MD145Y

MD145Y - Process for the obtaining of a nutrient medium for cultivation of lactobacteria

Info

Publication number: MD145Y
Application number: MDS20090138A
Authority: MD
Inventors: Ana Leorda
Original assignee: Institutul De Fiziologie Si Sanocreatologie Al Academiei De Stiinte A Moldovei
Priority date: 2009-07-22
Filing date: 2009-07-22
Publication date: 2010-02-26
Also published as: MD145Z

Abstract

Inventia se refera la microbiologie si biotehnologie, in particular la un procedeu de obtinere a mediului nutritiv pentru cultivarea lactobacteriilor. Procedeul include pregatirea mediului ce contine, la 1 L: peptona - 10 g, citrat de amoniu - 2 g, acetat de sodiu - 5 g, glucoza - 20,0 g, sulfat de mangan cristalohidrat - 0,05 g, sulfat de magneziu cristalohidrat - 0,2 g, cisteina - 0,2 g, agar-agar - 20 g, Tvin-80 - 1 mL, autolizat de drojdii - 50 mL, extract de ficat de vita - 100 mL, lapte hidrolizat - 500 mL, apa distilata - restul, cu pH 6,2…6,6 si sterilizarea lui. In mediul obtinut se adauga infuzie de rizomi de obligeana, obtinuta prin infuzarea a 4,8…7,0 g materie prima tocata in 200 mL de apa clocotita timp de 30 min cu filtrarea si sterilizarea ulterioara a infuziei obtinute, care se adauga in cantitate de 20 mL la un litru de mediu nutritiv.The invention relates to microbiology and biotechnology, in particular to a process for obtaining the nutritional environment for the cultivation of lactobacteria. The process includes preparing the medium containing, at 1 L: peptone - 10 g, ammonium citrate - 2 g, sodium acetate - 5 g, glucose - 20.0 g, manganese sulphate crystallohydrate - 0.05 g, magnesium sulfate crystallohydrate - 0.2 g, cysteine - 0.2 g, agar-agar - 20 g, Tvin-80 - 1 mL, autolysed yeast - 50 mL, beef liver extract - 100 mL, hydrolyzed milk - 500 mL, distilled water - the rest, with pH 6.2 ... 6.6 and its sterilization. In the obtained environment is added infusion of rhizome of obligate, obtained by infusing 4.8 ... 7.0 g raw material chopped in 200 mL of boiling water for 30 minutes with subsequent filtration and sterilization of the infusion obtained, which is added in quantity 20 mL per liter of nutrient medium.

Description

Invenţia se referă la microbiologie şi biotehnologie, în particular la un procedeu de obţinere a mediului nutritiv pentru cultivarea lactobacteriilor. The invention relates to microbiology and biotechnology, in particular to a process for obtaining a nutrient medium for cultivating lactobacteria.

Este cunoscut procedeul de obţinere a mediului de cultură pentru cultivarea lactobacteriilor care prevede adăugarea hidrolizatului de lactoproteină în calitate de supliment la un mediu de cultură iniţial, care conţine ser lactic cu un procent de substanţe uscate de 6…15%, amestecarea componentelor mediului, dezacidularea cu soluţie de amoniac, sterilizarea şi răcirea mediului [1] . The process of obtaining the culture medium for cultivating lactobacteria is known, which involves adding lactoprotein hydrolysate as a supplement to an initial culture medium, which contains lactic serum with a percentage of dry substances of 6…15%, mixing the medium components, deacidification with ammonia solution, sterilization and cooling of the medium [1].

Dezavantajul acestui procedeu constă în aceea că în calitate de supliment se adaugă hidrolizat de lactoproteină, component relativ costisitor şi nu întotdeauna accesibil. The disadvantage of this process is that lactoprotein hydrolysate is added as a supplement, a relatively expensive and not always accessible component.

