RO127796B1 - Procedeu de obţinere a unui material săditor liber de virusul pnrsv prin culturi in vitro la soiul de vişin schattenmorelle - Google Patents
Procedeu de obţinere a unui material săditor liber de virusul pnrsv prin culturi in vitro la soiul de vişin schattenmorelle Download PDFInfo
- Publication number
- RO127796B1 RO127796B1 ROA201101152A RO201101152A RO127796B1 RO 127796 B1 RO127796 B1 RO 127796B1 RO A201101152 A ROA201101152 A RO A201101152A RO 201101152 A RO201101152 A RO 201101152A RO 127796 B1 RO127796 B1 RO 127796B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- concentration
- stock solution
- virus
- culture medium
- pnrsv
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 14
- 235000005805 Prunus cerasus Nutrition 0.000 title abstract description 4
- 244000207449 Prunus puddum Species 0.000 title abstract description 4
- 235000009226 Prunus puddum Nutrition 0.000 title abstract description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims abstract description 21
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims abstract description 9
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims abstract description 9
- VYPKFHFVKFKHMK-UHFFFAOYSA-N 2-(1h-indol-2-yl)butanoic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(C(C(O)=O)CC)=CC2=C1 VYPKFHFVKFKHMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000005982 Indolylbutyric acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000005980 Gibberellic acid Substances 0.000 claims abstract description 5
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 241001522976 Prunus necrotic ringspot virus Species 0.000 claims description 18
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 39
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 7
- 238000000015 thermotherapy Methods 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001290151 Prunus avium subsp. avium Species 0.000 description 4
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 4
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 1
- ZKQDCIXGCQPQNV-UHFFFAOYSA-N Calcium hypochlorite Chemical compound [Ca+2].Cl[O-].Cl[O-] ZKQDCIXGCQPQNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 1
- 235000008534 Capsicum annuum var annuum Nutrition 0.000 description 1
- 235000007862 Capsicum baccatum Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000254137 Cicadidae Species 0.000 description 1
- 241000132536 Cirsium Species 0.000 description 1
- 240000000560 Citrus x paradisi Species 0.000 description 1
- 238000010159 Duncan test Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 241000208134 Nicotiana rustica Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241000133276 Osteospermum Species 0.000 description 1
- 241000208181 Pelargonium Species 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 241000723784 Plum pox virus Species 0.000 description 1
- 241001467043 Prune dwarf virus Species 0.000 description 1
- 244000007021 Prunus avium Species 0.000 description 1
- 235000010401 Prunus avium Nutrition 0.000 description 1
- 244000141353 Prunus domestica Species 0.000 description 1
- 235000014441 Prunus serotina Nutrition 0.000 description 1
- 241001412173 Rubus canescens Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000723681 Tomato ringspot virus Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001728 capsicum frutescens Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021953 cytokinesis Effects 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000006180 nutrition needs Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000014599 transmission of virus Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- -1 which Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
Invenția se referă la un procedeu de obținere a unui material săditor liber de virusul Prunus Necrotic Ring Spot Virus, prin oprimizarea mediului de cultură in vitro la soiul de vișin Schattenmoreile, destinat a fi utilizat la producerea materialului săditor.
Este cunoscut faptul că producerea de fructe de calitate superioară se realizează cu mare dificultate, în principal, datorită impactului economic deosebit pe care îl au unii patogeni virali. Virusurile care infectează culturile perene, cum este și cazul speciilor pomicole, produc adesea pierderi care sunt în creștere progresivă. Astfel de boli cronice pot avea consecințe foarte serioase, ca drept urmare a pierderilor de timp, bani și nu în ultimul rând blocarea terenului cu o cultură care merge în pierdere, datorită impactului negativ produs de virusuri. Pe lângă rezultatele economice scăzute, datorate producțiilor slabe calitativ și cantitativ, se pot adăuga și costurile efectuate cu o nouă cultură care să o înlocuiască pe cea bolnavă. Cercetări efectuate până în prezent de Ramsdelși colaboratorii, 1992, Effectsof Tornado ring spot virus and Prunus necrotic ring spot aione and in combination on the grows andyeld of Motmorency sour cherry. Acta Horticulturae, 309,111-113, indică faptul că se poate ajunge la pierderi ale producției de până la 54,5% în cazul infecției cu Prunus Necrotic Ring Spot Virus (PNRSV), asociat cu Tomato Ringspot Virus la soiul de vișin Motmorency.
