuesto particularmente preferido de esta clase es el compuesto de la Fórmula A, en donde B es el residuo de aminoácido B': S-CH, B' CH3 O y C es el residuo de aminoácido de 4-hidroxi-MeLeu. Un grupo particularmente preferido de los Compuestos Activos está constituido por los compuestos de la Fórmula I: r- - X - R - Y - Z - Q - Ala - (D)Ala - MeLeu - MeLeu - MeVal -? 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 | I en donde W es MeBmt, dihidro-MeBmt, u 8'-hidroxi-MeBmt; X es aAbu, Val, Thr, Nva, u O-metil-treonina (MeOThr); R es Sar ó (D)-MeAla; Y es MeLeu, ?-hidroxi-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Me Tyr, MeTyr(O-PO(OH)2), Mealle ó MeaThr, ó Pro; Z es Val, Leu, N-Alk-Val, ó N-Alk-Leu, en donde Alk represente Me, ó Me sustituido por vinilo opcionalmente sustituido por: fenilo, o un heteroarilo de N, S, u O, que contiene 6 miembros del anillo, o fenilo opcionalmente sustituido por: halógeno; y Q es MeLeu, ?-hidroxi-MeLeu, ó MeAla, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los grupos W, X, Y, Z, y Q tienen independientemente los siguientes significados preferidos: W es de preferencia W', en donde W' es MeBmt ó dihidro-MeBmt; X es de preferencia X', en donde X' es aAbu ó Nva, más preferiblemente X", en donde X" es aAbu; Y es de preferencia Y', en donde Y' es ?-hidroxi-MeLeu, MeVal, MeThr, MeAla, ó MeTyr(O-PO(OH)2); Z es preferencia Z', en donde Z' es Val ó MeVal; y Q es de preferencia Q', en donde Q' es MeLeu. Un grupo especialmente preferido de los Compuestos Activos son los compuestos de la Fórmula I en donde W es W', X es X', Y es Y' , Z es Z', y Q es Q'. Los Compuestos Activos particularmente preferidos de la Fórmula I son : a) [dihidro-MeBmt]1-[?-hidroxi-MeLeu]4-Ciclosporina, b) [MeVal]4-Cíclosporina, c) [Melle]4-Ciclosporina, d) [MeThr]4-Ciclosporina, e) [?-hidroxi-MeLeu]4-Ciclosporina, f) [Nva]2-[?-hidroxi-MeLeu]4-Ciclosporina, g) [?-hídroxi-MeLeu]4-[?-hidroxi-MeLeu]6-Ciclosporina, h) [MeVal]5-Ciclosporina, i) [MeOThr]2-[(D)MeAla]3-[MeVal]5-Ciclosporina, j) [8'-h id roxi-MeBmt]1 -Ciclosporina, k) [MeAla]6-Ciclosporina, I) [DMeAla]3-[MeTyr(OPO(OH)2)]4-Ciclosporina, m) [N-bencil-Val]5-Ciclosporina, n) [N-5-fluoro-bencil-Val]5-Ciclosporina, 0) [N-Alil-Val]5-Ciclosporina, p) [N-3-fenil-Alil-Val]5-Ciclosporina, q) [Pro]4-Ciclosporina. Ciclosporina. Los Compuestos Activos especialmente preferidos son [Melle]4- Ciclosporina y [?-hidroxi-MeLeu]4-Ciclosporina, más especialmente [Melle]4-Ciclosporina. En adición a los compuestos de la Fórmula I , los Compuestos Activos preferidos incluyen, por ejemplo: r) [?-hidroxi-MeLeu]9-Ciclosporina. Los Compuestos Activos se pueden obtener mediante los métodos que incluyen: 1 ) Fermentación, 2) Biotransformación, 3) Derivación, 4) Síntesis parcial, 5) Síntesis total. Estos métodos se describen en general y más específicamente en los Ejemplos 1 a 10 de la Patente Europea Número EP 0484281 B y de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5767069. Esta descripción general y la enseñanza de estos ejemplos se incorporan por referencia en la presente solicitud . El Ejemplo 1 1 de la Patente Europea Número EP 0484281 B describe la medición de las actividades inmunosupresoras y de enlace de ciclofilina de los Compuestos Activos representativos en relación con la Ciclosporina, y la enseñanza de este ejemplo también se incluye dentro de la divulgación de la presente solicitud. Por consiguiente, la invención proporciona el uso de una ciclosporina de enlace de ciclofilina no inmunosupresora en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de las condiciones patológicas asociadas con la secreción de Aß, tales como Enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson , tauopatías, enfermedades de priones, demencia frontotemporal, degeneración estriatonigral, demencia de cuerpo de Lewis, enfermedad de Huntington , enfermedad de Pick, amiloidosis, y otros trastornos neurodegenerativos asociados con una producción excesiva de Aß. La invención proporciona además un método para el tratamiento o la prevención de las condiciones patológicas asociadas con la secreción de Aß, tales como Enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, tauopatías, enfermedades de priones, demencia frontotemporal, degeneración estriatonigral, demencia de cuerpo de Lewis, enfermedad de Huntington, enfermedad de Pick, amiloidosis, y otros trastornos neurodegenerativos, el cual comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un Compuesto Activo de la invención. El Compuesto Activo se puede administrar por cualquier vía convencional, en particular enteralmente, por ejemplo oralmente, por ejemplo en la forma de soluciones para beber, tabletas o cápsulas, o parenteralmente, por ejemplo en la forma de soluciones o suspensiones inyectables. Según la vía intravenosa, una dosificación diaria indicada puede ser de 1 a 20 miligramos/kilogramo, de preferencia de 3 a 10 miligramos/kilogramo, y por la vía oral, de 1 a 50 miligramos/kilogramo, de preferencia de 10 a 30 miligramos/kilogramo. Se cree que la toxicidad de los Compuestos Activos es menor que aquélla de la Ciclosporina. Debido a que los Compuestos Activos no son inmunosupresores, se evitan ciertos efectos secundarios de la Ciclosporina relacionados con la inmunosupresión. Otros efectos secundarios asociados con la Ciclosporina, en particular la nefrotoxicidad y la toxicidad para el sistema nervioso central en el uso a largo plazo, son convenientemente menores