MD4107293T2 - Tulpina de Cutibacterium acnes și utilizări medicale asociate - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la o tulpină bacteriană selectată de Cutibacterium acnes şi/sau un perete celular din aceasta sau la un postbiotic al tulpinii şi la utilizările medicale sau nutriţionale ale acesteia. Invenţia se referă, de asemenea, la compoziţii farmaceutice sau nutriţionale care conţin tulpina, peretele celular sau postbioticul din acestea pentru prevenirea sau tratamentul bolilor inflamatorii cum ar fi dermatita sau psoriazisul sau infecţiile, în special infecţiile fungice sau bacteriene ale pielii sau ale mucoaselor.

Description

DOMENIUL INVENŢIEI

Prezenta invenţie se referă la o tulpină bacteriană selectată aparţinând genului Cutibacterium, specie acnes şi la utilizarea medicală a acesteia şi la compoziţii farmaceutice şi nutriţionale care conţin aceeaşi tulpină.

Prezenta invenţie îşi are originea în domeniul microbiologic şi îşi găseşte aplicaţii în domeniul farmaceutic, cosmetic şi nutriţional.

În mod specific, invenţia se referă fie la o tulpină selectată de Cutibacterium acnes, fie la postbiotice şi fragmente de perete celular ale tulpinii care, prin componente microbiene structurale şi/sau prin producerea de substanţe, promovează creşterea celulelor fibroblaste. Tulpina conform invenţiei, fragmentele din peretele acesteia şi postbioticele acesteia au activităţi antiinflamatorii şi antibacteriene. De preferinţă, tulpina bacteriană selectată sau fragmentele din peretele său sunt pentru aplicare locală pentru tratarea afecţiunilor dermatologice, infecţiilor sau afecţiunilor pielii.

CADRUL INVENŢIEI

Inflamaţia este în esenţă un răspuns biologic la un stimul dăunător sau o leziune a unui ţesut al organismului, care poate fi cauzată de cauze externe, cum ar fi contactul cu agenţi iritanti sau microorganisme. Inflamaţia este considerată ca un răspuns protector al organismului care vizează eliminarea cauzei leziunilor tisulare, curăţarea ţesuturilor necrotice deteriorate de la insulta iniţială şi procesul inflamator şi iniţierea reparaţiei ţesuturilor. Acest răspuns al organismului implică celulele imune şi mediatorii moleculari.

În prezent, inflamaţia este tratată prin administrarea sistemică sau topică de medicamente antiinflamatoare nesteroidiene sau steroidiene. În ciuda răspândirii pe scară largă a agenţilor antiinflamatori, rămân unele riscuri reziduale ca inflamaţia să poată persista după tratamentul cu medicamente antiinflamatoare. În plus, tratamentul antiinflamator nu este lipsit de efecte secundare nici în cazul aplicării topice, cât şi al administrării sistemice.

În ultimii ani apariţia reacţiilor adverse în cazul administrării topice este crescută din cauza abuzului sau a utilizării greşite a cremelor cu steroizi care vizează tratarea inflamaţiei pielii.

De aceea, în prezent există necesitatea de a avea noi produse prevăzute cu activitate antiinflamatoare a căror folosire chiar şi pentru o perioada îndelungată să nu fie afectată de efecte secundare grave.

Probleme similare apar şi în domeniul dermatologic si ginecologic, în cazul infecţiilor cutanate sau mucoase.

Abuzul de produse antibiotice de uz local pentru tratarea infecţiilor cutanate a crescut numărul cazurilor de rezistenţă la antibiotico-terapia locală, obligând medicul să prescrie antibiotice de a doua generaţie.

Prin urmare, în prezent există necesitatea de a avea noi produse prevăzute cu activitate antiinflamatoare şi/sau eventual chiar antimicrobiană, care să fie alternative la medicamentele disponibile comercial.

Unul dintre scopurile prezentei invenţii constă în furnizarea unui produs prevăzut cu activitate antiinflamatoare şi posibil antimicrobiană sau antifungică a cărui utilizare este substanţial lipsită de efecte secundare. De asemenea, este de dorit să se furnizeze un produs care este activ în controlul microbiotei umane.

Un alt scop al invenţiei constă în furnizarea unui produs nesteroidian prevăzut cu activitate antiinflamatoare, care vizează în mod specific aplicarea topică pe piele sau pe mucoase cum ar fi mucoase vaginale.

Acesta din urmă este, în general, adresat împotriva bacteriilor şi/sau ciupercilor patogeni, funcţionând, în funcţie de ţintă, fie ca bactericid sau bacteriostatic, fie ca agent fungicid sau fungistatic.

Pe de altă parte, prin contrastarea agenţilor patogeni, se realizează o restabilire mai rapidă a condiţiilor de homeostazie prin normalizarea microbiomului rezident.

REZUMATUL INVENŢIEI

Prezenta invenţie provine din constatarea că o tulpină bacteriană selectată din genul Cutibacterium, specia acnes, promovează proliferarea fibroblastelor şi are capacitatea de a interfera cu creşterea majorităţii bacteriilor şi ciupercilor comune, în special a celor care afectează pielea umană.

În special, tulpina bacteriană de Cutibacterium acnes selectată, aşa cum este definită în revendicarea 1, fragmente din peretele său celular sau postbiotice sau compoziţia care le conţine, aşa cum este definită aici, prezintă o reglare a sistemului imunitar combinată cu un efect inhibitor îmbunătăţit asupra microorganismelor patogene ale pielii. Aceste efecte sunt în parte legate de o interferenţă a tulpinii cu ataşarea agentului patogen la celulele gazdă.

În plus, inventatorii au constatat că tulpinile bacteriene vii sau ucise sau o parte din ele, cum ar fi fragmente din peretele lor conform invenţiei, produc substanţe sau produse secundare care promovează creşterea şi migrarea celulelor fibroblaste. Această proprietate susţine în continuare utilizarea tulpinii selectate sau a substanţelor produse prin aceasta ca agenţi imunomodulanţi şi o face un candidat potrivit pentru aplicaţii în domeniul dermatologic sau ginecologic, în special în tratamentul infecţiilor bacteriene sau fungice ale pielii, în special cu Candida Albicans sau infecţii bacteriene.

În consecinţă, prezenta invenţie furnizează, într-un prim aspect, o tulpină bacteriană din genul Cutibacterium specia acnes depusă cu numărul de acces (sau numărul de înregistrare) DSM 28251 la Autoritatea Internaţională de Depozit Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, sau la o variantă care este în esenţă derivată din respectiva tulpină.

Într-un aspect, invenţia furnizează utilizări medicale ale tulpinii bacteriene Cutibacterium acnes menţionate mai sus, depusă cu numărul de acces DSM 28251. În conformitate cu acest aspect, tulpina invenţiei este pentru administrare topică sau sistemică.

Administrarea sistemică înseamnă o cale de administrare a unui medicament, nutriţie incluzând tulpina conform invenţiei în sistemul circulator astfel încât întregul organism este afectat. Administrarea poate avea loc prin administrare enterală, orală sau administrare parenterală, de exemplu prin injectare, perfuzie sau implantare.

Administrarea sau aplicarea topică este calea preferată de administrare a Cutibacterium acnes DSM 28251 conform prezentei invenţii. Cutibacterium acnes DSM 28251, postbiotic, fragmente de perete celular şi compoziţii care conţin aceleaşi fragmente ale acestuia pot fi aplicate pe piele în orice forme adecvate pentru aplicare locală.

În conformitate cu un alt aspect, invenţia furnizează tulpini sau variante ale tulpinii bacteriene DSM 28251 aşa cum s-a identificat mai sus, care sunt derivate în esenţă prin mutaţie spontană, mutaţie şi selecţie induse, hibridizare şi selecţie sau alte metode de manipulare genetică şi pot fi urmărite înapoi. Într-un alt aspect, invenţia se referă la postbiotice ale tulpinii de mai sus şi utilizări medicale sau nutriţionale ale acestora.

Tulpina bacteriană, conform prezentei invenţii, poate fi izolată şi selectată din pielea sănătoasă, dintre multitudinea de tulpini care compun microbiomul pielii.

Conform încă unui alt aspect, invenţia se referă la tulpina bacteriană Cutibacterium acnes, depusă cu numărul de acces DSM 28251 la Autoritatea Internaţională de Depozit Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, sau o variantă derivată în principal din tulpina menţionată, pentru utilizarea în prevenirea sau tratamentul unei boli sau infecţii inflamatorii, în special de piele sau mucoase.

De preferinţă, tulpina bacteriană a invenţiei îşi găseşte aplicaţii în domeniul dermatologic şi ginecologic, de exemplu în tratamentul inflamaţiei pielii sau mucoaselor sau al infecţiilor cu bacterii, ciuperci sau protozoare. În special, tulpina de mai sus este eficientă în prevenirea şi/sau tratarea infecţiilor, în special ale pielii.

Tulpina selectată conform invenţiei este eficientă în tratamentul ciupercilor, în special a drojdiilor din genul Candida spp, în special Candida Albicans, sau dermatofite precum Malassezia spp, ambele fiind printre cei mai comuni agenţi cauzali ai infecţiilor oportuniste ale corpului uman. În plus, tulpina selectată conform invenţiei este utilizată în tratamentul infecţiilor fungice care sunt rezistente la produsele antifungice disponibile pe piaţă.

Invenţia prevede, de asemenea, utilizarea proctologică a Cutibacterium acnes DSM 28251, în special ucis termic, postbiotic sau fragment de perete al acestei tulpini, sau o compoziţie topică a acesteia, în special în tratamentul hemoroizilor sau al rhagadelor anale sau al cicatricilor cutanate.

Într-un alt aspect, invenţia se referă la o compoziţie de acid hialuronic cu un fragment din peretele bacterian al C.acnes DSM 28251, în special pentru utilizare în tratamentul rănilor, abraziunii, ulceraţiilor pielii, de exemplu ulcere de presiune. Un alt aspect al invenţiei se referă la utilizarea cosmetică a tulpinii bacteriene identificate mai sus pentru ameliorarea unui aspect estetic al pielii, cum ar fi roşeaţa sau cuperoza.

Conform unui alt aspect, invenţia se referă la utilizările nutriţionale ale tulpinii identificate de mai sus sau ale unui postbiotic obţinut prin aceasta.

SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR

Invenţia va fi descrisă acum în detaliu şi cu referire la figurile ataşate, în care:

Figura 1 prezintă grafice cu bare care raportează valorile septului din Exemplul 1, calculate cu software-ul imagine j;

Figura 2 prezintă grafice cu bare cu aria septului din Exemplul 1, calculate cu software-ul imagine j;

Figura 3 prezintă grafice cu bare care ilustrează efectele in vitro asupra curbei de creştere a S. aureus, E. coli şi C. albicans prin adăugarea în mediile de cultură a diferitelor concentraţii de C. acnes DSM 28251 ucis termic.

Figura 4 ilustrează prepararea supernatantului şi a Staphylococcus aureus utilizat în testul din Exemplul 3.

Figurile 5A şi 5B prezintă grafice care ilustrează rata de supravieţuire a larvelor de Galleria mellonella după injectarea cu supernatanţi din culturile S. aureus ATCC BAA1680 (At) şi S.aureus ATCC 29213 (B) pre-incubate cu formulări testate timp de 1 oră conform Exemplului 4. Supernatanţi+formaA" înseamnă supernatant incubat cu LimpiAD A, „Supernatanţi+formaD" pentru supernatant incubat cu formula LimpiAD D, supernatant „Supernatanţi+perete" incubat cu componente active LimpiAD, „Supernatanţi" pos control, „Medium" pentru mediu de cultură singur (fără cultură bacteriană), „Ser fiziologic» pentru tratament simulat.

Figurile 6A şi 6B prezintă grafice care ilustrează rata de supravieţuire a larvelor de Galleria mellonella după injectarea cu supernatanţi din culturile S. aureus ATCC BAA1680 (A) şi S. aureus ATCC 29213 (B) pre-incubate cu formulări testate timp de 4 ore, conform exemplului 4 „Supernatanţi+formaA» înseamnă supernatant incubat cu formularea LimpiAD A (aşa cum este definit în Exemplul 4), „Supernatanţi+formaD» pentru supernatant incubat cu LimpiAD D, supernatant „Supernatanţi+perete» incubat cu componente active LimpiAD, „Supernatanţi» control poz., „Mediu» numai pentru mediul de cultură (fără cultură bacteriană), „Soluţie salină» pentru tratament simulat.

