MD4132587T2 - Conjugat HA-paclitaxel pentru tratamentul mezoteliomului - Google Patents

Abstract

Conjugat HA-paclitaxel pentru utilizare în tratamentul loco-regional al mezoteliomului, adică al mezoteliomului pleural malign, mezoteliomului pericardial şi mezoteliomului peritoneal, preferabil mezoteliomului pleural malign, şi compoziţii farmaceutice în legătură cu aceasta sunt descrise.

Description

OBIECTUL INVENŢIEI

Prezenta invenţie descrie conjugatul de acid hialuronic la paclitaxel şi compoziţia care cuprinde sau constă dintr-un astfel de conjugat asociat cu diluanţi/excipienţi acceptabili farmacologic, pentru utilizare în tratamentul loco-regional al mezoteliomului, în special pleural malign.

DOMENIUL INVENTIEI

Termenul membrană seroasă sau tunică înseamnă un anumit ţesut format dintr-un epiteliu simplu de pavaj cunoscut sub numele de mezoteliu susţinut de un ţesut conjunctiv subiacent, vascularizat şi inervat. Funcţia membranei seroase este de a acoperi organele toracelui şi abdomenului, de aceea se poate distinge în visceral, stratul sau foaia care acoperă organul, şi parietal, stratul sau foaia exterioară care este îndreptată spre şi căptuşeşte peretele; între cele două straturi este identificată o cavitate virtuală cunoscută sub denumirea de cavitate seroasă care conţine cantităţi moderate de lichid seros produs de mezoteliu, în timp ce ţesutul conjunctiv subiacent asigură alimentarea cu sânge şi nervi fiind mezoteliul complet lipsit de vase de sânge şi nervi.

Pe baza organului sau a peretelui acoperit, se distinge o membrană seroasă

• care acoperă inima şi mediastinul, cunoscută sub numele de pericard; • care acoperă plămânii şi peretele toracic, cunoscută sub numele de pleură; • care acoperă peretele abdominal şi organele conţinute în acesta, cunoscută sub numele de peritoneu; • care acoperă testiculul, cunoscută sub numele de tunică vaginală; • care acoperă, în cele din urmă, uterul, cunoscută sub numele de perimetru. Pleura este aşadar o membrană seroasă cu perete dublu care acoperă şi aderă la peretele interior al toracelui cu foaia parietală şi la peretele distal al fiecărui plămân cu foaia sa viscerală. Neoplasmul care provine din celulele mezoteliului se numeşte mezoteliom şi, prin urmare, poate proveni din torace, abdomen şi, foarte rar, din cavitatea din jurul inimii şi din membrana care acoperă testiculele. Mezoteliomul este o tumoră rară, reprezentând mai puţin de 1% din totalul bolilor oncologice chiar dacă incidenţa sa este în continuă creştere cu 2,2 cazuri la milion de oameni; este un neoplasm foarte agresiv iar cea mai frecventă formă este cea care afectează pleura: în acest caz este definit ca mezoteliom pleural malign (MPM) care reprezintă aproximativ 80% din totalul cazurilor de mezoteliom, cazurile de mezoteliom peritoneal, pericardic şi testicular fiind mai rare; mai frecvent la bărbaţi, incidenţa mezoteliomului creşte odată cu vârsta cu 75% dintre pacienţi având vârsta peste 65 de ani. Cel mai important factor de risc pentru mezoteliom pleural (dar în general pentru toate tipurile de mezoteliom) este reprezentat de expunerea la azbest: într-adevăr, majoritatea acestor tumori afectează persoanele care au intrat în contact cu această substanţă în principal la locul de muncă, sau care locuiesc cu oameni care lucrează cu ea. Azbestul este un mineral natural cu o structură fibroasă aparţinând clasei chimice a silicaţilor şi, datorită rezistenţei sale deosebite la căldură, a fost utilizat pe scară largă în trecut pentru etanşarea şi izolarea acoperişurilor (într-un material cunoscut sub numele de Eternit), la nave şi trenuri, în constructii (ţigle, pardoseli, vopsele...), la costume de pompieri, la autoturisme (componente mecanice si vopsele) şi în alte sectoare. Când acest mineral este fragmentat, de exemplu în timpul extracţiei şi prelucrării mineralelor sau pentru uzura materialului care îl conţine, se produce o pulbere foarte fină rămasă în suspensie în aer chiar şi pentru o perioadă lungă de timp şi care este uşor de inhalat. Această pulbere poate deteriora celulele mezoteliale provocând (în unele cazuri) cancer chiar şi la zeci de ani de la expunere. Alţi factori de risc pentru mezoteliom sunt: • virusul simian SV40, utilizat în vaccinurile poliomielitei între 1955 şi 1963; • dioxid de toriu utilizat între anii 1920 şi 1950; • radiatii către torace si abdomen.

