KR101250029B1 - Ｈｂｖ 감염 또는 ｈｂｖ-매개 질병의 예방/치료를 위한조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 두 개의 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAgs), 이의 단편들(fragments) 및/또는 이를 코딩하는(encoding) 핵산을 포함하고, 상기 HBsAg의 S 영역 및/또는 프리(pre)-S1 영역에서 B형 간염 바이러스(HBV) 유전자형이 다르며, HBsAgs, 및 HBV 코어 항원(HBcAg) 또는 그 항원을 코딩하는 핵산을 함유하지 않는 조성물; 악물학적 조성물, 특히 상기 조성물을 포함하는 백신 및 HBV 감염 또는 HBV-매개 질병의 예방/치료를 위한 이들의 사용방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 B형 감염의 치료적 처치를 위한 환자-특이 약물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Figure R1020067004038
B형 간염 바이러스, 표면 항원, 단편, 핵산, 유전자형, 코어 항원

Description

ＨＢＶ 감염 또는 ＨＢＶ-매개 질병의 예방/치료를 위한 조성물 {Composition for the prophylaxis/treatment of HBV infections and HBV-mediated diseases}
본 발명은 적어도 두 개의 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAgs), 이의 단편들(fragments) 및/또는 이를 코딩하는(encoding) 핵산을 포함하고, 상기 HBsAg의 S 영역 및/또는 프리(pre)-S1 영역에서 B형 간염 바이러스(HBV) 유전자형이 다르며, HBsAgs, 및 HBV 코어 항원(HBcAg) 또는 그 항원을 코딩하는 핵산을 함유하지 않는 조성물; 악물학적 조성물, 특히 상기 조성물을 포함하는 백신 및 HBV 감염 또는 HBV-매개 질병의 예방/치료를 위한 이들의 사용방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 B형 감염의 치료적 처치를 위한 환자-특이적 약물을 제조하는 방법; 및 HBV 유전자형 진단용 키트(kit)에 관한 것이다.
세계의 25억 이상의 인구가 B형 간염 바이러스(HBV)에 감염되어 있다. 만성 간 부전(insufficiency), 간경변 및 간세포 암종(HCC)을 포함하는 엄청난 감염자 수는 병리학적 중요성을 나타낸다. 다른 사람은 그렇지 않은데 소정의 사람들이 급성 HBV 감염이 발병되는 이유는 알 수 없다. 임상 데이타 및 다른 만성 바이러스 감염과의 유추는 바이러스 감염의 조절에서 세포-매개 면역 반응(immune response), 특히 세포독성 T-림프구(cytotoxic T-lymphocytes)의 중요성을 강조해 왔다. 세포독성 T-세포 반응의 유도는 급성 HBV 감염을 제거하고 만성 HBV 감염을 방지하는데 결정적인 요인이다. 바이러스 게놈(genome)은 특히(inter alia) 외피 단백질 프리-S1, 프리-S2 및 S-항원(HBsAg), 폴리머라제 및 코어 단백질(HBcAg)을 코딩한다.
만성 B형 간염은 만성적으로 지속적이거나 만성적으로 공격적인 과정을 일으킬 수 있는 간의 진행성(progredient) 염증이다. 만성적으로 지속적인 간염은 간의 넓혀진 간문맥 부분에 한정된 침윤(infiltration)을 나타내어 섬유종 형성(fibrosation)을 증가시킨다; 임상적으로, 지속적인 간염의 징후는 수년간(최고 10년) 유지되고, 상기 사례 중 약 80%가 HBsAg-양성이 된다. 병인은 아마도 세포의 면역 체계의 결핍 및 지속적인 바이러스 감염에서 비롯된다.
226개의 아미노산 단백질(p24/gp27 또는 S-단백질) 작은 B형 간염 표면 항원(HBsAg)은 100-150개의 서브단위들이(subunits) 다수의 외부- 및 내부-분자의 이황화 결합에 의해 교차결합된 20-30㎚ 리포 단백질(lipoprotein) 입자들로 회합된 대표적인 HBV 항원이다. 다른 서브타입 및 유전자형의 HBV-분리물로부터 S-단백질의 다양성은 제한된다. 4개의 안정한, HBsAg 서브타입 adw, adr 및 ayr은 면역우세한(immunodominant) "a-결정기"(124-147 부분을 포함하는 친수성 영역)에 인접하여 위치한 122 및 160 위치의 단일 아미노산 교환과 관련된다. 상기 서브타입들은 HBV 감염에 있어서 어떠한 생물학적 또는 병리학적 차이점이 규명된 적이 없다.
만성 HBsAg 보균자의 혈장(plasma)으로부터 얻은 백신은 1982년 독일 연방 공화국에서 최초로 승인되었다. 그 이후로, 상기 백신은 유전적 기술에 의해 생산되었고, 위험한 군들의 활성있는 면역화를 위해 사용되어왔다. 예방접종(inoculation)에 앞서 혈청반응음성(seronegative)인 사람들 중 95%는 1년 후에 면역반응(immune reaction)을 나타낸다. 사용된 모든 B형 간염 백신은 B형 간염 바이러스의 비-감염성 시스(sheath)와 관련된 고농도의 정제된 HBsAg 단백질을 함유하고 바이러스 DNA와 무관하고 포르말린-비활성(formalin-deactived)이다.
종래기술의 단점은 면역화된 적어도 5% 사람들이 면역반응(immune response)을 나타내지 않는 "비-감응자"라는 것이다. 더욱이, 지금껏 만성적으로 지속적인 간염의 치료용으로 알려진 백신이 없었다.
WO 01/40279 및 WO 01/38498은 B형 간염 바이러스 유전형 G를 기본으로 하나, 두 가지 특허 명세서는 다른 유전자형의 조합에 대해서는 언급하고 있지 않다.
Michel et al., PNAS 92 (1995), 5307-5311 및 Mancini et al., PNAS 93 (1996), 12496-12501은 HBsAg를 기본으로 한 DNA 백신에 관한 것이다. 상기 논문들은 다른 HBV 유전형의 HBsAg의 조합을 함유하는 조성물의 사용에 관해 언급하고 있지 않다.
따라서, 본 발명은 HBV 감염 또는 HBV-매개 질병을 예방/치료하는 개선된 방법을 제공하는 문제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 간염의 치료적 처치를 위한 환자-특이적 약물을 제공하는 문제에 관한 것이다. 다른 목적은 HBV 감염의 진단을 위한 개선된 키트를 제공하는 것이다.