Figura 7 prezintă expresia genelor ţintă „normalizate» la control, exprimată prin creşterea sau descreşterea orificiilor, aşa cum este raportat în Exemplul 4.

Figura 8 prezintă cinci grafice, fiecare ilustrând curbele de creştere comparative ale tulpinilor de Staphylococcus aureus (trei tulpini diferite), Staphylococcus epidermidis şi Candida albicans inoculate cu supernatanţi (plus control fără tulpini) din şapte tulpini cunoscute de Cutibacterium acnes şi din tulpina (comparativă) Cutibacterium acnes DSM 28251;

Figura 9 prezintă cinci grafice, fiecare ilustrând curbele de creştere comparative a trei tulpini de Staphylococcus aureus, o tulpină de Staphylococcus epidermidis şi o tulpină de Candida albicans fiecare într-un mediu inoculat cu şapte tulpini cunoscute diferite ucise termic de Cutibacterium acnes şi cu tulpina Cutibacterium acnes DSM 28251 (tulpină comparativă ucisă termic);

Figura 10 prezintă cinci grafice, fiecare ilustrând curbele de creştere comparative a trei tulpini de Staphylococcus aureus, o tulpină de Staphylococcus epidermidis şi o tulpină de Candida albicans fiecare într-un mediu inoculat cu fragmente de perete bacterian obţinute prin omogenizarea şi după separarea în gradient a şapte tulpini cunoscute diferite de Cutibacterium acnes şi de tulpină Cutibacterium acnes DSM 28251 (fragment comparativ de perete bacterian).

DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI

Într-un prim aspect, invenţia se referă la o tulpină aparţinând genului Cutibacterium species acnes, depusă cu numărul de acces DSM 28251 (ID 19-401) la Autoritatea Internaţională de Depozit Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, sau o variantă derivată în esenţă din tulpina menţionată.

Invenţia se referă, de asemenea, la un postbiotic aşa cum este definit în revendicările 2, 3 şi un perete celular aşa cum este definit în revendicările 4, 5.

Tulpina bacteriană de mai sus este prevăzută atât cu o activitate antiinflamatoare in vivo, cât şi cel puţin cu o activitate antimicrobiană in vitro. Un perete celular sau un postbiotic din tulpina de mai sus sunt furnizate şi cu aceste activităţi.

Activităţile de mai sus sunt dovedite prin testele experimentale efectuate de inventatori şi raportate în următoarele exemple. Aceste teste oferă o bază ştiinţifică pentru utilizarea tulpinii bacteriene identificate mai sus ca agenţi antiinflamatori, imunomodulatori şi antimicrobieni, în special pentru aplicaţii topice.

În anumite aspecte ale invenţiei, este furnizată aici o compoziţie, în special o compoziţie farmaceutică sau nutritivă, care conţine o tulpină/perete sau postbiotic aşa cum este definit aici.

În conformitate cu un alt aspect, invenţia se referă la utilizarea tulpinii/peretelui/postbioticului identificate mai sus ca medicament şi la utilizări medicale ale acestora, în special aşa cum sunt definite în revendicările 9-13.

Proprietăţile intrinseci ale tulpinii bacteriene selectate asigură o acţiune antiinflamatoare permiţând medicului să trateze o gamă largă de boli, în special pe cele localizate pe piele sau pe mucoasa corpului uman.

În plus, proprietăţile antibacteriene şi/sau bacteriostatice ale tulpinii selectate o fac utilă în tratamentul infecţiilor, în special al infecţiilor cutanate şi ale mucoasei. Tulpina selectată s-a dovedit a fi eficientă împotriva bacteriilor comune, în special bacteriilor gram pozitive, în special bacteriilor coci, cum ar fi Staphylococcus aureus, sau împotriva Escherichia coli şi a ciupercilor, de exemplu din genul Candida.

Tulpina conform prezentei invenţii este caracterizată genotipic şi este identificabilă într-o manieră clară şi definită prin trăsături specifice identificate în genom. Această tulpină a evoluat spontan, fără nicio intervenţie directă sau manipulare genetică şi are caracteristicile relevante pentru aplicare industrială. Pentru a verifica şi a stabili caracteristicile tulpinii DSM 28251 şi pentru a exclude posibila suprapunere a acestei tulpini cu tulpinile descrise în stadiul tehnicii, a fost realizată o caracterizare a genotipului de către DSMZ.

Într-un aspect, invenţia prevede utilizarea cosmetică a unei compoziţii topice aşa cum este definită în revendicările 7, 8, în special pentru tratamentul cosmetic sau prevenirea pielii sensibile, a pielii roşii, a cuperozei, a schiului uscat, în special a feţei unei fiinţe umane.

În anumite aspecte, invenţia se referă, de asemenea, la o tulpină sau perete sau postbiotic al tulpinii DSM 28251 C. acnes pentru utilizări medicale în tratamentul pentru:

• o boală ginecologică precum vaginita, infecţia sau inflamaţia vaginală, sau • o tulburare proctologică, de exemplu hemoroizi, ragade anale sau cicatrici ale pielii sau zona perianală, sau • răni, răni, abraziune, ulceraţii ale pielii, de exemplu ulcere de presiune sau pentru vindecarea rănilor.

Definiţii în prezenta invenţie:

• „Tulpina DSM 28251» este menită să includă o tulpină bacteriană din genul Cutibacterium, specia acnes, depusă la 18 decembrie 2013 (referinţa de identificare ULTIMO) şi transformată într-un depozit conform Tratatului de la Budapesta la 22 decembrie 2019 cu numărul de acces DSM 28251 la Autoritatea Internaţională de Depozit Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; De obicei, Cutibacterium acnes este o bacterie gram-pozitivă. • „manipularea genetică» este menită să includă orice intervenţie tehnică care vizează direcţionarea procesului de achiziţie a unor caracteristici genetice specifice care sunt exprimate ca trăsături fenotipice corespunzătoare, în care intervenţiile tehnice cuprind (Sturley & Young, 1986): (i) încrucişarea unor tulpini naturale, urmată de selecţie; (ii) producerea de hibrizi urmată de selecţie; (iii) transformare, adică inserarea ADN-ului exogen în cromozomi sau în genomul mitocondrial sau alte elemente genetice, cum ar fi plasmidele. (iv) Mutageneza aleatorie indusă, urmată de obicei de selecţia şi/sau producerea de hibrizi (Nevoigt 2008) poate fi adăugată ca mod suplimentar de manipulare; • „variantă derivată» este menită să includă o variantă de tulpină a tulpinii Cutibacterium acnes, depusă la DSMZ cu numărul de acces DSM 28251, care poate fi urmărită înapoi la aceasta prin profilarea ADN-ului microsatelit sau datorită unei trăsături genetice distincte detectabile de secvenţierea genomului şi analiză comparativă. • „mediu de creştere» (sinonime: mediu, mediu de creştere / bulion de cultură/ bulion de creştere) se referă la un substrat care conţine toţi compuşii (factorii) necesari unui microorganism, în special o bacterie, cum ar fi o bacterie Gram+, pentru replicarea celulară, ceea ce duce la creşterea a numărului de celule individuale şi a creşterii populaţiei. Factorii necesari microorganismelor pentru creşterea lor în mediu aparţin in principal categoriilor: sursa de carbon, sursa similară de azot (constituită atât din amoniac, cât şi din aminoacizi liberi, ultimul cunoscut şi sub denumirea de FAN), vitamine şi săruri (oligoelemente). Sursele tipice de carbon sunt melasa de trestie de zahăr, melasa de sfeclă, extractul de malţ de orz şi extractul de malţ de grâu. Compoziţia celulelor nevitale/celulelor neviabile, a extractelor celulare, a lizatului celular este strict legată de proprietăţile metabolice şi fiziologice unice ale tulpinii DSM 28251. • „Postbiotice» înseamnă produse bacteriene neviabile, inclusiv produse secundare metabolice secretate de un microorganism, cum ar fi tulpina depusă la DSMZ cu numărul de acces DSM 28251, care au activitate biologică în gazdă sau atunci când sunt aplicate pe un ţesut al corpului uman, cum ar fi pielea. Postbiotica cuprinde, de asemenea, materiale ale tulpinii Cutibacterium DSM 28251, inclusiv celule ucise termic, supernatantul celulelor lizate mecanic sau fragmente de perete celular. Postbioticele oferă beneficii fiziologice gazdei şi pot fi utilizate pentru a formula o compoziţie pentru utilizări medicale sau cosmetice şi pentru administrare orală şi/sau topică aşa cum este descris aici. Postbiotica tulpinii Cutibacterium DSM 28251 poate fi obţinută conform unei proceduri generale / a unui proces general care include următoarele etape: tulpina bacteriană este crescută în mediu sau în bulion pentru a se obţine o suspensie. Suspensia este centrifugată în eprubete, folosind tehnologia convenţională. La sfârşitul centrifugării se obţine o stratificare a suspensiei. Pe fundul eprubetei se depun pelete care conţin celulele cu un strat superior care conţine supernatantul, care este lichidul/mediul de cultură. Supernatantul este apoi îndepărtat lăsând peletul depus pe fundul eprubetei, care este colectat şi spălat cu apă. Peletul este apoi resuspendat într-o soluţie fiziologică (salină) pentru a obţine celulele şi apoi centrifugat pentru a îndepărta mediul de cultură rămas. Celulele suspendate în apă sunt tratate mecanic cu un agitator mecanic, cum ar fi Ultratturrax (liză mecanică). Odată cu liza mecanică a peretelui celular se eliberează conţinutul celular şi se obţine postbioticul (supernatantul). Realizări specifice ale acestei proceduri sunt descrise în următoarea descriere detaliată şi în Exemple. • „purtător" se referă la un excipient, vehicul, diluant sau adjuvant, care poate sau poate fi prezent în compoziţia invenţiei. • „produs nutriţional» înseamnă un produs care îmbunătăţeşte starea nutriţională şi poate fi utilizat pentru a susţine sau îmbunătăţi activitatea funcţională a unuia sau mai multor organe sau funcţionalitatea corpului uman în limitele fiziologice. • „tulpina bacteriană selectată» sau „tulpina» aşa cum este menţionat aici înseamnă tulpina invenţiei depusă la DSMZ cu numărul de acces DSM 28251. • „peretele celular» sau „peretele tulpinii bacteriene (din invenţie)» înseamnă peretele celular al tulpinii bacteriene Cutibacterium acnes depus cu numărul de acces DSM 28251. Peretele tulpinii conform invenţiei poate fi rupt în părţi sau fragmente. Termenul „fragment" înseamnă o parte a peretelui tulpinii DSM 28251 conform invenţiei. Un fragment poate desemna, de asemenea, un lizat celular al peretelui tulpinii DSM 28251. Un fragment sau lizat de perete celular al tulpinii DSM 28251 poate fi obţinut prin metode convenţionale sau generale de distrugere a celulelor, de exemplu aşa cum este dezvăluit mai jos:\tab Bacteriile din bulion sau mediu de cultură sunt spălate şi delipidate în mod obişnuit cu ajutorul unui extractor Soxhlet. Bacteriile delipidate sunt apoi suspendate în apă şi apoi supuse lizei mecanice, de exemplu cu un agitator mecanic, de exemplu folosind un Ultratturrax şi conţinutul este tratat cu sulfat de amoniu pentru a precipita fragmentele peretelui bacterian. Fragmentele pot fi apoi curăţate de exemplu prin spălare cu apă pentru a obţine fragmente de perete. Un procedeu specific pentru obţinerea unui fragment de perete al tulpinii de C. acnes DSM 28251 este descris în Exemplul 6. O distrugere/rupere adecvată a tulpinii sau a peretelui acesteia poate fi realizată fie prin supunerea tulpinii conform invenţiei la metode mecanice/tratamente de liză, fie prin metode nemecanice/tratamente de liză.

Dezmembrarea tulpinii prin metode/aparate mecanice

Metodele mecanice adecvate pentru dezmembrarea (lizarea) celulei de perete a prezentei tulpini şi obţinerea de fragmente de perete includ fie metode de forfecare solidă, fie metode de forfecare fluidă.

