Claims (1)
Procedeu de obţinere a plantelor de viţă-de-vie libere de virusul răsucirii frunzelor serotip 1, care include cultivarea in vitro a embrionilor imaturi obţinuţi de la genitori de viţă-de-vie apireni şi combinaţii hibride ale acestora, colectarea ciorchinilor după 30…45 zile de postanteză, pretratarea la temperatura de 4ºC pentru 10…12 zile, sterilizarea bobiţelor cu alcool etilic de 70% pentru 2…3 s, apoi în soluţie de hipoclorit de sodiu de 5,2% timp de 15 min şi clătirea în apă distilată sterilă, excizarea seminţelor imature şi inocularea pe mediul nutritiv Nitsch-Nitsch, suplimentat cu acid indolil acetic 1,5 mg/l, zeatină 1 mg/l, acid giberelic 0,2 mg/l şi cărbune activat 2,5 g/l, cultivarea timp de 30 zile la întuneric la o temperatură de 25±2°C, iar ulterior la aceeaşi temperatură, cu un fotoperiodism de 16 ore lumină, 8 ore întuneric şi iluminare de 2000 lx, la a 10…15-a zi de la primele germinări embrionii viabili se transferă pe un mediu nutritiv, conţinând 1⁄2 de macro- microelemente şi vitamine şi un conţinut integral de hormoni faţă de mediul Murashige-Skoog, suplimentat cu zaharoză 15 g/l, mio-inozitol 100 mg/l, glicină 3mg/l, benzilaminopurină 0,45 mg/l şi agar 6,8 g/l, apoi plantulele formate se transferă pe un mediu nutritiv conţinând 1⁄2 de macro- microelemente şi vitamine faţă de mediul Murashige-Skoog, lipsit de hormoni, după care se efectuează controlul virusologic şi transferul plantulelor libere de virus în substrat de sol şi turbă în raport de 1:3.
Invenţia se referă la biotehnologie şi poate fi utilizată în agricultură pentru obţinerea plantelor de viţă-de-vie libere de virusul răsucirii frunzelor.
Strategia generală de obţinere a materialului liber de infecţie cuprinde metode ale culturii in vitro a meristemelor, aprobate şi aplicate pe larg în eradicarea germenilor virali. Un procedeu inovativ în această direcţie se propune a fi embriogeneza directă, ce are drept model regenerarea plantelor sănătoase din embrioni proveniţi prin încrucişări hibride, autopolenizări sau polenizări libere a genitorilor atacaţi de viroze. În acelaşi timp cultura in vitro a embrionilor imaturi este unica metodă care permite obţinerea formelor noi hibride cu antrenarea genitorilor apireni.
Este cunoscut procedeul de eradicare a virusurilor viţei-de-vie, inclusiv virusul răsucirii frunzelor (serotip 1, grapevine leafroll-associated virus 1 - GLRaV-1), pe calea cultivării in vitro a meristemelor apicale [1].
Însă acest procedeu are şi dezavantaje. În cazul utilizării meristemelor apicale cu dimensiunile de 0,5 mm, mărime a explantului ce asigură o eradicare mai înaltă (95%) a virusului, se induce şi formarea de calus, ceea ce poate genera o variabilitate somaclonală. Prin utilizarea explantelor cu dimensiuni de 1mm se omite iniţierea de calus, însă rata de plantule libere de virus este mai redusă (77,5%).
Problema pe care o rezolvă invenţia constă în sporirea numărului de plante libere de germenii virali ai virusului GLRaV-1 complementar salvării embrionilor imaturi şi recuperării de plantule sănătoase obţinute din combinaţii hibride, autopolenizări sau polenizări libere a formelor cu diferit grad de apirenie.