que aquéllos con la Ciclosporina. Las formulaciones galénicas preferidas para los Compuestos Activos incluyen aquéllas basadas en microemulsiones, como se describen en la Solicitud de Patente Británica N úmero 2,222 ,770A, la incluye las formas tópicas, así como orales; también las formas orales e inyectables obtenidas a partir de soluciones sólidas que comprende u n monoéster de sacárido de ácido graso, por ejemplo monolaurato de sacarosa, como se describe en la Solicitud de Patente Británica N úmero 2 ,209,671 A. Las formas de dosificación unitaria adecuadas para administración oral comprenden , por ejemplo, de 25 a 200 miligramos del Compuesto Activo por dosificación . Los Ejemplos de formulación A, B, C , y D de la Patente Europea Número EP 0484281 B se incorporan a la presente como referencia . Los componentes individuales de estas formulaciones, así como los métodos para su preparación , se describen completamente en la Solicitud de Patente Británica Número 2,222 ,770, cuyo contenido se incorpora a la presente como referencia . La utilidad de los compuestos activos como agentes neu roprotectores se puede demostrar en pruebas in vivo o in vitro, por ejemplo: Los compuestos activos de la invención se pueden proporcionar solos, o en combinación , o en combinación en secuencia con otros agentes. Por ejemplo, los compuestos activos de la invención se pueden administrar en combinación con agentes anti-inflamatorios, tales como, pero no limitándose a, corticosteroides en seguida de embolia o lesión de la médula espinal , como un medio para bloq uear un daño neu ronal ad icional y la inhibición de la regeneración axonal , los factores neu rotróficos tales como NG F, BDN F, u otros fármacos para enfermedades neurogenerativas, tales como ExelonM R o Levodopa . Como se utiliza en la presente, se dice que dos agentes se van a administrar en combinación cuando los dos agentes se administran de una manera sim ultánea , o se admin istran independientemente en una forma ta l que los agentes actuarán al mismo tiempo. La estructura de los ingredientes activos identificados por números de código, nombres genéricos o comerciales , se puede tomar de la edición actual del compendio estándar "The Merck I ndex", o de las bases de datos, por ejemplo Patentes I nternational (por ejemplo, I MS World Publications) . El contenido correspondiente de las mismas se incorpora a la presente como referencia . Cualquier persona experta en la materia está absolutamente capacitada para identificar los ingredientes activos y, basándose en estas referencias, de la misma manera está capacitada para fabricar y probar las ind icaciones y propiedades farmacéuticas en modelos de prueba convencionales, tanto in vitro como in vivo. Para las indicaciones mencionadas anteriormente, la dosificación apropiada, por supuesto, variará depend iendo, por ejemplo, de la molécula pa rticular de la invención que se vaya a emplear, del modo de admin istración , y de la naturaleza y severidad de la cond ición que se esté tratando.

EJEMPLOS Los siguientes métodos se llevan a cabo para conducir los Ejemplos dados a conocer en seguida: Transfecciones. Las células CHO K1 (ATCC, Manassas, VA) se aplican con DMEM , suero bovino fetal al 10 por ciento, penicilina/estreptomicina al 5 por ciento, y 22 miligramos de L-prolina (Sigma Chemical, St. Louis, MO). Las placas se incuban durante la noche a 37°C en cámaras de cultivo celular con CO2 encamisadas en agua. El ADNc de interés se co-transfecta con la proteína precursora amiloide de longitud completa en una proporción de 1 : 15 (cDNA:APPwt(695)), utilizando el reactivo Qiagen® SuperFect, que se utiliza de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En los platos de 6 pozos, se aplican 5 x 105 células con DMEM , suero bovino fetal al 10 por ciento, penicilina/estreptomicina al 5 por ciento (Sigma Chemical, St. Louis, MO), y se cultivan durante 24 horas. La mezcla SuperFect se forma con 100 microlitros de medio exento de suero (DMEM), 3 microgramos de ADN total, y 20 microlitros de SuperFect. El medio se remueve de las células, y se agrega 1 mililitro de medio fresco. Toda la mezcla SuperFect se agrega al medio, y se incuba a 37°C durante 2 horas. Entonces se remueve la mezcla, y las células se lavan una vez con 3 mililitros de suero regulado con fosfato. Se agrega de regreso el medio fresco a las células, y se incuban durante 24 ó 48 horas. Inmunocitoquímica. Las células CHO se transfectan en OPTIMEM (Medio sin suero) con las construcciones apropiadas, utilizando Lipofectamina, como es descrito por los fabricantes (Life Technologies). Las células CHO se inmuno-tiñen, y se observa la inmuno-reactividad como se describe en Dev y colaboradores, 1999, Neuropharmacol. (1999) 38, 635-644. La expresión de proteína-Flag se detecta utilizando el anticuerpo de ratón monoclonal M2 anti-Flag (Sigma), y el anticuerpo secundario es la IgG de cabra anti-conejo Texas Red-X (Molecular Probes). Análisis de citometría de flujo de la caspasa-3. Las células H EK se transfectan transitoriamente con CyD ó CPZ junto con APPwt durante 24 horas. Las células se fijan, se permeabilizan , y se tiñen utilizando el kit de apoptosis de Caspasa-3 de BD Biosciences (#550914). Las células teñidas con FITC se inician desde > 101 , y se miden como células positivas para la caspasa-3 activa. También se examina la dispersión de luz hacia adelante y lateral para verificar la salud de la población celular. Tratamiento