LV14987B - Anti-HCV individuālas terapeitiskas vakcīnas prototips - Google Patents

Description

Izgudrojums attiecas uz biomedicmu, īpaši, vakcīnu veidošanas paņēmieniem.

Tehnikas līmeņa izklāsts

Hepatīta vīrusu klātbūtne ir un paliek nozīmīgs faktors, kas ietekmē sabiedrības veselības izmaiņas visā pasaulē. To apstiprina Pasaules veselības organizācijas dati, kas liecina, ka aptuveni 3 % no cilvēku populācijas ir inficēti ar hepatīta C vīrusu (HCV) un tādējādi tiek pakļauti hronisku aknu slimību, cirozes un hepatocelulārās karcinomas attīstīšanās riskam. Šobrīd HCV hepatīts tiek ārstēts kompleksi, ietverot medikamentozo ārstēšanu, saudzējošu režīmu un diētas ievērošanu. Visefektīvākais līdzekis šobrīd ir pegilētais α-IFN; lai panāktu augstāku ārstēšanas efektivitāti, pegilētais α-IFN tiek izmantots kombinācijā ar ribavirīnu, un HCV enzīmu inhibitoriem - šādas terapija ir efektīva apmērām 75 % gadījumos, bet ir saistīta ar smagām blakusparādībām (1). Būtiski ir tas, ka HCV daudzveidības un augstās ģenētiskās mainības dēļ replikācijas cikla laikā, pacientiem, kas pārslimojuši vīrushepatītu C, neveidojas specifiska neuzņēmība pret atkārtotu inficēšanos un saslimšanu (2), un tas ir galvenais iemesls kāpēc šobrīd vakcīna pret HCV - kā profilaktiska, tā arī terapeitiska, vel nav izveidota. Ir veikti aktīvi pētījumi, imunizējot šimpanzes ar profilaktisku vakcīnu kandidātiem, tiek veikti arī klīniskie pētījumi ar vīrusa apvalka E1 rajonu saturošiem preparātiem (InnoVac-C, Innogenetics u.c.) (3). Lielas cerības tie liktas arī uz HCV nestrukturālo proteīnu gēnu saturošam vakcīnām (4). Cilvēka C hepatīta vīrusa (HCV) apvalka proteīna augstā mainība rada nepieciešamību veidot personalizētās jeb individuālās vakcīnas, kas būtu efektīvas pret konkrētā slimnieka organismā persistējošo hepatīta C vīrusu, kura sauc par vīrusa izolātu.

Mēs piedāvājām HCV terapeitiskas vakcīnas izstrādes paņēmienu, kas ar vīrusveidīgo daļiņu (VLD, virus-like pārticies) tehnoloģijas palīdzību (5) ļauj apvienot preparātā gan vīrusa proteīnu augsti mainīgās, gan konservatīvas sekvences. HCV E2 apvalka proteīna hipervariablā rajona (HVR1) iekļaušana VLD sastāvā dod iespēju izsaukt konkrēta vīrusa izolāta neitralizējošu antivielu veidošanos. Savulaik HCV NS3 nestrukturāla proteīna fragmentu iekļaušana VLD sastāvā dod iespēju izsaukt anti-HCV citotoksisko limfocītu (CTL) aktivāciju (6).

Izgudroj urna izklāsts

Izgudrojumu paskaidro šādi zīmējumi:

1. zīm. HBc ekspresijas vektoru principiālā shēma.

A - HBc vektors HCV HVR1 rajona klonēšanai, B - HBc vektors HCV NS3 rajona fragmentu klonēšanai.

Elementi: HBcAg - mērķproteīna HBc gēns, BamHI un Bspl407I - attiecīgo restrikcijas endonukleāžu saiti, Ap un Neo - ampicilīna un kanamicīna rezistences gēni, Ptrp - triptofana operona promoters, ori - colEl replikācijas ori rajons.