Esenţa invenţiei constă în aceea că procedeul include cultivarea in vitro a embrionilor imaturi obţinuţi de la genitori de viţă-de-vie apireni şi combinaţii hibride ale acestora, colectarea ciorchinilor după 30…45 zile de postanteză, pretratarea la temperatura de 4ºC pentru 10…12 zile, sterilizarea bobiţelor cu alcool etilic de 70% pentru 2…3 s, apoi în soluţie de hipoclorit de sodiu de 5,2% timp de 15 min şi clătirea în apă distilată sterilă, excizarea seminţelor imature şi inocularea pe mediul nutritiv Nitsch-Nitsch, suplimentat cu acid indolil acetic 1,5 mg/l, zeatină 1 mg/l, acid giberelic 0,2 mg/l şi cărbune activat 2,5 g/l, cultivarea timp de 30 zile la întuneric la o temperatură de 25±2°C, iar ulterior la aceeaşi temperatură, cu un fotoperiodism de 16 ore lumină, 8 ore întuneric şi iluminare de 2000 lx, la a 10…15-a zi de la primele germinări embrionii viabili se transferă pe un mediu nutritiv, conţinând 1⁄2 de macro- microelemente, vitamine şi un conţinut integral de hormoni faţă de mediul Murashige-Skoog, suplimentat cu zaharoză 15 g/l, mio-inozitol 100 mg/l, glicină 3mg/l, benzilaminopurină 0,45 mg/l şi agar 6,8 g/l, apoi plantulele formate se transferă pe un mediu nutritiv conţinând 1⁄2 de macro- microelemente şi vitamine faţă de mediul Murashige-Skoog, lipsit de hormoni, după care se efectuează controlul virusologic şi transferul plantulelor libere de virus în substrat de sol şi turbă în raport de 1:3.
Noutatea invenţiei constă în eradicarea virusurilor, în special a virusului răsucirii frunzelor (serotip 1) al viţei-de-vie, pe calea cultivării in vitro a embrionilor imaturi, rezultaţi din încrucişări hibride, autopolenizări sau polenizări libere a formelor cu diferit grad de apirenie.
Rezultatul invenţiei rezidă în eradicarea GLRaV-1 pe calea salvării embrionilor imaturi prin culturi in vitro şi conversia acestora în plantule, ceea ce asigură soluţionarea concomitentă a două probleme majore asociate producerii materialului iniţial pentru ameliorare la genotipurile de tip stenospermocarpic: recuperarea embrionilor şi obţinerea populaţiilor hibride de plante sănătoase cu diferit grad de apirenie.
Exemplu de realizare a invenţiei
Pentru eradicarea in vitro a virusului GLRaV-1 pe calea embriogenezei zigotice au fost selectate genotipuri de viţă-de-vie de interes ameliorativ aflate în colecţia Institutului Ştiinţifico-Practic de Horticultură şi Tehnologii Alimentare, care au fost stabilite purtătoare de germeni patogeni ai acestui virus. Conform rezultatelor testelor de diagnostic virusologic (contrastare negativă, imunoelectronic şi imunoenzimatic) au fost selectaţi următorii genitori materni: Apiren roz Basarabean, Apiren extratimpuriu, Apiren negru de Grozeşti. În cercetare au fost utilizaţi embrioni imaturi obţinuţi din autopolenizări, polenizări libere, precum şi din combinaţii hibride cu utilizarea acestor forme.
Ţinând cont de obiectivele studiului au fost realizate următoarele scheme de încrucişări:
♀ sănătos x ♂ infectat
♀ infectat x ♂ sănătos
♀ infectat x ♂ infectat
autopolenizări, plantă infectată
polenizări libere, plantă infectată.
Procedeul, conform invenţiei, include cultivarea in vitro a embrionilor imaturi obţinuţi de la genitori de viţă-de-vie apireni şi combinaţii hibride ale acestora, colectarea ciorchinilor după 30…45 zile de postanteză, pretratarea la temperatura de 4ºC pentru 10…12 zile, sterilizarea bobiţelor cu alcool etilic de 70% pentru 2…3 s, apoi în soluţie de hipoclorit de sodiu de 5,2% timp de 15 min şi clătirea în apă distilată sterilă, excizarea seminţelor imature şi inocularea pe mediul nutritiv Nitsch-Nitsch, suplimentat cu acid indolil acetic 1,5 mg/l, zeatină 1 mg/l, acid giberelic 0,2 mg/l şi cărbune activat 2,5 g/l, cultivarea timp de 30 zile la întuneric la o temperatură de 25±2°C, iar ulterior la aceeaşi temperatură, cu un fotoperiodism de 16 ore lumină, 8 ore întuneric şi iluminare de 2000 lx, la a 10…15-a zi de la primele germinări embrionii viabili se transferă pe un mediu nutritiv, conţinând 1⁄2 de macro- microelemente, vitamine şi un conţinut integral de hormoni faţă de mediul Murashige-Skoog, suplimentat cu zaharoză 15 g/l, mio-inozitol 100 mg/l, glicină 3mg/l, benzilaminopurină 0,45 mg/l şi agar 6,8 g/l, apoi plantulele formate se transferă pe un mediu nutritiv conţinând 1⁄2 de macro- microelemente şi vitamine faţă de mediul Murashige-Skoog, lipsit de hormoni, după care se efectuează controlul virusologic şi transferul plantulelor libere de virus în substrat de sol şi turbă în raport de 1:3.