con el compuesto. Las células HEK 293 que expresan establemente el mutante APPswe se tratan durante 24 horas con ciclosporina A, Sanglifehrina A, FK506 (como se describe en Sedrani y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 125, páginas 3849-3859 (2003) incorporado como referencia en su totalidad), y concentraciones de N-metil-4-valina-ciclosporina. La viabilidad celular se mide utilizando el kit CelITier-Glo de Promega (#G7573). Se miden los niveles de Aß40 y 42 en los sobrenadantes celulares utilizando un ELISA de dos emparedados en casa (el ELISA en casa es del mismo formato que se describe, excepto que se utilizan los anticuerpos desarrollados en Novartis en lugar de los anticuerpos de Biosource). Se utiliza una línea celular que expresa establemente un elemento de respuesta 5xGal4-reportero de luciferasa, y se utiliza una construcción C99-Gal4-VP16 ó Muesca-Gal4-VP16 para medir la disociación de C99 ó de Muesca (como se da a conocer en Maltese, Wilson y colaboradores, 2001 ). Cuando se disocia mediante ?-secretasa, se libera Gal4-VP16, y se enlaza con el reportero, aumentando la actividad de la luciferasa. Las células estables se tratan con los compuestos, y se determinan los valores IC50. ELISA de Aß. Se utiliza un anticuerpo monoclonal de ratón comercialmente disponible dirigido hacia el término NH2 del péptido Aß como el anticuerpo de captura en placas de 96 pozos previamente recubiertas (Biosource Cat. #KBH3481 /PPO81 para Aß40 y Cat. #KBH3441 /PPO81 para Aß42). Los anticuerpos de detección policlonales se obtienen en Biosource (anti-hAß40 Cat. #44-348 y antí-hAß42 (Cat. #44-344), y se diluyen a 1 /220 en azida de sodio 15 mM . El anticuerpo secundario (Biosource Cat. #KBH3481 para Aß40 y Cat. #KBH3441 para Aß42) es una IgG anti-conejo marcada con peroxidasa de radícula roja. El anticuerpo secundario se diluye a 1 /100 en timol 3.3 mM. Las placas recubiertas con anticuerpo se lavan cuatro veces en PBS-TE (EDTA 1 mM y Tween 20 al 0.05 por ciento, regulador de lavado) en un lavador de microplacas (Bioteck Instruments, Inc. Winooski, VT). Se remueven 100 microlitros del medio acondicionado de las células transfectadas, y se diluyen a 1 :2 en diluyente de muestras que contiene AEBSF 1 mM (Biosource, Camarillo, CA). Se agregan 100 microlitros de esta mezcla a la placa de 96 pozos recubierta con anticuerpo lavada, se cubre con cinta, y se incuba a 4°C durante la noche. Las muestras se remueven, y las placas se lavan cuatro veces con regulador de lavado. Se agrega la solución de anticuerpo de detección a 100 microlitros/pozo, y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación. Las placas se lavan de nuevo cuatro veces con regulador de lavado, y se agrega la solución de anticuerpo secundario a 100 microlitros/pozo, y se incuba durante 2 horas con agitación . Las placas se lavan cinco veces en regulador de lavado, y se secan sobre una toalla de papel. Se agregan 100 microlitros de cromógeno estabilizado (tetrametil-bencidina) a cada pozo, y la placa se incuba durante 30 minutos en la oscuridad. Se agregan 100 microlitros de solución de paro (H2S 1 N) a las placas para detener la reacción . Las placas se leen un lector de microplacas a 450 nanómetros (Molecular Devices) dentro de 1 hora. Análisis de anticuerpos y Western blot. El ADNc para APP de tipo silvestre, y el mutante sueco de APP, se insertan en el vector de expresión del plásmido pCI corriente abajo de un promotor de citomegalovirus, como fue previamente descrito (Promega, Madison , Wl) (Bodendorf, U . , Fischer, F. , Bodien, D. , Multhaup, G. , Paganettí, P. 2001 , J. Biol. Chem. 276: 12019-12023). El anticuerpo PS1 NTF reconoce el término-N de PS1 (Thinakaran , Borchelt y colaboradores, 1996). Las células H EK 293 cultivadas se extraen a las 24 horas después de la transfección en regulador RI PA (Tris 10 mM , pH de 7.5, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 1 mM , Nonidet P-40 al 1 por ciento, desoxicolato de sodio al 0.5 por ciento, SDS al 1 por ciento) conteniendo inhibidores de proteasa (Complete® Roche Molecular Biochemícals) y se centrifugan a 4°C durante 10 minutos a 10,000 x g. Los sobrenadantes se recolectan, y los granulos se desechan . Subsecuentemente, los extractos celulares se resuelven mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, se transfieren a membranas PVDF Immobilon-P® (Millipore), y se sondean con los anticuerpos primarios como se indica. La detección inmunológica se lleva a cabo con el sistema de detección ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) como fue previamente descrito (Manni, M . y colaboradores, 1998. FEBS 427:367-370) . Inmunocitoquímica. Las células CHO se transfectan en OPTIMEM (medio sin suero) con las construcciones apropiadas, utilizando lipofectamina como es descrito por el fabricante (Life Technologies). Las células CHO se inmuno-tiñen, y se observa la inmuno-reactividad como fue previamente descrito (Dev y colaboradores, 1999, Neuropharmacol. , (1999) 38, 635-644). Se detecta la expresión de la proteína-Flag utilizando el anticuerpo de ratón monoclonal M2 anti-Flag (Sigma), y el anticuerpo secundario es la IgG de cabra anti-conejo Texas Red-X (Molecular Probes). Construcciones de CPZ. La carboxi-peptidasa humana de tipo silvestre (hCPZ) se obtiene de una biblioteca de ADNc normalizada de DRG humano puro (L0001 ) adquirido en Life Technologies Inc. (LTI, N úmero de Catálogo: 1 1315-017, Número de Lote: 81027-242).