Forfecarea solidă include utilizarea morii cu granule, X-press sau presa Hughes.

Forfecarea lichidă include metode de sonicare şi de înaltă presiune, inclusiv presa Hughes sau presa franceză şi/sau omogenizarea cu un omogenizator sau utilizarea unui omogenizator cu microfluidizor.

Tehnica cu moară cu granule (sau abraziune) include de obicei agitarea unei suspensii de tulpină cu granule de sticlă.

În mod obişnuit, dezmembrarea peretelui celular cu o metodă de moară cu granule este realizată într-o moară cu granule care include o cameră de măcinare învelită cu un arbore rotativ care trece prin centrul său. Arborele este echipat cu un agitator(agitatoare) care transmite energie cinetică granulelor din cameră, forţându-le să se ciocnească între ele (Chisti şi Moo-Young, 1986; Middelberg, 1995). Granulele potrivite pot avea un diametru de 0,10-0,15 mm pentru dezmembrarea eficientă a bacteriilor. Aparatele industriale mari pot folosi granule de 0,4-0,6 mm în diametru datorită mecanismului de separare a granulelor de suspensie (Kula & Shutte, 1987). Viteza de vârf adecvată este de cel puţin 10 m-1 pentru dezmembrarea bacteriilor (Kula & Shutte, 1987). Concentraţiile celulare pot varia de la 40-50% greutate umedă în bulionul introdus în cameră.

Forfecările solide adecvate includ, de asemenea, metode de sonicare şi de înaltă presiune, inclusiv presa Hughes sau presa franceză, în care o suspensie îngheţată de celule este forţată printr-o deschidere mică prin presiuni mari (Engler, 1985).

Sonicarea include utilizarea ultrasunetelor, unde sonore de obicei cu o frecvenţă mai mare de 15-20 kHz, care pot dezmembra peretele celular în suspensie. Puterea acustică adecvată, de exemplu, la sonicarea a 5-30 ml dintr-o suspensie bacteriană 20% într-un mediu lichid convenţional, foloseşte 35-95 W de putere acustică.

Alternativ, întreruperea mecanică poate fi obţinută într-un omogenizator cu supapă de înaltă presiune prin trecerea unei suspensii celulare a tensiunii la presiune înaltă printr-o supapă de descărcare cu orificiu reglabil, restrâns, aşa cum este raportat de Engler, 1985. De obicei, un model de omogenizator de bază cuprinde un pompă de deplasare care forţează o suspensie de celule prin centrul unui scaun de supapă şi peste faţa scaunului. Reglarea forţei asupra supapei controlează presiunea. Fluidul curge radial prin supapă şi loveşte un inel de impact (Middelberg, 1995). Dezmembrarea rezultă din ruperea nespecifică a peretelui celular.

Tipul de omogenizator exemplificator este modelul APV Manton-Gaulin (Middelberg, 1995). De exemplu, temperatura este crescută cu aproximativ 21°C la 10MPa într-un omogenizator. Există o influenţă puternică a presiunii de funcţionare asupra procesului de dezmembrare în omogenizator. Prin operarea omogenizatorului la presiuni mai mari, este posibilă scăderea numărului de treceri ale suspensiei celulare prin omogenizator pentru un anumit grad de dezmembrare (Chisti & Moo-Young, 1986; Bury şi colab., 2001).

Un omogenizator cu microfluidizor poate fi, de asemenea, utilizat ca echipament pentru obţinerea peretelui celular fragmentat. În acest aparat, două fluxuri de suspensie celulară sunt lovite cu viteză mare de o suprafaţă staţionară, iar aportul de energie este disipat aproape instantaneu în punctul de impact, ducând la dezmembrarea celulelor (Middelberg, 1995; Agerkvist & Enfors, 1990). Timpul de rezidenţă al suspensiei de tulpini în camera de dezmembrare a Microfluidizoarelor, care este cea mai fierbinte parte a dispozitivului, este de 25-40 ms. Răcirea în loc poate fi realizată prin imersarea camerei de dezmembrare într-o baie de gheaţă (Sauer şi colab., 1989; Geciova, experienţă personală). Fracţia de celule dezmembrate creşte odată cu creşterea presiunii şi a numărului de treceri.

Dezmembrarea tulpinii prin metode nemecanice

O metodă nemecanică se bazează pe decompresia obţinută prin introducerea unui gaz subcritic sau supracritic sub presiune în celule care provoacă dezmembrarea după eliberarea presiunii aplicate prin expansiune.

O altă dezmembrare nemecanică a peretelui celular poate fi obţinută prin şoc osmotic în care o suspensie de tulpină celulară este diluată într-un mediu/bulion lichid după echilibrare la presiune osmotică ridicată în condiţii convenţionale.

O metodă alternativă pentru liza celulară este termoliza care implică tratamentul termic al celulelor în condiţii convenţionale. O altă liză celulară nemecanică poate fi obţinută prin permeabilizare chimică, în special cu o substanţă selectată dintre antibiotice, cum ar fi antibioticul beta-lactamic de exemplu penicilina, agenţi de chelare de exemplu EDTA, haotropi de exemplu uree, guanidină, etanol, detergenţi de exemplu seria Triton X, dodecil sulfat de sodiu, lauril sarcosinat de sodiu, solvenţi cum ar fi toluen, acetonă, cloroform, hidroxizi cum ar fi hidroxid de sodiu, hipocloriţi cum ar fi hipoclorit de sodiu şi amestecuri ale acestora.

Liza celulară a tulpinii poate fi, de asemenea, obţinută prin liză enzimatică, de exemplu prin utilizarea unei proteaze şi glucanaze pentru a ataca, la început, complexul manoproteic al peretelui celular şi apoi scheletul glucanului (Kitamura, 1982). Un produs adecvat pentru liza peretelui de tulpină este produsul comercial Zymolase-20T (Seikagaku America, Inc., Rockville, MD). Lizozima poate fi de asemenea utilizată pentru liza straturilor de peptidoglican deoarece catalizează hidroliza legăturilor b-1,4-glicozidice.

În conformitate cu un exemplu de realizare preferat, un fragment de perete al tulpinii C.acnes DSM 28251 poate fi obţinut prin tratarea tulpinii bacteriene cu sulfat de amoniu, de preferinţă la o temperatură mai mică decât temperatura camerei, de exemplu, în intervalul de la 10 la 2°C şi în mod avantajos după tratament suspensia este centrifugată şi fragmentul precipitat este colectat.

În mod avantajos, înainte de tratarea cu sulfat de amoniu, tulpina C.acnes DSM 28251 este uscată şi centrifugată opţional cu apă. Opţional, după centrifugare, supernatantul rezultat din centrifugare este încălzit, de exemplu, la o temperatură de 40 până la 95°C, de preferinţă la 75-85°C şi apoi răcit, de exemplu, cu apă rece, de preferinţă la 3 până la 15°C. După aceea, etapa de precipitare se efectuează prin incubarea cu o soluţie de sulfat de amoniu la o concentraţie de la 20 până la 60 % v/v, de exemplu la 2 până la 10°C. În mod avantajos, după incubare suspensia obţinută este centrifugată şi fragmentul precipitat poate fi colectat. De exemplu, granula bacteriană este delipidată prin tratament Soxhlet utilizând solvenţi organici selectaţi dintre eter-etanol, cloroform, metanol-cloroform şi un amestec al acestora, apoi este uscat, de exemplu, sub fluxul laminar de capotă. După uscare, peletul se omogenizează prin 2 etape de tratament Ultratturrax, de preferinţă 1 minut fiecare, adăugând apă distilată, de preferinţă în proporţie de 1:2 p/V. După centrifugare, supernatantul este încălzit la 80°C şi apoi răcit sub apă rece, de preferinţă la 3 până la 15°C, şi în final pe gheaţă. Ulterior, etapa de precipitare a fragmentului este realizată prin incubare cu 40% v/v sulfat de amoniu rece timp de 24 de ore la 4°C. După incubare, suspensia este centrifugată, iar fragmentul precipitat a fost colectat şi liofilizat.

În unele exemple de realizare, fragmentul de perete celular al Cutibacterium acnes depus cu numărul de acces DSM 28251 este delipidat, adică tratat astfel încât fie să îndepărteze, fie să reducă considerabil componenta lipidică a peretelui celular al bacteriei prin intermediul tehnicilor chimice/biotehnologice. De exemplu, Cutibacterium acnes depus cu numărul de acces DSM 28251 este delipidat înainte de zdrobire pentru a produce fragmentele de perete celular. De obicei, fragmentele delipidate ale peretelui celular al tulpinii conform invenţiei cuprind zaharuri şi lanţuri peptidice, în mod obişnuit legate între ele în glicopeptide care formează o plasă strânsă. Zaharurile tipice ale peretelui celular cuprind acid N-acetilmuramic şi N-acetilglucozamină.

COMPOZIŢII FARMACEUTICE

Tulpina bacteriană DSM 28251 şi tulpinile derivate în esenţă ale acesteia sau un fragment sau un postbiotic rezultat prin aceasta se dovedesc a fi extrem de avantajoase pentru aplicare industrială în prepararea compoziţiilor farmaceutice, în special pentru aplicare topică.

În conformitate cu un aspect, prezenta invenţie se referă la o compoziţie farmaceutică care cuprinde o tulpină bacteriană aşa cum a fost definită mai sus sau un fragment postbiotic care rezultă din aceasta şi un excipient acceptabil farmaceutic sau fiziologic. Purtătorul, diluantul sau excipientul adecvat din punct de vedere fiziologic sau farmaceutic poate fi selectat pe baza căii de administrare pentru care este destinată compoziţia farmaceutică rezultată.

Compoziţiile farmaceutice ale prezentei invenţii cuprind orice compoziţii obţinute prin amestecarea unei tulpini aşa cum este definită aici, fragment al acesteia sau postbiotice ale acesteia conform prezentei invenţii şi un purtător acceptabil farmaceutic. Astfel de compoziţii sunt adecvate pentru utilizare farmaceutică la un animal sau om.

Compoziţiile farmaceutice ale prezentei invenţii cuprind o cantitate eficientă terapeutic dintr-o tulpină aşa cum a fost definită mai sus sau fragment/postbiotic al acesteia şi un purtător acceptabil farmaceutic.

O compoziţie farmaceutică poate conţine opţional şi alte ingrediente active. Termenul „purtător" se referă la un vehicul, excipient, diluanţi sau adjuvant cu care este administrat ingredientul activ sau terapeutic. Orice purtător şi/sau excipient adecvat pentru forma de preparat dorită pentru administrare este avut în vedere pentru utilizare cu tulpinile/peretele/postbioticele dezvăluite aici.

Purtătorul poate lua o mare varietate de forme în funcţie de forma de preparat dorită pentru administrare, de exemplu orală sau parenterală, inclusiv intravenoasă. La prepararea compoziţiilor pentru forma de dozare orală, poate fi folosit oricare dintre mediile farmaceutice uzuale, cum ar fi, de exemplu, apă, glicoli, uleiuri, alcooli, agenţi de aromatizare, conservanţi, agenţi de colorare şi altele asemenea, în cazul preparatelor lichide orale, cum ar fi, de exemplu, suspensii, elixiruri şi soluţii; sau purtători cum ar fi amidon, zaharuri, celuloză microcristalină, diluanţi, agenţi de granulare, lubrifianţi, lianţi, agenţi de dezintegrare şi altele asemenea, în cazul preparatelor solide orale, cum ar fi, de exemplu, pulberi, capsule şi tablete tari şi moi, cu preparatele orale solide fiind preferate preparatelor lichide.

În anumite variante de realizare, tulpina/peretele/postbioticul din prezenta invenţie poate fi combinat ca ingredient activ într-un amestec intim cu un purtător farmaceutic adecvat şi/sau excipient conform tehnicilor convenţionale de combinare farmaceutică.

