Procedeu de obţinere a plantelor de viţă-de-vie libere de virusul răsucirii frunzelor serotip 1, care include cultivarea in vitro a embrionilor imaturi obţinuţi de la genitori de viţă-de-vie apireni şi combinaţii hibride ale acestora, colectarea ciorchinilor după 30…45 zile de postanteză, pretratarea la temperatura de 4ºC pentru 10…12 zile, sterilizarea bobiţelor cu alcool etilic de 70% pentru 2…3 s, apoi în soluţie de hipoclorit de sodiu de 5,2% timp de 15 min şi clătirea în apă distilată sterilă, excizarea seminţelor imature şi inocularea pe mediul nutritiv Nitsch-Nitsch, suplimentat cu acid indolil acetic 1,5 mg/l, zeatină 1 mg/l, acid giberelic 0,2 mg/l şi cărbune activat 2,5 g/l, cultivarea timp de 30 zile la întuneric la o temperatură de 25±2°C, iar ulterior la aceeaşi temperatură, cu un fotoperiodism de 16 ore lumină, 8 ore întuneric şi iluminare de 2000 lx, la a 10…15-a zi de la primele germinări embrionii viabili se transferă pe un mediu nutritiv, conţinând 1⁄2 de macro- microelemente şi vitamine şi un conţinut integral de hormoni faţă de mediul Murashige-Skoog, suplimentat cu zaharoză 15 g/l, mio-inozitol 100 mg/l, glicină 3mg/l, benzilaminopurină 0,45 mg/l şi agar 6,8 g/l, apoi plantulele formate se transferă pe un mediu nutritiv conţinând 1⁄2 de macro- microelemente şi vitamine faţă de mediul Murashige-Skoog, lipsit de hormoni, după care se efectuează controlul virusologic şi transferul plantulelor libere de virus în substrat de sol şi turbă în raport de 1:3.
Invenţia se referă la biotehnologie şi poate fi utilizată în agricultură pentru obţinerea plantelor de viţă-de-vie libere de virusul răsucirii frunzelor.
Strategia generală de obţinere a materialului liber de infecţie cuprinde metode ale culturii in vitro a meristemelor, aprobate şi aplicate pe larg în eradicarea germenilor virali. Un procedeu inovativ în această direcţie se propune a fi embriogeneza directă, ce are drept model regenerarea plantelor sănătoase din embrioni proveniţi prin încrucişări hibride, autopolenizări sau polenizări libere a genitorilor atacaţi de viroze. În acelaşi timp cultura in vitro a embrionilor imaturi este unica metodă care permite obţinerea formelor noi hibride cu antrenarea genitorilor apireni.
Este cunoscut procedeul de eradicare a virusurilor viţei-de-vie, inclusiv virusul răsucirii frunzelor (serotip 1, grapevine leafroll-associated virus 1 - GLRaV-1), pe calea cultivării in vitro a meristemelor apicale [1].
Însă acest procedeu are şi dezavantaje. În cazul utilizării meristemelor apicale cu dimensiunile de 0,5 mm, mărime a explantului ce asigură o eradicare mai înaltă (95%) a virusului, se induce şi formarea de calus, ceea ce poate genera o variabilitate somaclonală. Prin utilizarea explantelor cu dimensiuni de 1mm se omite iniţierea de calus, însă rata de plantule libere de virus este mai redusă (77,5%).
Problema pe care o rezolvă invenţia constă în sporirea numărului de plante libere de germenii virali ai virusului GLRaV-1 complementar salvării embrionilor imaturi şi recuperării de plantule sănătoase obţinute din combinaţii hibride, autopolenizări sau polenizări libere a formelor cu diferit grad de apirenie.