Los insertos de ADNc se clonan en los sitios EcoR V y Not I, en la dirección 5' a 3', en el vector compatible con Gateway, pCMV'SPORTd. La supresión del dominio rizado (FZ) correspondiente a los aminoácidos 42-161, el dominio catalítico (Cat) de los aminoácidos 179-568, el mutante puntual (aminoácido E251A), y la introducción de una marca-FLAG N-terminal (DYKDDDDK SEQ ID NO:1) después del aminoácido 29, se hacen mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando los cebadores: 5' CCTCCAGGCCTCCCCGAAGCTTCTCGGCGCTGTCTGCAGCTGGTGG CCTGTGG-3' (SEQ ID NO:2), y 5' CCACAGGCCACCAGCTGCAGACAGCGCCGAGAAGCTTCGGGGAGG CCTGGAGG-3' (SEQ ID NO:3) para la supresión del dominio rizado, 5' CCACACGGCCAGCCCTCTTCATCCGGGCCAGCCCTGAGGGCAGTG CCTCGTCAGC-3' (SEQ ID NO:4), y 5' GCTGACGAGGCACTGCCCTCAGGGCTGGCCCGGATGAAGAGGGCT GGCCGTGTGG 3' (SEQ ID NO:5) para la supresión del dominio catalítico, 5'GCATCTCCCGGCCCGCCACCGCGTTGCCATGAATGTTGC-3' (SEQ ID NO:6), y 5'GCAACATTCATGGCAACGCGGTGGCGGGCCGGGAGATGC-3' (SEQ ID NO:7) para la mutación puntual E251A, y 5' GGTGGCCTGTGGCATTCACCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGG CGGGGTTCCGCTCAAACTCG-3' (SEQ ID NO:8), y 5'CGAGTTTGAGCGGAACCCCGCCGACTACAAGGACGACGATGACA AGGGTGAATGCCACAGGCCACC-3' (SEQ I D NO:9) para la introducción de la marca-FLAG. El aislamiento de todo el ADN a partir de E. coli transformada, se lleva a cabo los kits de plásmidos Qiagen. La secuencia de todos los marcos de lectura abierta se verifica mediante secuenciación del ADN utilizando el sistema analizador de ADN ABI Prism 3700. Hibridaciones in situ. Utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los cebadores de oligonucleótidos de auto-cebado flanqueados en 5' con las secuencias de reconocimiento promotoras SP6 y T7, es posible generar plantillas de ribo-sonda a partir de cualquier secuencia genética conocida sin ningún paso de clonación . La reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo por 40 ciclos con el paso de desnaturalización a 95°C durante 45 segundos, la fase de templado a 58°C durante 30 segundos, y la fase de extensión a 70°C durante 1 minuto. Después de la separación sobre gel de agarosa al 4 por ciento, los productos de la reacción en cadena de la polimerasa se limpian con el kit de purificación QIAQuick de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Suiza). El producto de la reacción en cadena de la polimerasa limpiado se transcribe utilizando la polimerasa de ARN-T7 (anti-sentido) y la polimerasa de ARN-SP6 (en sentido) a 37°C durante 2 horas, utilizando el dNTP que contiene Digoxigenina-UTP. Los nucleótidos no incorporados se remueven, la sonda se precipita con etanol y se disuelve en 50 microlitros de agua antes de su almacenamiento a -20°C. Las diluciones en serie de la sonda-DIG y el ARN de control marcado (concentración conocida) se aplican sobre una membrana de nylon. La incubación con el anticuerpo anti-DIG conjugado con fosfatasa alcalina es seguida por la fase de revelado de color utilizando NBT/BCI P (75 miligramos/mililitro de Tetrazolio Azul Nitro en dimetil-formamida al 70 por ciento y agua al 30 por ciento, y 50 miligramos/mililitro de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolílo en dimetil-formamida al 100 por ciento) como el sustrato para la fosfatasa alcalina. La concentración de la sonda de CPZ se estima mediante la comparación de las intensidades de las manchas con el ARN de control marcado. La ISH se lleva a cabo utilizando el instrumento completamente automatizado DiscoveryMR (Ventana Medical Systems, Estrasburgo) para la hibridación in situ y la inmunoqu ímica. El protocolo llevado a cabo para localizar este gen utilizando la sección de tejido empotrado en parafina se establece dentro del laboratorio analítico de ARN , y se describe más adelante. La desparafinización y la rehidratación de las secciones de tejido se llevan a cabo en condiciones sin solvente, utilizando la solución EZprep (Ventana Medical Systems SA, Estrasburgo) durante 8 minutos a 75°C, seguido por 8 minutos más a 42°C. Todos los pasos de tratamiento previo se hacen con el kit RiboMapMR (Ventana Medical Systems SA, Estrasburgo) siguiendo las instrucciones del fabricante, con un paso de permeabilización adicional utilizando digestión enzimática: se obtienen resultados óptimos con 12 microgramos/mililitro de proteinasa K a 37°C durante 16 minutos. La hibridación de la sonda de CPZ se lleva a cabo a 45°C durante 6 horas con las cantidades adecuadas de ribosonda-DIG (sonda de CPZ = 5 nanogramos/placa) diluida en solución RiboHybe (Ventana Medical Systems SA, Estrasburgo). Los lavados posteriores a la hibridación se llevan a cabo a 50°C durante 8 minutos en condiciones de alta restringencia (0.1 x SSC) por tres veces. Para la detección de la marca-DIG , se aplica un anticuerpo anti-digoxina de ratón conjugado con biotina (Jackson Immunoresearch , Inc.) durante 30 minutos a 37°C después de la dilución a 1 /2000 en un diluyente de anticuerpo, y la siguiente detección cromogénica de BCIP/NBT se hace utilizando el kit BlueMapMR (Ventana Medical Systems SA, Estrasburgo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tiempo