본 발명에 기초를 이루는(underlying) 문제는 적어도 두 개의 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg), 이의 단편들 및/또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 HSbAg의 S 영역 및/또는 프리-S1 영역에서 B형 간염 바이러스(HBV) 유전자형이 다르며, HBsAg, HBV 코어 항원(HBcAg) 또는 그 항원을 코딩하는 핵산을 함유하지 않는 조성물을 제공함으로써 해결될 것이다.
본 발명은 후술 될 놀라운 관찰결과들을 기반으로 한다: 간에서 HBsAg 서브타입 ayw를 항시적으로 발현하는 형질전환(transgenic) 쥐(마우스)들은 만성 HBV 감염에 대한 특이 면역치료 프로토콜(protocol)의 효율성을 평가하기 위한 예비임상 모델로서 간주된다. 이러한 쥐들은 지속적인 항원혈증(antigenaemia)의 결과로서 발생하는 대량의 HBsAg를 생성하고, 실질적으로 HBsAg에 대해 내성을 갖는다. 발명자들은 이제 HBsAg 유전자형에서 형질전환 쥐의 유전자형(ayw)에 정확하게 대응되는 백신으로, 한편으로는 상기 형질전환 쥐의 것과 다른 HBsAg 유전자형을 함유하는 백신으로 HBsAg-형질전환 쥐들을 면역시킨다. 그 자체의 HBsAg에 대응되는 HBsAg 항원으로 상기 형질전환 쥐의 반복적인 면역화에도 불구하고, 세포독성 T-세포 반응이 관찰되지 않았다. 반면에, 그 자체의 유전자형과 다른 HBsAg 유전자형으로 형질전환 쥐의 면역화는 HBsAg에 유전자형-특이 및 교차-반응성 세포독성 T-세포 반응을 이끌어냈다. 이것은 천연적으로 발생하는 HBsAg의 변이체가 교차-반응성 T-세포 면역의 기폭제(priming)에 의해 "내성"을 깨뜨릴 수 있다는 것을 보여준다. 더욱이, 상기 세포독성 T-세포 면역의 활성은 HBsAg ayw-항원의 감소 및 HBV의 효과적인 조절을 가진 급성 간염에 관련된 간-특이 징후 및 증상을 초래한다. 관찰된 면역 반응(immune response)은 단지 적은 수의 부위에서만 HBsAg ayw-항원의 아미노산 서열이 HBsAg adw2-항원의 아미노산 서열과 다르기 때문에 특히 주목할 만하다. T-세포 에피토프에 있는 아미노산의 적은 양의 보존적인(conservative) 교환일지라도 상기 에피토프에 관련된 T-세포 반응에서 변화를 초래할 수 있다는 사실이 본 발명에서 확실해졌다.
단백질 항원에 대한 T-세포 반응의 특이성 및 효율은 다양한 수준에 의해 조절되는데, 특히 (i) 에피토프(또는 항원성 펩타이드)의 단백질 가수분해성(proteolytic) 방출; (ii) MHC(major histocompatibility complex)의 표제성(presenting) 당단백질에 대한 항원성 단백질의 친화도; 및 동일한 항원의 다른 에피토프들에 대한 T-세포 반응들을 경쟁적으로(competitatively) 발전시키는 음성적 간섭; 등의 결정적인 요인들에 의해 조절된다. 단백질 항원의 천연 변이체는 (에피토프 내의 주요한 서열에서 각각의 아미노산 서열을 교환하거나, 에피토프를 인접(flanking)시킴으로써, 또는 새로운 에피토프의 생성에 의하여) 다음의 4가지 면에서 특이한 T-세포 반응을 유도할 수 있다:
(i) 단백질로부터 항원 펩타이드의 더욱 효과적인 단백질 프로세싱(해리);
(ii) 존재하는 MHC 분자에 대한 항원성 펩타이드의 고-친화성 결합;
(iii) 에피토프의 면역원성(immunogenicity)을 약화시키는, (i) 및/또는 (ii)에서 언급된 유사한 진행에 의해 (동일한 단백질 항원의 다른 에피토프에 대한 반응을 억제하는) 면역우세한 에피토프의 제거;
(iv) 새로운 에피토프가 생성될 수 있음.
본 발명의 내용에서, 유전자형에 의해 반영된 HBsAg의 천연 변이체는 이들이 자극하는 T-세포 반응에서 비교적 넓은 스펙트럼의 특이성을 갖는다.
본 발명에 따르면, 용어 "HBV 유전자형"은 B형 바이러스 게놈의 전체를 의미한다. HBV 유전자형은 전체 서열 및 계통 발생의(phylogenetic) 분석에 의해 결정되는 것이 바람직하다. 현재 8개의 표준 유전자형이 알려져 있다. 상기 8개의 유전자형은 서로에 대해 8%의 뉴클레오티드 변이에 기초한 것이다; Bartholomeusz, Rev. Med. Virol. 13 (2003), 1-14 참고. 바람직하게는 상기 HBV 유전자형 A는 기준(reference) 핵산 서열 Genbank X02763을, HBV 유전자형 Aafr의 경우 Genbank AF297621에 따른 기준 핵산 서열을 갖는다. HBV 유전자형 Ba의 경우, 기준 핵산 서열은 Genbank D00330이고 유전자형 Bj의 경우 기준 핵산 서열은 AB073858이다. HBV 유전자형 C의 경우, 기준 핵산 서열은 Genbank AY206389이고, 유전자형 Caus 경우에 기준 핵산 서열은 Genbank AB048704에 따른다. 유전자형 D의 경우, 기준 핵산 서열은 Genbank X02496이다. 유전자형 E에 대한 기준 핵산 서열은 X75657이다. 유전자형 F에 대한 기준 핵산 서열은 X69798이다. 유전자형 G에 대한 기준 핵산 서열은 AF160501이고 유전자형 H에 대한 기준 핵산 서열은 AY090454이다.
전술한 유전자형에 있어서, 하기와 같은 유전자형과 서브타입(subtype) 사이에 소정의 관계가 있다: 유전자형 A는 서브타입 adw2, ayw1과 관련되고; 유전자형 B는 adw2, ayw1과 관련이 있고; 유전자형 C는 adw2, adrq+, adrq-, ayr, adr과 관련이 있다. 유전자형 D는 ayw2, ayw3, ayw4와 관련이 있다. 유전자형 E는 ayw4와 관련이 있다. 유전자형 F는 adw4q-, adw2 및 ayw4와 관련이 있고; 유전자형 G는 adw2와 관련이 있고 유전자형 H는 adw4와 관련이 있다.
