MD4745C1 - Compusul 2,5,11,14-tetraazatriciclo-[13,3,1,16,10]-icosa-1(19),6,8,10(20),15,17-hexaen-3,4,12,13-tetraontetraoximă bis(N,N-dimetilformamidă) cu activitate antibacteriană şi antifungică - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la chimie, în particular la un solvat al tetraoximei 2,5,11,14-tetraazatriciclo-[13,3,1,16,10]-icosa-1(19),6,8,10(20),15,17-hexaen-3,4,12,13-tetraontetraoximă bis(N,N-dimetilformamidă) (TOxC·2dmf), care poate fi utilizat în calitate de ligand polidentat în scopul obţinerii compuşilor coordinativi noi cu structură originală şi supramoleculară, precum şi la microbiologie, pentru utilizare în calitate de remediu antibacterian şi antifungic.Conform invenţiei, se revendică compusul 2,5,11,14-tetraazatriciclo-[13,3,1,16,10]-icosa-1(19),6,8,10(20),15,17-hexaen-3,4,12,13-tetraontetraoximă bis(N,N-dimetilformamidă), care manifestă activitate antibacteriană şi antifungică.

Description

Invenţia se referă la chimie, în special la obţinerea solvatului cu N,N-dimetilformamida (DMF) a tetraoximei 2,5,11,14-tetraazatriciclo-[13,3,1,16,10]-icosa-1(19),6,8,10(20),15,17-hexaen-3,4,12,13-tetraontetraoximă bis(N,N- dimetilformamidă) (TOxC·2dmf), care poate fi utilizat în calitate de ligand polidentat în scopul obţinerii compuşilor coordinativi noi cu structură macrociclică şi supramoleculară, precum şi la microbiologie, pentru utilizarea acestui compus în calitate de remediu antibacterian şi antifungic.

Sunt cunoscuţi derivaţi de oxime heterociclice care datorită activităţii lor citotoxice, manifestă proprietăţi antibacteriene şi antifungice, la fel şi complecşii acestora cu metalele tranziţionale manifestă proprietăţi antibacteriene [1].

De asemenea, mai este cunoscut un alt compus din clasa dioximelor care a fost obţinut în urma condensării unei sări organice cu monoclorglioxima - (LH2) [2], neajunsul acestui compus oximic este lipsa activităţii antibacteriene şi antifungice, manifestând aceste proprietăţi doar complecşii în baza lui.

Este cunoscut compusul din clasa tetraoximelor - (2E,3E, 9E, 10E)-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecan-2,3,9,10-tetraontetraoximă, preparat prin reacţia templată la condensarea 1,3-propandiaminei şi cianogen-di-N-oxidului obţinut la agitarea (E, E)-diclorglioximei în CH2Cl2 cu Na2CO3 la -10°C. Compuşii coordinativi ai nichelului(II) şi cuprului(II) cu această tetraoximă manifestă activitate antibacteriană şi antifungică [3].

Neajunsul compusului respectiv constă în faptul că acesta nu există în stare liberă, el se obţine pe matrice de metale, există numai în stare coordinată la metal, din aceste cauze nefiind posibilă utilizarea ligandului liber (necoordinat la metale), inclusiv şi activitatea biologică a acestuia.

Este cunoscut compusul 2,5,11,14-tetraazatriciclo-[13,3,1,16,10]-icosa-1(19),6,8,10(20),15,17-hexaen-3,4,12,13-tetraontetraoximă (TOxC), care se obţine prin condensarea diclorglioximei cu 1,3-fenilendiamina în acetonitril [4]. Compusul obţinut are dezavantaje care constau în aceea că el se obţine în stare de pulbere, se separă greu de soluţia-mamă prin filtrare, acetonitrilul, prezentând un preţ de cost relativ mai mare datorită preţului ridicat al acetonitrilului faţă de N,N-dimetilformamidă (https://www.itwreagents.com/rest-of-world/en/product acetonitrile-reag-ph-eur-for-analysis-acs/131881), iar proprietăţile antibacteriene şi antifungice ale TOxC fiind necunoscute.

Este de asemenea cunoscut compusul de tipul dioximelor, obţinut la condensarea diclorglioximei cu sulfanilamida - (DsamH2) [5], care manifestă activitate biologică, rezultatele testării nu au fost publicate, dar sunt prezentate mai jos (Tabelul 2 ).