Compoziţiile includ compoziţii adecvate pentru administrare parenterală, inclusiv subcutanată, intramusculară şi intravenoasă, pulmonară, nazală, rectală, topică sau orală. Calea adecvată de administrare în orice caz dat va depinde parţial de natura şi severitatea stărilor care sunt tratate şi de natura ingredientului activ. O cale exemplificativă de administrare este calea orală. Compoziţiile pot fi prezentate convenabil în formă de dozare unitară şi preparate prin oricare dintre metodele binecunoscute în domeniul farmaciei. Compoziţiile preferate includ compoziţii adecvate pentru administrare orală, parenterală, topică, subcutanată sau pulmonară, sub formă de inhalare nazală sau bucală. Compoziţiile pot fi preparate prin oricare dintre metodele binecunoscute în domeniul farmaciei.

Compoziţiile farmaceutice pot fi sub formă de tablete, pilule, capsule, soluţii, suspensii, emulsii, pulberi, supozitoare şi formulări cu eliberare susţinută.

Dacă se doreşte, tabletele pot fi acoperite prin tehnici apoase sau neapoase standard. În anumite exemple de realizare, astfel de compoziţii şi preparate pot conţine cel puţin 0,1 procente de tulpină. Procentul de tulpină activă/perete/postbiotic în aceste compoziţii poate fi, desigur, variat şi poate fi în mod convenabil între aproximativ 0,1 procente până la aproximativ 60 procente, 0,5 până la 20% din greutatea unităţii. Cantitatea de tulpină activă/perete/postbiotic în astfel de compoziţii utile terapeutic este astfel încât se va obţine o doză activă terapeutic. Tulpina/peretele/postbioticul poate fi de asemenea administrat intranazal ca, de exemplu, picături lichide sau spray.

Tabletele, pilulele, capsulele şi altele asemenea pot conţine, de asemenea, un liant cum ar fi gumă tragacant, salcâm, amidon de porumb sau gelatină; excipienţi cum ar fi fosfat dicalcic; un agent de dezintegrare cum ar fi amidon de porumb, amidon de cartofi, acid alginic; un lubrifiant cum ar fi stearat de magneziu; şi un agent de îndulcire cum ar fi zaharoză, lactoză sau zaharină. Când o formă de unitate de dozare este o capsulă, aceasta poate conţine, în plus faţă de materialele de tipul de mai sus, un purtător lichid, cum ar fi un ulei gras. Diferite alte materiale pot fi prezente ca acoperiri sau pentru a modifica forma fizică a unităţii de dozare. De exemplu, tabletele pot fi acoperite cu şelac, zahăr sau ambele. Un sirop sau elixir poate conţine, în plus faţă de ingredientul activ, zaharoză ca agent de îndulcire, metil şi propilparabeni ca şi conservanţi, un colorant şi un agent de aromatizare, cum ar fi aromă de cireşe sau portocale. Pentru a preveni descompunerea în timpul tranzitului prin porţiunea superioară a tractului gastrointestinal, compoziţia să fie o formulare acoperită enteric.

În cadrul invenţiei, utilizările topice sunt preferate. În consecinţă, în anumite exemple de realizare preferate, compoziţia este pentru aplicare locală. În această cerere, compoziţia care conţine tulpină/perete/postbiotic aşa cum este definită aici poate fi aplicată pe pielea fiinţelor umane.

Compoziţiile pentru administrare topică includ, dar nu se limitează la, unguente, creme, loţiuni, soluţii, paste, geluri, batoane, lipozomi, nanoparticule, plasturi, bandaje şi pansamente pentru răni. În anumite variante de realizare, formularea topică cuprinde un amplificator de penetrare.

Compoziţiile pentru administrare pulmonară includ, dar nu se limitează la, compoziţii de pulbere uscată constând din pulbere dintr-o tulpină/fragment/postbiotic şi pulberea unui purtător şi/sau lubrifiant adecvat. Compoziţiile pentru administrare pulmonară pot fi inhalate din orice dispozitiv adecvat pentru inhalare de pulbere uscată, cunoscut unei persoane de specialitate în domeniu.

De obicei, compoziţia pentru utilizare locală poate conţine o cantitate din tulpina bacteriană identificată mai sus de la 0,00001% până la 10%, de la 0,0001 până la 3%, de la 0,1 până la 2% greutate faţă de greutatea totală a compoziţiei.

Compoziţia pentru aplicare topică poate fi sub formă solidă, semisolidă sau fluidă. Formulările adecvate în formă solidă includ creme, geluri, alifii, paste, unguente, creme, plasturi.

Compoziţia pentru aplicare locală sub formă fluidă poate fi sub formă de loţiuni, geluri, suspensii, emulsii.

În cazul formelor de formulări fluide sau semi-fluide, tulpina bacteriană poate fi diluată într-un purtător în formă lichidă acceptabilă fiziologic, cum ar fi apă, alcool, soluţie hidroalcoolică sau de gliceril sau amestecată cu alte lichide adecvate pentru aplicare locală.

Cu titlu de exemplu, compoziţiile conform invenţiei sub formă lichidă pot fi preparate prin dizolvarea sau dispersarea tulpinii bacteriene sau a unui produs secundar al acesteia în apă şi/sau alcool. Compoziţia lichidă poate fi tamponată pentru a atinge un interval de pH selectat în mod convenabil de la 5 la 7 pentru a fi compatibil cu pH-ul pielii şi apoi filtrată şi ambalată în recipiente adecvate, cum ar fi sticle sau flacoane.

Într-o variantă de realizare, formularea pentru aplicarea locală este sub formă de cremă sau emulsie care conţine tulpina bacteriană purtată într-un excipient adecvat.

Conform altor variante de realizare, compoziţia invenţiei este în formă pentru administrare sistemică, în special pentru administrare orală. În aceste cazuri, compoziţia conţine tulpină bacteriană aşa cum s-a definit anterior şi unul sau mai multe vehicule sau / mai mulţi excipienţi adecvaţi pentru administrare sistemică.

Administrarea compoziţiilor se realizează conform unui protocol şi la o doză suficientă pentru a reduce boala ţintă la subiect.

În unele exemple de realizare, în compoziţiile farmaceutice ale prezentei invenţii, principiul sau principiile active sunt în general formulate în unităţi de dozare. Unitatea de dozare poate conţine de la 0,00001 la 1000 mg dintr-o tulpină/perete/postbiotic per unitate de dozare pentru administrare zilnică.

În unele realizări, cantităţile eficiente pentru formularea topică vor depinde de severitatea bolii, tulburării sau stării, de terapia anterioară, de starea de sănătate a individului şi de răspunsul la medicament. În unele exemple de realizare, doza este în intervalul de la 0,001% în greutate până la aproximativ 60% în greutate din formulare.

Când sunt utilizate în combinaţie cu unul sau mai multe alte ingrediente active, tulpina/peretele/postbioticul prezentei invenţii şi celălalt ingredient activ pot fi utilizate în doze mai mici decât atunci când fiecare este utilizat separat.

În ceea ce priveşte formulările cu privire la orice varietate de căi de administrare, metodele şi formulările pentru administrarea medicamentelor sunt dezvăluite în Remington's Pharmaceutical Sciences, Ediţia a 17-a, Gennaro şi colab. Eds., Mack Publishing Co., 1985, şi Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro AR ed. Ediţia a 20-a, 2000, Williams & Wilkins PA, SUA, şi Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins Eds. , 2005; şi în Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, ediţia a 8-a, Eds. Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

În anumite exemple de realizare, compoziţia conform invenţiei pentru administrare orală este un produs nutritiv, sau dietetic, sau nutraceutic.

Exemple de exemple de realizare şi proceduri preferate ale prezentei invenţii sunt descrise mai jos pentru a ilustra invenţia.

EXEMPLUL 1

Migrare potenţială in vitro a celulelor fibroblaste umane stimulate cu supernatant derivat dintr-o cultură de tulpină bacteriană Nr. acces DSM 28251.

Scopul studiului

Unul dintre mecanismele de acţiune a supernatantului unei culturi de tulpini bacteriene Nr. de acces DSM 28251 este atribuit unui efect postbiotic. Termenul post-biotic se referă la produse secundare metabolice ale microorganismelor, în special bacterii şi/sau probiotice. De obicei, postbioticele sunt produse prin activitatea metabolică sau procesele fermentative ale bacteriilor, cum ar fi probioticele (microorganisme vii care exercită efecte benefice pentru gazde atunci când sunt administrate în cantităţi adecvate).

Postbioticele joacă un rol extrem de important în reglarea sănătăţii şi menţinerea unei microbiote sănătoase.

Unul dintre scopurile acestui studiu este de a evalua efectul postbiotic asupra migrării celulelor fibroblastice ale pielii umane imortalizate, pentru a evalua dacă cu supernatantul derivat dintr-o cultură de tulpină bacteriană Nr. de acces DSM 28251 se favorizează migrarea acestei linii celulare.

Probe testate

Supernatant derivat dintr-o cultură de tulpină de bacterii cu nr. de acces DSM 28251.

Materiale şi metode

Bacterii

Tulpina de bacterii cu nr. de acces DSM 28251 a invenţiei a fost crescută în mediu de bulion de infuzie Brain Heart (BHI) peste noapte la 37°C şi apoi pentru a evalua efectul postbiotic, supernatantul din creşterea bacteriană a fost centrifugat şi ulterior filtrat (0,45 µm) pentru a elimina celulele bacteriene. Înainte de utilizare, o alicotă a fost placată pe BHI Agar şi incubată timp de 24 de ore la 37 ° C pentru a verifica absenţa creşterii microbiene.

Linie celulară

Celulele fibroblastice netumorigenice ale pielii umane au fost (menţinute în baloane de cultură de 25 cm2 în mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) suplimentat cu 1% L-glutamină 200 mM, penicilină (100U/mL), streptomicină (100 µg/mL) şi 10% FBS. Celulele, după spălare cu DPBS, au fost detaşate la temperatura camerei cu 0,25% soluţie de tripsină-EDTA 1X şi vor fi observate la microscop inversat până când stratul celular va fi dispersat (de obicei în 5 minute). Celulele au fost placate în µ-Dish (diametru 35 mm) care conţine inserţia de cultură (cod. 81176 Ibidi, Giemme, Italia). Inserţia de cultură constă din două godeuri; când ambele godeuri sunt umplute cu celule aderente un gol lipsit de celule (canal) de aproximativ 500 µm este creat după îndepărtarea inserţiei de cultură. Suspensia de celule se păstrează la 37°C în 5% CO2 în DMEM suplimentat cu 1% L-glutamină 200 mM, penicilină (100U/mL), streptomicină (100 µg/mL) şi 10% FBS. După 24 de ore de ataşare adecvată a celulei, inserţia de cultură va fi îndepărtată cu ajutorul unei pensete sterile şi µ-Dish-ul a fost umplut cu mediu (2 mL).

Experiment celular pentru analiza migraţiei

Celulele au fost tratate cu supernatant, filtrat anterior, derivat dintr-o cultură de bacterii Aileens diluate 1:10 şi 1:100 cu DPBS (Soluţie salină tamponată cu fosfat a lui Dulbecco / Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline). În plus, fibroblastul tratat cu BHI diluat 1:10 şi 1:100 cu DPBS s-au utilizat ca martor.

Celulele vor fi menţinute încă 24 de ore. Gradul de migrare a celulelor va fi fotografiat de Digital Microscope Eyepiece şi măsurat folosind software-ul de analiză a imaginii, Image J (V 1.45s, furnizat de Institutul Naţional de Sănătate, SUA). Fiecare imagine va fi ulterior transformată în negativ folosind o funcţie a software-ului şi apoi măsurată. Experimentele au fost efectuate în trei exemplare, iar rezultatele au fost exprimate ca medie ± SE. Testul T Student va fi utilizat pentru semnificaţia statistică. Valorile p>0,05 vor fi considerate semnificative statistic.

Rezultate

Rezultatele obţinute arată că supernatantul din tulpina bacteriană nr. de acces DSM 28251 diluat 1:10 şi 1:100 cu DPBS promovează migrarea celulelor (figura 1 şi 2). În plus, BHI diluat 1:10 şi 1:100 cu DPBS nu interferează cu migrarea fibroblastelor.

EXEMPLUL 2

Activitatea tulpinii bacteriene ucise termic depusă sub Nr. de acces DSM 28251 cu DSMZ asupra creşterii microorganismelor patogene umane.

Material şi metode

Tulpina bacteriană a fost crescută în mediu de infuzie Brain Heart (BHI) o/n la 37°C şi apoi ucisă la căldură la 60°C timp de 1 oră.