de incubación del sustrato para el equilibrio óptimo de la señal al ruido es de 4 horas. El contra-teñido utilizando rojo rápido nuclear ISH se lleva a cabo durante 10 minutos. Las secciones se montan en un montaje Crystal, y se montan posteriormente utilizando Permount. Ejemplo 1 Procesamiento de Presenilina: La observación de que la sobre-expresión de los ADNcs aumentaron los niveles de Aß con el sustrato C99, sugiere un aumento en la disociación de proteína precursora amiloide mediada por GACE. Debido a que CPZ y CyD aumentaron de una manera significativa el procesamiento de C99, y aumentaron la secreción de Aß42, se seleccionan para una investigación adicional. Se examinan los niveles del fragmento N-termínal PS1 (NTF) en células HEK 293 transfectadas con CPZ ó CyD. En las células establemente transfectadas con PS1 , tanto el PS1 de longitud completa como los NTFs son fácilmente detectables. En contraste, en las células HEK no transfectadas, los niveles endógenos de PS 1 de longitud completa y de NTF son bajos. En las células que sobre-expresan CPZ ó CyD, hay un claro aumento en los niveles de PS1 -TNF, indicando que estos fragmentos se están generando a velocidades más altas, o que los NTFs endógenos se están estabilizando durante el período de transfección de 48 horas. Análisis de CPZ: CPZ es un miembro de la familia genética de Carboxi-peptidasa (CP) , en la sub-familia de CPE, que se sabe que procesa los neuropéptidos bioactivos (Song y Fricker, 1997). Las enzimas relacionadas con CPE generalmente están involucradas en las reacciones de procesamiento selectivo, mediante la remoción selectiva de los residuos básicos desde el término-C de los intermediarios de procesamiento. Para determinar si se requería la actividad catalítica, la expresión , o la localización subcelular de CPZ, para inducir la secreción de Aß, se generan tres construcciones mutantes de CPZ. En la primera construcción , se remueve completamente el dominio catalítico (?cat) dejando solamente el péptido de señal, el dominio rizado, y el término-C. En la segunda construcción , se suprime el dominio rizado (?fz), y en la tercera construcción, se introduce una sola mutación puntual (Glu251 Ala) en el dominio catalítico, que deterioraría la actividad catalítica de CPZ. Cada variante de CPZ se co-transfecta en células HEK 293 con el sustrato APPwt ó bien C99. Cada una de las tres construcciones mutantes no tienen actividad comparándose con la CPZ de tipo silvestre o la CPZ marcada con flag. Los resultados son similares a los de ambos sustratos APPwt y C99. Una posible explicación para la falta de actividad de los mutantes de CPZ es la falta de expresión o la mala localización de la proteína en la célula. Para resolver esta cuestión, los mutantes de CPZ se marcan con flag, y se sobre-expresan en células CHO. En las células permeabilizadas, la CPZ de tipo silvestre tiene una membrana de plasma transparente o una localización de vesícula secretora tardía. Este resultado es consistente con los estudios anteriores que examinan la distribución intracelular de CPZ (Novikova, Reznik y colaboradores, 2000). La distribución subcelular permaneció sin cambios para las construcciones de los mutantes de CPZ; ?cat, ?fz, y Glu251 Ala. Estos descubrimientos sugirieron que la actividad catalítica de CPZ no es la localización intracelular, o se requiere el nivel de expresión para la inducción de niveles de Aß en las células CHO. La interrupción de la actividad catalítica de CPZ abolió la producción de Aß sin afectar la expresión o la distribución subcelular. La sobre-expresión de CPZ competiría con el enlace de Wnt a los receptores rizados endógenos, dando como resultado menos activación de catenina-ß (Tesco, Kim y colaboradores, 1998). Se ha asociado una disminución en la actividad de la catenina-ß con una mayor producción de Aß, que se piensa que está mediada por la capacidad de PS1 para aumentar la asociación de la catenina-ß con GSK3ß (Kang, Soriano y colaboradores, 1999) . Es posible que la CPZ pueda inducir la producción de Aß mediante la activación de la disociación de PS1 por medio de la caspasa-3, dando como resultado menos complejos de PS1 /catenina-ß (Tesco, Kim y colaboradores, 1998). Si PS1 no es enlazado por la catenína-ß, entonces puede asociarse más fácilmente con el complejo GACE. Debido a que los dominios rizados se caracterizan como dominios de interacción de proteína, es posible que el dominio rizado de CPZ pueda interactuar con un componente del complejo de secretasa-?, es decir, PS1 , o con la proteína precursora amiloide misma. Estas interacciones se están investigando actualmente. Es interesante que el término-C de CPZ contiene un sitio de disociación de furina supuesto que se piensa que libera CPZ desde la membrana de plasma hacia el espacio extracelular (Novikova, Reznik y colaboradores, 2000). La furina también está involucrada en la liberación del ligando de Muesca delta desde Muesca en la superficie celular (Ikeuchi y Sisodia , 2003). Aunque no se ha confirmado el sitio de furina de CPZ como un sustrato de furina, se