Compusul DsamH2 reprezintă aceeaşi clasă de substanţe organice - oximele, se obţine printr-o metodă analoagă ca şi obiectul invenţiei (TOxC·2dmf), reieşind din acelaşi precursor - diclorglioxima şi care conţine componenta sulfanilamidei, aceasta din urmă singură manifestând activitate biologică. Reieşind din aceste criterii considerăm DsamH2 ca cea mai potrivită soluţie apropiată pentru partea activităţii antibacteriene şi antifungice a obiectului invenţiei la aceleaşi specii de microorganisme.

Dezavantajul compusului DsamH2 constă în faptul că el conţine numai două grupe oximice (=NOH) şi manifestă o activitate antimicrobiană mai redusă decât compusul revendicat.

Problema tehnică rezolvată de invenţie constă în extinderea gamei de compuşi tetraoximici în formă cristalină uşor separabili prin filtrare, care să manifeste proprietăţi antibacteriene şi antifungice sporite.

Esenţa invenţiei constă în elaborarea compusului TOxC·2dmf, care prevede condensarea diclorglioximei cu 1,3-fenilendiamina, elementul nou fiind utilizarea în calitate de solvent a N,N-dimetilformamidei în loc de acetonitril, ceea ce conduce la obţinerea unui produs cristalin, uşor separabil prin filtrare, structura căruia a fost stabilită cu metoda difracţiei razelor X pe monocristal, produsul manifestând activitate antibacteriană şi antifungică amplificată.

Rezultatul tehnic al invenţiei constă în obţinerea unui compus - solvatul tetraoximei macrociclice, cristalin nou 2,5,11,14-tetraazatriciclo-[13,3,1,16,10]-icosa-1(19),6,8,10(20),15,17-hexaen-3,4,12,13-tetraontetraoximă bis(N,N-dimetilformamidă) (TOxC·2dmf), care manifestă activitate antibacteriană şi antifungică superioară.

Rezultatul tehnic obţinut se datorează faptului, că N,N-dimetilformamida este un solvent aprotonic dipolar mai eficient decât acetonitrilul, atât pentru componentele reactante utilizate la condensare (diclorglioxima şi 1,3-fenilendiamina), cât şi, în mod special, pentru produsul condensării, deaceea se obţine un produs cristalizabil, inclusiv şi în formă de monocristale cu calităţi potrivite pentru caracterizarea univocă, de exemplu prin metoda studiului cu raze X.

Avantajele invenţiei constau în sporirea proprietăţilor antibacteriene de 2…4 ori în dependenţă de specia bacteriană testată şi celei antifungice de 4 ori în comparaţie cu soluţia cea mai apropiată, totodată compusul este utilizat sub formă de un compus bine cristalizat şi stabil.

Invenţia este expusă în fig.1a), care reprezintă structura moleculară şi cristalină a solvatului TOxC·2dmf şi 1b) - un fragment din structura cristalină cu modul de împachetare a componentelor în cristal.

Exemple de realizare a invenţiei

Exemplul 1.

Sinteza glioximei

Glioxima a fost sintetizată conform metodei cunoscute în literatură (Olofson, R. A., & Michelman, J. S. Furazan*,1,2. The Journal of Organic Chemistry, 1965. Vol. 30(6), pp. 1854-1859).

Sinteza diclorglioximei

Diclorglioxima a fost sintetizată conform metodei descrise în literatură (Ungnade, H. E., Fritz, G., & Kissinger, L. W. Structure and physical properties of glyoximes. Tetrahedron, 1963. Vol. 19, sup. 1. pp. 235-248).

Sinteza compusului 2,5,11,14-tetraazatriciclo-[13,3,1,16,10]-icosa-1(19),6,8,10(20),15,17-hexaen-3,4,12,13-tetraontetraoximă bis(N,N-dimetilformamidă) (TOxC·2dmf).

Se prepară soluţia de amestec din 0,2 g (0,2 mmol) 1,3-fenilendiamină (Sigma-Aldrich) şi 0,31 g (0,2 mmol) diclorglioximă (sintetizată) în 10 mL etanol (soluţie de culoare portocalie) şi 3 mL DMF care se pune la agitare. Peste 10 min se adaugă 0,12 g Na2CO3 şi 1,5 mL H2O. În soluţie se formează un sediment de culoare cafeniu-roşietică. Pentru dizolvarea totală a carbonatului de sodiu, amestecul reactant se încălzeşte la temperatura de 45…50°C timp de 30…40 min. Amestecul se mai agită fără încălzire încă 2 ore. După agitare sedimentul de culoare galben-roşietică format se separă prin filtrare, iar filtratul este lăsat pentru cristalizare la temperatura camerei. Sedimentul separat se spală cu alcool etilic (cu 3 porţii a 2 mL), apoi cu eter dietilic (cu 3 porţii a 2 mL) şi se usucă la aer. După spălare şi uscare substanţa capătă culoare bej. S-a obţinut 0,12 g, randamentul reacţiei constituind 60%. Substanţa este solubilă în metanol, dimetilformamidă, dimetilsulfoxid şi insolubilă în apă, etanol, acetonitril şi eter dietilic. Din filtratul lăsat pentru cristalizare peste 4 zile s-au format cristale incolore de forma unui poliedru regulat, care au fost supuse difracţiei cu raze X.

