MD4762C1 - Bis-(N,N′-bis(4-tolil)diaminoglioxim)-4-metilanilin-trihidrat pentru utilizare în calitate de remediu antibacterian în agricultură - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la chimie şi agricultură, în particular la utilizarea unui derivat de diaminoglioximă în calitate de remediu antibacterian.Conform invenţiei, se revendică compusul bis-(N,N′-bis(4-tolil)diaminoglioxim)-4-metilanilin-trihidrat ((TDAGH2)2·MA·3H2O), care poate fi utilizat în calitate de remediu antibacterian contra bacteriilor fitopatogene Xanthomonas campestris, Erwinia amylovora şi Erwinia carotovora.

Description

Invenţia se referă la chimie şi agricultură, în special la utilizarea unui derivat de diaminoglioximă în calitate de remediu antibacterian.

Sunt cunoscuţi derivaţi de oxime heterociclice care datorită activităţii lor citotoxice, manifestă proprietăţi antibacteriene şi antifungice, la fel şi complecşii acestora cu metalele tranziţionale manifestă proprietăţi antibacteriene [1].

Sunt cunoscuţi derivaţi ai dioximelor, şi anume, diaminoglioxime, care se obţin la condensarea diclorglioximei cu 2- sau 4-toluenamine (toluidine sau metilaniline). De exemplu, cu 4-toluenamina s-a obţinut N,N′-bis(4-tolil)diaminoglioxima (TDAGH2) [2]. Deasemenea au fost descrise dioxime similare (DsamH2) obţinute din sulfanilamidă [3]. Sulfanilamida este bine cunoscută şi utilizată în calitate de remediu antibacterian. Activitatea biologică a compuşilor obţinuţi nu a fost testată.

De asemenea, este cunoscut un compus din clasa dioximelor care a fost obţinut în urma condensării unei amine organice cu monoclorglioxima, neajunsul acestui compus dioximic fiind lipsa activităţii antibacteriene şi antifungice, aceste proprietăţi fiind manifestate doar de compuşii complecşi în baza lui cu ioni de metale tranzitive [4].

Problema tehnică rezolvată de invenţie constă în extinderea gamei de compuşi dioximici, care să manifeste proprietăţi antibacteriene şi antifungice sporite în stare liberă, necoordinată cu ioni de metale.

Esenţa invenţiei constă în obţinerea unui solvat nou a N,N′-bis(4-tolil)diaminoglioximei şi anume a compusului bis-(N,N′-bis(4-tolil)diaminoglioxim)-4-metilanilin-trihidrat ((TDAGH2)2·MA·3H2O), care prevede condensarea diclorglioximei cu p-aminotoluenul în alcool neabsolut. Structura solvatului a fost stabilită cu metoda difracţiei razelor X pe monocristal, produsul manifestând activitate antimicrobiană, fiind propus pentru utilizare în calitate de remediu antibacterian în agricultură.

Rezultatul tehnic al invenţiei constă în aceea că se propune pentru utilizare în calitate de remediu antibacterian un compus solvat nou cristalin - bis-(N,N′-bis(4-tolil)diaminoglioxim)-4-metilanilin-trihidrat ((TDAGH2)2·MA·3H2O), care manifestă o activitate antibacteriană şi antifungică superioară şi care poate fi utilizat, în special contra tulpinilor fitopatogene de Xanthomonas campestris, Erwinia amylovora şi Erwinia carotovora.

Avantajele invenţiei constau în faptul că pentru utilizare se propune un compus organic accesibil, cristalin, stabil şi relativ ieftin, deoarece el conţine în componenţa sa un radical de 4-tolilamină, ultima fiind o substanţă ieftină şi accesibilă. Totodată pentru manifestarea proprietăţilor antibacteriene şi antifungice nu este necesar de utilizat compusul în stare coordinată (complexată) cu ioni de metale ca în analogul proxim.

Invenţia este explicată prin fig. 1a, care reprezintă structura moleculară şi cristalină bis-(N,N′-bis(4-tolil)diaminoglioxim-4-metilanilin-trihidrat; şi

(1b) - un fragment din structura cristalină cu modul de împachetare a componentelor în cristal.