Cultura a fost spălată cu apă pentru a spăla mediul şi cultura fără mediu a fost diluată la 10°C7, 106 şi 105 CFU/ml atât în în mediu Muller Hinton (MH), căt şi Sabouraud. 105 celule/ml inocul de S. aureus ATCC 29213 şi E coli ATCC 11775 au fost crescute în trei exemplare în volumul final de 150 ul din fiecare diluţie Muller Hinton a culturii ucise la căldură într-o placă cu 96 de godeuri. În mod similar, 105 celule/ml inocul de C. albicans au fost cultivate în trei exemplare în diluţii 107, 106 şi 105 Sabouraud ale culturii bacteriene ucise. Ca martori, au fost produse triplicate ale tuturor diluţiilor în ambele medii, precum şi martori pentru creşterea tulpinilor cu 105 celule/ml inocul de S. aureus şi tulpini de E.coli şi C. albicans în volumul final de 150 ul de mediu Muller Hinton şi Sabouraud, respectiv. Densitatea optică (O.D.) la lungimea de undă de 600 nm a fost măsurată pentru fiecare godeu înainte de (T0) şi după 3, 6, 20 şi 24 de ore (T3, T6, T20, T24) de incubare la 37°C. Creşterea ca tendinţă a valorilor O.D. observate pentru fiecare tulpină în mediul adăugat prin tulpina ucisă la căldură a fost comparată numai cu cea din mediul Muller Hinton sau Sabouroaud.

Capacitatea tulpinii bacteriene Nr. de acces DSM 28251 de a interfera sau inhiba creşterea microbiană a bacteriilor şi ciupercilor întâlnite în mod obişnuit în pielea umană (vezi Tulpinile bacteriene testate) a fost testată cu o metodă spectrofotometrică descrisă de Hall şi colab.

Inhibarea creşterii microbiene a fost evaluată în plăci de polistiren cu 96 de godeuri. Diluţiile în serie ale amestecului tindalizat (107 la 105 CFU/ml) au fost inoculate cu microorganismele testate, împreună cu microorganismele singure (martor) şi mediu (martor). Toate tulpinile microbiene au fost testate conform ghidurilor CLSI (Clinical Standard Laboratory Institute) [3,4].

La intervale definite (3, 6, 20 şi 24 de ore i) a fost efectuată o citire spectrofotometrică la 600 nm. Rezultatele au fost furnizate ca şi curbe de creştere (microorganism singur) şi curbe de inhibiţie (microorganism şi concentraţii tindalizate). Fiecare experiment a fost efectuat de opt ori şi repetat de trei ori, rezultatele au fost exprimate ca medie ± SD.

Tulpini bacteriene testate:

• Staphylococcus aureus • Candida albicans • Escherichia coli Rezultatele sunt raportate în Figura 3 anexată. După cum se evidenţiază în Figura 3, adăugarea tulpinii bacteriene Nr. de acces DSM 28251 a invenţiei la culturile de S aureus încetineşte într-o doză dependentă faza logaritmică de creştere. Rezultate similare se găsesc cu C. albicans. Aceste date experimentale susţin un efect inhibitor pentru tulpina bacteriană Nr. de acces DSM 28251 conform invenţiei. Test comparativ cu mediul de cultură singur (adică fără tulpina 28251).

EXEMPLUL 3

Teste cu formulări care conţin tulpina DSM 28251 a invenţiei asupra creşterii de C. albicans

Material si metode

Formulări testate

1. A) o formulă de bază (fără tulpina DSM 28251 ) 2. B) o formulă cu 1% tulpină DSM 28251 3. C) o formulă cu 2,5 % tulpină DSM 28251 4. D) o formulă cu 2,5% tulpina DSM 28251 (2x C40) Formula de bază a formulării conţine apă, triglicerid caprilic/capric, unt de glicerină butyrospermum parkii.

Procedură

Fiecare formulare a fost inclusă în mediul de agar (20%) în plăci cu 4 sectoare. Cele 4 sectoare au fost folosite pentru placarea diferitelor diluţii fungice (10-5 10-8 CFU/ml), aceleaşi diluţii au fost placate pe medii fără formulări, ca martor. După inoculare, plăcile cu formularea au fost incubate la 37° timp de 48 de ore. Creşterea fungică în mediul cu formulări a fost verificată faţă de control. Mai mult, au fost înregistrate pH-ul mediului singur şi formule/mediu, pentru a verifica o posibilă interferenţă cu starea de virulenţă la cea de tranziţie de non-virulenţă a C. albicans.

Rezultate

La martor, s-a observat o formare evidentă a numeroase colonii cu morfologia tipică albă şi tulbure (2x109 CFU/ml).

Din constatările microscopice, observăm morfologiile celulare caracteristice microorganismului patogen cu producerea de hife fungice.

Pentru toate formulările testate se observă formarea unei patine opace cu formarea eşuată a hifelor, două caractere care sunt asociate cu trecerea agentului patogen din starea de virulenţă la cea de non-virulenţă.

Mai mult, pH-ul mediului de cultură singur (S) este similar cu formulele medii de pH; prin urmare, modificarea pH-ului nu pare să fie implicată în comutarea fenotipică.

Concluzii

La C. albicans s-a observat o variaţie a morfologiei coloniilor: în absenţa formulărilor s-au observat coloniile tipice cu aspect lăptos, în timp ce în prezenţa formulărilor s-a obţinut o patină omogenă şi translucidă. Această variaţie a fost confirmată şi la nivel microscopic, fără formulări. Microorganismul a fost observat atât ca drojdie, cât şi ca mucegai (prezenţa hifelor), în timp ce în prezenţa formulelor doar ca drojdie.

Această observaţie este o dovadă a activităţii inhibitoare asupra creşterii Candida albicans a formulărilor care conţin tulpina selectată a invenţiei.

EXEMPLUL 4

Acţiunea inhibitoare a unei formulări care conţine tulpina DSM 28251 (LimpiAD) împotriva toxinelor/cataboliţilor produşi de S. aureus: test Galleria mellonella in vivo şi test de exprimare a genelor

Introducere

Acţiunea potenţială a formulei şi a principiului activ ca agenţi capabili să reducă efectele S. aureus au fost testate toxine pe o ţintă biologică specifică. S. aureus este unul dintre cele mai cunoscute microorganisme în etiologia şi dezvoltarea dermatitei atopice. Unul dintre principalele sale mecanisme de patogeneză este producerea unei game largi de toxine.

Formula testată LimpiAD conţine apă, triglicerid caprilic/capric, unt de glicerină butyrospermum parkii.

În acest scop, a fost efectuat un test in vivo folosind Larvele de Galleria mellonella. Molia de ceară mai mare Galleria mellonella (G. mellonella) este un organism model care este deja validat pentru experimente de infecţie bacteriană şi pentru teste de toxicitate farmacologică. Reprezintă un instrument esenţial pentru screening-ul preliminar al noilor compuşi şi o evaluare rapidă şi fiabilă a activităţii inhibitorii potenţiale şi, prin urmare, ar trebui să reducă numărul de experimente necesare folosind modele de mamifere [6].

Larvele de G. mellonella oferă mai multe opţiuni pentru livrarea uşoară a agentului patogen, cum ar fi aplicarea topică, administrarea orală şi injectarea. Microorganismul poate fi injectat direct în hemocelul larvarului şi, prin urmare, larvele primesc o cantitate cunoscută de agenţi patogeni.

Un alt avantaj al modelului G. mellonella este posibilitatea de a evalua expresia genelor legate de imunitate şi stres. Astfel, pentru a investiga acţiunea dispozitivului pe larvele G. mellonella inoculate cu supernatantul de S aureus, s-a efectuat testul qPCR pentru a evalua efectul LimpiAD asupra imunităţii şi genelor de stres ale G. mellonella. Au fost selectate gene care joacă un rol crucial în răspunsurile imunităţii insectelor la infecţie: fagocitoză, reglarea citokinelor, adeziunea celulară şi inhibitorul de metaloproteinază.

Material şi metode

Tulpini microbiene testate şi condiţii de cultură

Staphylococcus aureus ATCC BAA1680 şi Staphylococcus aureus ATCC 29213 au fost crescute în bulion de perfuzie Brain Hearth şi incubate în condiţii termice la 37°C peste noapte.

Prepararea supernatantelor: culturile peste noapte ale ambelor tulpini de Staphylococcus au fost centrifugate la 5000 rpm timp de 5 minute. Celulele bacteriene reziduale au fost îndepărtate prin sterilizare pe filtru (0,22 µm) şi diluate în soluţie salină într-un raport (1:2).

Supernatanţii diluaţi au fost amestecaţi (1:5 g/v) cu trei formulări diferite (Tabelul 1):

• LimpiAD A (formula de bază, fără componenta activă); • LimpiAD D (cu 2,5% componentă activă); • componenta activă singură. După 1 oră şi 4 ore de incubare a formulărilor, supernatantele au fost recuperate prin centrifugare şi utilizate pentru a inocula Larvele de Galleria mellonella. Larvele tratate injectate cu supernatante (fără formulare) şi mediul de cultură singur (bulion de infuzie BrainHearth) într-un raport de 1:2 au fost utilizate ca martori (Figura 25). Pentru a evalua supravieţuirea larvelor infecţiei cu larve de G. de mellonella : larvele au fost selectate pe baza greutăţii şi mărimii şi împărţite în grupurile experimentale enumerate în Tabelul 1. Larvele au fost inoculate prin injectare folosind un distribuitor repetat prevăzut cu o seringă de insulină (BD, Wellington) şi un ac ultrafin de 1 ml prin ultimul proleg al larvelor. După inoculare, larvele pentru fiecare condiţie au fost incubate într-o cutie Petri la 35°C şi s-a observat supravieţuirea în următoarele 96 de ore.

Tabelul Nr. 1 Substanţe testate şi numărul de larve de G. Mellonella injectate pentru fiecare grup

Substanţe testate Nr. de larve

Supernatant ATCC BAA 1680/29213+LimpiAD A (1h) 20 Supernatant ATCC BAA 1680/29213+LimpiAD A (4h) 20 Supernatant ATCC BAA 1680/29213+LimpiAD D (1h) 20 Supernatant ATCC BAA 1680/29213+LimpiAD D (4h) 20 Supernatant ATCC BAA 1680/29213+componentă activă (1h) 20 Supernatant ATCC BAA 1680/29213+componentă activă (4h) 20 Supernatant ATCC BAA 1680/29213 pozitiv CNTR 1:2 20 CNTR negativ (BHI) 1:2 20 Soluţie salină 20

Eseul expresiei genice: qPCR

Trei larve de supravieţuire pentru fiecare grup (Martor, soluţie salină; Infectat, supernatant ATCC BAA1680; Tratat cu supernatant ATCC BAA1680 S aureus) au fost recuperate la 96 de ore după tratament. ARN a fost extras în reactiv TRI (Sigma Aldrich) urmând protocolul producătorului. Extractele de ARN au fost cuantificate spectrofotometric apoi transcrise invers în ADNc folosind un amestec de sinteză ReadyScript™ de ADNc (Sigma Aldrich)

Funcţia şi secvenţele denumirilor primerilor utilizate în expresia genelor sunt enumerate în Tabelul 2. Pliurile expresiei genei în raport cu o genă de referinţă EF1, au fost determinate în probele normalizate de către Rotor-Gene Q - QIAGEN, cu PowerSYBR®(AppliedBiosystems). Condiţiile de ciclu au fost 95°C 5 min, apoi 42 de cicluri de: 95°C 5 sec, recoacere 10 sec, 72°C 20 sec. O atingere iniţială a valorii de 1°C pe ciclu de la 65°C pentru primele 5 cicluri, a dus la o amplificare optimă pentru toţi locii. Toate experimentele au fost efectuate în trei exemplare pentru trei măsurători diferite [7].