Schema eradicării germenilor virali la viţa-de-vie pe calea embriogenezei zigotice constă din: inocularea seminţelor imature (1), desecarea seminţelor (2), excizarea şi transferul embrionilor viabili pe mediul nutritiv de recuperare (3), obţinerea regeneranţilor (4), subcultivarea regeneranţilor pe mediul de conversie (5), expertiza virusologică a regeneranţilor (6), adaptarea ex vitro şi transferul plantulelor libere de virusuri în substrat de sol (7) (fig. 1).
Pentru identificarea eficienţei procedeului propus de eradicare a virusului GLRaV-1 a fost aplicat paralel procedeul cunoscut de eliminare a germenilor virali pe calea cultivării in vitro a meristemelor apicale cu dimensiunile de 1 mm. În acest scop de la tufele genitorilor materni şi paterni, în perioada creşterii intensive (iunie-iulie), au fost preluaţi lăstări (6…10 cm), care au fost spălaţi în apă curgătoare timp de 10 min. Pentru aseptizare, fragmentele de lăstari au fost plasate pentru 10 s în etanol 70% şi ulterior trecute în soluţie de 1% (v/v) de hipoclorit de sodiu (20% Clorox) cu două picături de 0,1% Tween 20, apoi clătite în 3 băi de apă sterilă, a câte 5 minute fiecare, pentru înlăturarea totală a clorului. Toate operaţiunile de sterilizare a lăstarilor, precum şi excizarea apexurilor cu mărimea de 1mm şi inocularea lor pe medii de cultură s-au desfăşurat în condiţii aseptice, în interiorul hotei cu flux laminar de aer steril. Vitrocultura a fost iniţiată în eprubete, conţinând câte 2 ml de mediu nutritiv Murashige & Skoog (1962) suplimentat cu 6-benzilaminopurină (5 µM), acid naftalenacetic (0,5 µM), 3% zaharoză şi 0,8% agar. Valoarea pH-ului mediului nutritiv a fost ajustată înainte de autoclavare la 5,7. Pentru inducerea regenerării eprubetele au fost incubate în condiţii controlate cu un fotoperiodism de 16 ore-lumină, temperatura de 25±2°C şi iluminare de 2000 lx.
La 25…35 zile de la inoculare s-a atestat proliferarea şi dezvoltarea regeneranţilor, care ulterior au fost transferaţi pe medii nutritive pentru multiplicare în vase Magenta ce conţineau 10…12 ml mediu. Plantulele cu 3…4 internoduri rezultate din fiecare ciclu de subcultivare au fost transferate pe mediul pentru rizogeneză Murashige & Skoog (1962) suplimentat cu acid indolilbutiric (0,2 µM). La 6…7 zile după pasaj pe acest substrat regeneranţii care prezentau un sistem radicular cu perişori absorbanţi bine dezvoltaţi au fost transferaţi în vase de plastic de 500 ml cu amestec de sol:turbă (1:3). Vasele cu regeneranţi au fost acoperite cu peliculă de polietilenă şi transferate în camera de cultivare la 25±2°C şi cu un fotoperiodism de 16 ore-lumină.
Meristemele celor 3 genotipuri de viţă-de-vie analizate au prezentat un potenţial înalt de răspuns la condiţiile in vitro de cultivare (tab.). În pofida cotei înalte a explantelor cu răspuns pozitiv şi eficienţei de inducere a regeneranţilor, numărul plantulelor stabilite libere de germeni virali a fost destul de redus, variind între 39,1% pentru Apiren extratimpuriu şi 68,4% pentru Apiren roz Basarabean. Totodată, s-a constatat că toţi cei 23 de regeneranţi derivaţi de la Apiren negru de Grozeşti s-au dovedit a fi purtători ai serotipului 1 al virusului GLRaV. Nereuşita eradicării virale la genotipul dat poate fi cauzată atât de particularităţile soiului, cât şi de starea fitosanitară gravă stabilită la plantele donatoare de explant (infecţii mixte).