ha demostrado que CPZ se puede secretar desde las células (Novikova, Reznik y colaboradores, 2000). Esto sugirió que CPZ podría estar en las mismas sendas de procesamiento que Muesca, pero actualmente no está clara la forma en que la disociación de furina de CPZ está relacionada con la producción de Aß (Kim, Wang y colaboradores, 1999). Sin embargo, la observación de que la sobre-expresión de CPZ, como CyD, puede impulsar las células hacia la apoptosis, indica un mecanismo común para las dos proteínas, que afecta la producción de Aß. Los descubrimientos anteriores (Novikova y Friker, 1999) sugieren que CPZ se expresa en las células leptomeningeales del cerebro de rata, pero no se ha demostrado que CPZ se exprese en las regiones del cerebro que se sabe que son afectadas por la enfermedad de Alzheimer (Novikova y Friker, 1999). Con el fin de determinar en dónde se expresa CPZ, se analizan rebanadas de cerebro de ratón mediante hibridación in situ. En los ratones C7BL-6 de tipo silvestre (Jackson Laboratories), una sonda anti-sentido de CPZ exhibió enlace como una amplia distribución en el cerebro, teniendo el cerebelo y la corteza frontal el nivel más alto de señal. Después de un examen más cercano, también se encuentra que CPZ se expresa en el hipocampo cerca de las regiones CA1 y CA3, más probablemente en las células piramidales. En el cerebelo, CPZ se expresa proximal a la región molecular en el Perkinje y en las capas celulares granulares. La distribución de CPZ en la corteza frontal no pareció estar localizada en un tipo de célula específico, sino que en su lugar, se expresa uniformemente a través de la región . La localización de CPZ en el hipocampo, cerebelo, y corteza frontal de ratón, demuestra su expresión en las regiones del cerebro que se sabe que son afectadas por la enfermedad de Alzheimer en los seres humanos. Caracterización de CyD: Con el fin de probar si estos compuestos de enlace de inmunofilina podrían modular el procesamiento de la proteína precursora amiloide, las células estables HEK/APPswe se tratan con un intervalo de concentraciones de ciclosporina A, Sanglifehrina A, FK506, o concentraciones de N-metil-4-valina-ciclosporina. Para cada concentración, se mide la viabilidad mediante un ensayo de MTS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega Cat. #G5421 ), y se miden las Aß40 y Aß42 secretadas utilizando el ensayo ELISA descrito en la presente. La viabilidad IC50 para todos los compuestos es >40 µM . La IC50 inhibidora para la ciclosporina A, Sanglifehrina A, es de <3 µM para Aß40 y Aß42, indicando una fuerte inhibición de la secreción de Aß. La IC50 para N-metil-4-valina-ciclosporina es < 10 µM para la secreción de Aß40 y Aß42, mientras que FK506 no tuvo efecto alguno sobre la secreción de Aß40. En contraste, el tratamiento con FK506 provoca un aumento dependiente de la dosis en Aß42 de 3 a 20 µM. Se ha demostrado que los inmunosupresores, tales como la ciclosporina A, pueden inhibir la neurodegeneración y la apoptosis en varios modelos animales, e inhiben el daño mitocondrial inducido por Aß en la mitocondria de ratón aislada (Kim 2002) . Debido a que CyD es un objetivo de la ciclosporina A, y se localiza en la mitocondria, podría tener un papel en el procesamiento de Aß en este sitio, sugiriendo que CyD puede ser importante para el desarrollo de enfermedad de Alzheimer en los seres humanos. Aunque no se han probado otras isoformas, CyD podría tener un efecto único sobre el procesamiento de Aß, posiblemente debido a que es la única isoforma de ciclofilina que se sabe que se localiza en la mitocondria. Se encuentra que la sobre-expresión de CyD en las células HEK podría aumentar la actividad de la caspasa-3 y estabilizar los NTFs PS1 , sugiriendo que podría modificar directamente la actividad de PS1 . Adicionalmente, los compuestos que pueden enlazarse e inhibir la actividad de CyD, inhiben fuertemente tanto la secreción de Aß como al disociación de C99. En particular, la Sanglifehrina A inhibe fuertemente la Aß en 3 µM , y no es tóxica para las células hasta 20 µM . Se sabe que la Sanglifehrina A se enlaza con , e inhibe, la actividad de PPIasa de CyD sin afectar la capacidad de CyD para enlazarse con el translocalizador del nucleótido de adenina (ANT), y no inhibe la actividad de la calcineurina como CsA (Samantha J. Clarke, 2002). La escarpada respuesta a la dosis de la Sanglifehrina A podría explicarse de varias maneras. La Sanglifehrina A puede inhibir la abertura del poro solamente cuando se enlace una porción significativa de CyD, suficiente para alterar su actividad en la MPT (Clarke, 2002). Debido a que ANT existe como un dímero, es probable que CyD tenga que enlazar la ANT con más de una molécula para inducir un cambio de conformación. Debido a la Sanglifehrina A tiene que enlazar múltiples moléculas de CyD para inhibir su actividad en el complejo MPT, esto explicaría la rápida inhibición de la secreción de Aß en el umbral de 3 µM . Una vez que se alcanza este umbral, se puede inhibir completamente el complejo MPT, y se puede prevenir la abertura del poro. Este umbral de