감염된 환자의 HBV 서브타입의 결정방법은 단일-특이 항체, 예를 들어 항-d 항-y, 항-r 항-a(w)에 의하여 혈청학적으로(serologically) 수행될 수 있다. 상기 결정 방법은 아가(agar) 겔 분산 테스트의 형태 또는 방사선 면역검사(immunoassay)의 형태로 수행할 수 있다;("HBs 항원 서브타입들", 1976년 Bibliotheca Haematologica no.42, S. Karger, Basel에 Courouce, A. M., Holland, P.V., Muller, J.Y. 및 Soulier, J. P.에 의해 출판됨).
서브타입은 또한 환자 혈청(serum)으로부터 HBsAg-코딩 DNA를 서열분석(sequencung)함으로써 결정될 수 있다. 그다음 HBsAg의 아미노산 서열은 상기 결정된 핵산 서열로부터 유도된다. 그 다음 Magnius, L.O. 및 Norder, H.에 의해 "subtypes, Genotypes and molecular epideminology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability of the S-gene"이라는 제목으로 intervirology 38(1-2): 24-34에 기재된 바와 같이 서브타입의 할당(assignment)은 위치 122 및 160에서 아미노산에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면 "B형 간염 바이러스 표면 항원" (HBsAg) 발현은 작은 HBV 표면 항원 또는 S 단백질(p24/gp27)을 표시한다. 또한 HBsAg는 프리-S1 단백질 도메인(domain)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, HBsAg는 S 단백질 및/또는 프리-S1 단백질 도메인으로 이루어진다.
HBsAg 넘버링에 있어서, KiddLjunggren et al., J. Gem. Virol. 83(2002), 1267-1280에 따른 시스템이 사용된다.
본 발명에 있어서, 용어 "단편(fragment)"은 HBsAg의 단편들을 포함한다. 바람직하게는 상기 단편은 적어도 5개의 아미노산을 포함하고 T-세포 에피토프, 바람직하게는 적어도 10개, 특별히 적어도 20개, 더욱 특별히 적어도 50개의 아미노산을 함유한다. 바람직한 구체예에 따르면, 조성물은 적어도 두 개의 HBsAg 또는 그것의 단편 두 개를 포함한다. 상기 조성물은 폴리펩타이드-계 백신으로서 사용되기에 특히 적합하다. 특히 상기 조성물이 다른 HBV 유전자형을 가진 HBsAg로부터 유래된 두 개의 단편들을 포함하는 경우에, 제1 및 제2 단편들은 공통적으로 적어도 10개의 아미노산, 바람직하게는 20개의 아미노산을 가지나, 적어도 하나의 아미노산이 서로 다르다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 다른 유전자형의 결과로서 나타나는 항원(HsAg)의 매우 작은 차이점으로 인해 변형된 T-세포 에피토프를 유도하는데, 그것은 서로 매우 약간만 다르나 T-세포 반응성에 엄청난 차이를 초래한다는 점에 기초한다. 따라서, 적어도 하나의 아미노산에 의해 서로 다른 두 개의 단편은 HBsAg와 관계된 알려진 유전자형의 단순 서열 비교에 의해 쉽게 인지될 수 있다. 적어도 하나의 아미노산에 의해 서로 다른 적당한 단편들이 본 발명에 따른 조성물에 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 단편들은 적어도 하나의 T-세포 에피토프, 특히 인간 세포 에피토프를 함유한다. T-세포 에피토프를 결정하는 방법은 알려져 있는데, 예를 들어 Lauer et al., J. Virol. 76(2003), 6104-6113에 기재되어 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 상기 조성물은 적어도 두 개의 HBsAg 및/또는 적어도 두 개의 그것의 단편들을 포함한다.
또한, 바람직하게는 적어도 제1 HBsAg 또는 그것의 단편 및 제2 HBsAg를 코딩하는 핵산 또는 그것의 단편, HBV 유전자형이 다른 제1 및 제2 HBsAg를 포함하는 조성물이다.
더욱 바람직한 구체예에 따르면, 상기 조성물은 두 개의 HBsAgs를 코딩하는 적어도 두 개의 핵산을 포함하며, 상기 HBsAgs는 HBV 유전자형이 다르다. 또한 핵산은 상기 정의된 대로 단편을 코딩하는 핵산이 될 수 있다. 상기 핵산은 바이러스 DNA 또는 합성 DNA가 될 수 있고, 상기 합성 DNA 서열은 변형된 뉴클레이시드간의(internucleoside) 결합을 함유하는 것들을 포함하는 것으로 이해된다. 또한 상기 핵산은 재조합 벡터 시스템에 의해 발현하기 위해 요구될 수 있는 RNA 분자가 될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따르면 혼합된 DNA/RNA 분자 또한 핵산으로서 고려될 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 유전자형은 알려진 유전자형 A, B, C, D, E, F, G 및 H로부터 선택된다. 각각의 기준 핵산 서열에 있어서, 기준 서열은 상술한 바와 같다. 일반적으로 유전자형은 상기 기준 핵산 서열에 비해 8% 뉴클레오티드 변이에 의해 결정되는데, 이것은 또한 기준 핵산 서열에 적어도 92% 동일한 핵산이 정의에 따른 유전자형으로서 이해된다는 것을 말한다. 기준 핵산 서열에 비해 적어도 95%, 특히 98%의 동일성이 특히 바람직하다. 기준 핵산 서열에 대한 "동일성"은 알려진 방법에 의해 결정된다. 특이한 조건을 고려한 알고리즘(algorithms)을 갖는 특별한 컴퓨터 프로그램이 일반적으로 사용된다.
동일성을 결정하는 바람직한 방법은 비교될 서열들 사이의 최대 일치 예에서 발생한다. 동일성을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램은 GAP(Deverory, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), 387; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (WI)); 및 BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul, S., et al. J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410)를 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. BLASTX 프로그램은 National Center For Biotechnology Information(NCBI) 및 다른 출처(BLAST Handbook, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al.; above)로부터 얻을 수 있다. 알려진 Smith-Waterman 알고리즘은 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다.