Exemple de realizare a invenţiei

Exemplul 1. Sinteza compusului bis-(N,N′-bis(4-tolil)diaminoglioxim)-4-metilanilin-trihidrat

Se prepară soluţia ce conţine 0,24 g (0,2 mmol) 4-metilanilină (para-toluidină) şi 0,16 g (0,1 mmol) diclorglioximă în 10 mL etanol (soluţie de culoare galbenă), care se pune la agitare. Peste 10 min se adaugă 0,12 g Na2CO3 şi 1,5 mL H2O. Pentru dizolvarea completă a carbonatului de sodiu, amestecul reactant se încălzeşte la temperatura de 50°C şi se agită timp de 40...50 min. După agitare se formează un sediment gelatinos de culoare galben-deschisă. Amestecul se mai lasă la agitare 2 ore, timp în care sedimentul trece în culoare albă. Amestecul se filtrează pe un filtru de sticlă, iar sedimentul separat se spală cu alcool etilic (cu 3 porţii a câte 2 mL), apoi cu eter dietilic (cu 3 porţii a câte 2 mL) şi se usucă la aer. După spălare şi uscare substanţa capătă culoarea bej. S-a obţinut 0,17 g, randamentul reacţiei constituind 26%. Substanţa este solubilă în metanol, dimetilformamidă, dimetilsulfoxid, etanol şi insolubilă în apă, acetonitril şi eter dietilic. Din filtratul lăsat pentru cristalizare în 8 zile s-au format cristale slab-gălbui de forma unor ace, care au fost supuse difracţiei cu raze X.

Găsit, %: C 61,80; H 6,78; N 16,64.

Pentru C39H51N9O7

Calculat, %: C 61,72; H 6,81; N 16,42.

Spectrul IR al ((TDAGH2)2·MA·3H2O) a fost înregistrat la spectrometrul Perkin-Elmer 100 FT-IR în intervalul 4000-400 cm-1 (suspensie în ulei de vazelină) şi ATR în intervalul 4000-650 cm-1.

Benzi de absorbţie, cm-1: 3676(s), 3401(s), 3371(m), 3308(m), 3187(m), 3126(m), 2972(p), 2922(p), 2786(m), 1892(s), 1877(s), 1649(p), 1624(f.p.), 1614(f.p.), 1516(f.p.), 1466(p), 1459(p), 1452(p), 1420(m), 1407(m), 1396(m), 1380(s), 1314(m), 1277(m), 1237(s), 1209(s), 1125(s), 1111(s), 1074(s), 1066(s), 1057(s), 1044(s), 1029(s), 1020(s), 991(s), 983(s), 964(p), 954(p), 894(p), 812(p), 806(p), 762(m), 727(s), 708(s), 679(m), 578(s), 491(s); (intensitatea benzii de absorbţie, apreciată calitativ: f.p.- foarte puternică; p - puternică; m - medie; s - slabă).

Benzile de absorbţie pot fi atribuite conform: Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. Изд-во МИР, Москва, 1965, с. 216. În compus ((TDAGH2)2·MA·3H2O) sunt prezente benzile de absorbţie: 3400cm-1 ν(N-H)diox; 3371cm-1 şi 3308 cm-1 νas(NH2) şi respectiv νs(NH2) în molecula necondensată de 4-metilanilină; 3187cm-1 şi 3126 cm-1 ν(OH)diox,apă participante la formarea legăturilor de hidrogen de tipul O-H···O. Oscilaţiile ν(C-H) se manifestă în regiunea 3000-2700 cm-1. Banda de absorbţie la 1649 este atribuită oscilaţiilor ν(C=N)diox, iar benzile la 1624, 1516 şi 1452 - oscilaţiilor ν(C=C)in.arom.. Banda de intensitate înaltă la 954 cm-1 se atribuie oscilaţiilor ν(N-O)diox.. Tipul de substituţie 1,4- în inelul aromatic este confirmat de prezenţa benzii de absorbţie de intensitate înaltă δ(CH) la 812 cm-1 (Беллами Л. Инфракрасные спектры сложных молекул. Изд-во иностранной литературы, Москва, 1963, с. 590). Absenţa în spectrul dioximei a benzii de absorbţie de intensitate înaltă ν(C-Cl) la 851 cm-1 prezentă în spectrul diclorglioximei este o dovadă incontestabilă că a avut loc procesul de alchilare a 4-aminotoluenului cu diclorglioxima.

Spectrele 1H şi 13C RMN au fost înregistrate la spectrometrul Bruker la 400,13 MHz pentru 1H şi 100,61 MHz pentru 13C în DMSO-d6 folosind TMS ca referinţă internă. Deplasările chimice (δ) sunt prezentate în părţi per milion (ppm) şi raportate la vârful solventului nedeuterat rezidual (2,49 pentru 1H şi 39,70 pentru 13C).