Esenţa invenţiei constă în aceea că procedeul include cultivarea in vitro a embrionilor imaturi obţinuţi de la genitori de viţă-de-vie apireni şi combinaţii hibride ale acestora, colectarea ciorchinilor după 30…45 zile de postanteză, pretratarea la temperatura de 4ºC pentru 10…12 zile, sterilizarea bobiţelor cu alcool etilic de 70% pentru 2…3 s, apoi în soluţie de hipoclorit de sodiu de 5,2% timp de 15 min şi clătirea în apă distilată sterilă, excizarea seminţelor imature şi inocularea pe mediul nutritiv Nitsch-Nitsch, suplimentat cu acid indolil acetic 1,5 mg/l, zeatină 1 mg/l, acid giberelic 0,2 mg/l şi cărbune activat 2,5 g/l, cultivarea timp de 30 zile la întuneric la o temperatură de 25±2°C, iar ulterior la aceeaşi temperatură, cu un fotoperiodism de 16 ore lumină, 8 ore întuneric şi iluminare de 2000 lx, la a 10…15-a zi de la primele germinări embrionii viabili se transferă pe un mediu nutritiv, conţinând 1⁄2 de macro- microelemente, vitamine şi un conţinut integral de hormoni faţă de mediul Murashige-Skoog, suplimentat cu zaharoză 15 g/l, mio-inozitol 100 mg/l, glicină 3mg/l, benzilaminopurină 0,45 mg/l şi agar 6,8 g/l, apoi plantulele formate se transferă pe un mediu nutritiv conţinând 1⁄2 de macro- microelemente şi vitamine faţă de mediul Murashige-Skoog, lipsit de hormoni, după care se efectuează controlul virusologic şi transferul plantulelor libere de virus în substrat de sol şi turbă în raport de 1:3.
Noutatea invenţiei constă în eradicarea virusurilor, în special a virusului răsucirii frunzelor (serotip 1) al viţei-de-vie, pe calea cultivării in vitro a embrionilor imaturi, rezultaţi din încrucişări hibride, autopolenizări sau polenizări libere a formelor cu diferit grad de apirenie.
Rezultatul invenţiei rezidă în eradicarea GLRaV-1 pe calea salvării embrionilor imaturi prin culturi in vitro şi conversia acestora în plantule, ceea ce asigură soluţionarea concomitentă a două probleme majore asociate producerii materialului iniţial pentru ameliorare la genotipurile de tip stenospermocarpic: recuperarea embrionilor şi obţinerea populaţiilor hibride de plante sănătoase cu diferit grad de apirenie.
Exemplu de realizare a invenţiei
Pentru eradicarea in vitro a virusului GLRaV-1 pe calea embriogenezei zigotice au fost selectate genotipuri de viţă-de-vie de interes ameliorativ aflate în colecţia Institutului Ştiinţifico-Practic de Horticultură şi Tehnologii Alimentare, care au fost stabilite purtătoare de germeni patogeni ai acestui virus. Conform rezultatelor testelor de diagnostic virusologic (contrastare negativă, imunoelectronic şi imunoenzimatic) au fost selectaţi următorii genitori materni: Apiren roz Basarabean, Apiren extratimpuriu, Apiren negru de Grozeşti. În cercetare au fost utilizaţi embrioni imaturi obţinuţi din autopolenizări, polenizări libere, precum şi din combinaţii hibride cu utilizarea acestor forme.
Ţinând cont de obiectivele studiului au fost realizate următoarele scheme de încrucişări:
♀ sănătos x ♂ infectat
♀ infectat x ♂ sănătos
♀ infectat x ♂ infectat
autopolenizări, plantă infectată
polenizări libere, plantă infectată.
Procedeul, conform invenţiei, include cultivarea in vitro a embrionilor imaturi obţinuţi de la genitori de viţă-de-vie apireni şi combinaţii hibride ale acestora, colectarea ciorchinilor după 30…45 zile de postanteză, pretratarea la temperatura de 4ºC pentru 10…12 zile, sterilizarea bobiţelor cu alcool etilic de 70% pentru 2…3 s, apoi în soluţie de hipoclorit de sodiu de 5,2% timp de 15 min şi clătirea în apă distilată sterilă, excizarea seminţelor imature şi inocularea pe mediul nutritiv Nitsch-Nitsch, suplimentat cu acid indolil acetic 1,5 mg/l, zeatină 1 mg/l, acid giberelic 0,2 mg/l şi cărbune activat 2,5 g/l, cultivarea timp de 30 zile la întuneric la o temperatură de 25±2°C, iar ulterior la aceeaşi temperatură, cu un fotoperiodism de 16 ore lumină, 8 ore întuneric şi iluminare de 2000 lx, la a 10…15-a zi de la primele germinări embrionii viabili se transferă pe un mediu nutritiv, conţinând 1⁄2 de macro- microelemente, vitamine şi un conţinut integral de hormoni faţă de mediul Murashige-Skoog, suplimentat cu zaharoză 15 g/l, mio-inozitol 100 mg/l, glicină 3mg/l, benzilaminopurină 0,45 mg/l şi agar 6,8 g/l, apoi plantulele formate se transferă pe un mediu nutritiv conţinând 1⁄2 de macro- microelemente şi vitamine faţă de mediul Murashige-Skoog, lipsit de hormoni, după care se efectuează controlul virusologic şi transferul plantulelor libere de virus în substrat de sol şi turbă în raport de 1:3.