Tabelul 2. Primerii utilizaţi pentru a analiza expresia genelor în Larve de Galleria mellonella

Primer Proces Funcţie Primer înainte Primer invers EF1 Factorul de alungire 1 -Alfa întreţinere AACTCCTTACAGTGAATCC Impi Metaloproteinază Gena ţintă TAGTAAGCAGTAGCATAGTCC Glut Răspuns la stresul oxidativ, Gena ţintă CCACACTGTGAGGCAACATT Cytk Reglarea citokinelor Gena ţintă CGAGCTAAAGACAGGCGATT Phag Fagocitoză Gena ţintă ATTGCTAGCCAGGTTCAGGA

Prepararea supernatantului şi a S. aureus utilizate în test sunt ilustrate în Figura 5.

Supravieţuirea larvelor

În comparaţie cu grupurile de control, supernatanţii care au fost pre-incubaţi timp de o oră cu formulele de testare au fost mult mai puţin letali.

Astfel creşterea supravieţuirii a larvelor de S. aureus ATCC BAA1680 a atribuit acţiunea componentelor active.

În mod similar, după 4 ore de incubare, activitatea formulei de bază A a fost confirmată la un nivel mai mic, în timp ce formula D a confirmat cea mai mare supravieţuire a larvelor .

În ceea ce priveşte tulpina de S. aureus ATCC 29213, a fost confirmată şi activitatea mai scăzută pentru formula de bază A faţă de celelalte formule testate. În acest caz, componentele active au produs o creştere mai mare de supravieţuire a larvelor respectând formula D, atât în pre-tratamente de 1 oră, cât şi în 4 ore.

În total, aceste rezultate au sugerat că respectiv componentele active ar putea interfera cu patogeneza asociată toxinelor/cataboliţilor produşi de S. aureus ATCC BAA1680. Mai mult, acţiunea ar putea fi apreciată deja după 1 oră de incubare atât pentru tulpini, cât şi pentru tulpina de S. aureus ATCC 29213 intensitatea interferenţei a rezultat mai mare cu cât este mai prelungită interacţiunea presupusă cu toxinele/cataboliţii din supernatanţi (Fig. 27-28).

În schimb, gena 18-wheeler a fost hipo-exprimată (99,98%) în grupul infectat, comparativ cu grupul tratat. Preincubarea LimpiAD, prin urmare, a crescut semnificativ expresia acestei gene implicate în adeziunea şi migrarea celulelor.

Testul expresiei genelor

Expresia celor două gene legate de stresul metabolic IMPI şi GLUT nu a fost modificată semnificativ în comparaţie cu controlul în ambele grupuri, aşa cum se evidenţiază în Fig. 7. Prin urmare, LimpiAD nu modifică expresia acestor gene. Expresia celor două gene legate de imunitatea înnăscută a fost exprimată diferit în grupul infectat decât în grupul tratat. Citokinele inflamatorii care reglează gena CITOK (cascada NF-kappa B) au fost supra-exprimate (93,8%) în grupul infectat comparativ cu grupul tratat. Prin urmare, LimpiAD a redus expresia citokinelor proinflamatorii.

Tabelul 3. Expresia genei G. mellonalla's în urma tratamentului cu LimpiAD/infectat

GENĂ % din expresie Tratat/infectat Exprimare IMPI 6,56% Ipo-exprimat GLUT 6,56% Supraexprimat CITOK 93,08% Ipo-exprimat 18 wheeler 99,08 Ipo-exprimat

Concluzie

Infecţiile cu tulpini patogene de Staphylococcus aureus sunt considerate un factor dăunător în dermatita atopică deoarece aceste microorganisme, producătoare de cataboliţi, stimulează eliberarea de citokine inflamatorii şi contribuie la deteriorarea barierei epidermice şi la manifestarea simptomelor caracteristice bolii.

Rezultatele obţinute sugerează că respectiv componentele LimpiAD reduc efectul cataboliţilor produşi de S. aureus asupra supravieţuirii larvelor de G. mellonella injectate.

Mai mult, tratamentul cu LimpiAD a redus expresia citokinelor proinflamatorii şi a crescut expresia genei 18-wealer implicată în adeziunea şi migrarea celulelor. Datele obţinute din exprimarea stresului metabolic şi a genelor de imunitate oferă dovezi suplimentare cu privire la mecanismul de acţiune al dispozitivului LimpiAD.

EXEMPLUL 5

Test Comparativ in vitro

Un test comparativ cu C. acnes DSM 28251 tindalizat faţă de alte tulpini de cutibacterium privind creşterea microorganismului patogen al pielii.

Scopul testului

Activitatea inhibitoare a bacteriilor ucise termic tulpina de C. acnes DSM 28251 asupra bacteriilor care colonizează pielea a fost comparată cu activitatea a patru tulpini diferite din aceeaşi specie (tulpini de Cutibacterium cu aceeaşi compoziţie de peptidoglican) şi o tulpină de C. granulosum care sunt foarte apropiate din punct de vedere evolutiv (proximitate filogenetică).

Scopul acestui studiu a fost de a evalua dacă tulpina de C. acnes DSM 28251 are proprietăţi deosebite sau îmbunătăţite în comparaţie cu alte specii cu proximitate filogenetică.

În acest scop, patru tulpini de Cutibacterium spp. (Trei Cutibacterium acnes şi una Cutibacterium granulosum) care diferă de tulpina DSM 28251, fie prin filotip, fie prin distanţa filogenetică, au fost alese şi testate (tulpina testată).

În studiu au fost incluse şi două tulpini de C. acnes (DSM 30738 şi 30753) ale căror caracteristici nu sunt cunoscute, deşi aparţin aceleiaşi specii ca şi tulpina DSM 28251 din această invenţie.\tab

TULPINI TESTATE (Cutibacterium genus)

Cutibacterium spp. Compoziţie \tab Distanţa filogenenetică de la Peptidoglican\tab C acnes DSM 28251\tab (tip filotip murein) (omologie 16% 16S ADNr)

C.acnes DSM 28251 A3γ LL-Dpm-Gly I 1.C.acnes ATTC 11828 A3γ LL-Dpm-Gly II 99,9% 2.C.granulosum DSM 20458 ATTC 11829 A3γ LL-Dpm-Gly NA* 94,0% 3. C.acnes DSM A3γ LL-Dpm-Gly I 99,9% 4. C.acnes DSM A3γ LL-Dpm-Gly I 99,9% 5. C.acnes DSM Nav* Nav* Nav* 6. C.acnes DSM Nav* Nav* Nav*

NA*: neatribuit. Clasificarea filotipurilor este disponibilă doar pentru tulpini de C. acnes.

Nav*: nu este disponibil

MICROGANISME PATOGENE ALE PIELEI

Activitatea inhibitorie a celor şase tulpini de Cutibacterium de mai sus a fost testată împotriva următoarelor cinci microorganisme care sunt agenţi patogeni ai pielii bine cunoscuţi şi reprezentaţi pe scară largă:

• S. aureus ATCC 29213 • S. aureus ATCC BAA-1680 • S. aureus DSM 20491 • S. epidermidis ATCC 12228 • Candida albicans ATCC 90028

MATERIALE ŞI METODE

Prepararea bacteriilor ucise termic (Cutibacterium)

Cutibacterium testat au fost distruşi prin tindalizare (sterilizare fracţionată).

Toate tulpinile de Cutibacterium au fost crescute în bulion BHI (Brain Heart Infusion) cu suplimentare de 20% la o temperatură de 37°C până la faza exponenţială maximă de creştere verificată prin citire spectrofotometrică (O.D. 600 nm). Ulterior, mediul a fost îndepărtat prin centrifugare şi prelucrat pentru testarea supernatantului. Peletul bacterian a fost spălat în soluţie salină (NaCl 0,9%) până la îndepărtarea completă a oricărui supernatant rezidual şi apoi diluat la o concentraţie de 0,5McFarland (1,5x108CFU/ml).

Inoculul titrat a fost supus tindalizării.

Procesul de tindalizare a implicat încălzirea la 80°C timp de 30 de minute pentru a distruge formele vegetative, urmată de o perioadă de incubare la 37°C timp de 24 de ore pentru a promova germinarea celulelor vegetative rămase care nu au fost ucise de tratamentul termic, apoi materialul a fost din nou adus la 80°C timp de 30 de minute. Întregul ciclu termic a fost repetat de 3 ori. O parte alicotă din materialul tindalizat a fost însămânţată pe Columbia Blood Agar şi incubată la 37°C în aerobioză timp de 24 de ore pentru a verifica absenţa creşterii microbiene şi implementarea corectă a procesului. Celulele bacteriene tindalizate au o capacitate de replicare şi enzimatică inactivată, menţinând în acelaşi timp structura şi peretele celular, deci intacte din punct de vedere fiziologic şi, din acest motiv, active imunologic.

Evaluarea activităţii tulpinilor ucise asupra creşterii microorganismelor patogene

Capacitatea tulpinilor de C. acnes ucise termic de a interfera şi/sau inhiba cu/asupra creşterii tulpinilor de Staphylococcus testate şi a unei tulpini de C. albicans a fost evaluată folosind o metodă spectrofotometrică.

Tulpinile ucise termic au fost testate folosind acelaşi mediu de creştere (bulion BHI, suplimentat cu 20% în concentraţie) prin următoarea procedură: Bacteriile ucise termic au fost diluate anterior la concentraţia finală de 105 CFU/ml şi apoi inoculat cu microorganismele patogene ale pielii după cum urmează.

În triplu exemplar, 100 ul de culturi active de tulpini de S. aureus ATCC@ BAA-1680™, S. aureus DSM 20491, S. aureus ATCC® 29213™, S. epidermidis ATCC@ 12228™ şi C. albicans ATCC® 90028™ testate au fost inoculate în godeurile fiecărui fragment. Fiecare tulpină bacteriană a fost crescută anterior în mediu BHI la 37°C până la stadiul de creştere exponenţială şi celulele au fost colectate prin centrifugare la 3000 rpm timp de 5 minute. Peletul a fost resuspendat în mediu BHI proaspăt pentru a obţine suspensii cu o concentraţie de 1 x 105 CFU/ml.

Aceste suspensii au fost utilizate ca inocule în godeurile plăcii cu 96 de godeuri.

Plăcile cu 96 de godeuri au fost preparate în trei exemplare, fiecare cu controale experimentale, adică tulpinile inoculează singure fără niciun fragment adăugat şi „martorii» experimentului (mediu BHI cu fiecare fragment) pentru calibrarea spectrofotometrică.

Densitatea optică la 600 nm (O.D. 600 nm) a fost măsurată utilizând sistemul VICTOR Multilabel Plate Reader (PerkinElmer) şi a fost considerată ca valoare de creştere la momentul zero (T0) pentru fiecare tulpină şi tratament. Măsurătorile ulterioare au fost efectuate după 2, 4, 6, 8, 18, 20, 22 şi 24 de ore în timpul perioadei de incubaţie. Valorile O.D. au fost normalizate faţă de martori şi controale şi apoi analizate pentru a evalua tendinţa de creştere a diferiţilor germeni cu/fără (CTR) fragmentele de perete. Rezultatele au fost raportate ca valoare medie ± S.D. (Deviaţia standard), iar curbele de creştere au fost obţinute prin analiză de regresie neliniară utilizând o funcţie Sigmoidală adecvată creşterii bacteriene. Analizele au fost efectuate cu software-ul Graph Pad Prism versiunea 7.0a.

REZULTATE

Curbele de creştere ale microorganismului patogen al pielii în prezenţa şi absenţa (controlul) bacteriilor ucise termic ale Tulpinilor de Cutibacterium sunt prezentate în figura 9. O primă evaluare calitativă AUC arată că ucisă termic C. acnes DSM 28251 are un efect inhibitor îmbunătăţit asupra creşterii microbiene pentru toate microorganismele patogenice testate ale pielii.

Următorul Tabel 2a raportează o evaluare cantitativă a AUC pentru fiecare derivat faţă de toate microorganismele testate. Aceste valori confirmă ceea ce este arătat în Figura 9 în care bacteriile ucise termic obţinute din C. acnes DSM 28251 arată o influenţă/activitate inhibitorie remarcabilă asupra creşterii tuturor microorganismelor cutanate testate.

Tab 2a. Valorile ariei sub curbă (AUC) şi erorile standard relative (albastru deschis) ale curbelor de creştere prezentate în figura 2 cu/fără bacterii ucise termic (de control). Scala de culori pentru fiecare tulpină indică intervalul valorilor AUC: de la valoarea AUC minoră (roşu închis) la valoarea AUC majoră (verde închis).