Cea mai apropiată soluţie este procedeul de pregătire a mediului de cultură care prevede adăugarea la 300 mL de apă distilată a 10,0 g peptonă, 2,0 g citrat de amoniu, 5,0 g acetat de sodiu, 20,0 g glucoză, 0,05 g sulfat de mangan cristalohidrat, 0,2 g sulfat de magneziu cristalohidrat, 0,2 g cisteină, 20,0 g agar-agar, 1 mL Tvin-80, 50 mL autolizat de drojdii şi 100 mL extract de ficat de vită. Volumul obţinut se aduce până la 500 mL cu apă distilată şi se adaugă lapte hidrolizat până la un litru. Se stabileşte pH-ul mediului în limitele 6,2…6,6 şi se sterilizează la temperatura de 112…115°C timp de 15…20 min [2]. The closest solution is the process of preparing the culture medium which provides for the addition to 300 mL of distilled water of 10.0 g peptone, 2.0 g ammonium citrate, 5.0 g sodium acetate, 20.0 g glucose, 0.05 g manganese sulfate crystallohydrate, 0.2 g magnesium sulfate crystallohydrate, 0.2 g cysteine, 20.0 g agar-agar, 1 mL Twin-80, 50 mL yeast autolysate and 100 mL beef liver extract. The volume obtained is brought up to 500 mL with distilled water and hydrolyzed milk is added up to one liter. The pH of the medium is established within the limits of 6.2…6.6 and sterilized at a temperature of 112…115°C for 15…20 min [2].

Dezavantajul procedeului cunoscut constă în aceea că nu asigură o multiplicare efectivă a lactobacteriilor în procesul de cultivare. The disadvantage of the known process is that it does not ensure effective multiplication of lactobacteria in the cultivation process.

Problema pe care o rezolvă invenţia constă în elaborarea unui procedeu de obţinere a mediului nutritiv pentru cultivarea lactobacteriilor accesibile, care asigură obţinerea unei biomase sporite a lactobacteriilor în procesul de cultivare. The problem solved by the invention consists in developing a process for obtaining the nutrient medium for cultivating accessible lactobacteria, which ensures obtaining an increased biomass of lactobacteria in the cultivation process.

Problema se soluţionează prin aceea că procedeul include pregătirea mediului ce conţine, la 1 L: peptonă - 10 g, citrat de amoniu - 2 g, acetat de sodiu - 5 g, glucoză - 20,0 g, sulfat de mangan cristalohidrat - 0,05 g, sulfat de magneziu cristalohidrat - 0,2 g, cisteină - 0,2 g, agar-agar - 20 g, Tvin-80 - 1 mL, autolizat de drojdii - 50 mL, extract de ficat de vită - 100 mL, lapte hidrolizat - 500 mL, apă distilată - restul, cu pH 6,2…6,6 şi sterilizarea lui. În mediul obţinut se adaugă infuzie de rizomi de obligeană, obţinută prin infuzarea a 4,8…7,0 g materie primă tocată în 200 mL de apă clocotită timp de 30 min cu filtrarea şi sterilizarea ulterioară a infuziei obţinute, care se adaugă în cantitate de 20 mL la un litru de mediu nutritiv. The problem is solved by the fact that the process includes the preparation of the medium containing, per 1 L: peptone - 10 g, ammonium citrate - 2 g, sodium acetate - 5 g, glucose - 20.0 g, manganese sulfate crystallohydrate - 0.05 g, magnesium sulfate crystallohydrate - 0.2 g, cysteine - 0.2 g, agar-agar - 20 g, Tween-80 - 1 mL, yeast autolysate - 50 mL, beef liver extract - 100 mL, hydrolyzed milk - 500 mL, distilled water - the rest, with pH 6.2...6.6 and its sterilization. In the obtained medium, an infusion of obligeana rhizomes is added, obtained by infusing 4.8…7.0 g of chopped raw material in 200 mL of boiling water for 30 min with subsequent filtration and sterilization of the obtained infusion, which is added in an amount of 20 mL per liter of nutrient medium.