핵산 비교에 바람직한 변수는 하기사항들을 포함한다:
Needleman 및 Wunsch 알고리즘, J. Mol. Biol. 48 (1970), 443-453
비교 매트릭스(comparison matrix):
일치(Matches) = +10
불일치(Mismatches) = 0
갭 패널티(Gap penalty): 50
갭 랭쓰 패널티(Gap length penalty): 3
GAP 프로그램은 상기 변수들을 가지고 사용하기에 적절하다. 상기 변수들은 핵산 서열 비교에서 디폴트(default) 변수이다. 알고리즘의 다른 예인 갭 오프닝 패널티(gap opening penalties), 갭 익스텐션 패널티(gap extention penalties) 및 비교 매트릭스(matrices)는 프로그램 핸드북 위스콘신 패키지, 버전 9, 1997년 9월에 상기의 것들을 포함한다. 선택은 수행될 비교에 달려있고 GAP 또는 BEST Fit이 사용될 때 서열 쌍들 사이에 수행될 비교, 또는 FASTA 또는 BLAST가 사용될 때 서열과 큰 서열 데이터 뱅크 사이의 비교에 달려있다.
상기 알고리즘에 따른 92% 일치는 본 발명에 연관된 92% 동일성을 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은, 변이체가 기준 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리머라제의 활성에 실질적으로 상응하는 활성을 갖는 폴리머라제를 코딩하고/하거나 변이체가 기준 핵산 서열에 의해 코딩된 HBsAg의 면역반응성에 실질적으로 상응하는 면역반응성을 갖는 HBsAg를 코딩하는 것에 특징이 있다.
상기 폴리머라제 활성은 Kim et al., Biochem. Mol. Int. 1999; 47 (2), 301-308에 따라 결정될 수 있다. HBsAg의 면역반응성은 상업적으로 시판되는 항원 ELISAs에 의해 결정될 수 있다. "기준 핵산에 의해 코딩된 HBsAg의 면역반응성에 의해 실질적으로"는 항체가 변이체에 의하여 코딩된 HBsAg에 대해 실질적으로 동일한 친화성을 갖는 기준 HBsAg에 결합하는 것을 의미한다.
바람직한 구체예에 따르면, 조성물은 적어도 세 개의, 바람직하게는 적어도 다섯개의 다른 HBsAg, 그것의 단편 및/또는 그것들을 코딩하는 핵산을 포함한다.
특히 바람직하게는, 상기 조성물은 모든 알려진 HBV 유전자형, 그것의 단편 및/또는 그것들을 코딩하는 핵산을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물의 바람직한 구체예에 있어서, HBsAg 또는 그것의 단편을 코딩하는 핵산은 포유동물(mammal) 세포, 바람직하게는 인간 세포에서의 발현에 적합한 프로모터의 조절 하의 벡터 내에 존재한다. 상기 조성물이 HBsAg 또는 그것의 단편을 코딩하는 두 개의 핵산을 포함하면, 상기 핵산들은 동일한 벡터(이중 벡터)에 존재하거나 또는 다른 벡터들상에 서로 분리되어 존재할 수 있다. 예를 들어, 적당한 벡터는 플라스미드, 아데노바이러스, 종두 바이러스, 배큘로바이러스, 홍역 바이러스 및 레트로바이러스이다. 일반적으로 상기 벡터는 감염된 포유동물 세포에 있는 벡터의 복제에 영향을 미치는 복제 원인을 포함한다.
적당한 프로모터는 항시성(constitutive) 및 유도성인 프로모터가 될 수 있다. 바람직한 프로모터는 CMV 및 SV-40으로부터 유래한 것들이다.
전술된 조성물은 각각의 성분을 단순히 혼합함으로써 얻어질 수 있고 따라서 제조가 매우 간단하다. 적절한 용매 및 담체(carriers)는 상기 조성의 특성물(폴리펩타이드 및/또는 핵산)에 달려있다. 원칙적으로, 물-함유 시스템이 바람직하다. HBsAg 또는 그것의 단편은 합성하거나 또는 재조합법에 의해 얻어질 수 있다. 제조된 폴리펩타이드는 크로마토그래프 방법으로 정제될 수 있다.
다르게는, 상기 조성물은 재조합 발현 시스템에서 HBsAg 또는 그것의 단편을 코딩하는 적어도 두 개의 핵산의 공-발현에 의해 얻어질 수 있다. 당업계에서 숙련된 기술자(당업자)는 다수의 발현 시스템 및 방법에 익숙할 것이다; 바람직하게는 효모는 숙주 세포로서 사용되고, 특히 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)가 사용된다. 핵산은 하나의 벡터 안에 또는 서로 분리된 두 개의 벡터에 존재할 수 있다. 적당한 벡터 및 프로모터는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 일면에 따르면, 본 발명에 따른 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 것이다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업자들에게 알려져 있다. 예로는 알루미늄 염, 칼슘 인산염, 다당류가 첨가 또는 첨가되지 않는 HBsAg의 리오필리세이트(lyophilisates), 수중유 이멀젼, 폴리-락타이드-코-글리콜레이트(poly-lactide-co-glycolate)이다. 상기 담체는 자체로 보강제(adjuvant) 작용을 갖지 않는 경우, 그것들은 예를 들어, 지방 A 유사물질(lipid A mimetics), 면역자극성(immunostimulatory) 뉴클레오티드 또는 박테리아 독소와 혼합될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 특히 백신이다. 본 발명에 따르면, 약제학적 조성물, 특히 백신은 HBV 감염 또는 HBV-매개 질병의 치료적 처치에 적당하다. 약제학적 조성물, 특히 백신은 HBV 감염 또는 HBV-매개 질병의 예방 처리에 적당하다. 특히 HBV 감염은 만성적으로 지속적인 B형 간염 감염이다. HBV-매개 질병은 급성 만성 B형 간염이 될 수 있다. 다른 HBV-매개 질병은 간의 간경변(cirrhosis) 및 초기 간 세포 암종이다. 백신은 임상적으로 불현성인 HBV 보균자에 투여하기에 적합하고, 이것은 실제로는 질병을 겪지 않지만 미래에 HBV-매개 질병으로 발전할 수 있는 보균자를 말하는 것이다.
약제학적 조성물은 근육내, 피하, 피내, 정맥, 점막 또는 구강으로 투여될 수 있으나, 상기 투여법은 바람직한 방법을 제시한 것이고 이에 한정되는 것은 아니다.
약제학적 조성물은 HBsAg 또는 그것의 단편 당 0.1 내지 1000㎍ 범위의 투여량(dosage)으로, 바람직하게는 HBsAg 또는 그것의 단편 당 2.5 내지 40㎍ 범위의 x투여량으로 적어도 두 개의 HBsAgs 또는 그것의 단편을 포함한다.