DSM 28251 ATCC 11828 DSM 20458 DSM 1897 DSM 16379 DSM 30738 DSM 30753 Control ATCC 11829 S. aureus ATCC 29213 Suprafaţa totală 11,92 15,18 14,54 13,26 13,02 14,11 14,72 15,55 Eroare Std. 0,61 0,25 0,18 0,28 6,27 6,33 0,13 0,57 S. aureus ATCC BAA-1680 Suprafaţa totală 12,38 13,13 15,01 13,39 12,71 13,40 14,54 15,55 Eroare Std. 0,40 0,52 0,42 0,39 0,31 0,48 0,54 0,58 S. aureus DSM 20491 Suprafaţa totală 9,16 11,33 10,86 10,15 9,55 10,86 11,04 11,38 Eroare Std. 0,56 0,23 0,14 0,25 0,16 0,32 0,19 0,25 S. epidermidis ATCC 1228 Suprafaţa totală 14,83 16,37 16,67 15,58 15,20 15,88 15,60 17, 62 Eroare Std. 0,55 0,18 0,34 0,51 0,24 0,11 0,44 0,98 C. albicans ATCC 90028 Suprafaţa totală 12, 94 15, 24 15, 66 14,87 15,12 14,98 13,81 18,81 Eroare Std. 0,60 6,47 0,89 0,21 0,36 0,21 0,35 0,58

Reducerea procentuală a creşterii în comparaţie cu condiţiile de control este prezentată în următorul Tabel 2b. Aceste date confirmă rezultatele discutate mai sus, evidenţiind activitatea îmbunătăţită a C. acnes DSM 28251 ucisă termic faţă de tulpinile comune de C. acnes.

Tab 2b. Procent de creştere în scădere faţă de starea de control (fără inocul de bacterii ucise termic). Scala de culori pentru fiecare tulpină indică intervalul de scădere: de la scădere majoră (roşu închis) la scădere minoră (verde închis) a creşterii (%).

DSM 28251 ATCC 11828 DSM 20458 DSM 1897 DSM 16379 DSM 30738 DSM 30753 ATCC 11829 S. aureus ATCC29213 23,344 2,379 6,495 14,727 16,270 9,260 5,338 S. aureus ATCC BAA-1680 20,386 2,572 3,473 13,891 18,264 13,826 6,495 S. aureus DSM 20491 19,135 0,439 4,148 10,415 15,719 4,148 2,560 S. epidermidis ATCC 1228 15,834 7,094 5,392 11,578 13,734 9,875 11,464 C. albicans ATCC 90028 31,207 18,979 16,746 20,946 19,617 20,362 26,582

EXEMPLUL 6

Testul comparativ din Exemplul 5 a fost repetat folosind postbiotice/supernatanţi din toate tulpinile de C. acnes (în loc de tulpinile ucise termic din Exemplul 5).

Scopul testului

Activitatea inhibitorie a postbioticelor/supernatanţilor obţinute(i) din aceleaşi şase tulpini de Cutibacterium din Exemplul 5 pe aceleaşi microorganisme patogene ale pielii din Exemplul 5 au fost comparate.

Scopul acestui studiu a fost de a evalua dacă un postbiotic din tulpină C. acnes DSM 28251 are o activitate inhibitoare îmbunătăţită asupra microorganismului patogen al pielii în comparaţie cu postbioticele din specia C acnes din Exemplul 5.

MATERIAL ŞI METODE

Prepararea postbioticului de C. acnes DSM 28251.

Supernatanţii bacterieni obţinuţi anterior din tulpini de Cutibacterium au fost supuse la filtrare (filtre de 0,22 µm) pentru a îndepărta orice reziduuri celulare; sterilitatea a fost confirmată prin absenţa creşterii bacteriene după inocularea pe Columbia Blood Agar şi incubarea la 37°C în aerobioză timp de 24 de ore dintr-o alicotă din fiecare supernatant investigat.

Pentru a exclude orice interferenţă datorată producerii de substanţe acide tipice unor tulpini de Cutibacterium spp., pH-ul fiecărui supernatant a fost măsurat cu atenţie şi, dacă este necesar, neutralizat cu o soluţie de hidroxid de sodiu 1M.

Evaluarea spectrofotometrică a activităţii postbioticelor asupra creşterii microorganismelor patogeni.

Capacitatea postbioticului care provine din tulpinile de C. acnes la care se face referire în Exemplul 5 de a interfera şi/sau inhiba cu/asupra creşterii aceloraşi tulpini de Staphylococcus şi a unei tulpini de C. albicans raportate în Exemplul 5 a fost evaluată utilizând o metodă spectrofotometrică.

Postbioticele au fost testate folosind acelaşi mediu de creştere din Exemplul 5 (bulion BHI, suplimentat cu 20% în concentraţie) prin următoarea procedură: Supernatanţii au fost diluaţi într-o proporţie de 1:10 în bulion BHI şi apoi incubaţi cu microorganisme cutanate testate.

În trei exemplare, 100 ul de culturi active de microorganisme patogene ale pielii S. aureus ATCC@ BAA-1680™, S. aureus DSM 20491, S. aureus ATCC® 29213™, S. epidermidis ATCC® 12228™ şi C. albicans ATCC® 90028™au fost inoculate în godeuri. Fiecare tulpină bacteriană a fost crescută anterior în mediu BHI la 37°C până la stadiul de creştere exponenţială şi celulele au fost colectate prin centrifugare la 3000 rpm timp de 5 minute. Peletul a fost resuspendat în mediu BHI proaspăt pentru a obţine suspensii cu o concentraţie de 1 x 105 CFU/ml.

Aceste suspensii au fost utilizate ca inocule în godeurile plăcii cu 96 de godeuri.

Plăcile cu 96 de godeuri au fost preparate în trei exemplare, fiecare cu controale experimentale, adică tulpini inocul singure, şi „martorii» de experiment (mediu BHI cu fiecare fragment) pentru calibrarea spectrofotometrică.

Densitatea optică la 600 nm (O.D. 600 nm) a fost măsurată utilizând sistemul VICTOR Multilabel Plate Reader (PerkinElmer) şi a fost considerată ca valoare de creştere la momentul zero (T0) pentru fiecare tulpină şi tratament. Măsurătorile ulterioare au fost efectuate după 2, 4, 6, 8, 18, 20, 22 şi 24 de ore în timpul perioadei de incubaţie. Valorile O.D. au fost normalizate faţă de martori şi controale şi apoi analizate pentru a evalua tendinţa de creştere a diferiţilor germeni cu/fără (CTR) fragmente de perete. Rezultatele au fost raportate ca valoare medie ± S.D. (Deviaţia standard), iar curbele de creştere au fost obţinute prin analiză de regresie neliniară utilizând o funcţie Sigmoidală adecvată creşterii bacteriene. Analizele au fost efectuate cu software-ul Graph Pad Prism versiunea 7.0a.

REZULTATE

Curbele de creştere ale microorganismului patogen al pielii în prezenţa şi absenţa (controlul) postbioticului tulpinii C. acnes DSM 28251 sunt prezentate în Figura 8.

O primă evaluare calitativă a AUC (Aria de sub curbă) arată că probioticul (supernatantul) obţinut din tulpină C. acnes DSM 28251 are cea mai mare acţiune inhibitoare asupra creşterii microbiene pentru majoritatea microorganismelor patogene testate.

Tabelul 1a prezintă evaluarea cantitativă AUC pentru fiecare supernatant. Aceste valori confirmă ceea ce s-a demonstrat în Figura 1. Într-adevăr, postbioticul/supernatantul de C. acnes DSM 28251 inhibă creşterea tuturor bacteriilor cutanate testate mai mult decât ceilalţi supernatanţi testaţi, cu singura excepţie a C. albicans ATCC 90028 (care este inhibat de derivatul DSM 30738).

Tabelul 1a

DSM 28251 ATCC 11828 DSM 20458 DSM 1897 DSM 16379 DSM 30738 DSM 30753 Control ATCC 11829 S. aureus ATCC 29213 Suprafaţa totală 1,86 5,24 3,35 3,916 3,29 4,11 3,63 14,58 Eroare Std. 0,07 0,3 0,51 0,06 0,14 0,61 0,58 1,02 S. aureus ATCC BAA-1680 Suprafaţa totală 2,16 5,23 5,96 3,89 3,36 4,16 4,09 14,61 Eroare Std. 0,34 0,33 0,81 0,06 0,52 0,61 0,52 1,02 S. aureus DSM 20491 Suprafaţa totală 1,86 4,87 3,34 3,35 3,27 3,51 3,57 7,57 Eroare Std. 0,07 0,15 0,52 0,53 0,138 0,387 0,575 1,12 S. epidermidis ATCC 12228 Suprafaţa totală 3,74 12,39 16,00 4,97 4,07 6,36 6,38 17,09 Eroare Std. 0,75 0,76 0,37 0,62 0,35 0,82 0,48 0,33 C. albicans ATCC 90028 Suprafaţa totală 8,37 22,35 23,74 8,37 8,70 7,19 7,79 30,47 Eroare Std. 0,67 0,21 1,22 0,56 0,15 0,44 0,35 0,46

Tab 1a. Valorile ariei sub curbă (AUC) şi erorile standard relative (albastru deschis) ale curbelor de creştere prezentate în figura 1 cu/fără supernatant bacterian (de control). Scala de culori pentru fiecare tulpină indică intervalul valorilor AUC: de la valoarea AUC minoră (roşu închis) la valoarea AUC majoră (verde închis).

Procentul de reducere a creşterii contra condiţiilor de control obţinute de supernatanţii testaţi sunt prezentate în Tabelul 1b. Aceste date confirmă, de asemenea, rezultatele discutate până acum, subliniind în continuare faptul că activitatea supernatantului DSM 30738 pe tulpina de C. albicans ATCC 90028 este doar puţin mai mare şi, prin urmare, este comparabilă cu cea a supernatantului C. acnes DSM 28251.

Tab 1b. Procent de creştere în scădere faţă de starea de control (fără inocul de supernatant). Scala de culori pentru fiecare tulpină indică intervalul de scădere: de la scădere majoră (roşu închis) la scădere minoră (verde închis) a creşterii (%).

DSM 28251 ATCC 11828 DSM 20458 DSM 1897 DSM 16379 DSM 30738 DSM 30753 ATCC 11829 S. aureus ATCC 29213 87,22 64,05 77,01 73,14 77,45 71,80 75,09 S. aureus ATCC BAA-1680 85,24 64,18 59,23 73,40 76,99 71,54 72,00 S. aureus DSM 20491 75,44 35,70 55,92 55,79 56,82 53,63 52,88 S. epidermidis ATCC 12228 78,12 27,50 6,38 70,93 76,16 62,86 68,52 C. albicans ATCC 90028 72,52 26,65 22,09 72,54 71,46 76,40 74,43

REZULTATE

O primă evaluare calitativă AUC arată că postbioticul/supernatantul de C. acnes DSM 28251 are un efect inhibitor îmbunătăţit asupra creşterii microbiene pentru toate microorganismele patogenice testate ale pielii.

EXEMPLUL 7

Testul comparativ din Exemplul 5 a fost repetat folosind fragmente de perete celular din toate tulpinile testate de C. acnes (în loc de tulpinile ucise termic din Exemplul 5).

Scopul testului

Scopul acestui test a fost să compare activitatea inhibitorie a fragmentelor de perete ale aceloraşi şase tulpini de Cutibacterium din Exemplul 5 pe aceleaşi microorganisme patogene ale pielii din Exemplul 5.

Scopul acestui studiu a fost acela de a evalua dacă un fragment de perete din tulpina de C. acnes DSM 28251 are o activitate inhibitoare îmbunătăţită asupra microorganismului patogen al pielii în comparaţie cu fragmentul de perete bacterian al speciilor comparative de C. acnes din Exemplul 5.

MATERIAL ŞI METODE

Prepararea fragmentelor de perete ale C. acnes DSM 28251 şi ale tulpinilor C acnes comparative.

Tulpina de C. acnes DSM 28251 şi tulpinile de Cutibacterium ATCC@ 11829, DSM 16379, DSM 30738, DSM 30753 şi DSM 1897, au fost crescute la 37°C în mediu BHI suplimentat cu 20% în concentraţie.