Rezultatul invenţiei constă în aceea că adăugarea extractului din rizomi de obligeană are o acţiune benefică asupra lactobacteriilor, efectul stimulator asupra multiplicării acestora fiind confirmat prin datele experimentale obţinute. The result of the invention is that the addition of the extract from obligeana rhizomes has a beneficial effect on lactobacteria, the stimulating effect on their multiplication being confirmed by the experimental data obtained.

Procedeul se realizează în modul următor. The procedure is carried out in the following way.

Se pregăteşte mediul electiv pentru cultivarea lactobacteriilor, adăugând la 300 mL de apă distilată 10,0 g peptonă, 2,0 g citrat de amoniu, 5,0 g acetat de sodiu, 20,0 g glucoză, 0,05 g sulfat de mangan cristalohidrat, 0,2 g sulfat de magneziu cristalohidrat, 0,2 g cisteină, 20,0 g agar-agar, 1 mL Tvin-80, 50 mL autolizat de drojdii şi 100 mL extract de ficat de vită. Volumul obţinut se aduce până la 500 mL cu apă distilată şi se adaugă lapte hidrolizat până la un litru. Se stabileşte pH-ul mediului în limitele 6,2…6,6 şi se sterilizează mediul la temperatura de 112…115°C timp de 15…20 min. Se cântăresc rizomii de obligeană, în prima variantă 4,8 g, în a doua - 5,8 g, iar în a treia - 7,0 g, se toacă şi se umectează timp de 5 min cu apă potabilă. Se toarnă peste tocătura umectată 200 mL apă potabilă încălzită până la fierbere şi se lasă amestecul pentru o jumătate de oră. Se filtrează extractul obţinut prin filtru de vată şi tifon şi se sterilizează în autoclavă la 0,5 atm timp de 30 min. Se adaugă în condiţii aseptice câte 20 mL extract de obligeană la fiecare litru de mediu. Se amestecă minuţios componentele şi se inoculează câte 0,2 mL suspensie microbiană, diluată succesiv de la 10…1 până la 10…9, se însămânţează pe mediul de cultură agarizat şi se incubă plăcile Petri timp de 24 ore la temperatura optimală pentru fiecare specie de microorganisme. După inoculare se determină cantitatea celulelor vii de lactobacterii în loturile experimental şi martor. Prepare the selective medium for the cultivation of lactobacteria by adding to 300 mL of distilled water 10.0 g peptone, 2.0 g ammonium citrate, 5.0 g sodium acetate, 20.0 g glucose, 0.05 g manganese sulfate crystallohydrate, 0.2 g magnesium sulfate crystallohydrate, 0.2 g cysteine, 20.0 g agar-agar, 1 mL Tween-80, 50 mL yeast autolysate and 100 mL beef liver extract. The volume obtained is brought up to 500 mL with distilled water and hydrolyzed milk is added to one liter. The pH of the medium is established within the limits of 6.2…6.6 and the medium is sterilized at a temperature of 112…115°C for 15…20 min. Weigh the rhizomes of the obligeana, in the first variant 4.8 g, in the second - 5.8 g, and in the third - 7.0 g, chop and moisten for 5 min with drinking water. Pour 200 mL of drinking water heated to boiling over the moistened mince and leave the mixture for half an hour. Filter the extract obtained through a cotton wool and gauze filter and sterilize in an autoclave at 0.5 atm for 30 min. Add 20 mL of obligeana extract to each liter of medium under aseptic conditions. Mix the components thoroughly and inoculate 0.2 mL of microbial suspension, successively diluted from 10…1 to 10…9, sow on the agarized culture medium and incubate the Petri plates for 24 hours at the optimal temperature for each species of microorganisms. After inoculation, the quantity of live lactobacilli cells in the experimental and control groups is determined.

Varianta 1 prevedea pregătirea extractului în conformitate cu procedeul propus din 4,8 g rizomi de obligeană, varianta II - din 5,8 g, iar varianta III - din 7,0 g. Variant 1 provided for the preparation of the extract according to the proposed procedure from 4.8 g of comfrey rhizomes, variant II - from 5.8 g, and variant III - from 7.0 g.