Schema eradicării germenilor virali la viţa-de-vie pe calea embriogenezei zigotice constă din: inocularea seminţelor imature (1), desecarea seminţelor (2), excizarea şi transferul embrionilor viabili pe mediul nutritiv de recuperare (3), obţinerea regeneranţilor (4), subcultivarea regeneranţilor pe mediul de conversie (5), expertiza virusologică a regeneranţilor (6), adaptarea ex vitro şi transferul plantulelor libere de virusuri în substrat de sol (7) (fig. 1).
Pentru identificarea eficienţei procedeului propus de eradicare a virusului GLRaV-1 a fost aplicat paralel procedeul cunoscut de eliminare a germenilor virali pe calea cultivării in vitro a meristemelor apicale cu dimensiunile de 1 mm. În acest scop de la tufele genitorilor materni şi paterni, în perioada creşterii intensive (iunie-iulie), au fost preluaţi lăstări (6…10 cm), care au fost spălaţi în apă curgătoare timp de 10 min. Pentru aseptizare, fragmentele de lăstari au fost plasate pentru 10 s în etanol 70% şi ulterior trecute în soluţie de 1% (v/v) de hipoclorit de sodiu (20% Clorox) cu două picături de 0,1% Tween 20, apoi clătite în 3 băi de apă sterilă, a câte 5 minute fiecare, pentru înlăturarea totală a clorului. Toate operaţiunile de sterilizare a lăstarilor, precum şi excizarea apexurilor cu mărimea de 1mm şi inocularea lor pe medii de cultură s-au desfăşurat în condiţii aseptice, în interiorul hotei cu flux laminar de aer steril. Vitrocultura a fost iniţiată în eprubete, conţinând câte 2 ml de mediu nutritiv Murashige & Skoog (1962) suplimentat cu 6-benzilaminopurină (5 µM), acid naftalenacetic (0,5 µM), 3% zaharoză şi 0,8% agar. Valoarea pH-ului mediului nutritiv a fost ajustată înainte de autoclavare la 5,7. Pentru inducerea regenerării eprubetele au fost incubate în condiţii controlate cu un fotoperiodism de 16 ore-lumină, temperatura de 25±2°C şi iluminare de 2000 lx.
La 25…35 zile de la inoculare s-a atestat proliferarea şi dezvoltarea regeneranţilor, care ulterior au fost transferaţi pe medii nutritive pentru multiplicare în vase Magenta ce conţineau 10…12 ml mediu. Plantulele cu 3…4 internoduri rezultate din fiecare ciclu de subcultivare au fost transferate pe mediul pentru rizogeneză Murashige & Skoog (1962) suplimentat cu acid indolilbutiric (0,2 µM). La 6…7 zile după pasaj pe acest substrat regeneranţii care prezentau un sistem radicular cu perişori absorbanţi bine dezvoltaţi au fost transferaţi în vase de plastic de 500 ml cu amestec de sol:turbă (1:3). Vasele cu regeneranţi au fost acoperite cu peliculă de polietilenă şi transferate în camera de cultivare la 25±2°C şi cu un fotoperiodism de 16 ore-lumină.
Meristemele celor 3 genotipuri de viţă-de-vie analizate au prezentat un potenţial înalt de răspuns la condiţiile in vitro de cultivare (tab.). În pofida cotei înalte a explantelor cu răspuns pozitiv şi eficienţei de inducere a regeneranţilor, numărul plantulelor stabilite libere de germeni virali a fost destul de redus, variind între 39,1% pentru Apiren extratimpuriu şi 68,4% pentru Apiren roz Basarabean. Totodată, s-a constatat că toţi cei 23 de regeneranţi derivaţi de la Apiren negru de Grozeşti s-au dovedit a fi purtători ai serotipului 1 al virusului GLRaV. Nereuşita eradicării virale la genotipul dat poate fi cauzată atât de particularităţile soiului, cât şi de starea fitosanitară gravă stabilită la plantele donatoare de explant (infecţii mixte).