(Sekido Y. şi colab., Carcinogenesis, 2013, 34(7):1413-9; Remon J. et al., Cancer Treat Rev, 2013, 39(6):584-91).

Tratamentul mezoteliomului depinde în general de locul tumorii, stadiul bolii, vârsta pacientului şi starea generală de sănătate. Opţiunile standard de tratament includ chirurgie, radioterapie şi chimioterapie.

În general, în stadiul I MPM, tumora este limitată la pleura parietală şi nu este prezentă în ganglionii limfatici; în stadiul II afectează şi pleura viscerală, plămânul sau diafragma; în stadiul III, tumora a invadat primul strat al peretelui toracic, o parte a mediastinului sau un punct de pe peretele toracic; poate afecta, de asemenea, suprafaţa exterioară a pericardului şi a ganglionilor limfatici de pe una dintre cele două părţi ale toracelui; în stadiul IV, tumora a ajuns în alte organe (metastaze) precum ficatul, creierul, oasele sau ganglionii limfatici de pe ambele părţi ale toracelui.

Conform studiilor clinice recente, chimioterapia poate fi considerată ca singurul tratament capabil să prelungească (cel puţin parţial) viaţa pacientului, îmbunătăţind, deşi limitat, calitatea acesteia. Medicamentele aprobate pentru o astfel de utilizare, utilizate în mod obişnuit singure (sau mai des în combinaţie), sunt pemetrexed (Alimta®), cisplatină şi raltitrexed (Tomudex®); mitomicina, vinorelbina şi gemcitabina sunt în schimb încă în stadiu experimental, cu toate acestea, mezoteliomul pleural malign MPM (ca toate celelalte forme de mezoteliom) este în general refractar la astfel de tratamente şi rezultatele obţinute sunt modeste (Stahel RA. şi colab., Ann Oncol., 2015, 26(8):1649-60). Agenţii chimioterapeutici au, de asemenea, efecte secundare foarte debilitante şi, prin urmare, există multe incertitudini şi chiar contraindicaţii cu privire la oportunitatea de a începe chimioterapia la diagnosticul sau la debutul simptomelor precoce ale MPM.

În Sasai Masao şi colab., ANTICANCER RESEARCH, vol. 36, nr. 3, paginile 907-912, un conjugat de acid hialuronic şi un compus de bor este utilizat în tratamentul mezoteliomului.

Până în prezent nu există nicio terapie capabilă să trateze sau să încetinească semnificativ mezoteliomul pleural malign, este posibilă doar reducerea masei tumorale a acestuia şi, în consecinţă, prelungirea supravieţuirii pacientului cu câteva luni. Cele mai de succes proceduri implică stadiile incipiente ale bolii şi combină chimioterapia preoperatorie cu procedura chirurgicală şi radioterapia ulterioară postoperatorie. Cu toate acestea, o astfel de abordare poate fi propusă numai pacienţilor foarte tineri fără boli concomitente. În orice caz, studiile adecvate care să demonstreze un beneficiu eficient în ceea ce priveşte prelungirea vieţii nu sunt încă disponibile. Din păcate, timpul mediu de supravieţuire după diagnostic încă este de 6-9 luni fără chimioterapie, 12 luni cu o astfel de terapie.