2. zīm. HBc-NS3 vīrusveidīgo daļiņu attīrīšanas process. A - HBc-NS3/£.coli BL21 izdalīšanas un attīrīšanas process: 1 - lizāts pēc šūnu dezintegrēšanas, 2 - supematants, 3 - supematants pēc ekstrakcijas ar 1M urīnvielu, 4 - debris pēc ekstrakcijas ar 1M urīnvielu, 5 - attīrītais proteīna preparāts, 6 - proteīnu molekulārā svara marķieris (Thermo Scientific Pierce); B - HBcNS3/E.coli BL21 lizāta frakcionēšana saharozes gradientā: 1-18 - frakcijas no ultracentrifugēšanas saharozes gradientā, 19 - lizāts pēc šūnu dezintegrēšanas. Paraugu analīze SDS-PAGE, krāsots ar Coomassie Brilliant Blue G250.

3. zīm. HBc- vīrusveidīgo daļiņu elektronmikroskopija. A - attīrīta proteīna HBc-HVRl veidotas vīrusveidīgās daļiņas, B - attīrīta proteīna HBc-NS3 veidotas vīrusveidīgās daļiņas.

4. zīm. HBc-HVRl un HBc-NS3 proteīnu imunizācijas rezultāti.

A - anti-HBc un anti-HVRl antivielu titrs imunizēto dzīvnieku serumā, B - anti-HBc un anti-NS3 T-limfocītu stimulācijas indeksi imunizēto dzīvnieku liesā, C - HCV pseidovīrusu neitralizācija ar imunizēto dzīvnieku serumu.

Ekspresijas sistēma HBc- HVR1 un HBc-NS3 vīrusveidīgo daļiņu iegūšanai

Cilvēka B hepatīta vīrusa (HBV) nukleokapsīda proteīna (HBc) rekombinantā forma, kas E.coli ekspresijas sistēmās veido vīrusam līdzīgas daļiņas (VLD), ir izmantojama rekombinantu vakcīnu prototipu konstruēšanai. HBc proteīna tolerances pakāpe insercijām ir augsta (3, 5, 7).

HBc-HVRl un HBc-NS3 ekspresijas vektori

HBc-HVRl un HBc-NS3 proteīnu ekspresijas vektori (l.zīm.) ir izveidoti uz pBR327 plazmīdas (8) bāzes un satur šādus principiālos elementus (9): replikācijas ori, Ap- un Neo- rezistences gēnus, Ptrp promoteru (10, 11) un attiecīgā mērķproteīna gēnu. Ekspresijas vektori izveidoti, izmantojot HBc gēnu no Latvijā izolēta HBV (genotips D, subtips ayw2) genoma (7).

HBc vektors pHBc 1-832 ir paredzēts HBc-HVRl rekombinanto proteīnu iegūšanai. Vektora mērķproteīna gēns satur HBc proteīna 1-144 ask kodējošo sekvenci, kurā HBc MIR rajonā starp proteīna 78. un 79. aminoskābēm ir ievests BamHI restrikcijas endonukleāzes saits HVR1 sekvenču ieklonēšanai, un 13 ask garo linkeri 3’-galā.

HBc vektors pHBc 1-984 ir paredzēts HBc-NS3 rekombinanto proteīnu iegūšanai. Vektora mērķproteīna gēns satur HBc proteīna pilna garuma sekvenci ar Bspl407I restrikcijas endonukleāzes saitu 3 ’ galā NS3 proteīna fragmentu ieklonēšanai.

Ekspresijas sistēma ir pielietojama jebkura HBV genotipa - Α, B, C, D, E, F. G, H attiecīgo HBc un jebkura HCV genotipa HVR1 un NS3 himēro proteīnu variantiem. Sistēma ir elastīga un viegli adaptējama konkrēta pacienta terapijai, ieklonējot attiecīgajos ekspresijas vektoros HCV sekvences, kas ir iegūtas no pacienta organismā persistējoša vīrusa.

Sistēmas efektivitāte tika pabaudīta uz laboratorijas dzīvniekiem (Balb/C līnijas peles). Kā modelis tika izmantota HVR1 sekvence no HCV genoma H77 izolāta (12) un NS3 proteīna 1435.-1446. ask fragmentu kodējošā sekvence no Bolela sintētiska HCV genoma (13).

HBc-HVRl rekombinantais proteīns

HBc-HVRl rekombinantā proteīna aminoskābju secība:

MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDNASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILC

WGELMTLATWVGGNLEDPETHVTGGSAGHTTAGLVGLLTPGAKQNIkDPISRDLVV

SYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPislgp gleklefg

HCV HVR1 sekvence dota treknrakstā, ar mazajiem burtiem apzīmētas nespecifiskās aminoskābes.