약제학적 조성물이 HBsAg 또는 그것의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하면, 그것들은 HBsAg 또는 그것의 단편을 코딩하는 핵산 당 10 내지 1000㎍ 범위의 양으로 존재한다.
본 발명의 다른 면은 B형 간염의 치료적 처치용 약을 제조하는 방법을 제공하는 것으로서, 다음과 같은 단계들을 포함한다:
a) 환자가 감염된 HBV 유전자형을 결정하는 단계; 및
b) 적어도 하나의 HBsAg 유전자형의 HBsAg, 이의 단편 또는 HBsAg를 코딩하는 핵산을 포함하는 약물을 제공하는 단계, 여기서 상기 유전자형은 a)단계에 따라 결정된 환자의 HBV 유전자형과 다름.
전술한 바와 같이, 본 발명의 중요한 인식은 만성적으로 지속적인 간염의 예비임상 모델에 있어서, 치료 효과는 형질전환 동물의 유전자형과 다른 HBV 유전자로부터 유래된 HBsAg로 형질전환 동물을 처리함으로써 얻어졌다는 것이다.
상기 유전자형은 하기의 방법: 전체 HBV 게놈 또는 HBsAg에 대한 최소 부분 코딩 및 계통발생의 분석, 제한 단편 길이 다형현상(RFLP), 복합-PCR에 의해 결정될 수 있다.
상기 약물의 제조는 적어도 하나의 HBsAg, 그것의 단편 또는 그것의 단편 중 HBsAg를 코딩하는 핵산의 제형화에 의한 기존에 알려진 방법에 수행된다.
다른 면에 있어서, 본 발명은 HBV 감염의 유전자형의 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 적어도 두 개의 HBsAg-특이 결합제를 포함하는데, 상기 두 개의 HBsAg-특이 결합제는 서로 다른 HBV 유전자형에 특이적인 것을 특징으로 한다. 상기 적어도 두 개의 HBsAg-특이 결합제는 HBsAg 유전자형-특이 프라이머 및/또는 특이적 항체가 될 수 있다. 상기 프라이머는 10-30 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있고 각각의 유전자형의 알려진 HBsAg 서열에 상보적이다. 상기 항체들은, 예를 들어 바람직한 HBsAg 유전자형에 연관된 각각의 HBsAg를 갖는 쥐와 같은 실험 동물의 면역화, 기존에 알려진 방법으로 하이브리도마(hybridoma)의 제조 및 서브타입-특이 단일항체의 항원을 위한 스크리닝에 의해 얻어질 수 있다.
도 1: HBsAg 변이체. (A) 작은 B형 간염 표면 항원(HBsAg)인 유전자형 D에 상응하는 ayw(1) 및 유전자형 A에 상응하는 adw2(2)의 아미노산 서열을 나타냄. (B) HBsAg ayw- 및 adw2-유도된, Kb-제한된 에피토프 서열. 에피토프 1(S208-215)은 외인성 HBsAg를 진행하는 세포에 의해 표현되는 반면, 에피토프 2(S190-197)는 내인성 HBsAg를 진행하는 세포에 의해서만 표현됨.
도 2: 에피토프-1- 또는 에피토프-2-특이 세포독성 T-세포주(CTLL)의 HBS-이식 유전자(HBs-tg) 숙주로의 전이는 세포독성 T-세포주 HBs-이식 유전자에 일시적인 간 손상을 유도한다. 비장 세포가 pCl/Sayw DNA-면역시킨 B6 쥐로부터 제거되고 동종 RBL5-세포를 가지고 인 비트로로 재자극되는데, 상기 RBL5-세포는 Kb/S208-215-결합 단백질 1 (ILSPFLPL) 또는 Kb/S208-215-결합 단백질 2 (VWLSVIWM)으로 파동하거나(pulsed), ConA로 자극되었다. 마우스마다 5 x 106 CD8+ CTLL을 정맥(i.v.) 주입하여 HBs-tg 쥐로 만들고 평균 혈청 알라닌 전달효소(ALT) 수준을 결정했다.
도 3: 면역화시킨 쥐의 간 및 비장에서 HBsAg-특이 CD8+ T-세포의 생체 내 증거. pCl/Sayw DNA 100㎍을 근육내 주입함으로써 C57BL/6 쥐들을 면역시켰다. 특이 CD8+ T-세포는 면역화 후 12일에 나타났다. 분리된 간-단핵 세포(MNC) 및 비장 세포는 Kb/S208-215-결합 단백질 1 (ILSPFLPL) 또는 Kb/S190-197-결합 단백질 2 (VWLSVIWM)를 가지고 인 비트로로 4시간에 걸쳐 재자극시켰다. 각 군당(서로 독립적인 두 실험으로부터 얻음) 4-6 쥐의 105 CD8+ T-세포 당 CD8+ IFNγ+ T-세포의 평균 빈도수 ± 표준편차를 나타낸다.
도 4: HBsAg-특이 CD8 T-세포는 HBs-tg 쥐의 에피토프 1에 반응한다. 간에서 HBsAg를 발현하는 HBs-tg 쥐는 HBsAg 서브형 ayw(pCl/Sayw) 또는 adw2(pCl/Sadw2)를 코딩하는 DNA 백신 또는 음성 조절 벡터 pCl(삽입 없는 벡터)를 가지고 세차례(4주 간격으로) 근육내로 면역시켰다. 마지막 면역화한 12일 후 면역시킨 쥐로부터 비장 세포를 제거하고 RBL5-세포를 가지고 (브레펠딘 A 존재 하에서) 인 비트로로 4시간에 걸쳐 재자극되는데, 상기 RBL5-세포는 ayw(RBL5/Sp ayw) 또는 adw2(RBL5/Sp adw2) 서브형의 HBsAg 입자들, 또는 HBsAgayw (ILSPFLPL) 또는 HBsAgadw2 (IVSPFIPL)의 Kb/S208-215-결합 펩타이드 1로 재자극된다. 각 군당(서로 독립된 두 실험으로부터 얻음) 4-6 쥐의 105 CD8+ T-세포 당 CD8+ IFNγ+ T-세포의 평균 비장 수 ± 표준편차를 나타낸다.