În spectrul 1H RMN al dioximei sunt prezente două semnale dublet în intervalul 6,68-6,86 ppm care aparţin grupărilor (=CH-) ale inelului aromatic din dioximă şi două semnale dublet în intervalul 7,34-7,37 ppm ale carbonilor terţiari ai moleculei de 4-metilanilină (p-toluidină). Grupărilor aminice (-NH2) şi iminice (-NH-) aparţin semnalele de la 7,91 şi 8,43 ppm. De asemenea sunt bine vizibile semnalele pentru grupa hidroxilică (-OH) la 10,36 ppm, pentru grupele metilice (-CH3) în intervalul 2,15-2,51 ppm, atât ale dioximei, cât şi ale moleculei de MA necondensată.

În spectrul 13C RMN al dioximei sunt prezente semnalele atomilor de carbon terţiari ai inelului aromatic δ(=CH-) la 119,76 şi 129,26 ppm, atomii de carbon cuaternari ai inelului aromatic δ(=C=) la 131,05 şi 137,42 ppm şi atomul cuaternar al grupei oximice δ(=C=) la 143,55 ppm, ceea ce dovedeşte faptul că condensarea a avut loc. De asemenea într-un câmp mai slab este prezent semnalul pentru grupa metilică (-CH3) la 20,64 ppm.

Exemplul 2. Difracţia cu raze X

Datele experimentale au fost obţinute la temperatura camerei (293(2)K) la difractometrul Xcalibur E (radiaţie - MoKα, monocromator de grafit). Parametrii celulei elementare, fitaţi în baza datelor experimentale complete, au fost obţinuţi utilizând pachetul software CrysAlis Oxford Diffraction (CrysAlis RED, O. D. L., Version 1.171.34.76, 2003). Structura compusului a fost determinată prin metode directe, iar poziţiile atomilor nehidrogenici au fost fitaţi prin metoda celor mai mici pătrate în varianta anizotropă (SHELX-97) (Sheldrick G. M. A short history of SHELX. Acta Cristallographica Section A, 2008, 64(1), pp. 112. DOI:10.1107/s0108767307043930). Coordonatele atomilor de hidrogen au fost calculate din considerente geometrice şi fitate izotropic în modelul „corp solid” cu Uef = 1,2 Uech. sau 1,5 Uech. corespunzător atomilor O, N şi C. S-a stabilit că datele structurale obţinute pentru compusul ((TDAGH2)2·MA·3H2O), ce conţine bis-(N,N′-bis(4-tolil)diaminoglioxima sunt în deplin acord cu rezultatele evidenţiate din spectrele IR şi RMN. Datele cristalografice şi caracteristicile experimentale pentru compusul dioximic sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1

Datele cristalografice şi caracteristicile experimentale pentru (TDAGH2)2·MA·3H2O

Parametrii Valoarea Formula empirică C39H51N9O7 M 757,89 Sistemul cristalografic monoclinic Grupul spaţial Pn a, Å 13,863(2) b, Å 6,4122(14) c, Å 23,213(5) β, ° 99,512(18) V, Å3 2035,1(7) Z 2 ρ(calculată), g/cm3 1,355 Dimensiunea cristalului, mm 0,55x0,3x0,08 Numărul reflexelor colectate 4083 Factorul de divergenţă final R1 0,0446

Compusul ((TDAGH2)2·MA·3H2O) se cristalizează în grupul spaţial monoclinic Pn şi conţine în partea asimetrică a celulei elementare două molecule de TDAGH2, cristalografic independente, obţinute la condensarea 4-metilanilinei (MA) cu diclorglioxima (DClH2), o moleculă de MA şi trei molecule de apă (fig. 1(a)). Ca urmare a fost obţinut un agent nou de coordinare ((TDAGH2)2·MA·3H2O), care poate coordina la atomii de metal în mod diferit - de la mono- până la polidentat. În grupările oximice din ((TDAGH2)2·MA·3H2O) sunt următoarele lungimi de legătură: N(1)-C(1) 1,288(12) Å; N(1)-O(1) 1,431(9) Å; N(2)-C(2) 1,273(12) Å; N(2)-O(2) 1,417(10) Å; N(3)-C(3) 1,269(11) Å; N(3)-O(3) 1,429(10) Å; N(4)-C(4) 1,249(11) Å; N(4)-O(4) 1,446(9) Å. Unghiurile de valenţă C(1)-N(1)-O(1), C(2)-N(2)-O(2), C(3)-N(3)-O(3) şi C(4)-N(4)-O(4) sunt 111,3(8)°, 110,2(8)°, 110,7(8)° şi respectiv 109,0(7)°. Distanţa dintre centrele celor două inele aromatice din aceste două molecule constituie 4,817 Å şi respectiv 4,829 Å, ca urmare ele sunt stabilizate suplimentar de interacţiunile de tip π···π. În cristal moleculele de apă şi de MA sunt legate cu moleculele de dioximă printr-un sistem complicat de legături de hidrogen (tabelul 2, fig. 1(b)).