inhibición de MPT también parece ser un regulador importante del procesamiento y/o la secreción de Aß. De una manera alternativa, la Sanglifehrina A podría tener múltiples objetivos diferentes de, o en adición a, CyD. Todavía no está claro si CyD está regulando el complejo MPT directamente a través de su actividad de PPIasa, o bien mediante un cambio de conformación en MPT. En cualquier caso, los datos presentados aquí y por otros, son consistentes con que CyD y el poro de MPT tienen un papel clave en el procesamiento de Aß. Aunque estos compuestos podrían disminuir dramáticamente la secreción de Aß e inhibir la disociación de C99, también inhibieron la disociación de Muesca. Esto no fue sorprendente, considerando los datos que sugirieron que la sobre-expresión de CyD y CPZ afectaron la actividad de GACE. Estos datos son la primera indicación de que los compuestos de inmunofilina pueden inhibir la actividad de GACE, y definen una nueva senda que puede tener influencia sobre el procesamiento de Aß y Muesca en la célula. Es interesante que el tratamiento con FK506 aumenta dramáticamente la secreción de Aß42 de una forma dependiente de la dosis. Se sabe que FK506 se enlaza con las proteínas de inmunofilina, pero no con CyD. El aumento específico en Aß42 sugiere que las proteínas objetivas de FK506 podrían estar regulando el metabolismo o la producción de Aß42. Tanto FK506 como CsA pueden inhibir la calcineurina, pero tienen efectos diferenciales sobre la secreción de Aß, y por lo tanto, la calcineurina probablemente no está afectando los niveles de Aß. Este efecto único de FK506 apoya adicionalmente que la senda de inmunofilina regula el procesamiento de Aß. Ejemplo 2 Disociación de C99 y Muesca Se genera la línea celular estable HEK293 utilizando una secuencia transmembrana de C99 ó Muesca modificada, con un péptido de señal, la secuencia de retención TGN , y una secuencia de GAL4-NLS-VP 16 insertada en Q56/Y57, como se describe en Maltrese, Wilson y colaboradores, 2001 . Las células también expresan establemente una construcción de reportero de 5xGAL4RE-luciferasa (RD-2002-01437 y RD-2001 -02419). Estas células miden la actividad de GACE cuando se disocia el transgén C99, que activa al reportero de luciferasa Gal4. Estas células estables HEK se tratan con ciclosporina A, Sanglifehrina A, FK 506, ó N-metil-4-valina-ciclosporina, y se determina la IC50 para la disociación de C99. GALVP solo puede ser el control negativo. La IC50 de GALVP para la ciclosporina A, N-metil-valina-ciclosporina, Sanglifehrina A, y FK506, es de 6.9, 9.9, >20, y >20 µM , respectivamente, indicando una clara ventana entre la inhibición de la disociación de C99 y la viabilidad celular, debido a que estos compuestos no son tóxicos sino hasta >40 µM. Sin embargo, la ciclosporina A, la N-metil-4-valina-ciclosporina, y la Sanglifehrina A, inhiben todas la disociación de C99 en 0.71 , 0.87, y 0.85 µM , e inhiben la disociación de Muesca en 1 .7, 2.7, y 3.2 µM, respectivamente. FK506 no tiene efecto alguno sobre la disociación de C99 ó Muesca. Por consiguiente, los ligandos que pueden enlazarse con CyD inhiben fuertemente la disociación de C99 y Muesca, sugiriendo que se está inhibiendo la actividad de GACE. Ejemplo 3 Activación de la Caspasa-3 Los estudios recientes sugieren que la activación de la caspasa-3 puede provocar un aumento en la secreción de Aß, y estabilizar las proteínas en el complejo GACE (Tesco, Koh y colaboradores, 2003). Debido a que CyD y CPZ incrementan ambos la secreción de Aß, y estabilizan los NTFs de PS1 , se analizan los niveles de activación de la caspasa-3 en las células que sobre-expresan CyD y CPZ. Las células HEK293 se transfectan transitoriamente con CyD y CPZ, junto con APPwt durante 24 horas, se permeabilizan con saponina , se fijan , y se sondean con un anticuerpo monoclonal conjugado con FITC para activar la caspasa-3. Las células de control negativo se transfectan con un vector vacío y APPwt, y las células de control positivo se tratan con estaurosporina 1 µM durante 6 horas antes del análisis. En las células que expresan CyD, el 52 por ciento de las células de probaron positivas para la caspasa-3 activa, mientras que en las células que expresan CPZ, el 48 por ciento de las células son positivas para la caspasa-3. Estos resultados indican que la sobre-expresión de estas proteínas induce la activación de la caspasa-3, sugiriendo que éste es un posible mecanismo mediante el cual se estabilizan los NTFs de PS1 , y se aumenta la secreción de Aß.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1 . El uso de una ciclosporina de enlace de ciclofilina no inmunosupresora en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de las condiciones patológicas asociadas con la producción y/o secreción de Aß, tales como Enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, tauopatías, enfermedades de priones, demencia frontotemporal, degeneración estriatonigral, demencia de cuerpo de Lewis, enfermedad de Huntington , enfermedad de Pick, amiloidosis, y otros trastornos neurodegenerativos asociados con una producción excesiva de Aß.