Cultivarea s-a desfăşurat în sisteme discontinue şi de scalare de la volume de 5 la 1000 ml şi s-a prelungit până la obţinerea unei mase celulare consistente (adica 2 zile în volumul mai mare de inocul). Peletele bacteriene obţinute au fost apoi colectate şi supuse procedurii standardizate pentru a obţine fragmentul de perete de interes, aşa cum este descris în continuare. În continuare, fragmentele izolate vor fi menţionate cu codul de catalogare al tulpinilor de derivaţie.

Mai exact, izolarea fragmentelor de perete a fost realizată după cum este descris în continuare.

Peleta bacteriană a fost supusă anterior procedurii de delipidare prin tratament Soxhlet folosind un solvent organic (de exemplu, eter-etanol, cloroform, metanol-cloroform, amestecuri ale acestora) solvenţi ulterior; apoi s-a uscat sub fluxul laminar de capotă. După uscare, peletul a fost omogenizat prin 2 etape de tratament Ultratturrax (20 secunde până la 10 min fiecare), adăugând apă distilată (în proporţie de 1:2 p/V). După centrifugare, supernatantul a fost încălzit la 80°C şi apoi răcit sub apă rece, de preferinţă la 3 până la 15°C, şi în final pe gheaţă. Ulterior, etapa de precipitare a fragmentelor a fost efectuată incubând cu 15-40% v/v sulfat de amoniu rece timp de 24 de ore la 4°C. După incubare, suspensia a fost centrifugată, iar fragmentul precipitat a fost colectat şi liofilizat.

Specimenele liofilizate au fost în final sterilizate prin procedură ad-hoc în mai multe etape (-80°C ultra-congelare, 80°C supraîncălzire, 1 oră sterilizare U.V.). În cele din urmă, au fost folosite pentru a configura experimentul, după cum este descris mai jos.

Evaluarea spectrofotometrică a activităţii postbioticelor asupra creşterii microorganismelor patogene.

Activitatea fragmentelor de perete care provin din tulpinile de C. acnes (vezi mai sus) de a interfera şi/sau inhiba cu/asupra creşterii aceloraşi tulpini de Staphylococcus şi a unei tulpini de C. albicans raportate în Exemplul 5 a fost evaluată utilizând o metodă spectrofotometrică.

Fragmentele de perete au fost testate folosind acelaşi mediu de creştere din Exemplul 5 (bulion BHI, suplimentat cu 20% în concentraţie) prin următoarea procedură: Fragmentele de perete au fost pulverizate şi emulsionate în mediu de creştere BHI la concentraţia finală de 10 mg/ml. S-au adăugat alicote de 100 µl la godeurile plăcilor cu fund plat cu 96 de godeuri.

În triplicat, 100 ul de culturi active de microorganisme patogene ale pielii S. aureus ATCC@ BAA-1680™, S. aureus DSM 20491, S. aureus ATCC@ 29213™, S. epidermidis ATCC@ 12228™ şi C. albicans ATCC@ 90028™au fost inoculate în godeurile fiecărui fragment. Fiecare tulpină bacteriană a fost crescută anterior în mediu BHI la 37°C până la stadiul de creştere exponenţială şi celulele au fost colectate prin centrifugare la 3000 rpm timp de 5 minute. Peletul a fost resuspendat în mediu BHI proaspăt pentru a obţine suspensii cu o concentraţie de 1 x 105 CFU/ml.

Aceste suspensii au fost utilizate ca inocule în godeurile plăcii cu 96 de godeuri.

Plăcile cu 96 de godeuri au fost preparate în trei exemplare, fiecare cu controale experimentale, adică tulpinile inoculează singure fără niciun fragment adăugat şi „martorii» experimentului (mediu BHI cu fiecare fragment) pentru calibrarea spectrofotometrică.

Densitatea optică la 600 nm (O.D. 600 nm) a fost măsurată utilizând sistemul VICTOR Multilabel Plate Reader (PerkinElmer) şi a fost considerată ca valoare de creştere la momentul zero (T0) pentru fiecare tulpină şi tratament. Măsurătorile ulterioare au fost efectuate după 2, 4, 6, 8, 18, 20, 22 şi 24 de ore în timpul perioadei de incubaţie. Valorile O.D. au fost normalizate faţă de martori şi controale şi apoi analizate pentru a evalua tendinţa de creştere a diferiţilor germeni cu/fără (CTR) fragmente de perete. Rezultatele au fost raportate ca valoare medie ± S.D. (Deviaţia standard), iar curbele de creştere au fost obţinute prin analiză de regresie neliniară utilizând o funcţie Sigmoidală adecvată creşterii bacteriene. Analizele au fost efectuate cu software-ul Graph Pad Prism versiunea 7.0a.

REZULTATE (fragmente de perete C. acnes)

Curbele de creştere ale bacteriilor cutanate cultivate cu şi fără (CTR) ale diverselor fragmente de perete testate sunt prezentate în Figura 10. Pe baza unei evaluări calitative preliminare a parametrului „Area de sub curbă» (AUC) se evidenţiază cum pentru majoritatea germenilor de piele testaţi, fragmentul DSM 28251 produce cea mai mare acţiune inhibitorie asupra creşterii microbiene.

În schimb, în următorul tabel 3a sunt raportate rezultatele unei evaluări cantitative a aceluiaşi parametru AUC pentru toţi germenii cutanaţi testaţi. Valorile AUC calculate confirmă ipoteza formulată prin evaluarea calitativă. Fragmentul de perete celular al bacteriei DSM 28251 a demonstrat un efect inhibitor mai mare asupra creşterii bacteriilor decât celelalte fragmente testate.

Aprofundând estimarea inhibiţiei creşterii, valorile prezentate în Tabelul 3b reprezintă procentele de reducere a creşterii (%) faţă de starea de control a fiecărei tulpini care este considerată ca fiind 100% din rata de creştere în condiţiile experimentale specifice. Compararea reducerilor procentuale de creştere a fost în concordanţă cu concluzia discutată mai sus despre efectul inhibitor mai mare al fragmentului de tulpină DSM 28251.

Deşi fragmentul obţinut din tulpina de C. acnes DSM 30738 demonstrează valori apropiate de inhibiţie în comparaţie cu fragmentul DSM 28251, procentul de inhibiţie al acestuia din urmă rezultând întotdeauna mai mare, de asemenea cu o performanţă mai bună împotriva tulpinii de S. aureus ATCC BAA-1680 (82, 43% pentru DSM 30738 vs 94,95% pentru DSM 28251).

Fila 3a. Valorile ariei de sub curbă (AUC) şi erorile standard relative (albastru deschis) ale curbelor de creştere sunt prezentate în figura 3 cu/fără fragmente de perete bacterian (de control). Scala de culori pentru fiecare tulpină indică intervalul valorilor AUC: de la valoarea AUC minoră (roşu închis) la valoarea AUC majoră (verde închis).

s DSM 28251 ATCC 11828 DSM 20458 ATCC 11829 DSM 1897 DSM 16379 DSM 30738 DSM 30753 Control S. aureus ATCC 29213 Suprafaţa totală 0,20 1,13 2,23 6,63 2,89 0,70 3,19 11,73 Eroare Std. 0,11 0,15 0,24 0,22 0,16 0,15 0,28 0,26 S. aureus ATCC BAA-1680 Suprafaţa totală 0,57 1,66 1,09 3,87 1,53 1,99 1,99 11,34 Eroare Std. 0,31 0,088 0,11 0,32 0,16 0,20 0,082 0,31 S. aureus DSM 20491 Suprafaţa totală 0,36 1,47 1,35 5,40 2,14 0,39 2,72 11,26 Eroare Std. 0,35 0,16 0,16 0,32 0,28 0,15 0,24 0,23 S. epidermidis â ATCC 1228 Suprafaţa totală 0,15 1,27 2,14 2,21 1,07 0,15 1,21 6,03 Eroare Std. 0,34 0,18 0,34 0,33 0,17 0,32 0,15 0,20 C. albicans ATCC 90028 Suprafaţa totală 0,03 1,27 1,15 0,48 1,20 0,03 0,90 7,35 Eroare Std. 0,10 0,35 0,35 1,20 0,12 0,28 0,33 0,22

Tab 3b. Procent de creştere în scădere faţă de starea de control (fără inocul de fragment). Scala de culori pentru fiecare tulpină indică intervalul de scădere: de la scădere majoră (roşu închis) la scădere minoră (verde închis) a creşterii (%).

DSM 28251 ATCC 11828 DSM 20458 ATCC 11829 DSM 1897 DSM 16379 DSM 30738 DSM 30753 S. aureus ATCC 29213 98,29 90,38 80,99 43,44 75,32 94,02 72,83 S. aureus BAA-1680 94,95 85,36 90,39 65,89 86,49 82,43 82,41 S. aureus DSM 20491 96,82 86,96 88,03 52,02 80,96 96,54 75,84 S. epidermidis ATCC 12228 97,49 78,86 64,54 63,28 82,16 97,46 79,99 C. albicans ATCC 90028 99,63 82,67 84,34 93,46 83,61 99,54 87,70

Claims (19)

1. O tulpină bacteriană, care este Cutibacterium acnes depusă sub depozit nr. de acces DSM 28251 la Autoritatea Internaţională de Depozit Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.

2. Un produs postbiotic care cuprinde celule ucise termic sau supernatantul celulelor lizate mecanic sau fragmente de perete celular din tulpina bacteriană conform revendicării 1.

3. Produs postbiotic conform revendicării 2, în care celulele lizate sunt obţinute prin liza mecanică a peretelui celular.

4. Fragment al peretelui celular al tulpinii bacteriene conform revendicării 1.

5. Tulpina bacteriană conform revendicării 1 caracterizată prin aceea că este inactivată, preferabil prin tindalizare.

6. Tulpina bacteriană conform revendicării 1 sau produsul postbiotic conform revendicării 2 sau un fragment de perete celular conform revendicării 4 pentru utilizare ca medicament.

7. O compoziţie care cuprinde o cantitate eficientă de Cutibacterium acnes depusă sub depozit nr. de acces DSMZ 28251 conform revendicării 1, sau un produs postbiotic al acestuia conform revendicării 2 sau un fragment al peretelui celular al acestuia conform revendicării 4 şi un purtător acceptabil fiziologic.

8. Compoziţie conform revendicării 7 în care compoziţia este o compoziţie topică, de preferinţă sub formă de cremă, spumă, unguent, pastă, pulbere, gel, soluţie, ovul, duş sau emulsie.

9. Compoziţie conform revendicării 7 pentru utilizare ca medicament.

10. Compoziţie conform revendicării 7 pentru utilizare în tratamentul unei boli sau infecţii inflamatorii sau alergice.

11. Compoziţie conform revendicării 7 pentru utilizare în tratamentul topic al unei boli inflamatorii sau alergice a pielii sau mucoasei.

12. Compoziţie pentru utilizare conform oricăreia dintre revendicările 10-11 în prevenirea sau tratamentul unei infecţii bacteriene sau fungice ale pielii sau mucoaselor.

13. Compoziţie pentru utilizare conform revendicării 12, în care boala de piele este eczemă, dermatită atopică, acnee, dermatită seboreică, rozacee, psoriazis, eritem, erupţie cutanată.

14. Compoziţie pentru utilizare conform revendicării 12 pentru tratamentul unei infecţii fungice a pielii sau mucoasei, în special infecţia cu Candida.

15. Compoziţie conform revendicării 7 sau 8 pentru utilizare în tratamentul unei boli ginecologice care este o infecţie vaginală, o inflamaţie.

16. Compoziţie pentru utilizare conform revendicării 15 în care boala ginecologică este vaginita.

17. Compoziţie conform revendicării 7 sau 8 pentru utilizare proctologică în tratamentul hemoroizilor, rahadelor anale sau cicatricilor cutanate.

18. Compoziţie conform revendicării 7 sau 8 pentru utilizare în tratamentul rănilor, rănilor, abraziunii, ulceraţiilor pielii sau ulcerelor de presiune sau pentru vindecarea rănilor.

19. Un produs postbiotic care este supernatantul total care poate fi obţinut printr-un proces fermentativ al tulpinii bacteriene conform revendicării 1.