Măsurile de control aplicate bolilor virale vizează o serie de proceduri, printre care:
- tratamentele fitosanitare care să împiedice transmiterea virusurilor cu ajutorul vectorilor (afide, cicade, nematozi etc.);
- ameliorarea rezistenței genetice este de asemenea un obiectiv care este prezent în toate programele de ameliorare și prevede crearea de soiuri rezistente. Importanța unui astfel de obiectiv este mare și finalizarea lui se materializează prin implicații economice și ecologice cu impact extraordinar asupra vieții oamenilor, dar este un proces lung și anevoios;
- transformarea genetică în scopul obținerii de soiuri rezistente, care însă este o procedură controversată în special în Europa și ca urmare utilizarea în scop comercial este în prezent nesigură, în cazul speciilor pomicole, cercetările în această direcție sunt abia la început.
Ca o concluzie la cele enumerate mai sus, lupta împotriva virozelor plantelor pomicole este eficientă atunci când se bazează mai ales pe măsuri preventive, profilactice, care au drept scop să împiedice extinderea infecției și să reducă la minimum pierderile provocate de viroze. O soluție o reprezintă producerea materialului săditor liber de virusuri, care se materializează apoi prin înființarea de plantații sănătoase. Acest lucru însă nu este realizabil cu ușurință, datorită faptului că foarte multe virusuri se transmit prin înmulțirea vegetativă sau prin semințe și polen.
în scopul eliminării acestui neajuns, calea care poate să înlăture riscul transmiterii virozelor este utilizarea culturilor de țesuturi. Condusă în funcție de anumiți parametri specifici, cultura in vitro poate să asigure producerea de plante sănătoase. Esențială este însă optimizarea factorilor care influențează acest lucru. Principalii factori de influență sunt reprezentați de genotip, virus, mediul de cultură și tipul de explant. Atât genotipul (soiul), cât și virusul, reprezintă însă factori asupra cărora nu se poate interveni, cele două componente ale „ecuației reprezentând compoziția genetică a unui organism, iar intervenția asupra lor ar face obiectul unor altor preocupări (transformarea genetică). Componentele asupra cărora se poate interveni sunt reprezentate de tipul de explant și mediul de cultură (macroelemente, microelemente, vitamine, balanță hormonală etc.).
în cadrul balanței hormonale, citochinineie au un rol determinant chiar prin modul lor de acțiune: au rol în organogeneza directă în procesele de regenerare adventivă a lăstarilor și creșterea acestora, realizând astfel și creșterea ratei de multiplicare.
RO 127796 Β1
Datorită diviziunii intense a celulelor în meristem, există o competiție între aceasta 1 și particula virală pentru folosirea acizilor nucleici sintetizați. Acizii nucleici se pare că sunt puși la dispoziția diviziunii celulare în detrimentul multiplicării virale. Astfel ritmul diviziunii 3 celulare în meristem este mult mai mare, decât ritmul replicării virusului. Meristemul excizat suferă un traumatism puternic, cu atât mai puternic cu cât el este de dimensiuni mai mici. 5 Acest lucru a fost remarcat de Walkey și colaboratorii la cireș, 1969,The inactivation of virus in cultured shoots tips of Nicotiana rustica, J. Gen. Virol. 5,237-241. Alte explicații 7 precizează că, datorită concentrației ridicate de auxine și citochinîne din apexurile meristematice, penetrarea particulelor virale în celule este oprită sau chiar are loc inactivarea 9 acestora (Quak, 1977, Meristem culture and libere de virus plants. In: J. Reinert and Y.P.S. Bajaj (eds.). Applied and fundamental aspects of plant cells, tissue, and organ 11 culture. Springer, Berlin, pp. 598-615). Cele enumerate mai sus vin să întărească faptul că nu poate exista o tehnologie standard pentru toate soiurile și toate virusurile, însă 13 tehnologia de eliberare a unui soi față de un virus poate fi realizată prin intermediul mărimii explantului și al mediului de cultură. 15 în literatura de brevete, se regăsesc date atât despre cultura in vitro - cultura de țesuturi, cât și aspecte de obținere a plantelor libere de virus. 17
Brevetul de invenție US 5731201 prezintă o metodă de producere de portaltoi libere de virus la hamei prin utilizarea unui mediu de cultură cu un conținut crescut de zaharuri. 19
Brevetul de invenție US 5906941 se referă ia o invenție cu aplicație în culturile de țesuturi, unde utilizarea unor nutrienți duce la îmbunătățirea rezultatelor în ceea ce privește 21 embriogeneza somatică, reducerea vitrifierii și îmbunătățirea procesului de aclimatizare prin scurtarea timpului necesar acestui proces și ridicând rata de supraviețuire a plantelor în 23 timpul aclimatizării.