Lotul martor l-au constituit culturile de microorganisme însămânţate pe mediul electiv pentru cultivarea lactobacteriilor [2]. Pe variantele experimentale de mediu şi pe cele din lotul martor au fost însămânţate culturi de Streptococcus thermophilus, Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus casei. The control group consisted of cultures of microorganisms inoculated on the selective medium for the cultivation of lactobacteria [2]. Cultures of Streptococcus thermophilus, Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus casei were inoculated on the experimental medium variants and those in the control group.

Rezultatele testării sunt incluse în tabel. Cantitatea de celule microbiene vii reprezintă logaritmul zecimal al coloniilor de microorganisme crescute pe medii de cultură agarizate. The test results are included in the table. The amount of live microbial cells represents the decimal logarithm of the colonies of microorganisms grown on agarized culture media.

Variantele Cantitatea de celule microbiene vii la 1 mL suspensie (lg) Streptococcus thermophilus Streptococcus lactis Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus lactis Lactobacillus casei Martor 5,38 8,94 4,75 8,10 8,56 I 7,36 9,07 7,20 9,35 9,00 II 9,5 9,96 9,81 10,18 9,85 III 8,25 9,25 7,82 9,43 9,14Variants Quantity of live microbial cells per 1 mL suspension (lg) Streptococcus thermophilus Streptococcus lactis Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus lactis Lactobacillus casei Control 5.38 8.94 4.75 8.10 8.56 I 7.36 9.07 7.20 9.35 9.00 II 9.5 9.96 9.81 10.18 9.85 III 8.25 9.25 7.82 9.43 9.14

Analiza datelor obţinute denotă o multiplicare evident sporită a tuturor speciilor de lactobacterii testate pe mediul de cultură preparat conform procedeului propus comparativ cu lotul martor, mai evidentă fiind în cazul variantei a doua. Această compoziţie constituie varianta optimală a mediului preparat conform procedeului propus. The analysis of the obtained data shows a clearly increased multiplication of all lactobacilli species tested on the culture medium prepared according to the proposed procedure compared to the control batch, being more evident in the case of the second variant. This composition constitutes the optimal variant of the medium prepared according to the proposed procedure.

Procedeul de obţinere a mediului nutritiv propus este accesibil, uşor realizabil, permite de a cultiva eficient microorganismele din genul lactobacteriilor. Adăugarea la mediul nutritiv a extractului din rizomi de obligeană stimulează procesul de multiplicare a lactobacteriilor, ceea ce permite de a acumula biomasa necesară pentru pregătirea preparatelor microbiene. The proposed process for obtaining the nutrient medium is accessible, easy to implement, and allows for efficient cultivation of microorganisms of the lactobacilli genus. The addition of the extract from obligeana rhizomes to the nutrient medium stimulates the multiplication process of lactobacilli, which allows for the accumulation of the biomass necessary for the preparation of microbial preparations.

1. RU 2324732 C2 2008.05.20 1. RU 2324732 C2 2008.05.20

2. Timoşco M. Stresul şi flora microbiană intestinală. Chişinău, Tipografia AŞM, 2005, p. 170 2. Timoşco M. Stress and intestinal microbial flora. Chisinau, AŞM Printing House, 2005, p. 170

Claims

Process for obtaining the nutrient medium for cultivating lactobacteria which includes preparing the medium containing, per 1 L: peptone - 10 g, ammonium citrate - 2 g, sodium acetate - 5 g, glucose - 20.0 g, manganese sulfate crystallohydrate - 0.05 g, magnesium sulfate crystallohydrate - 0.2 g, cysteine - 0.2 g, agar-agar - 20 g, Twin-80 - 1 mL, yeast autolysate - 50 mL, beef liver extract - 100 mL, hydrolyzed milk - 500 mL, distilled water - the rest, with pH 6.2...6.6 and its sterilization, characterized in that in the obtained medium is additionally added infusion of obligeana rhizomes, obtained by infusing 4.8...7.0 g of chopped raw material in 200 mL of boiling water for 30 min with subsequent filtration and sterilization of the infusion obtained, which are added in an amount of 20 mL to one liter of nutrient medium.