도 5: HBsAg-특이 CD8 T-세포는 HBS-tg 쥐의 에피토프 2에 반응한다. 도 4에서 기술된 바와 같이 면역화시킨 쥐로부터 비장 세포를 제거하고, 동종 RBL5/Sayw 또는 RBL5/Sadw2 전이체(transfectants), 또는 HBsAgayw (VWLSVIWM) 또는 HBsAgadw2 (VWLSAIWM)의 Kb/S190-197 에피토프 2를 가지고 인 비트로로 재자극되었다. 각 군당 4마리 쥐의 105 CD8+ T-세포당 CD8+ IFNγ+ T-세포의 평균 비장 수 ± 표준편차를 나타낸다.
도 6: S208-215-특이 CD8+ T-세포는 면역시킨 HBs-tg 쥐의 간에서 증명되었다. 형질전환 HBs-tg 쥐는 HBsAgadw2(pCl/Sadw2)를 코딩하는 DNA 백신으로 세번(4주 간격으로) 면역시켰다. 간 및 비장 세포는 마지막 주입 후 12일에 면역시킨 쥐로부터 제거했고 Kb/S208-215-결합 펩타이드 ILSPFLPL을 가지고 인 비트로로 재자극되었다. 각 군당 4마리 쥐의 105 CD8+ T-세포당 CD8+ IFNγ+ T-세포의 평균 비장 수 ± 표준편차를 나타낸다.
도 7: pCl/Sadw2 DNA 백신으로 면역화된 HBs-tg 쥐의 간 조직병리학. 비-병리학상의 간 조직구조는 B6 쥐(A, B)에서 관찰되었다. HBs-tg 쥐(C, D)는 적절한 세포 확대를 나타냈고 세포질은 연마된 유리 형태를 보였다. 간 세포의 핵은 적절히 다형으로 보여졌다. 문맥주위의 침윤은 거의 없었다. pCl/Sadw2 DNA로의 반복적인 면역화는 급성 바이러스 간염과 일치하는 간 (E-I)에서 심각한 조직형태상의(histomorphological) 변화를 유도한다. 염증성 침윤은 소엽(lobular) 실질(F) 및 주변부분(G)에 위치한 쿠퍼(Kupfer) 세포, 림프구 및 작은 수의 다형핵의 과립성 백혈구를 포함한다. 간세포는 소수성을 나타내고 종종 농축(pyknotic) 핵을 갖는데, 이것은 세포자멸사의 초기 단계의 표시이다(F, 화살표). 호산성 바디(H, 화살표), 즉 세포자멸사 간 세포들은 공통적이고 종종 병소의 염증성 침윤에 둘러싸인다. 많은 간 세포는 표지된 액포화를 나타낸다(I, 화살표). H 및 E는 포르말린-고정된, 파라핀-적신 조직의 염색. 고유 확대도: A, C는 x10; B, D 및 F는 x40; G-I는 x63.
도 8: HBs-tg 쥐에서 HBsAg-특이 혈청 항체 반응의 유도. B6 쥐 및 형질전환 HBs-tg 쥐는 HBsAgadw2(pCl/Sadw2) 또는 HBsAgayw(pCl/Sayw)를 코딩하는 DNA 백신을 가지고 근육내로 면역화되었고 3주 후에 동일한 백신으로 추가 자극되었다. 마지막 주입 4주 후에, 혈청 샘플은 HBsAg 항원(A) 또는 HBsAg-특이 항원(B)에 대해 테스트되었다. 군당 4-6 마리의 평균 항체 적가(mIU/ml) 및 혈청 HBsAg 수준(ng/ml)± 표준 편차를 보여준다.
도 9:
정상적인 B6 및 HBsayw-tg 쥐의 에피토프 1 (S208-215) 및 에피토프 2 (S190-197)에 대한 HBsAg-특이 CD8+ T-세포 반응.
상기 동물들은 서브타입 ayw 또는 adw2의 HBsAg 단백질 입자들(Sp)을 가지고 각각 세 차례(21일 간격으로) 근육내로 면역화하였다. 단백질 백신을 보강제로서 CpG-올리고뉴클레오티드(ODN) 또는 RC529과 각각 혼합시켰다. PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 마지막 면역화 12일 후에 동물로부터 비장을 제거하였고 그후 분리된 비장 세포는 미리 HBsAg-특이 펩타이드로 펄스된 RBL5 세포를 가지고 시험관에서(브레펠딘 A의 존재) 4시간에 걸쳐 재자극되었다. 상기 목적을 위해, 각 경우에 HBsAgayw (ILSPFLPL) 또는 HBsAgadw2 (IVSPFIPL)의 Kb/S208-215-결합 펩타이드 1 또는 HBsAgayw (VWLSVIWM) 또는 HBsAgadw2 (VWLSAIWM)의 Kb/S190-197-결합 펩타이드 2가 사용되었다. 군당 4-6 마리 쥐(서로 독립적인 두 실험에서 얻음)의 105 CD8+ T-세포당 비장 IFNγ+ CD8+ T-세포의 수 ± 표준 편차를 보여준다.
도 10:
HBsayw-tg 쥐의 에피토프 1 (S208-215)에 대한 HBsAg-특이 CD8+ T-세포 반응.
A. 간에서 HBsAgayw를 발현하는 HBs-tg 쥐는 HBsAg 서브타입 ayw(pCl/Sayw) 또는 세가지 서브타입 ayw(pCl/Sayw), adw2 (pCl/Sadw2) 및 adr (pCl/Sadr)를 코드하는 DNA 백신, 또는 음성 대조군 벡터 pCl (삽입체 없는 벡터)를 가지고 각각 세 차례(4주 간격으로) 근육내로 면역화하였다. 마지막 면역화 12일 후에 상기 동물로부터 비장을 제거하였다. 분리된 비장 세포는 미리 HBsAgayw (ILSPFLPL) 또는 HBsAgadw2 (IVSPFIPL)의 Kb/S208-215-결합 펩타이드 1으로 펄스된 RBL5 세포를 가지고 인 비트로로(브레펠딘 A의 존재 하에서) 4시간에 걸쳐 재자극되었다. 군당 4-6 마리 쥐(서로 독립적인 두 실험에서 얻음)의 105 CD8+ T-세포 당 비장 IFNγ+ CD8+ T-세포의 수 ± 표준 편차를 보여준다.