în brevetul de invenție US 6265217 este prezentată o metodă pentru producerea in 25 vitro a microbulbilor de usturoi (Allium sativum).
în brevetul de invenție US 7964405 B2, se face descrierea unei metode de cultivare 27 a plantelor, cu referire la producerea de plante tinere și/sau a unui ministoc de plante mamă la plante ornamentale ierbacee printre care: Petunia, Osteospermum, Pelargonium. 29
Brevetul de invenție EP0938840A1 prezintă o metodă pentru producerea materialului săditor liber de virus de ardei roșu cu ajutorul interferonului uman față de virusul mozaicului 31 tutunului.
De asemenea, la nivel internațional, au fost efectuate diverse studii pentru obținerea 33 de plante libere de virus, prin culturi de țesuturi și alte metode. Astfel au fost obținute unele rezultate la soiurile de cireș Noire de Meched, infectat cu Apple Ghlorotic Leafspot Virus; 35 Vittoria, infectat cu PNRSV, Van 2D, infectat cu complexul PNRSV și Prune Dwarf Virus (Deogratias și colaboratorii, 1989, Eradication of prune dwarf virus, primus necrotic 37 ring spotvirus and apple chhrotic leaf spot virus in tissue cultured sweet cherry, Canadian Journal of Plant Pathology, 11: 332-336) 39
Eliberarea de infecția cu PNRSV a fost studiată și la soiurile de vișin llva și Nana (Isac M. și colaboratorii, 2005, Utilizarea metodei DAS-ELISA și a culturii in vitro în 41 diagnosticarea și devirusarea materialului biologic pomicol, pag. 1271 -1276. Lucr. șt. lași. 43
Tot că urmare a specificității modului de reacție a complexului soi-virus, au fost făcute încercări prin diferite metode care să ducă la devirusarea materialului infectat. La prun, 45 eliminarea virusului PNRSV din materialul infectat a fost studiată și prin utilizarea termoterapiei in vitro la soiul Earliblue (Dziedzic, 2008, Elimination of Prunus necrotic ring spot 47
RO 127796 Β1 virus (PNRSV) from plum 'Earliblue' shoots through thermotherapy in vitro. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research., Voi. 16:101 -109, sau termoterapia asociată cu chimioterapia in vitro la soiurile Empress și Early Rivers (Cieslinska, 2007, Application of thermo-and chemotherapy in vitro for eliminating some viruses infecting Primus sp. fruit trees, Journal of Fruit and Ornamental Plant Research., Voi. 15: 117-124).
Rezultate au fost obținute și în producerea plantelor libere de virus de căpșun (Biswas și colaboratorii, 2007, World Journal of Agricultural Sciences 3(6): 757-763. ISSN 1817- 3047).
Toate aceste soluții prezente în literatură au însă caracteristici care pot reprezenta dezavantaje în anumite situații:
- nu au aplicare universală, ci se referă la alte specii de plante sau genotipuri;
- soluțiile respective vizează alte virusuri;
- unele sunt foarte costisitoare, de exemplu, cea în care se utilizează interferonul;
- se referă la utilizarea culturilor de țesuturi în alte scopuri și nu numai acela de obținere a plantelor libere de virus.
Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă în realizarea unui procedeu pentru obținerea materialului săditor de vișin liber de virusul PNRSV prin culturi in vitro, la soiul Schattenmorelle, în mai multe faze și etape, având ca efect creșterea calității din punct de vedere fitosanitar a materialului biologic.