Găsit, %: C 50,07; H 5,58; N 26,31.

Pentru C11H15N5O3

calculat, %: C 49,80; H 5,70; N 26,42.

Spectrul IR al TOxC·2dmf a fost înregistrat la spectrometrul Perkin-Elmer 100 FT-IR în intervalul 4000-400 cm-1 (suspensie în ulei de vazelină) şi ATR în intervalul 4000-650 cm-1.

Benzi de absorbţie, cm-1: 3199 (p), 2972 (p), 2902 (p), 1647 (m), 1602 (f.p), 1496 (p), 1448 (f.p), 1353 (s), 1313 (m), 1289 (m), 1240 (s), 1189 (s), 1161 (s), 1080 (m), 1045 (p), 999 (s), 958 (p), 938 (p), 899 (p), 882 (m), 820 (s), 780 (m), 727 (s), 690 (p), 662 (s), 640 (p), 550 (s), 488 (s), 447 (s), 420 (s); (intensitatea benzii de absorbţie, apreciată calitativ: f.p.- foarte puternică; p - puternică; m - medie; s - slabă).

În spectrul IR sunt prezente benzile de absorbţie ν(OH) la 3203 cm-1 care participă la formarea unor legături de hidrogen intramoleculare slabe şi ν(CH3) la 2972 cm-1 şi ν(CH) + ν(CHO) la 2897 cm-1, precum şi ν(C=O) participante la formarea legăturilor de hidrogen la 1648 cm-1 sunt caracteristice moleculelor de solvatare de dimetilformamidă (Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. Изд-во МИР, Москва, 1965, с.216). Pentru vibraţiile grupărilor oximice ν(C=N) şi ν(N-O) sunt atribuite benzile de absorbţie de la 1648 şi respectiv 937 cm-1. Pentru inelul aromatic sunt caracteristice benzile de absorbţie intense ν(C=C) în intervalul 1523 - 1447 cm-1 (Беллами Л. Инфракрасные спектры сложных молекул. Изд-во иностранной литературы, Москва, 1963, с.590). Pentru inelul aromatic 1,3-substituit aparţin şi benzile de deformare neplanare δ(CH) la 899 şi 780 cm-1. Faptul că condensarea a avut loc demonstrază lipsa benzii de intensitate înaltă ν(C-Cl) în regiunea 800 - 850 cm-1.

Spectrele 1H şi 13C RMN au fost înregistrate la spectrometrul Bruker la 400,13 MHz pentru 1H şi 100,61 MHz pentru 13C în DMSO-d6 folosind TMS ca referinţă internă. Deplasările chimice (δ) sunt prezentate în părţi per milion (ppm) şi raportate la vârful solventului nedeuterat rezidual (2,49 pentru 1H şi 39,70 pentru 13C).

În spectrul 1H RMN al TOxC·2dmf sunt prezente un triplet la 6,90 ppm, două dublete - la 6,37 şi 7,71 ppm şi un singlet la 5,69 ppm, care aparţin grupărilor (=H-) ale inelului aromatic. Semnalele la 9,36 şi 10,51 ppm sunt atribuite grupărilor iminică (=NH) şi respectiv hidroxilică (-OH). Semnalele intense la 2,51 şi 1,05 ppm aparţin grupărilor =CH- şi respectiv -CH3 ale dimetilformamidei solvatate.

Exemplul 2. Difracţia cu raze X.