Având în vedere motivele de mai sus, sunt testate noi abordări farmaceutice, cum ar fi, de exemplu, imunoterapia sau tratamente care vizează direct tratamentul neoplasmului prin utilizarea sistemelor de livrare a medicamentelor. Într-adevăr, astfel de sisteme pot transporta medicamentele direct la locul tumorii permiţând tratamentul neoplasmului la doze mai mici de agent chimioterapeutic decât un tratament sistemic, prin urmare cu o toxicitate mai mică şi rezultând o calitate a vieţii mai bună pentru pacient, dar, mai ales, astfel de sisteme, atunci când sunt cu adevărat eficiente, sunt capabile să mărească semnificativ speranţa de viaţă a unui pacient cu cancer.

Acidul hialuronic este unul dintre polimerii (şi polizaharidele) folosiţi în formarea acestor sisteme de livrare a medicamentelor atât ca polimer asociat, cât şi ca polimer legat chimic la numeroase categorii de medicamente antineoplazice (Liao YH. şi colab., Drug Deliv., 2005, 12(6):327-42). HA este o hetero-polizaharidă compusă din resturi alternante de acid D-glucuronic şi N-acetil-D-glucozamină, este un polimer cu lanţ liniar cu o greutate moleculară cuprinsă între 50.000 şi 13 × 106 Da, în functie de sursa din care se obtine si de metodele de preparare folosite. Este prezent în mod natural în gelurile pericelulare, în substanţa esenţială a ţesutului conjunctiv al organismelor vertebrate, în lichidul sinovial articular, în umoarea vitroasă şi în cordonul ombilical. HA joaca un rol important in organismul biologic, de exemplu ca suport mecanic al celulelor multor tesuturi precum pielea, tendoanele, muschii si cartilajele, fiind componenta principala a matricei extracelulare, dar actionand si functii ulterioare precum hidratarea tesuturilor, lubrifierea celulelor, migrarea şi diferenţierea (Weigel P. şi colab., J Theoretical Biol, 1986:219-234). Printre sistemele de livrare a medicamentelor care utilizează HA, conjugatul de paclitaxel cu acid hialuronic (HA) derivat cu molecule de hidrazidă legate de gruparea carboxil a HA prin legătură amidă (Luo Y. şi colab., Biomacromolecules, 2000, 1(2):208-218) este cunoscut: cu toate acestea, până în prezent nu există studii preclinice sau clinice care să fi demonstrat eficacitatea unui astfel de derivat.

Sistemul constituit din HA conjugat cu paclitaxel printr-un distanţier (EP2045270) este deasemenea cunoscut: un astfel de conjugat a fost testat atât în studii in vitro (şi în special în cancerul vezicii urinare, cancerul de sân şi celulele cancerului ovarian) care dovedesc că ar fi cel puţin la fel de activ ca medicamentul de referinţă şi în protocoale clinice in vivo (în desfăşurare în prezent) privind tratamentul cancerului neinvaziv al vezicii urinare (IT 102018000009731).

Conjugarea cu HA face paclitaxelul solubil şi, prin urmare, administrarea de paclitaxel se poate întâmpla fără multiplele fenomene de hipersensibilitate care apar în mod normal în timpul utilizării medicamentului datorită prezenţei Cremophor EL, solventul de solubilizare utilizat în prezent în protocoalele clinice standard, a cărui prezenţă este necesară tocmai pentru că ingredientul activ este liposolubil (Taxol®). Paclitaxelul este un agent anti-cancer (Huizing MT şi colab., Cancer Inv., 1995, 13: 381-404) exercitându-şi acţiunea antiproliferativă acţionând asupra organizării microtubulilor sistemului citoscheletic celular împiedicându-l să se reorganizeze normal în timpul diviziunii mitotice (Manfredi JJ şi colab., J Cell Biol, 1982, 94:688-696); principalele sale indicaţii terapeutice fiind tratamentul cancerului de sân, cancerului pulmonar, cancerului ovarian, cancerului de vezică urinară, cancerului de prostată şi endometrial şi necuprinzând tratamentul mezoteliomului.