Tabel. Rata de regenerare şi cota de eradicare a GLRaV-1 prin culturi in vitro a meristemelor şi embrionilor imaturi de viţă-de-vie
Nr Genotip Numărul de explante inoculate Numărul de explante cu răspuns pozitiv Numărul de regeneranţi obţinuţi Numărul de plante libere de virus Cota de plante libere de virus, % Cultura in vitro a meristemelor 1 Apiren roz Basarabean 32 28 19 13 68,42 2 Apiren negru de Grozesti 44 38 23 - - 3 Apiren extratimpuriu 47 46 23 9 39,13 Total 123 112 65 22 35,85 Cultura in vitro a embrionilor imaturi Genotpul formei materne Numărul de embrioni inoculaţi Numărul de embrioni viabili Numărul de regeneranţi obţinuţi Numărul de plante libere de virus Cota de plante libere de virus 1 Apiren roz Basarabean 688 162 181 181 100 2 Apiren negru de Grozeşti 1054 83 12 10 83,33 3 Apiren extratimpuriu 152 77 83 83 100 Total 1894 322 276 274 94,44
Conform algoritmului invenţiei propuse au fost inoculaţi 1894 de embrioni imaturi pe mediul de recuperare Nitsch-Nitsch (1969). La momentul desecării s-a determinat că cota embrionilor viabili a variat de la 7,9% (Apiren negru de Grozeşti) până la 50,7% (Apiren extratimpuriu) în funcţie de genotip şi starea lor fitosanitară. Gradul înalt de infectare a genotipului Apiren negru de Grozeşti cu agenţi virali ai complexului degenerativ (în special infecţii mixte) a contribuit la diminuarea viabilităţii embrionilor.
S-a stabilit că reacţia embrionilor imaturi la cultivarea in vitro este determinată în mare măsură de genotip, de aceea reuşita procedeului de convertire a embrionilor în plantule este direct dependentă de particularităţile genotipurilor antrenate. O altă trăsătură specifică atribuită genotipului este poliembrionia, fapt ce a dus la creşterea numărului de regeneranţi comparativ cu numărul de embrioni viabili cultivaţi (de exemplu la soiurile Apiren extratimpuriu şi Apiren roz Basarabean). Asemenea plantule reprezintă clone, iar inducerea lor sporeşte cota de recuperare şi conversie în plantule.
Plantulele recuperate după aspect nu prezentau simptome vizuale specifice virozelor. De asemenea prin metode de diagnostic virusologic a fost confirmată lipsa agenţilor virali. Eficienţa eradicării virusului GLRaV-1 a fost identificată prin tehnica imunoenzimatică DAS-ELISA: A - aplicarea probelor biologice, B şi C - rezultatul reacţiei cromatice de identificare a germenilor GLRV-1 în regeneranţii obţinuţi prin cultura de meristeme (B) şi a embrionilor imaturi (C) (fig.2).
A fost stabilită influenţa stării fitosanitare şi particularităţilor combinaţiei hibride de viţă-de- vie asupra eficienţei procedeului de salvare, recuperare şi conversie a embrionilor imaturi în plantule. Infectarea formelor parentale cu serotipul 1 al GLRaV influenţează mai puţin viabilitatea embrionilor.
Conform rezultatelor obţinute, procedeul propus conform invenţiei permite eradicarea germenilor virali chiar şi în cazul unor infecţii duble sau triple, fapt constatat la genotipul Apiren negru de Grozeşti.
Expertiza virusologică în baza testului DAS-ELISA a dovedit că salvarea embrionilor imaturi prin culturi in vitro şi conversia acestora în plantule constituie un procedeu eficient ce asigură eradicarea GLRaV-1. Totodată procedeul propus permite soluţionarea concomitentă a două probleme majore asociate producerii materialului iniţial pentru ameliorare la genotipurile de tip stenospermocarpic: recuperarea embrionilor şi obţinerea populaţiilor hibride de plante sănătoase cu diferit grad de apirenie.
Plantele clone, stabilite sănătoase, urmează a fi multiplicate, pentru crearea plantelor-mamă sănătoase, precum şi a formelor hibride de interes ameliorativ.