Tabel. Rata de regenerare şi cota de eradicare a GLRaV-1 prin culturi in vitro a meristemelor şi embrionilor imaturi de viţă-de-vieProcess for obtaining grapevine plants free from leaf curl virus serotype 1, which includes in vitro cultivation of immature embryos obtained from apyrene grapevine parents and their hybrid combinations, collection of clusters after 30…45 days of postanthesis, pretreatment at 4ºC for 10…12 days, sterilization of berries with 70% ethyl alcohol for 2…3 s, then in 5.2% sodium hypochlorite solution for 15 min and rinsing in sterile distilled water, excision of immature seeds and inoculation on Nitsch-Nitsch nutrient medium, supplemented with indolyl acetic acid 1.5 mg/l, zeatin 1 mg/l, gibberellic acid 0.2 mg/l and activated carbon 2.5 g/l, cultivation for 30 days in the dark at a temperature of 25±2°C, and subsequently at the same temperature, with a photoperiod of 16 hours light, 8 hours dark and illumination of 2000 lx, on the 10th…15th day from the first germination, the viable embryos are transferred to a nutrient medium, containing 1⁄2 of macro- and microelements and vitamins and a full content of hormones compared to the Murashige-Skoog medium, supplemented with sucrose 15 g/l, myo-inositol 100 mg/l, glycine 3mg/l, benzylaminopurine 0.45 mg/l and agar 6.8 g/l, then the formed seedlings are transferred to a nutrient medium containing 1⁄2 of macro- and microelements and vitamins compared to the Murashige-Skoog medium, devoid of hormones, after which the virological control is carried out and the virus-free seedlings are transferred to a soil and peat substrate in a ratio of 1:3.
The invention relates to biotechnology and can be used in agriculture to obtain grapevine plants free from leaf roll virus.
The general strategy for obtaining infection-free material includes methods of in vitro meristem culture, approved and widely applied in the eradication of viral germs. An innovative process in this direction is proposed to be direct embryogenesis, which has as a model the regeneration of healthy plants from embryos obtained by hybrid crosses, self-pollination or free pollination of virus-infected parents. At the same time, in vitro culture of immature embryos is the only method that allows obtaining new hybrid forms with the involvement of apyrene parents.
The process of eradicating grapevine viruses, including leaf roll virus (serotype 1, grapevine leafroll-associated virus 1 - GLRaV-1), is known by in vitro cultivation of apical meristems [1].
However, this procedure also has disadvantages. In the case of using apical meristems with dimensions of 0.5 mm, the explant size that ensures a higher eradication (95%) of the virus, callus formation is also induced, which can generate somaclonal variability. By using explants with dimensions of 1 mm, callus initiation is omitted, but the rate of virus-free seedlings is lower (77.5%).
The problem solved by the invention consists in increasing the number of plants free from viral germs of the GLRaV-1 virus, in addition to rescuing immature embryos and recovering healthy seedlings obtained from hybrid combinations, self-pollination or free pollination of forms with different degrees of apyreny.
The essence of the invention is that the process includes in vitro cultivation of immature embryos obtained from apyrene grapevine parents and their hybrid combinations, collection of clusters after 30…45 days of postanthesis, pretreatment at 4ºC for 10…12 days, sterilization of berries with 70% ethyl alcohol for 2…3 s, then in 5.2% sodium hypochlorite solution for 15 min and rinsing in sterile distilled water, excision of immature seeds and inoculation on Nitsch-Nitsch nutrient medium, supplemented with indolyl acetic acid 1.5 mg/l, zeatin 1 mg/l, gibberellic acid 0.2 mg/l and activated carbon 2.5 g/l, cultivation for 30 days in the dark at a temperature of 25±2°C, and subsequently at the same temperature, with a photoperiod of 16 hours of light, 8 hours of darkness and 2000 lx illumination, on the 10th…15th day from the first germination, the viable embryos are transferred to a nutrient medium, containing 1⁄2 of macro- and microelements, vitamins and a full content of hormones compared to the Murashige-Skoog medium, supplemented with sucrose 15 g/l, myo-inositol 100 mg/l, glycine 3mg/l, benzylaminopurine 0.45 mg/l and agar 6.8 g/l, then the formed seedlings are transferred to a nutrient medium containing 1⁄2 of macro- and microelements and vitamins compared to the Murashige-Skoog medium, devoid of hormones, after which the virological control is carried out and the virus-free seedlings are transferred to a soil and peat substrate in a ratio of 1:3.