Astfel, procedeul pentru obținerea materialului săditor liber de virusul Prunus Necrotic Ring Spot Virus prin culturi in vitro la soiul de vișin Schattenmorelle se desfășoară în trei faze: I. Faza de diferențiere, pentru derularea căreia sunt necesare etapele:
a) - pregătirea mediului de cultură pentru inițiere;
b) - pregătirea materialului biologic;
c) - inocularea explantelor în condiții aseptice;
d) - diferențierea materialului biologic inoculat.
lî. Faza de multiplicare, care comportă următoarele etape:
a) pregătirea mediului de cultură pentru multiplicare și transferul lăstarilor obținuți în urma diferențierii pe mediul de multiplicare;
b) multiplicare cultură primară;
c) pregătirea mediului de cultură pentru multiplicare și transferul lăstarilor obținuți în cultura primară pe mediul de multiplicare;
d) multiplicare subcultura 1;
e) pregătirea mediului de cultură pentru multiplicare și transferul lăstarilor obținuți în subcultura 1, pe mediul de multiplicare;
f) multiplicare subcultura 2;
g) pregătirea mediului de cultură pentru multiplicare și transferul lăstarilor obținuți în subcultura 2, pe mediul de multiplicare;
h) multiplicare subcultura 3.
III. Faza de înrădăcinare, pentru derularea căreia sunt necesare etapele;
a) pregătirea mediului de cultură pentru înrădăcinare și transferul lăstarilor de pe mediul de multiplicare pe mediul de înrădăcinare;
b) înrădăcinarea, precedată de retestarea virală și aclimatizarea plantelor sănătoase. Invenția de față înlătură dezavantajele prezentate în literatura amintită și prin aceea că nu este necesară aplicarea culturilor in vitro în același timp cu alte proceduri, ca termoterapie, chimioterapie, în cazul de față, soluția optimă fiind reprezentată de mărimea explantului în corelație cu condițiile de cultură, la genotipul de vișin luat în studiu, respectiv, Schattenmorelle.
RO 127796 Β1
Avantajele invenției sunt următoarele: 1
- permite obținerea de plante libere de virus la un soi cu cerința mare pe piața internațională a cărui producere este limitată de efectul virozelor; 3
- pe lângă scopul în sine, obținerea de material săditor liber de virusuri se realizează și o sporire a cantității de material prin multiplicarea acestuia în cultură in vitro, pornind de 5 la zeci de plante în etapa de multiplicare, la finele subculturilor 3-4, se pot obține zeci de mii de plante; 7
- nu sunt implicate proceduri care să prezinte risc de poluare;
- costurile sunt mai reduse decât în cazul aplicării mai multor tehnici în același timp: 9 cultură in vitro asociată cu chimioterapie sau cultură in vitro asociata cu termoterapie etc.
în continuare, se dă un exemplu de realizare în legătură cu figura, în care este 11 reprezentat algoritmul de lucru al procedeului conform invenției, fiind reliefate cele trei faze de bază: diferențierea sau inițierea, multiplicarea și înrădăcinarea, fiecare dintre aceste faze 13 fiind explicitate prin etape, care comportă importante particularități tehnice.
Procedeul pentru obținerea materialului săditor liber de virusul PNRSV prin culturi in 15 vitro la soiul de vișin Schăttenmorelle se bazează pe metoda de înmulțire a plantelor in vitro, procedeu în urma căruia, prin utilizarea unui substrat de cultură cu componente în con- 17 centrații optimizate și a materialului biologic (explantul) la dimensiuni de asemenea optimizate, numărul de plante obținut este într-un anumit procent și liber de virus. Pentru obținerea 19 plantelor libere de virus, procedeul începe în faza de diferențiere, numită și inițiere.
Mediul deculturâ necesarfazei de diferențiere este cunoscutul mediu(Murashige&Skoog, 21
1962- A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant 15:473-497), obținut prin combinarea anumitor cantități din soluțiile stoc, după 23 cum urmează: 80-100 ml/t din soluția stoc de macroelemente cu concentrația 10Χ, 8-12 ml/l din soluția stocde microelemente cu concentrația de 100X, 8-12 ml/l din soluția stoc de vitamine 25 cu concentrația de 100X.