HBc-NS3 rekombinantais proteīns

HBc-NS3 rekombinantā proteīna aminoskābju secība:

MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILC

WGELMTLATWVGGNLEDPISRDLWSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYL

VSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRES

QCtVATDALMTGYGD

HCV NS3 fragmenta sekvence dota treknrakstā, ar mazajiem burtiem apzīmētas nespecifiskās aminoskābes.

E.coli saimniekcelmi himēro proteīnu ekspresijai

HBc-HVRl rekombinantā proteīna ekspresijai tiek izmantots E.coli celms K802 (F' r_K' m_K ⁺ el4 McrA metBl lacYl [or lacī-Y6] galK2 galT22 glnV44 mcrB): HBc-NS3 rekombinantā proteīna ekspresijai tiek izmantots celms E.coli BL21 [F’ ompThsdSņ (r_B‘m_B’) gal dcm lon\.

Izgudrojuma izpildes piemērs

HBc-HVRl un HBc-NS3 proteīnu saturošas E.coli biomasas iegūšana

Mērķproteīnu saturoša biomasa tiek iegūta, kultivējot producenta šūnas kolbās uz kratītāja (250 apgr/min) M9 sāļu barotnē (pH 7,2) ar sekojošām piedevām: kazamīnskābes (Casamino Acids, Difco) - 1,0 %, glikoze - 0,2 %, tiamīns - 0,001 %. Barotnes daudzums - Ά no kolbas tilpuma (3,

9). Kultivēšanas apstākļi: 37 °C, 16-20 h. Biomasas iznākums 6-8 g/1, mērķproteina sintēzes līmenis 5-10 % no šūnas kopproteīna.

Mērķproteīna ekstrakcija

Visi darbi tiek veikti +4 °C temperatūrā.

Dezintegrācija, izmantojot French presi - 3 cikli, spiediens 20000 psi, pēc tam 30 min ekstrakcija ar 1M urīnvielu 0,1% Triton X 100 klātbūtnē, tad supematanta iegūšana centrifugējot 30 min pie 10000 x g.

Ultracentrifugēšana

Visi darbi tiek veikti +4 °C temperatūrā.

Mērķproteīnu saturošais E.coli šūnu ekstrakta supematants tiek frakcionēts ar ultracentrifugēšanu lineārā saharozes gradientā (20-60%, svara procenti) SW 32 piekaru rotorā 18-20 stundas pie 28000 apgr/min. Iegūtās frakcijas tiek analizētas SDS-PAGE gēlā, mērķproteīnu saturošās frakcijas tiek atbrīvotas no saharozes ar dialīzi pret PBS buferi un koncentrētas uz Amicon 100 kD filtra. Proteīna preparātam tiek pielikts glicerīns līdz 50%.

Vakcīnas prototipa proteīnu preparātu īpašības

Vakcīnas prototipa preparāti ir vīrusveidīgās daļiņas (3.zīm.). Mērķproteīnu koncentrācija gala preparātos - 1-5 mg/ml. Mērķproteīna tīrības pakāpe >90%.Vīrusveidīgo daļiņu iznākums - 5-10 mg/g svaigas biomasas.

Denaturējošā poliakrilamīda-SDS gēlā vīrusveidīgās daļiņas uzrāda vienu specifisku zonu.

HBc-HVRl un HBc-NS3 vīrusveidīgo daļiņu imunogenitāte

Anti-HBc un anti-HCV imunoatbildes stimulācijai izstrādāta imunizācijas shēma. Balb/C līnijas peles (H-2d haplotips, svars 20 g) tika imunizētas ar HBc-HVRl un HBc-NS3 rekombinanto proteīnu ekvimolāro maisījumu (deva 25 mkg, adjuvants Alhydrogel (Brendtag, Denmark), 250 mkg) divos piegājienos, ar 21 dienu ilgu starplaiku starp imunogēna injekcijām. Šāda imunizācijas shēma nodrošina B-šūnu imūno atbildi un specifisko anti-HVRl un anti-HBc antivielu sintēzi, kā arī HBV- un HCV-specifisko T-šūnu aktivāciju (4. zīm. Α, B).

Parādīts, ka imunizācijas rezultātā iegūtās anti-HVR antivielas neitralizē HCV pseidodaļiņas modeļsistēmā (14) (4.zīm. C).