The novelty of the invention consists in the eradication of viruses, especially grapevine leaf curl virus (serotype 1), by in vitro cultivation of immature embryos resulting from hybrid crosses, self-pollination or open pollination of forms with different degrees of apyreny.
The result of the invention lies in the eradication of GLRaV-1 by rescuing immature embryos through in vitro cultures and their conversion into seedlings, which ensures the simultaneous solution of two major problems associated with the production of initial material for improvement of stenospermocarpic genotypes: embryo recovery and obtaining hybrid populations of healthy plants with different degrees of apyreny.
Example of realization of the invention
For the in vitro eradication of the GLRaV-1 virus by zygotic embryogenesis, grapevine genotypes of amelioration interest were selected from the collection of the Scientific-Practical Institute of Horticulture and Food Technologies, which were established as carriers of pathogenic germs of this virus. According to the results of virological diagnostic tests (negative contrast, immunoelectronic and immunoenzymatic), the following maternal parents were selected: Apiren roz Basarabean, Apiren extratimpuriu, Apiren negru de Grozeşti. Immature embryos obtained from self-pollination, free pollination, as well as from hybrid combinations using these forms were used in the research.
Taking into account the objectives of the study, the following crossbreeding schemes were carried out:
♀ healthy x ♂ infected
♀ infected x ♂ healthy
♀ infected x ♂ infected
self-pollination, infected plant
free pollination, infected plant.
The process, according to the invention, includes in vitro cultivation of immature embryos obtained from apyrene grapevine parents and their hybrid combinations, collection of clusters after 30…45 days of postanthesis, pretreatment at 4ºC for 10…12 days, sterilization of berries with 70% ethyl alcohol for 2…3 s, then in 5.2% sodium hypochlorite solution for 15 min and rinsing in sterile distilled water, excision of immature seeds and inoculation on Nitsch-Nitsch nutrient medium, supplemented with indolyl acetic acid 1.5 mg/l, zeatin 1 mg/l, gibberellic acid 0.2 mg/l and activated carbon 2.5 g/l, cultivation for 30 days in the dark at a temperature of 25±2°C, and subsequently at the same temperature, with a photoperiod of 16 hours light, 8 hours dark and illumination of 2000 lx, on the 10th…15th day from the first germination, the viable embryos are transferred to a nutrient medium, containing 1⁄2 of macro- and microelements, vitamins and a full content of hormones compared to the Murashige-Skoog medium, supplemented with sucrose 15 g/l, myo-inositol 100 mg/l, glycine 3mg/l, benzylaminopurine 0.45 mg/l and agar 6.8 g/l, then the formed seedlings are transferred to a nutrient medium containing 1⁄2 of macro- and microelements and vitamins compared to the Murashige-Skoog medium, devoid of hormones, after which the virological control is carried out and the virus-free seedlings are transferred to a soil and peat substrate in a ratio of 1:3.
The scheme of eradication of viral germs in grapevine by zygotic embryogenesis consists of: inoculation of immature seeds (1), desiccation of seeds (2), excision and transfer of viable embryos to the nutrient recovery medium (3), obtaining regenerants (4), subculturing of regenerants on the conversion medium (5), virological expertise of regenerants (6), ex vitro adaptation and transfer of virus-free seedlings to soil substrate (7) (fig. 1).
To identify the efficiency of the proposed procedure for eradication of the GLRaV-1 virus, the known procedure for eliminating viral germs by in vitro cultivation of apical meristems with dimensions of 1 mm was applied in parallel. For this purpose, shoots (6…10 cm) were taken from the bushes of maternal and paternal parents during the period of intensive growth (June-July), which were washed in running water for 10 min. For asepsis, the shoot fragments were placed for 10 s in 70% ethanol and subsequently passed in a 1% (v/v) solution of sodium hypochlorite (20% Clorox) with two drops of 0.1% Tween 20, then rinsed in 3 sterile water baths, 5 minutes each, to completely remove chlorine. All shoot sterilization operations, as well as the excision of 1mm apices and their inoculation on culture media, were carried out under aseptic conditions, inside a hood with sterile laminar air flow. Vitroculture was initiated in test tubes, containing 2 ml of Murashige & Skoog (1962) nutrient medium supplemented with 6-benzylaminopurine (5 µM), naphthaleneacetic acid (0.5 µM), 3% sucrose and 0.8% agar. The pH of the nutrient medium was adjusted to 5.7 before autoclaving. To induce regeneration, the tubes were incubated under controlled conditions with a photoperiod of 16 hours-light, a temperature of 25±2°C and an illumination of 2000 lx.