Tabelul 2

Parametrii legăturilor de hidrogen intermoleculare din compusul ((TDAGH2)2·MA·3H2O)

D-H⋅⋅⋅A Distanţa interatomică, Å Unghiul DHA, grad Transformarea simetrică pentru A H···A D···A N(9)-H(1)···O(1W) 2.19 3.14(1) 178 x+1/2, -y, z-1/2 N(9)-H(2)···O(1) 2.53 3.18(1) 132 x+1/2, -y, z-1/2 O(1)-H···O(1W) 1.83 2.64(1) 170 x, y+1, z O(2)-H···O(2W) 1.90 2.70(1) 175 x-1/2, -y, z+1/2 O(3)-H···N(9) 1.93 2.72(1) 163 x, y+1, z O(4)-H···O(3W) 1.83 2.64(1) 169 x+1/2, -y, z-1/2 O(1W)-H(1)···N(2) 2.07 2.83(1) 148 x, y, z O(1W)-H(2)···N(4) 2.08 2.86(1) 152 x-1/2, -y, z+1/2 O(2W)-H(1)···O(3W) 2.00 2.87(1) 178 x+1/2, -y+1, z-1/2 O(2W)-H(2)···O(4) 2.09 2.97(1) 179 x, y, z O(3W)-H(1)···N(1) 1.96 2.83(1) 177 x, y, z O(3W)-H(2)···N(3) 1.94 2.82(1) 169 x-1/2, -y+1, z+1/2

Exemplul 3. Evaluarea activităţii antibacteriene şi antifungice a ((TDAGH2)2·MA·3H2O) şi a compusului martor DsamH2

În calitate de bacterii-test pentru evaluarea activităţii antimicrobiene au fost selectate tulpini nepatogene de Bacillus subtilis CNMN BB-01, Pseudomonas fluorescens CNMN-PFB-01 şi tulpini fitopatogene de Xanthomonas campestris, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora şi 2 tulpini de fungi-drojdii Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae.

În calitate de compus martor s-a utilizat compusul cunoscut cu structură foarte apropiată - DsamH2 [3], care conţine în molecula sa în loc de 4-tolil doi radicali de sulfanilamidă, larg cunoscută pentru activitatea antimicrobiană foarte pronunţată.

Activitatea antimicrobiană a fost testată utilizând metoda diluţiilor succesive duble care constă în aceea că la etapa iniţială se iau şiruri de 10 eprubete în care se introduc câte 1 mL de bulion peptonat pentru bacterii şi Sabouraud pentru fungi. Ulterior se picură 1 mL de preparat în prima eprubeta (din şirul de 10 eprubete). Se pipetează amestecul obţinut, după care 1 mL din acesta se transferă în eprubeta următoare, astfel că procedura se repetă până la eprubeta nr. 10 a şirului. În aşa mod, concentraţia preparatului iniţial se micşorează de 2 ori în fiecare eprubetă următoare. În acelaşi timp, se prepară culturi de 24 ore de microorganisme-test. Se prepară iniţial suspensii de culturi bacteriene şi fungice cu densităţile optice (D.O.) de 2,0 şi 7,0, respectiv, în conformitate cu indicele McFarland. Ulterior, se transferă 1 mL de suspensie bacteriană sau fungică obţinută într-o eprubetă ce conţine 9 mL de apă distilată sterilă. Se amestecă conţinutul obţinut, după care se transferă 1 mL în eprubeta cu nr.2 din şirul de 5 eprubete ce conţin câte 9 mL de apă distilată sterilă. Din eprubeta cu nr.5 a şirului se ia câte 0,1 mL de suspensie bacteriană sau fungică, ceea ce reprezintă doza de însămânţare, şi se adaugă în fiecare eprubetă care conţine preparatele titrate. Ulterior, eprubetele cu preparatele titrate în care s-au introdus dozele de însămânţare ale bacteriilor sau fungului se plasează în termostat la temperatura de 35°C timp de 24 ore. A 2-a zi se analizează preliminar rezultatele obţinute. Ultima eprubetă din şir în care nu se atestă o creştere vizibilă a bacteriilor sau fungilor se consideră a fi concentraţia minimă inhibitorie (CMI) a preparatului. Pentru aprecierea concentraţiei minime bactericide (CMB) sau fungicide (CMF), conţinutul eprubetelor cu CMI şi a eprubetelor cu concentraţii mai înalte ale preparatelor se însămânţează pe agarul peptonat sau Sabouraud solid din cutiile Petri cu ajutorul ansei bacteriologice. Cutiile însămânţate se plasează în termostat la temperatura de 35°C pentru 24 ore. Concentraţia preparatelor care nu permit creşterea nici a unei colonii bacteriene sau fungice se consideră a fi concentraţia minimă bactericidă sau fungicidă a preparatului. Rezultatele activităţii antibacteriene ale compusului revendicat şi a compusului martor sunt prezentate în tabelul 3.