În conjugatul HA-paclitaxel, legătura dintre paclitaxel şi HA permite medicamentului să ajungă direct la suprafaţa membranei celulei tumorale caracterizată printr-o supraexprimare a receptorului HA, CD44 (Isacke CM. şi colab., Int J Biochem Cell Biol, 2002, 34:718-21). În consecinţă, paclitaxelul conjugat cu HA este capabil să se lege în mod specific la CD44 al celulei tumorale fiind astfel capabil să intre în citoplasma celulară în care, prin hidroliza medicamentului de legătură/HA, acesta este activat. Acest mecanism de transport selectiv al medicamentului este definit de „direcţionarea» la celula ţintă.

DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI

Obiectul prezentei invenţii este conjugatul HA-paclitaxel pentru utilizare în tratamentul loco-regional al mezoteliomului, prin urmare mezoteliom pleural malign, mezoteliom pericardic şi mezoteliom peritoneal, în special pentru utilizare în tratamentul MPM, în care un astfel de conjugat HA-paclitaxel are o legătură ester între carboxilul acidului hialuronic (HA) şi un distanţier, legat la rândul său printr-o legătură ester prin carboxilul său la gruparea hidroxil la carbonul C2' al paclitaxelului, în care distanţierul introdus este acidul 4-bromobutiric şi în care gradul de derivatizare al paclitaxelului în conjugatul HA-paclitaxel este în intervalul care variază de la 15% până la 21% în greutate (g/g), şi preferabil de la 16% până la 20% (g/g).

În continuare, în prezenta descriere, gradul de derivatizare (sau esterificare) al conjugatului menţionat mai sus înseamnă procentul în greutate de paclitaxel în raport cu greutatea conjugatului HA-paclitaxel.

Prin urmare, 100 mg de conjugat cu grad de derivatizare cuprins între 15% şi 21% g/g, va conţine 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg sau 20 mg sau 21 mg de paclitaxel chimioterapeutic, în funcţie de gradul de derivatizare indicat (pentru a exemplifica aceasta în continuare, gradul de derivatizare la 20% g/g conţine 20 mg de paclitaxel la 100 mg de conjugat); este totuşi evident pentru persoana de specialitate că, la sfârşitul unor astfel de procese de sinteză industrială, poate apărea o mică variaţie a raporturilor de greutate între molecule, de aceea, în continuare, solicitantul, descriind şi revendicând domeniul de derivatizare a conjugatului menţionat mai sus, cuprins între 15% şi 21% g/g, intenţionează să revendice toate valorile procentuale raportate cuprinzând ±1%: cu titlu de exemplu, gradul de 20% g/g se intenţionează, în consecinţă, să fie considerat ca 20% ± 1%.

Conjugatul HA-paclitaxel pentru utilizarea revendicată mai sus a fost preparat conform unui procedeu de sinteză cunoscut în stadiul tehnicii aşa cum este descris în EP2045270 şi, pentru gradul de derivatizare de 20%, îmbunătăţit în IT 102018000009731.