Datele experimentale au fost obţinute la temperatura camerei (293(2)K) la difractometrul Xcalibur E (radiaţie - MoKα, monocromator de grafit). Parametrii celulei elementare, rafinate în baza datelor experimentale complete, au fost obţinute utilizând pachetul software CrysAlis Oxford Diffraction (CrysAlis RED, O. D. L., Version 1.171.34.76, 2003). Structura compusului a fost determinată prin metode directe şi rafinată prin metoda celor mai mici pătrate în varianta anizotropă pentru atomii nehidrogenici (SHELX-97) (Sheldrick G. M. A short history of SHELX. Acta Cristallographica Section A, 2008, 64(1), pp. 112. DOI:10.1107/s0108767307043930). Atomii de hidrogen sunt calculaţi geometric şi rafinaţi izotropic în modelul „corp solid” cu Uef = 1,2 Uech. sau 1,5 Uech. corespunzător atomilor O, N şi C. S-a stabilit că structura agentului de coordinare ToxC din TOxC·2dmf (fig. 1(a)) confirmă rezultatele evidenţiate în spectrele IR şi RMN. Datele cristalografice şi caracteristicile experimentale pentru compusul tetraoximic sunt prezentate în Tabelul 1.

Tabelul 1

Datele cristalografice şi caracteristicile experimentale pentru TOxC·2dmf

Parametrii Valorea Formula empirică C11H15N5O3 M 265,28 Sistemul cristalografic Triclinic Grupul spaţial P-1 a, Å 6,9940(5) b, Å 8,7940(8) c, Å 11,9818(8) °, o 101,291(7) β, o 99,668(6) γ, o 111,270(8) V, Å3 650,02(9) Z 2 ρ(calculată), g/cm3 1,355 Dimensiunea cristalului, mm 0,55x0,3x0,08 Numărul reflexelor colectate 4083 Factorul de divergenţă final R1 0,0446

Compusul TOxC·2dmf cristalizează în grupul spaţial triclinic P-1. Două molecule de m-fenilendiamină (mFDA) condensează alternativ cu două molecule de diclorglioximă (DClH2), formând astfel un compus macrociclic centrosimetric din 14 atomi. În grupările oximice sunt următoarele lungimi de legătură: N(1)-C(1) 1,286(2) Å; N(1)-O(1) 1,420(2) Å; N(2)-C(2) 1,289(2) Å; N(2)-O(2) 1,422(2) Å. Unghiurile de valenţă O(1)-N(1)-C(1) şi C(2)-N(2)-O(2) sunt 110,5(1)o şi 110,7(14)o. Distanţa dintre centrele inelelor aromatice din macrociclu constituie 3,51 Å, ca urmare acesta este stabilizat suplimentar de interacţiune de tip π···π. În cristal se pot evidenţia lanţuri formate de moleculele macrociclice prin intermediul legăturilor puternice de hidrogen O(2)-H···N(2) cu parametrii O(2)···N(2) 2,722(2) Å, H···N(2) 2,05 Å, unghiul OHN 139° (fig. 1(b)). Moleculele de DMF sunt legate cu compusul macrociclic prin legături puternice de hidrogen N(4)-H···O(3) şi O(1)-H···O(3) (fig. 1(b)), parametrii fiind: N(4)···O(3) 3,012(2) Å, H···O(3) 2,27 Å, unghiul NHO 145° şi O(1)···O(3) 2,746(2) Å, H···O(3) 1,98 Å, unghiul OHO 155°.

Exemplul 3. Evaluarea activităţii antibacteriene şi antifungice a compusului revendicat şi celei mai apropiate soluţii.

În calitate de bacterii-test pentru evaluarea activităţii antibacteriene au fost selectate tulpini nepatogene de Bacillus subtilis CNMN BB-01, Pseudomonas fluorescens CNMN-PFB-01 şi tulpini fitopatogene de Xanthomonas campestris, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora şi în calitate de fungi -test au fost selectaţi Candida utilis şi Saccharomyces cerevisiae.