Pentru inițierea culturilor, în componența balanței hormonale este utilizată giberelina 27 GAS (acid giberelic) în cantități de 0,05...0,2 mg/l; în asociere cu auxina IBA (acid indolil butiric) în cantități de 0,01 ...0,03 mg/l, și în asociere cu citochinina BAP (6-benzilaminopurina) 29 în cantități de 0,1 ...0,5 mg/l. Pentru ca fierul să fie accesibil plantelor, administrarea în mediul de cultură se face sub forma de chelatde fier Na2FeEDTA, în cantitate de 32 mg/l. Drept sursă 31 de carbon organic, este folosită zaharoza, 20.. .30 g/l, iar pentru sol idi fi care, este folosit agar,
6.. .8 g/l. Mediul astfel obținut este distribuit în eprubete în vederea sterilizării, care se face 33 în autoclavă la o presiune de 1,2 atm timp de 20 min.
Materialul biologic este recoltat în perioada februarie-martie și este reprezentat de 35 ramuri cu vârsta de un an, de la plantele depistate pozitiv în urma testului DAS-ELISA (Clark și Adams, 1977, Characteristicsofthemicroplatemethodofenzyme-linkedimmunosorbent 37 assayforthe detection of plant viruses, J, Gen. Virol., 34:475-483), utilizând un kit PNRSV și/sau TAS- ELISA (Cambra și colaboratorii, 1994, Detection ofplumpoxpotyvirus using 39 monoclonal antibodiesto structural and non-structuralproteins, EPPOBull. 24,569-577). Explantele cu care se înființează culturile in vitro sunt obținute din mugurii acestor ramuri din 41 care se extrage, la binocular, țesutul meristematic. Dezinfecția materialului biologic se face prin spălarea mugurilorîn apă cu detergent lichid 3:1, urmată de imersie în alcool etilic 96 vol%, 43 timp de 10...15 min; imersie în hipoclorit de calciu cu o concentrație de 6 % (w/v) timp de
15.. .20 min, 3 spălări a câte 2.. .3 min fiecare, în apă bidistilată și sterilă. 45
Prelevarea explantelor se efectuează în spațiu aseptic, sub hota cu flux de aer laminar. Instrumentarul, reprezentat de pensete, anse, bisturie, este sterilizat în timpul 47 lucrului prin flambare. Mărimea explantelor este cuprinsă între 0,1 și 1 mm. Explantele se pun în eprubetă, după care sunt trecute în scop de diferențiere în camera de creștere. 49
RO 127796 Β1
Diferențierea, numită și inițierea sau regenerarea explantelor, se derulează în condiții controlate, și anume; expunere 16 h la lumină cu o intensitate luminoasă de 2.500.. .3.000 lucși și 8 întuneric, la temperatură de 21...23° C. Timpul necesar regenerării explantelor pentru a putea fi trecute în faza de multiplicare este de 28...32 zile.
Ca urmare a condițiilor descrise mai sus, respectiv, mărime explant, mediu de cultură, balanță hormonală, factori de mediu, capacitatea de regenerare a materialului biologic în faza de diferențiere este influențată de mărimea explantului. Explantele cu mărimi de 0,1...0,2 mm, asigură o capacitate regenerativă de 44% a explantelor față de 70% explante regenerate la dimensiunea explantului de 0,4...0,5 mm și 80% explante regenerate în cazul explantelor de 1 mm, așa cum este ilustrat în graficul de mai jos.
Graficul 1
Test Duncan (P<0,05)
După perioada de diferențiere, lăstarii astfel obținuți sunt transferați, în aceleași condiții de asepsie, din camera sterilă, pe mediul de cultură specific celei de-a doua faze de cultură in vitro, respectiv, faza de multiplicare.
La mediul de bază Murashige&Skoog, conținând 80...110 ml/l din soluția stoc de macroelemente cu concentrația 10X, 8...12 ml/l din soluția stoc de microelemente cu concentrația de 1Ό0Χ, 8...12 ml/l din soluția stoc de vitamine cu concentrația de 1Ό0Χ, este adăugată balanța hormonală reprezentată de 0,8... 1,2 mg/l BAP și auxină 0,1.. .0,3 mg/l ANA (acid alfa naftil acetic).