În termeni largi, într-un astfel de proces de sinteză a conjugatului menţionat mai sus, distanţierul/linkerul acid 4-bromobutiric este introdus între acidul hialuronic şi paclitaxel prin formarea legăturii esterice între carboxilul acidului hialuronic şi distanţier, respectivul distanţierul fiind legat la rândul său (întotdeauna prin legătură esterică) prin carboxilul său de gruparea hidroxil la carbonul C2' al paclitaxelului, mai precis gruparea carboxil a acidului 4-bromobutiric, prin activare cu un agent de activare şi în prezenţa unui catalizator, formează o legătură ester cu funcţia hidroxil la carbonul C2' al paclitaxelului; ulterior intermediarul astfel obţinut reacţionează cu o sare de HA, în condiţii adecvate, dând naştere la substituţia nucleofilă a COO- a HA la carbonul legat de bromul linkerului distanţier. În acest fel, legătura esterică este formată între HA şi elementul de legătură distanţier legat anterior la paclitaxel.

HA utilizat pentru sinteza unui astfel de conjugat HA-paclitaxel poate proveni din orice sursă, de exemplu prin extracţie din faguri de cocoş (EP0138572, WO2018020458), pe cale fermentativă (EP0716688), sau pe cale biotehnologică (EP2614088, EP2614087) şi având o greutate moleculară medie în greutate (MW) cuprinsă între 400 şi 3x106Da, în special de la 400 la 1 × 106Da, chiar mai ales de la 140.000 la 250.000 Da (greutatea moleculară medie înseamnă cea calculată cu metoda „vâscozităţii intrinsece» (Terbojevich şi colab., Carbohydr Res, 1986, 363-377).

De preferinţă, HA utilizat pentru sinteza conjugatului HA-paclitaxel pentru utilizare conform prezentei invenţii este un HA fermentativ cu o greutate medie MW cuprinsă între 140.000 şi 250.000 Da.

De preferinţă, conjugatul HA-paclitaxel pentru utilizare conform prezentei invenţii are un grad mediu de derivatizare de 20% g/g.

Un alt obiect al prezentei invenţii este, de asemenea, o compoziţie farmaceutică constând în esenţă din conjugatul HA-paclitaxel descris mai sus, asociat cu diluanţi/excipienţi acceptabili farmacologic, de preferinţă o compoziţie farmaceutică formulată în apă izotonă sterilă, care conţine 5% g/v glucoză pentru utilizare în tratamentul loco-regional al mezoteliomului, deci al mezoteliomului pleural malign, mezoteliomului pericardic şi mezoteliomului peritoneal, de preferinţă pentru utilizare în tratamentul mezoteliomului pleural malign.

O astfel de compoziţie farmaceutică este astfel formulată ca soluţie apoasă sterilă şi izotonă, constând în esenţă din conjugatul însuşi.

Solicitantul descrie şi revendică conjugatul pentru utilizarea de mai sus în tratamentul loco-regional al tuturor formelor de mezoteliom cunoscute şi mai sus citate şi, de preferinţă, utilizarea în tratamentul loco-regional al MPM, deoarece efectul sinergic al HA şi al paclitaxelului legate chimic în conjugatul obiect al invenţiei, atât în testele efectuate in vitro cât şi in vivo vs paclitaxel neconjugat, este demonstrat mai jos.

Rezultatele obţinute, atât în ceea ce priveşte IC50 pentru studiile in vitro cât şi exprimate ca valori de bioluminiscenţă ca indice al mărimii masei tumorale la animalele tratate, demonstrează în mod surprinzător potenţa farmacologică a conjugatului HA-paclitaxel şi efectul sinergic al conjugatului acid hialuronic cu agent chimioterapeutic faţă de paclitaxel neconjugat în tratamentul mezoteliomului, în special a mezoteliomului pleural.

Un astfel de rezultat este cu atât mai important având în vedere tratamentul loco-regional destinat a fi revendicat pentru un astfel de conjugat: această cale de administrare, adică intrapleurală, sau intraperitoneală şi intrapericardică, permite de fapt administrarea conjugatului direct la masa tumorală în doze la nivel inferior/analog sau chiar mai mari decât agentul chimioterapeutic de referinţă, pentru a obţine o eficacitate terapeutică mai mare decât medicamentul de referinţă cu menţinerea unui profil ridicat de siguranţă.