25…35 days after inoculation, the proliferation and development of the regenerants were attested, which were subsequently transferred to nutrient media for multiplication in Magenta dishes containing 10…12 ml of medium. Plantlets with 3…4 internodes resulting from each subculturing cycle were transferred to the Murashige & Skoog (1962) rhizogenesis medium supplemented with indolylbutyric acid (0.2 µM). 6…7 days after passage on this substrate, the regenerants that presented a root system with well-developed absorbent hairs were transferred to 500 ml plastic dishes with a soil:peat mixture (1:3). The regenerant pots were covered with polyethylene film and transferred to the cultivation room at 25±2°C and a photoperiod of 16 hours of light.
The meristems of the 3 grapevine genotypes analyzed showed a high potential for response to in vitro cultivation conditions (tab.). Despite the high rate of explants with positive response and the efficiency of induction of the regenerants, the number of established plantlets free of viral germs was quite low, ranging between 39.1% for Apiren extratimpuriu and 68.4% for Apiren roz Basarabean. At the same time, it was found that all 23 regenerants derived from Apiren negru de Grozeşti proved to be carriers of serotype 1 of the GLRaV virus. The failure of viral eradication in a given genotype can be caused by both the particularities of the variety and the serious phytosanitary condition established in the explant donor plants (mixed infections).
Table. Regeneration rate and eradication rate of GLRaV-1 by in vitro cultures of grapevine meristems and immature embryos
Nr Genotip Numărul de explante inoculate Numărul de explante cu răspuns pozitiv Numărul de regeneranţi obţinuţi Numărul de plante libere de virus Cota de plante libere de virus, % Cultura in vitro a meristemelor 1 Apiren roz Basarabean 32 28 19 13 68,42 2 Apiren negru de Grozesti 44 38 23 - - 3 Apiren extratimpuriu 47 46 23 9 39,13 Total 123 112 65 22 35,85 Cultura in vitro a embrionilor imaturi Genotpul formei materne Numărul de embrioni inoculaţi Numărul de embrioni viabili Numărul de regeneranţi obţinuţi Numărul de plante libere de virus Cota de plante libere de virus 1 Apiren roz Basarabean 688 162 181 181 100 2 Apiren negru de Grozeşti 1054 83 12 10 83,33 3 Apiren extratimpuriu 152 77 83 83 100 Total 1894 322 276 274 94,44
Conform algoritmului invenţiei propuse au fost inoculaţi 1894 de embrioni imaturi pe mediul de recuperare Nitsch-Nitsch (1969). La momentul desecării s-a determinat că cota embrionilor viabili a variat de la 7,9% (Apiren negru de Grozeşti) până la 50,7% (Apiren extratimpuriu) în funcţie de genotip şi starea lor fitosanitară. Gradul înalt de infectare a genotipului Apiren negru de Grozeşti cu agenţi virali ai complexului degenerativ (în special infecţii mixte) a contribuit la diminuarea viabilităţii embrionilor.
S-a stabilit că reacţia embrionilor imaturi la cultivarea in vitro este determinată în mare măsură de genotip, de aceea reuşita procedeului de convertire a embrionilor în plantule este direct dependentă de particularităţile genotipurilor antrenate. O altă trăsătură specifică atribuită genotipului este poliembrionia, fapt ce a dus la creşterea numărului de regeneranţi comparativ cu numărul de embrioni viabili cultivaţi (de exemplu la soiurile Apiren extratimpuriu şi Apiren roz Basarabean). Asemenea plantule reprezintă clone, iar inducerea lor sporeşte cota de recuperare şi conversie în plantule.
Plantulele recuperate după aspect nu prezentau simptome vizuale specifice virozelor. De asemenea prin metode de diagnostic virusologic a fost confirmată lipsa agenţilor virali. Eficienţa eradicării virusului GLRaV-1 a fost identificată prin tehnica imunoenzimatică DAS-ELISA: A - aplicarea probelor biologice, B şi C - rezultatul reacţiei cromatice de identificare a germenilor GLRV-1 în regeneranţii obţinuţi prin cultura de meristeme (B) şi a embrionilor imaturi (C) (fig.2).