Tabelul 3

Rezultatele activităţii antibacteriene a compusului utilizat în revendicare şi a compusului martor DsamH2

Microorganismele testate Compusul martor: (DsamH2 0,5% în DMSO) Invenţia: (soluţia iniţială de 0,5%) CMB, % Ps. fluorescens 0,06 0,015 B.subtilis 0,06 0,007 X. campestris 0,06 0,015 E. amylovora 0,06 0,007 E. carotovora 0,06 0,015 CMF, % C.utilis 0,06 0,007 S.cerevisiae 0,06 0,015

Conform datelor din tabelul 3 sporul activităţii antibacteriene a invenţiei în comparaţie cu compusul martor a constituit 4…8 ori în dependenţă de specia bacteriană testată şi celei antifungice de 4…8 ori în dependenţă de specia de fungi testată. Aceste rezultate par a fi neaşteptate, deoarece s-ar părea ca anume DsamH2 să manifeste o activitate mai înaltă decât ((TDAGH2)2·MA·3H2O), dat fiind faptul că martorul conţine în molecula sa doi radicali de sulfanilamidă, compus cu o activitate antimicrobiană bine cunoscută şi foarte pronunţată.

În concluzie, compusul ((TDAGH2)2·MA·3H2O) poate fi utilizat în agricultură, în special, în calitate de remediu antibacterian contra tulpinilor fitopatogene de Xanthomonas campestris, Erwinia amylovora şi Erwinia carotovora.

1. Zvi Roppoport and Joel F. Liebman. The Chemistry of Hidroxylamines, Oximes and Hydroxamic Acids, Part 1, Wiley, 2009, p. 646.

2. Bedrettin Mercimek, Emine Ozcan, Ali Ihsan Pekacar. The synthesis and Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II), Cd(II) and UO2(VI) complexes of N,N'-bis(2Tolyl)Diaminoglyoxime and N,N'-bis(4Tolyl)Diaminoglyoxime. Synthesis and Reactivity in Inorganic and Metal-Organic Chemistry, 1995, vol. 25 (9), p. 1571-1579, găsit în Internet la data de 2021.02.09 URL: <https://www.researchgate.net/publication/244600564_The_Synthesis_and_NiII_CoII_CuII_ZnII_CdII_and_UO2_VI_COMPLEXES_OF_NN'BIS2TolylDiaminoglyoxime_and_NN'-bis4TolylDiaminoglyoxime>.

3. Rija A., Bulhac I., Coropceanu E., Gorincioi E., Calmîc E., Barbă A., Bologa O. Synthesis and spectroscopic study of some coordinative compounds of Co(III), Ni(II) and Cu(II) with dianiline- and disulfanilamideglyoxime. Chemistry Journal of Moldova, 2011, vol. 6(2), pp. 73-78.

4. Kurtoğlu M., İspir E., Kurtoğlu N. and Serin S. Novel vic-dioximes: Synthesis, complexation with transition metal ions, spectral studies and biological activity. Dyes and Pigments, 2008, vol. 77(1), pp. 75-80.

Claims (1)

1. Bis-(N,N′-bis(4-tolil)diaminoglioxim)-4-metilanilin-trihidrat pentru utilizare în calitate de remediu contra bacteriilor fitopatogene Xanthomonas campestris, Erwinia amylovora şi Erwinia carotovora.