Atsauces

1. Kim do Y, Ahn SH, Han KH. Emerging therapies for hepatitis C. Gut and liver. 2014;8(5):471-9. Epub 2014/09/18.

2. Vīksna L. Vakcinācija. Rīga: Nacionālais apgāds; 2003.

3. Pumpens P. UR, Sasnauskas K, Kazaks A., Ose V., Grens E. Construction of novel vaccines on the basis of the virus-like pārticies: Hepatitis B virus proteīns as vaccine carriers. In: YE K, editor. Medicīnai Protein Engineering: CRC Press; 2008. p. 205-48.

4. Sallberg M, Frelin L, Weiland O. DNA vaccine therapy for chronic hepatitis C virus (HCV) infection: immune control of a moving target. Expert opinion on biological therapy. 2009;9(7):805-15. Epub 2009/06/17.

5. Pumpens P GE. Artificial genes for chimeric virus-like pārticies. In: Khudyakov YE FH, editor. Artificial DNA: Methods and Applications. Boca Raton: CRC Press LLC; 2002. p. 24937.

6. Stoll-Keller F, Barth H, Fafi-Kremer S, Zeisel MB, Baumert TF. Development of hepatitis C virus vaccines: challenges and progress. Expert review of vaccines. 2009;8(3):33345. Epub 2009/03/03.

7. Pumpens P, Grens E. HBV core pārticies as a carrier for B cell/T celi epitopes. Intervirology. 2001;44(2-3):98-l 14. Epub 2001/08/18.

8. Soberon X, Covarrubias L, Bolivar F. Construction and characterization of new cloning vehicles. IV. Deletion derivatives of pBR322 and pBR325. Gene. 1980;9(3-4):287-305. Epub 1980/05/01.

9. Dislers A., Sominska I, Kazaks A, Petrovskis I, Zariņa I. Expression system for producing recombinant virus-like pārticies. Latvian Patent 2008: LV 13587 (B) Int.Cl: C12N15/71, A61K39/29.

10. Ovchinnikov Iu A, Sverdlov ED, Tsarev SA, Khodkova EM, Monastyrskaia GS. [Direct expression of the gene of human leukocyte interferon F in Escherichia coli celis], Doklady Akademii nauk SSSR. 1982;265(l):238-42. Epub 1982/01/01. Priamaia ekspressia gēna chelovecheskogo leikotsitamogo interferona F v kletkakh Escherichia coli.

11. Pushko P, Sallberg M, Borisova G, Ruden U, Bichko V, Wahren B, et al. Identification of hepatitis B virus core protein reģions exposed or intemalized at the surface of HBeAg pārticies by scanning with monoclonal antibodies. Virology. 1994;202(2):912-20. Epub 1994/08/01.

12. Ogata N, Alter HJ, Miller RH, Purcell RH. Nucleotide sequence and mutation rāte of the H strain of hepatitis C virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1991 ;88(8):3392-6. Epub 1991/04/15.

13. Burke KP, Munshaw S, Osbum WO, Levine J, Liu L, Sidney J, et al. Immunogenicity and cross-reactivity of a representative ancestral sequence in hepatitis C virus infection. J Immunol. 2012; 188(10):5177-88. Epub 2012/04/18.

14. Bartosch B, Dubuisson J, Cosset FL. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. The Journal of experimental medicine. 2003; 197(5):633-42. Epub 2003/03/05.

Claims (4)

1. Pretenzijas

   1. HCV terapeitiskas proteīna vakcīnas preparāts, kas satur rekombinantas HBc-HVRl un HBcNS3 vīrusveidīgas daļiņas.
2. 2. HBc-HVRl vīrusveidīgas daļiņas saskaņā ar 1. pretenziju, kas satur HCV HVR1 sekvenci 1144 ask HBc gēna MIR rajonā starp 78. un 79. aminoskābi.
3. 3. HBc-NS3 vīrusveidīgas daļiņas saskaņā ar 1. pretenziju, kas satur HCV NS3 rajona fragmenta sekvenci pilna garuma HBc gēna 3’ galā.
4. 4. Vīrusveidīgās daļiņas saskaņā ar 2. vai 3. pretenziju, kas iegūtas, ekspresējot rekombinanto konstrukciju E. coli šūnās un izolējot ekspresijas produktus.