Conjugatul HA-paclitaxel rămâne într-adevăr ca depozit în cavitatea de administrare direct în contact cu masa tumorală timp prelungit, permiţând astfel concentrarea acesteia în principal la locul de acţiune (şi nu la nivel sistemic), maximizând astfel interacţiunea cu tumora fără a deteriora ţesutul înconjurător, reducând efectele colaterale. Se foloseşte şi mecanismul de transport selectiv al medicamentului către celula tumorală pentru exprimarea ridicată a CD44 pe suprafaţa unor astfel de celule, prin acţiunea de „ţintire» a acidului hialuronic.

Testele pe animale descrise mai jos demonstrează în special eficacitatea in vivo a unui astfel de conjugat HA-paclitaxel, în care o astfel de eficacitate va duce la oameni nu numai la creşterea supravieţuirii persoanelor bolnave, ci şi la o mai bună calitate a vieţii pentru o categorie de pacienţi care, după cum s-a raportat anterior, au o speranţă de viaţă extrem de limitată chiar şi după tratamentul cu chimioterapie.

Exemplul 1

Citotoxicitatea conjugatului HA-paclitaxel în celulele de mezoteliom vs paclitaxel

Procedura experimentala: a fost evaluată activitatea citotoxică a conjugatului HA-paclitaxel obiect al invenţiei in vitro prin efectuarea testului MTT pe linii celulare de mezoteliom uman H2052, H28 şi H2452 disponibile comercial, în care toate aceste linii celulare exprimă receptorul CD44 pentru acid hialuronic. Conjugatul folosit pentru un astfel de proces a fost preparat conform IT 102018000009731, deci cu un grad mediu de derivatizare de 20% g/g pornind de la un HA fermentativ cu o greutate medie MW cuprinsă între 140.000 şi 250.000 Da.

Celulele au fost placate (Ziua 0) în placă cu mai multe godeuri cu 96 de godeuri cu fund plat (3000 de celule per godeu) în mediu de cultură EMEM (SIGMA, Saint Louis, Missouri, SUA) şi ulterior au fost incubate timp de 24 de ore la 37°C în prezenţa a 5% CO2. A doua zi (Ziua 1) mediul a fost schimbat furnizând celulelor mediu EMEM proaspăt conţinând alternativ paclitaxel, ca martor, sau conjugatul HA-paclitaxel în diluţii adecvate. După două zile de incubare (Ziua 3), fiecare godeu care conţine celulele a fost tratat cu 100 µl de reactiv bromură de 3-2,5-difeniltetrazoliu (5 mg/ml în DMEM) timp de 90 de minute. Ulterior, la îndepărtarea reactivului din fiecare godeu şi adăugarea corespunzătoare a 100 µl de DMSO, s-a măsurat absorbanţa sării de formazan (albastru, produsă prin reacţia de rupere a inelului de tetrazoliu MTT, realizată de enzima mitocondrială „succinat dehidrogenază" prezentă numai în celulele viabile) la lungimea de undă de 570 nm de către un cititor cu mai multe plăci. O astfel de analiză MTT, larg cunoscută persoanei de specialitate, permite evaluarea viabilităţii celulelor tratate cu conjugat faţă de cele tratate doar cu paclitaxel şi, prin urmare, determinarea susceptibilităţii celulelor menţionate mai sus la probele testate. Datele au fost apoi normalizate la control şi valoarea IC50 a fost calculată în µg/ml de conjugat (exprimată în termeni de echivalenţi de paclitaxel) comparativ cu paclitaxel neconjugat.

Rezultatele sunt rezumate în tabelul de mai jos unde este clar evident că conjugatul HA-paclitaxel prezintă o activitate (deci o eficacitate antitumorală) de până la 65-70 de ori mai mare decât cea a paclitaxelului neconjugat.