Vasele de cultură utilizate au capacitatea de 150 ml, cu un conținut de mediu de cultură de aproximativ 20 ml. în fiecare vas, sunt transferate câte 5 plante. Ca urmare a corelării acțiunii citochininelor cu cantitatea de auxine și cu proporțiile de macroelemente, microelemente și vitamine din mediului de cultură Murashige&Skoog în condiții de mediu reprezentate de expunere 16 la lumină cu o intensitate luminoasă de 2.500...3.000 lucși și 8 întuneric la temperatură de 21. ..24°C, se obțin creșteri însemnate ale numărului de lăstari adventivi. După o perioadă de 4...6 săptămâni, asigurarea necesarului nutrițional de către mediul de cultură devine critică, datorită consumului componentelor mediului de cultură, în scopul apariției de muguri adventivi din care se dezvoltă apoi lăstari. După o perioadă de
4...6 săptămâni, lăstarii obținuți se separă între ei și sunt transferați pe un mediu de cultură proaspăt, realizat după aceeași rețetă, ca la cultura primară de multiplicare.
Repetarea subculturilor poate fi eficientă până la subcultura 3 inclusiv, după care se înregistrează o scădere a ratei de multiplicare. în tabelul de mai jos, este prezentată evoluția ratei de multiplicare pe parcursul culturii primare și a încă trei subculturi.
RO 127796 Β1
Tabel
| SUBCULTURA | RATA DE MULTIPLICARE |
| Cultura primară | 1:3 |
| Subcultura 1 | 1:5 |
| Subcultura 2 | 1:6 |
| Subcultura 3 | 1:6 |
| Subcultura 4 | 1:5 |
în subcultura 1, numărul de lăstari adventîvi crește față de cultura primară, de la 3 9 lăstari adventîvi pe lăstarul inițial, la 5 lăstari adventivi pe lăstarul inițial, în subcultura 1 și la 6 lăstari adventivi, în subculturile 2 și 3. în subcultura 4, se constată deja o scădere a 11 randamentului la multiplicare. Lăstarii obținuți sunttrecuți în continuare la înrădăcinare.
Ca urmare a procedeului descris mai sus, se obțin creșteri substanțiale în ceea ce 13 privește numărul de lăstari, care vor fi trecuți la înrădăcinare.
în faza de înrădăcinare, componenta mediului de cultură este identică cu cea de la 15 fazele precedente. Vasele de cultură au o capacitate de 780 ml, cu un conținut de mediu de cultură de 80...100 ml. în fiecare vas, sunt puse un număr de 10 plante. Transferul plantelor 17 se realizează în condiții de asepsie la hota cu flux de aer laminar. Vasele cu culturi sunt trecute în scop de înrădăcinare în camera de creștere, unde li se asigură condiții de mediu 19 ca la fazele precedente.
Rizogeneza lăstarilor obținuți în faza de multiplicare a fost evaluată în funcție de 21 componentele mediilor de cultură și balanța hormonală.
Mediul de cultură este reprezentat de componentele Murashige&Skoog, în următoa- 23 rele cantități: 40...60 ml/l din soluția stoc de macroelemente cu concentrația 10X, 4...6 ml/l din soluția stoc de microelemente cu concentrația de 100X, 8...12 ml/l din soluția stoc de 25 vitamine cu concentrația de 100X și balanța hormonală 0,1...0,3 mg/l GA3 în asociere cu 0,5...1,5 mg/l IBA. 27
Succesul procedeului este măsurat prin randamentul de plante libere de virus obținute, Procentul de plante libere de virus este determinat în urma retestării virotice prin meto- 29 de serologice DAS-ELISA (Clark și Adams, 1977, Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses, J. 31 Gen. Virol., 34:475-483) și/sau TAS-ELISA (Cambra și colaboratorii, 1994, Detection of plum pox potyvirus using monocional antibodies to structural and non-structural 33 proteins, EPPO Bull. 24,569-577), utilizând un kit PNRSV.
în urma testării virotice, poate fi apreciat răspunsul materialului biologic în ceea ce 35 privește eliberarea de virus în condițiile prezentate în graficul 2.
Se constată că explantele cu dimensiunea de 1 mm au avut un randament foarte 37 scăzut, de 25%, în ceea ce privește numărul de plante libere de virus. Din explantele cu dimensiunea de 0,4...0,5 mm, la sfârșitul fazei de înrădăcinare, sunt libere de virus un 39 procent de 50% din plante. Explantele cu dimensiuni de 0,1...0,2 mm, deși în faza de diferențiere au arătat că nu au avut o capacitate regenerativă bună, în schimbau înregistrat cel mai 41 mare procent de plante libere de virus, 80%.