B. HBsayw-tg 쥐는 서브타입 ayw의 HBsAg 단백질 입자들(Sp) 또는 서브타입 ayw, adw2 및 adr의 HBsAg 단백질 입자들의 혼합물을 가지고 각각 세 차례(21일 간격으로) 근육내로 면역화하였다. 상기 단백질 백신은 보강제로서 CpG-올리고뉴클레오티드(ODN) 또는 RC529(서브타입 혼합물에만)과 각각 혼합시켰다. PBS는 음성 대조군으로서 사용되었다. 마지막 면역화 12일 후에 동물로부터 비장을 제거하였다. 분리된 비장 세포는 미리 HBsAgayw (ILSPFLPL) 또는 HBsAgadw2 (IVSPFIPL)의 Kb/S208-215-결합 펩타이드 1으로 펄스된 RBL5 세포를 가지고 시험관에서(브레펠딘 A의 존재) 4시간에 걸쳐 재자극되었다. 군당 4-6 마리 쥐(서로 독립적인 두 실험에서 얻음)의 105 CD8+ T-세포 당 비장 IFNγ+ CD8+ T-세포의 수 ± 표준 편차를 보여준다.
도 11:
HBs-tg 쥐에서 HBsAg-특이 혈청 항체 반응의 유도.
B6 쥐 및 형질전환 HBs-tg 쥐는 서브타입 ayw 또는 서브타입 adw2의 HBsAg 단백질 입자 백신(Sp) 또는 서브타입 ayw, adw2 및 adr의 혼합물을 가지고 근육내로 면역화하였고 3주 후에 동일한 백신으로 추가 자극되었다. 상기 단백질 백신은 보강제로서 CpG-올리고뉴클레오티드(ODN)을 함유했다. 추가 자극 주입 4주 후, 혈청 샘플은 HBsAg (A) 및 HBsAg-특이 항체 (B)에 대해 테스트되었다. 군당 4-6 마리 쥐의 평균 항체 역가(mIU/ml) 및 혈청 HBsAg 수준 (ng/ml) ± 표준 편차를 보여준다.
재료 및 방법
일반( General )
연구 중인 HBV 서브타입 adw2는 유전자형 A에 대응된다. HBV 서브타입 ayw는 유전자형 D에 대응된다. HBV 서브타입 adr은 유전자형 C에 대응된다.
쥐(마우스)
C57BL/6JBom (B6) 쥐 (H-2b)는 표준-무균 조건(standard-pathogen-free conditions)하에서 사육하였다.
C57BL/6J-TgN(ALb1HBV)44Bri 형질전환(HBs-tg) 쥐, HBsAhayw(기탁 번호 H V01460 J02203을 갖는 HBV 서열에 의해 코딩됨)는 잭슨 실험실에서 얻었다(BarHarbour, ME). 8-16주 된 수컷 및 암컷 쥐를 사용했다.
세포, 재조합 HBsAg 입자 및 항원성 HBsAg 펩타이드
사용된 H-2b 세포주 RBL5는 [10]에 기재되어 있다. 유사한 양의 HBsAgayw 및HBsAgadw2를 발현하는 안정한 RBL5 트랜스펙턴트(transfectant)를 제조했다(데이타 표시 안함). 서브타입 ayw, adw2 및 adr의 재조합 HBsAg 입자들은 세포주 바이오테크 GMbH (독일, 뒤셀돌프)에서 얻을 수 있다. 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 숙주 균주(strain) RB10에서 제조된 HBsAg 입자들은 [3]에 기술된 바와 같이 정제되었다. 합성 Kb-결합 S208-215 ILSPFLPL (ayw) 또는 I V SPF I PL (서브타입 adw2) 펩타이드 및 Kb-결합 S190-197 VWLSVIWM (ayw) 또는 VWLS A IWM (adw2) 펩타이드는 제리니 바이오툴로부터 얻었다(독일, 베를린). 상기 펩타이드는 10mg/ml의 농도로 DMSO 용액에 용해시키고 사용전에 배양 배지로 희석시켰다.
플라스미드 및 DNA 면역화
HBsAgayw, HBsAgadw2 및 HBsAgadr을 [4; 5]에 기술된 바와 같이 pCl(프로메가) 및 BMGno 벡터에 클론닝하였다. DNA 백신으로서, 플라스미드 pCl/Sayw, pCl/Sadw2, pCl/Sadr을 사용하여 HBsAgayw, HBsAgadw2 및 HBsAgadr을 똑같이 잘 발현시켰다. 이것은 상기 플라스미드의 DNA로 일시적으로 형질전환된 세포로부터 HBsAg의 면역침강에 의해 확인하였다(데이타 표시안함). 따라서, HBsAg 에피토프의 면역원성 차이는 DNA 백신 또는 형질전환체에 의한 HBsAg 발현양 차이를 토대로는 명확해질 수 없다. 근육내 핵산 면역화에 있어서, 1㎍/㎕의 플라스미드 DNA를 함유하는 50㎕ PBS(인산-완충 염류)를 각각의 경골 정면 근육(tibialis anterior muscle)에 [4]에서 기술된 바와 같이 주입하였다. HBsAg 서브타입 혼합물로의 면역화는 1㎍/㎕ pCl/Sayw, 1㎍/㎕ pCl/Sadw2 및 1㎍/㎕ pCl/Sadr 각각의 경우를 함유하는 50㎕ PBS를 주입함으로써 영향을 받았다.
HBsAg 단백질 입자들로 면역화
쥐 한마리당 5㎍의 HBsAg 단백질 입자들을 100㎕의 PBS 중의 30㎍의 CpG 올리고뉴클레오티드(독일, 에버스베르그, MWG 바이오테크, ODN1826) 또는 8㎍의 RC-529(미국, 위싱턴, 시애틀, 코리사 코프.)를 함께 피하 주사하였다. HBsAg 서브타입 혼합물로의 면역화를 위하여, 5㎍의 HBsAgayw, 5㎍의 HBsAgadw2 및 5㎍의 HBsAgadr 단백질 입자들 각각의 경우를 100㎕의 PBS 중의 30㎍의 CpG 올리고뉴클레오티드 보강제 또는 8㎍의 RC-529와 함께 피하 주사하였다.