2. Un método para el tratamiento o la prevención de las condiciones patológicas asociadas con la producción y/o secreción de Aß, el cual comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una ciclosporina de enlace de ciclofilina no inmunosupresora.

3. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1 , o un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la ciclosporina de enlace de ciclofilina no inmunosupresora es un compuesto de la Fórmula A: en donde B es un residuo de aminoácido de la Fórmula B: S-Alk-R en donde a denota el enlace con el residuo aAbu en la posición 2 ; b denota el enlace con el residuo C en la posición 4; Alk representa alq uileno de cadena recta o ramificada que contiene de 2 a 6 átomos de carbono, o cicloalquileno q ue contiene de 3 a 6 átomos de carbono, y R representa: un radical de carboxilo o alquiloxi-carbonilo; un radical de - N R T R^ en donde Ri y R2 son iguales o diferentes, y representan hidrógeno, alq uilo, alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, cicloalq uilo de 3 a 6 átomos de carbono , fen ilo (opcionalmente sustituido por halógeno, alcoxilo, alcoxi-carbonilo, amino, alq uil-amino, ó dialquil-amino), o un rad ical de bencilo o de heterociclilo satu rado o insaturado que contiene 5 ó 6 átomos del anillo y de 1 a 3 heteroátomos, o en donde R T y R2 forman , junto con el átomo de n itrógeno con el q ue están un idos, un heterociclo saturado o insaturado q ue contiene de 4 a 6 átomos del anillo, y q ue contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre, y opcionalmente sustituido por alqu ilo, fenilo, o bencilo; u n radical de la Fórmula: en donde Ri y R2 son como se definen anteriormente, R3 representa hidrógeno o un radical de alquilo, y n es un número entero de 2 a 4, y en donde alquilo denota alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de 1 a 4 átomos de carbono; C es MeLeu ó 4-hidroxi-MeLeu; y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

4. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1, o un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la ciclosporina de enlace de ciclofilina no inmunosupresora es un compuesto de la Fórmula I: r- W - X - R - Y - Z - Q - Ala - (D)Ala - MeLeu - MeLeu - MeVal --¡ 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 en donde W es MeBmt, dihidro-MeBmt, u 8'-h¡droxi-MeBmt; X es aAbu, Val, Thr, Nva, u O-metil-treonina (MeOThr); R es Sar ó (D)-MeAla; Y es MeLeu, ?-hidroxi-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Me Tyr, MeTyr(O-PO(OH)2), Mealle ó MeaThr, ó Pro; Z es Val, Leu, N-Alk-Val, ó N-Alk-Leu, en donde Alk represente Me, ó Me sustituido por vinilo opcionalmente sustituido por: fenilo, o un heteroarilo de N, S, u O, que contiene 6 miembros del anillo, o fenilo opcionalmente sustituido por: halógeno; y Q es MeLeu, ?-hidroxi-MeLeu, ó MeAla.

5. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1 , o un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la ciclosporina de enlace de ciclofilina no inmunosupresora es un compuesto seleccionado a partir del grupo que comprende: a) [dihidro-MeBmt]1-[?-hidroxi-MeLeu]4-Ciclosporina, b) [MeVal]4-Ciclosporina, c) [Melle]4-Ciclosporina, d) [MeThr]4-Ciclosporina, e) [?-hidroxi-MeLeu]4-Ciclosporina, f) [Nva] 9 -[?-hidroxi-MeLeu] A -Ciclosporina, g) [?-hidroxi-MeLeu] -[?-hidroxi-MeLeu]6-Ciclosporina, h) [MeVal]5-Ciclosporina, i) [MeOThr]2-[(D)MeAla]3-[MeVal]5-Ciclosporina, j) [8'-h id roxi-MeBmt]1 -Ciclosporina, k) [MeAla]6-Ciclosporina, I) [DMeAla]3-[MeTyr(OPO(OH)2)]4-Ciclosporina, m) [N-bencil-Val]5-Ciclosporina , n) [N-5-fluoro-bencil-Val]5-Ciclosporina, o) [N-Alil-Val]5-Ciclosporina, p) [N-3-fenil-Alil-Val]5-Ciclosporina, q) [Pro] -Ciclosporina. Ciclosporina, o r) [?-hidroxi-MeLeu]9-Ciclosporina.

6. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1 , o un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la ciclosporina de enlace de ciclofilina no inmunosupresora es [MeVal]4-Ciclosporina.