RO 127796 Β1
Grafi cui 2 x v WArK.<M 4* 4-N**#$(> ***- <
<: ,9<n<>xm> ik 'X&Xixe-;> fxftaxotbN
i r wîx ¢4 <\dA W *<** >XXV «Nv. M. 4 Ά 'Φ.-ν ' S<\
T estDuncan(P<O,05)
Materialul libere de virus a fost trecute ulterior în seră, pe un substrat de perlit pentru aclimatizare. Condițiile asigurate pe perioada aclimatizării au constat în asigurarea umidității și a nutriției prin aplicarea de diferiți fertilizanți foliari pentru plante, recomandată fiind soluția KNOP (KNO3, KH2PO4, Ca(N03)2MgSO4).
Procedeul conform invenției a fost orientat asupra soiului de vișin Schattenmorelle, deoarece este un soi de bază în Europa, cu cerere foarte mare pe piața de fructe, alături și de alte clone provenite din acest soi. Producțiile sigure sunt însă limitate, deoarece în caz de infecție cu PNRSV, după Keglerși colaboratorii, 1972, Effect of virase son the yield andgrowth of the sour cherry variety Schattenmorelle, Arch. Gartenbau, 20:479-487, pierderile la soiul Schattenmorelle sunt foarte mari, putând ajunge până la 76...93%.
Acest soi de vișin are o bună pretabilitate la cultura in vitro, de unde derivă avantajele specifice acestui tip de cultură:
- asigură multiplicarea clonală rapidă, pornind de la cantități mici de material vegetal;
- necesită spații mici de cultură, valorificând astfel bine spațiul din camera de creștere;
- se evită efectul sezonier din pepinieristică;
- asigură conservarea materialului obținut în faza de plantulă până la primirea unor comenzi de multiplicare.
în urma aplicării procedeului, s-a ajuns la concluzia că nu au existat diferențe în evoluția materialului biologic cu care s-au înființat culturile in vitro de la soiul Schattenmorelle infectat cu PNRSV față de martor, care a fost reprezentat de material biologic sănătos de la soiul Schatenmorelle.
Claims (2)
- Revendicări1. Procedeu de obți nere a unui material saditor liber de virusul PNRSV prin optimizarea3 mediului de cultură in vitro la soiul de vișin Schattenmorelte, caracterizat prin aceea că, în faza de diferențiere, mediul de cultură este constituit pe baza componentelor Murashige&Skoog,5 în următoarele cantități: 80...110 ml/l din soluția stoc de macroelemente cu concentrația 10X, 8.12 ml/l din soluția stoc de microelementecu concentrația de 100X, 8.. .12 ml/l din soluția7 stoc de vitamine cu concentrația de 100X și o balanță hormonală reprezentată din 0,05...0,2 mg/l acid giberelic 0,01...0,03 mg/l acid indolil butiric și 0,1...0,5 mg/l 6-benzilaminopurina; 9- în faza de multiplicare, mediul de cultură este constituit pe baza componentelor Murashige&Skoog, în următoarele cantități: 80...110 ml/l din soluția stoc de macroelemente 11 cu concentrația 10X, 8..,12 ml/l din soluția stoc de microelemente cu concentrația de100X, 8... 12 ml/l din soluția stoc de vitamine cu concentrația de 100X și o balanță hormonală 13 reprezentată din 0,5...1,5 mg/i 6-benzilaminopurina și 0,1...0,5 mg/l acid alfa naftil acetic, repetat pe parcursul a trei subculturi; 15- în faza de înrădăcinare, mediul de cultură este constituit pe baza componentelor Murashige&Skoog, în următoarele cantități: 40...60 ml/l din soluția stoc de macroelemente 17 cu concentrația 10X, 4...6 ml/l din soluția stoc de microelemente cu concentrația de 100X, 8... 12 ml/l din soluția stoc de vitamine cu concentrația de 10OX și o balanță hormonală 19 reprezentată din 0,1...0,3 mg/l acid giberelic și 0,5...1,5 mg/l acid indolil butiric.