A fost stabilită influenţa stării fitosanitare şi particularităţilor combinaţiei hibride de viţă-de- vie asupra eficienţei procedeului de salvare, recuperare şi conversie a embrionilor imaturi în plantule. Infectarea formelor parentale cu serotipul 1 al GLRaV influenţează mai puţin viabilitatea embrionilor.
Conform rezultatelor obţinute, procedeul propus conform invenţiei permite eradicarea germenilor virali chiar şi în cazul unor infecţii duble sau triple, fapt constatat la genotipul Apiren negru de Grozeşti.
Expertiza virusologică în baza testului DAS-ELISA a dovedit că salvarea embrionilor imaturi prin culturi in vitro şi conversia acestora în plantule constituie un procedeu eficient ce asigură eradicarea GLRaV-1. Totodată procedeul propus permite soluţionarea concomitentă a două probleme majore asociate producerii materialului iniţial pentru ameliorare la genotipurile de tip stenospermocarpic: recuperarea embrionilor şi obţinerea populaţiilor hibride de plante sănătoase cu diferit grad de apirenie.
Plantele clone, stabilite sănătoase, urmează a fi multiplicate, pentru crearea plantelor-mamă sănătoase, precum şi a formelor hibride de interes ameliorativ.No. Genotype Number of inoculated explants Number of explants with positive response Number of regenerants obtained Number of virus-free plants Share of virus-free plants, % In vitro culture of meristems 1 Basarabean pink apiren 32 28 19 13 68.42 2 Grozesti black apiren 44 38 23 - - 3 Extra-early apiren 47 46 23 9 39.13 Total 123 112 65 22 35.85 In vitro culture of immature embryos Maternal form genotype Number of inoculated embryos Number of viable embryos Number of regenerants obtained Number of virus-free plants Share of virus-free plants 1 Basarabean pink apiren 688 162 181 181 100 2 Grozesti black apiren 1054 83 12 10 83.33 3 Apiren extratimpuriu 152 77 83 83 100 Total 1894 322 276 274 94.44
According to the algorithm of the proposed invention, 1894 immature embryos were inoculated on the Nitsch-Nitsch (1969) recovery medium. At the time of drying, it was determined that the share of viable embryos varied from 7.9% (Apiren negru de Grozeşti) to 50.7% (Apiren extratimpuriu) depending on the genotype and their phytosanitary status. The high degree of infection of the Apiren negru de Grozeşti genotype with viral agents of the degenerative complex (especially mixed infections) contributed to the decrease in embryo viability.
It was established that the reaction of immature embryos to in vitro cultivation is largely determined by the genotype, therefore the success of the process of converting embryos into seedlings is directly dependent on the particularities of the genotypes trained. Another specific feature attributed to the genotype is polyembryony, which led to an increase in the number of regenerants compared to the number of viable embryos cultivated (for example, in the varieties Apiren extratimpuriu and Apiren roz Basarabean). Such plantlets represent clones, and their induction increases the rate of recovery and conversion into seedlings.
The recovered plantlets did not show any visual symptoms specific to viruses. Also, the absence of viral agents was confirmed by virological diagnostic methods. The efficiency of GLRaV-1 virus eradication was identified by the immunoenzymatic DAS-ELISA technique: A - application of biological samples, B and C - the result of the chromatic reaction for identifying GLRV-1 germs in regenerants obtained by meristem culture (B) and immature embryos (C) (fig.2).
The influence of the phytosanitary status and the particularities of the hybrid grapevine combination on the efficiency of the procedure for rescuing, recovering and converting immature embryos into seedlings was established. Infection of parental forms with serotype 1 of GLRaV has less influence on embryo viability.
According to the results obtained, the proposed procedure according to the invention allows the eradication of viral germs even in the case of double or triple infections, a fact found in the Apiren negru de Grozeşti genotype.
Virological expertise based on the DAS-ELISA test proved that rescuing immature embryos through in vitro cultures and their conversion into seedlings constitutes an efficient procedure that ensures the eradication of GLRaV-1. At the same time, the proposed procedure allows the simultaneous solution of two major problems associated with the production of initial material for improvement in stenospermocarpic genotypes: embryo recovery and obtaining hybrid populations of healthy plants with different degrees of apireny.
The cloned plants, established healthy, are to be multiplied to create healthy mother plants, as well as hybrid forms of amelioration interest.