IC50 Normalizat, µg/ml

HA-paclitaxel paclitaxel H2452 0,0122 0,8 H28 0,033 0,787 H2052 0,0342 0,225

Exemplul 2

Studiu in vivo pe şoareci NSG imunodeficienţi

Liniile celulare ale mezoteliomului uman H2052 au fost transduse cu un vector lentiviral (metodă prin care genele pot fi inserate în celule folosind lentivirusul) care conţine un promotor bidirecţional care permite exprimarea ridicată şi coordonată a două gene reporter pentru sinteza luciferazei şi eGFP (proteina verde fluorescentă îmbunătăţită), aşa cum este descris în Amendola şi colab., Nat Biotechnol 2005, 23:108-16: luciferaza este o enzimă care catalizează oxidarea luciferinei care oxidând emite energie (electroni) sub formă de radiaţie luminoasă şi o astfel de reacţie are o sensibilitate ultra-înalta; eGFP derivă din meduza Aequorea victoria, şi este capabil să emită lumină verde strălucitoare atunci când este expus la anumite lungimi de undă; ambele astfel de proteine sunt folosite mai jos ca „sistem marker» pentru celulele mezoteliom umane H2052 transduse ca mai sus, pentru a identifica masa tumorală care se formează la animalele cărora li s-au injectat astfel de celule şi pentru a determina dimensiunile acesteia şi creşterea în timp printr-un senzor de bioluminiscenţă adecvat.

Celulele au fost incubate timp de 6 ore într-un amestec de mediu complet (RPMI + 10% FBS, 1% HEPES, L-glutamină şi penicilină/streptomicina) care conţine vectorul menţionat mai sus şi sulfat de protamină. La sfârşitul a 6 ore de incubare, supernatanţii au fost reintegraţi cu mediu complet. După 5 zile, efectul transducţiei a fost evaluat prin citometrie în flux.

Celulele au fost apoi extinse şi subdivizate pentru a izola populaţia cu o expresie mai mare a genelor reporter. Astfel de celule transduse şi selectate au fost apoi injectate în peritoneul şoarecilor NSG, (adică, imunodeficienţi care, prin urmare, permit grefarea unei game largi de celule canceroase umane), 10 şoareci/probă, care au fost apoi supuse următorului tratament:

1° probă tratată cu HA-paclitaxel 40mg/Kg, administrare loco-regională pe cale intraperitoneală (ip);

2° probă tratată cu paclitaxel 10mg/Kg, prin administrare intravenoasă (iv) pentru 3 tratamente, trecând apoi la administrare ip din cauza tolerabilitatii foarte slabe a tratamentului iv cu paclitaxel al şoarecilor NSG;

3° probă tratată cu paclitaxel 10mg/Kg, administrare loco-regională pe cale intraperitoneală (ip);

4° probă netratată;

prin administrare săptămânală timp de 10 săptămâni.

Toate animalele tratate au fost monitorizate prin detectarea bioluminiscenţei emise de zona lor tumorală tratată cu conjugat HA-paclitaxel, pentru a evalua în timp dimensiunea (şi deci creşterea) tumorii cu referire la animalele netratate cu niciun agent chimioterapeutic şi la cele tratate cu paclitaxel neconjugat.

Rezultatele au fost reprezentate grafic în Figura 1, unde este clar evident că luminiscenţa (exprimată în fotoni/sec, Ph/sec) animalelor netratate atinge valori medii de ordinul mărimii 1×10.12 în ziua 100 de supravieţuire, indicând deci dimensiunea/creşterea atinsă de tumora netratată; probele 2 şi 3, ambele tratate cu paclitaxel neconjugat cu moduri diferite de administrare, sunt comparate cu o astfel de probă controlată: această comparaţie indică un rezultat important pentru ambele, deoarece valorile medii de luminescenţă atinse se dovedesc a fi de ordinul mărimii de 1×1011, deci mai mici decât netratat, indicând o masă tumorală redusă comparativ cu controlul.