Pentru evaluarea activităţii antibacteriene şi antifungice a fost utilizată metoda diluţiilor succesive duble care constă în aceea că la etapa iniţială se iau şiruri de 10 eprubete în care se introduc câte 1 mL de bulion peptonat pentru bacterii şi Sabouraud pentru fungi. Ulterior se picură 1 mL de preparat în prima eprubeta (din şirul de 10 eprubete). Se pipetează amestecul obţinut, după care 1 mL din acesta se transferă în eprubeta următoare, astfel că procedura se repetă până la eprubeta nr. 10 a şirului. În aşa mod, concentraţia preparatului iniţial se micşorează de 2 ori în fiecare eprubetă următoare. În acelaşi timp, se prepară culturi de 24 ore de microorganisme-test. Se prepară iniţial suspensii de culturi bacteriene şi fungice cu densităţile optice (D.O.) de 2,0 şi 7,0, respectiv, în conformitate cu indicele McFarland. Ulterior, se transferă 1 mL de suspensie bacteriană sau fungică obţinută într-o eprubetă ce conţine 9 mL de apă distilată sterilă. Se amestecă conţinutul obţinut, după care se transferă 1 mL în eprubeta cu nr.2 din şirul de 5 eprubete ce conţin câte 9 mL de apă distilată sterilă. Din eprubeta cu nr.5 a şirului se ia câte 0,1 mL de suspensie bacteriană sau fungică, ceea ce reprezintă doza de însămânţare, şi se adaugă în fiecare eprubetă care conţine preparatele titrate. Ulterior, eprubetele cu preparatele titrate în care s-au introdus dozele de însămânţare ale bacteriilor sau fungului se plasează în termostat la temperatura de 35°C timp de 24 ore. A 2-a zi se analizează preliminar rezultatele obţinute. Ultima eprubetă din şir în care nu se atestă o creştere vizibilă a bacteriilor sau fungilor se consideră a fi concentraţia minimă inhibitorie (CMI) a preparatului. Pentru aprecierea concentraţiei minime bactericide (CMB) sau fungicide (CMF), conţinutul eprubetelor cu CMI şi a eprubetelor cu concentraţii mai înalte ale preparatelor se însămânţează pe agarul peptonat sau Sabouraud solid din cutiile Petri cu ajutorul ansei bacteriologice. Cutiile însămânţate se plasează în termostat la temperatura de 35oC pentru 24 ore. Concentraţia preparatelor care nu permit creşterea nici a unei colonii bacteriene sau fungice se consideră a fi concentraţia minimă bactericidă sau fungicidă a preparatului. Rezultatele activităţii antibacteriene a compusului revendicat şi celei mai apropiate soluţii sunt prezentate în Tabelul 2.

Tabelul 2

Rezultatele activităţii antibacteriene şi antifungice a compusului revendicat şi celei mai apropiate soluţii

Microorganismele testate Cea mai apropiată soluţie: (DsamH2 0,5% în DMSO) Invenţia: N1(solutia initială-0,5% în DMSO) CMB, % Ps. fluorescens 0,06 0,03 B.subtilis 0,06 0,015 X. campestris 0,06 0,015 E. amylovora 0,06 0,015 E. carotovora 0,06 0,03 CMF, % C.utilis 0,06 0,015 S.cerevisiae 0,06 0,015

Conform datelor din tabel sporul activităţii antibacteriene a invenţiei în comparaţie cu soluţia cea mai apropiată a constituit 2…4 ori în dependenţă de specia bacteriană testată şi celei antifungice de 4 ori.

1. Zvi Rappoport and Joel F. Liebman. The Chemistry of hidroxylamines, oximes and hydroxamic acids, Part 1, Wiley, 2009, p. 646.

2. Kurtoğlu M., İspir E., Kurtoğlu N., Serin S. Novel vic-dioximes: Synthesis, complexation with transition metal ions, spectral studies and biological activity. Dyes and Pigments, 2008, vol. 77 (1), p. 75-80.

3. Mukerem Kurtoglu, Esin Ispir, Nurcan Kurtoglu, Sevil Toroglu, Selahattin Serin. New soluble coordination chain polymers of nickel(II) and copper(II) ions and their biological activity. Tranzition Metal Chemistry, 2005, vol. 30 (6), p.765-770.

4. Kakanejadifard A., Sharifi A., Delfani F., Ranjbar B., Naderimanesh H. Synthesis of Di and Tetraoximes from the Reaction of Phenylendiamines with Dichloroglyoxime. Iranian Journal of Chemistry and Chemical Engineering, 2007, vol. 26 (4), p. 63-67.

5. Rija A., Bulhac I., Coropceanu E., Gorincioi E., Calmîc E., Barbă A., Bologa O. Synthhesis and spectroscopic study of some coordinative compounds of Co(III), Ni(II) and Cu(II) with dianiline- and disulfanilamideglyoxime. Chemistry Journal of Moldova, 2011, vol. 6 (2), p. 73-78.

Claims (2)

1. Compusul 2,5,11,14-tetraazatriciclo-[13,3,1,16,10]-icosa-1(19),6,8,10(20),15,17-hexaen-3,4,12,13-tetraontetraoximă bis(N,N-dimetilformamidă).

2. Compus, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că manifestă activitate antibacteriană şi antifungică.