- 2. Procedeu definit |a revendicarea 1, caracterizat prin aceea că materialul biologic 21 inițial este constituit dintr-un meristem cu dimensiunea de 0,1...0,2 mm, obținut din muguri situați pe ramuri anuale. 23
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA201101152A RO127796B1 (ro) | 2011-11-15 | 2011-11-15 | Procedeu de obţinere a unui material săditor liber de virusul pnrsv prin culturi in vitro la soiul de vişin schattenmorelle |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA201101152A RO127796B1 (ro) | 2011-11-15 | 2011-11-15 | Procedeu de obţinere a unui material săditor liber de virusul pnrsv prin culturi in vitro la soiul de vişin schattenmorelle |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO127796A0 RO127796A0 (ro) | 2012-09-28 |
| RO127796B1 true RO127796B1 (ro) | 2014-01-30 |
Family
ID=46880841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ROA201101152A RO127796B1 (ro) | 2011-11-15 | 2011-11-15 | Procedeu de obţinere a unui material săditor liber de virusul pnrsv prin culturi in vitro la soiul de vişin schattenmorelle |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RO (1) | RO127796B1 (ro) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110476813B (zh) * | 2019-09-03 | 2021-11-30 | 江苏农林职业技术学院 | 一种樱花离体快繁方法 |
-
2011
- 2011-11-15 RO ROA201101152A patent/RO127796B1/ro unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110476813B (zh) * | 2019-09-03 | 2021-11-30 | 江苏农林职业技术学院 | 一种樱花离体快繁方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RO127796A0 (ro) | 2012-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101803569B (zh) | 试管内诱导草莓匍匐茎和高温处理结合茎尖培养脱毒方法 | |
| Tian et al. | Plant regeneration through protocorm-like bodies induced from rhizoids using leaf explants of Rosa spp. | |
| Manjunathagowda et al. | Virus–free seed production of garlic (Allium sativum L.): Status and prospects | |
| CN109566412B (zh) | 一种提高芍药属组间远缘杂交种子成苗率的方法 | |
| Liu et al. | Different eradication effects of latent viruses by combining thermotherapy with shoot tip culture or cryotherapy in four apple cultivars | |
| Jin et al. | Direct and indirect shoot and bulblet regeneration from cultured leaf explants of Lilium pumilum, an endangered species | |
| Khosh-Khui et al. | In vitro culture of the Rosa species | |
| da Costa et al. | Advances observed in papaya tree propagation | |
| Romyanon et al. | Direct-shoot organogenesis as an alternative protocol for in vitro regeneration of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) | |
| Ayenew et al. | Efficient use of temporary immersion bioreactor (TIB) on pineapple (Ananas comosus L.) multiplication and rooting ability | |
| CN104429940B (zh) | 一种获得草莓脱毒苗的方法 | |
| Rajora et al. | Effect of plant growth regulators on micropropagation of Catharanthus roseus | |
| Nasri et al. | Propagation in vitro of Alstroemeria ligtu hybrid through direct organogenesis from leaf base | |
| Caple et al. | Micropropagation of hermaphrodite Carica papaya L.‘Rainbow’seedlings via axillary bud pathway | |
| CN102144563B (zh) | 牡丹花药愈伤组织诱导方法 | |
| Comlekcioglu et al. | Polyploidy induction by colchicine treatment in golden berry (Physalis peruviana), and effects of polyploidy on some traits | |
| RO127796B1 (ro) | Procedeu de obţinere a unui material săditor liber de virusul pnrsv prin culturi in vitro la soiul de vişin schattenmorelle | |
| Xu et al. | Efficient in vitro plant regeneration of Pinellia ternata (Thunb) Breit | |
| Yanmaz et al. | In vitro plant regeneration and bulblet formation of Tunceli garlic (Allium tuncelianum (Kollman) Özhatay, Matthew, Siraneci) by shoot and root culture | |
| Shi et al. | Mass-propagation and bioreactor-based technologies for germplasm conservation, evaluation and international distribution of breadfruit | |
| Cybularz-Urban et al. | Therapeutic effect of cytokinin sequence application on virus-infected Cattleya tissue cultures | |
| Palijo et al. | 29. In vitro based multiplication of a superior Brazilian Cavendish banana clone | |
| Gobena et al. | In vitro root development system in two popular cultivars of banana | |
| Quintero-Jiménez et al. | Embryogenesis and organogenesis of Mexican creole avocado | |
| WO2024197373A1 (pt) | Processo para obtenção de calos embriogênicos vegetais, para obtenção de embriões somáticos vegetais, para obtenção de plântulas, para produção de semente sintética, para modificação genética, e, semente sintética |