Cu toate acestea, rezultatul conjugatului HA-paclitaxel este cu totul surprinzător, deoarece din ziua 14 până la ziua 125 de supravieţuire, luminescenţa scade dramatic şi rămâne neglijabilă în timp. Aceste date complet neaşteptate arată reducerea semnificativă a tumorii atât faţă de controlul netratat, cât şi faţă de animalele tratate cu agent chimioterapeutic neconjugat administrat iv şi ip, demonstrând eficacitatea totală a conjugatului în sine. În figura 1, data de luminescenţă legată de conjugatul HA-paclitaxel este reprezentată în a treia din cele patru coloane corespunzătoare zilelor de supravieţuire raportate în abscisă.

În Figura 2 sunt raportate în schimb datele obţinute după 139 de zile de observaţie, unde este clar evident că detectarea bioluminiscenţei în Ph/sec emisă de zona lor tumorală tratată şi, prin urmare, reprezentativă pentru masa tumorală, rămâne în jur de 1-2×10.11 la şoarecii trataţi cu paclitaxel neconjugat, în timp ce la şoarecii trataţi cu conjugat această valoare este extrem de mică şi apropiată de 0, indicând prin urmare o reducere aproape completă a masei tumorale.

Prin rezultatele discutate mai sus, solicitantul a demonstrat potenţa farmacologică şi, prin urmare, eficacitatea conjugatului HA-paclitaxel în tratamentul loco-regional al mezoteliomului, în special al MPM, mezoteliomului peritoneal şi pericardic, deoarece este capabil să determine reducerea semnificativă a masei tumorale, crescând în consecinţă supravieţuirea pacientului şi calitatea vieţii acestuia.

Claims (8)

1. Un conjugat HA-paclitaxel pentru utilizare în tratamentul loco-regional al mezoteliomului, în care respectivul conjugat acid hialuronic-paclitaxel are o legătură ester între carboxilul acidului hialuronic (HA) şi un distanţier, legat la rândul său printr-o legătură ester prin carboxilul său la gruparea hidroxil la carbonul C2' al paclitaxelului, în care distanţierul introdus este acid 4-bromobutiric, în care gradul de derivatizare a paclitaxelului în conjugatul HA-paclitaxel este în intervalul care variază de la 15% la 21% în greutate/greutate (g/g) şi în care HA utilizat pentru sinteza conjugatului HA-paclitaxel este un HA fermentativ cu o greutate medie MW variind de la 140.000 la 250.000 Da.

2. Conjugatul HA-paclitaxel pentru utilizare conform revendicării 1, în care mezoteliomul este mezoteliom pleural malign, mezoteliom pericardic şi mezoteliom peritoneal,

3. Conjugatul HA-paclitaxel pentru utilizare conform revendicării 1, în care mezoteliomul este mezoteliom pleural malign.

4. Conjugatul HA-paclitaxel pentru utilizare conform uneia sau mai multor revendicări anterioare, în care calea de administrare este intrapleurală sau intraperitoneală şi intrapericardică.

5. Conjugatul HA-paclitaxel pentru utilizare conform uneia sau mai multor revendicări anterioare, în care gradul de derivatizare a paclitaxelului în conjugatul HA-paclitaxel variază de la 16% la 20% g/g.

6. Conjugatul HA-paclitaxel pentru utilizare conform uneia sau mai multor revendicări anterioare, în care gradul de derivatizare a paclitaxelului în conjugatul HA-paclitaxel este egal cu 20% g/g.

7. Compoziţie farmaceutică, constând în esenţă dintr-un conjugat HA-paclitaxel pentru utilizare conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 6, asociat cu diluanţi/excipienţi acceptabili farmacologic.

8. Compoziţie farmaceutică pentru utilizare conform revendicării 7, în care respectiva compoziţie farmaceutică este formulată în apă izotonă sterilă, conţinând 5% g/v glucoză.