특정 비장 및 간 CD8+ T-세포 빈도수의 결정
비장 세포 현탁액 [1] 및 간의 NPC(비-실질) 세포의 제조가 기재되어 있다 [6: 7]. 비장 세포 및 간 NPC(1x106/ml)를 5㎍/㎕의 HBsAg-유래 펩타이드 또는 HBsAg-발현 트랜스펙탄트(106/ml) 또는 HBsAg-입자-펄스된 세포를 가진 RPMI-1640 배지에서 1시간에 걸쳐 배양하였다. 그 후 5㎍/㎕의 브레펠딘 A(BFA)(카달로그 번호. 15870; 시그마)를 넣고 4시간 동안 더 배양물을 배양했다. 상기 세포를 수확하여 그들의 표면을 항-CD8 mAb로 염색하고, 고정하고 침투시키고 세포질의 IFNγ에 대한 염색을 수행했다. CD8+ IFNγ+ CTL의 빈도수는 FACS 분석법에 의해 결정되었다. 105 비장 당 CD8+ IFNγ+ T-세포 또는 간 T-세포의 평균 수치를 나타낸다.
특정 CD8+ T-세포주의 전달
CD8+ T-세포주를 pCl/Sayw DNA 백신으로 면역화된 B6 쥐의 비장으로부터 얻었다. Kb/S208-215-결합 펩타이드 1(ILSPFLPL) 또는 Kb/S190-197-결합 펩타이드 2(VWLSVIWM)으로 펄스된 합성 RBL5 세포를 가지고 생체 내에서 비장 세포를 재자극시켰다. 약 2주 동안에 인 비트로에서 확대된 세포주에서, 80% 이상의 CD8+ T-세포가 예상한 에피토프 특이성을 갖는다는 것이 특이 IFNγ-발현 테스트에 의해 밝혀졌다. 세포를 세척하고, 상기 세포주의 5 x 106 세포를 정맥내 주사하였다. 대조군 세포는 3일 ConA-자극된 배양액에서 분리된 비-특이 CD8+ T 아세포(blast)였다.
혈청에서의 아미노기 전이효소, HBsAg 및 항-HBsAg 항체의 결정
혈청 항체는 주입 후 소정의 시간에 꼬리 동맥으로부터 혈액을 제거함으로써 각각의, 면역화된 또는 대조군 쥐로부터 반복적으로 얻었다. 혈청 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotranferase; ALT) 활성은 Reflotron? 테스트(카달로그 번호. 745138; 로체 진단기구 GmbH)를 사용하여 혈액에서 수행되었다. 형질전환 쥐의 혈청에서 HBsAg 농도는 시판되는 ELISA AUSZYME II (독일, 비즈바덴, 아보트 실험실) 테스트에 의해 결정되었다. HBsAg에 대한 항체는 통상적인 IMxAUSAB 테스트(카달로그 번호. 7A39-20; 독일, 비즈바덴, 아보트)를 사용하여 쥐 혈청에서 입증되었다.
항체 수준은 6개의 표준 혈청에 의하여 정성화되었다. 테스트된 혈청은 측정된 OD 값이 표준 혈청 1과 6 사이에 놓이도록 희석되었다. 여기 나타낸 수치는 상기 측정된 항체 수준(mlU/ml)에 의해 혈청 희석의 증폭에 의해 결정되었다. 주어진 혈청 역가는 4마리 각각의 쥐의 평균치±표준 편차에 대응된다.
조직구도( Histology )
간 세포 구획(3mm 미만)을 24시간동안 4% 포르말린 (pH 7.0)에 고정하고 파라핀에 파묻었다. 2㎛ 두께의 파라핀 구획을 헤마톡실린(haematoxylin)-에오신(H&E)으로 염색했다.
K b 에 대한 HBsAg 펩타이드의 결합
친화성-정제된 MHC 클래스 1 분자 Kb를 [8, 9]에서 기술된 바와 같이 3㎛의 인간 β2m의 존재하에 테스트 펩타이드 및 정해진 농도(약 2nM)의 방사선활성 표지된 VSV NP 52-59 지표 펩타이드의 농도를 증가시키면서 18℃에서 48시간동안 배양했다. 그후 MHC 1군 분자에 대한 펩타이드의 결합은 세파덱스 G50 컬럼 겔 여과법[8]에 의해 결정되었다. 방사활성 표지된 VSV NP 52-59 펩타이드는 배제(exclusion) 부피(MHC-결합 펩타이드) 및 함유(inclusion) 부피(유리 펩타이드)로 존재했다. 이것은 감마-방사선분광법에 의해 결정되고 테스트 펩타이드의 전체 양에 대한 MHC 분자에 결합된 테스트 펩타이드의 비율에 의해 결정되었다. 지표 펩타이드 결합의 50% 저해를 얻기 위해 요구되는 테스트 펩타이드의 농도(IC50)를 결정했다. IC50 수치가 낮을수록, 테스트 펩타이드의 결합은 더 좋아진다. 리간드의 손실을 막기 위해, 모든 결합 실험에서 15-25%를 넘지 않는 결합을 얻기에 충분한 MHC 부피가 사용되었다. 상기 조건 하에서, IC50 수치는 분해 상수(Kd)에 대한 근사값이다. 모든 결합 실험은 저해 실험으로서 수행하였다.
실시예 1
에피토프 1 또는 에피토프 2에 특이적인 Kb-제한된 CD8+ T-세포주의 입양 전달(adoptive transfer)은 HBs-tg B6 쥐에서 간 손상을 유도한다
B6 쥐의 비장으로부터 HBsAg의 에피토프 1 또는 에피토프 2(도 1B)에 특이적이고, pCl/Sayw 플라스미드 DNA로 면역화된 단-기간 CD8+ T-세포주가 생산되었다. 상기 세포주 내에서, 세포의 〉95%가 CD8+이었고, 특이 IFNγ 발현이 상기 CD8+ T-세포의 〉80%에서 유도되었다. 간에서 HBsAgayw를 발현한 유사유전자형 B6 숙주로의 상기 세포주 중 5 x 106 세포들의 입양 전달은 급성 간 손상을 유도하는데, 이는 혈청 아미노기 전이효소(transaminase)에서 짧지만 큰 증가에 의해 밝혀졌다(도 2). 혈청 아미노기 전이효소 수준은 전이 후 5-6일만에 정상화되어 숙주에서 어떠한 전이된 CD8+ T-세포도 측정되지 않았다. 동일한 수의 폴리클론성(마이토젠-활성) CD8+ T 아세포(blasts)는 간 손상을 나타내지 않았다. 따라서, (i) 특이 CD8+ T-세포가 HBs-tg 쥐에서 간 손상을 효과적으로 유도함([2]에서 기술됨); (ii) 내인성 또는 외인성 HBsAg의 프로세싱에 의해 생성된 HBsAg 에피토프는 형질전환-발현 간에서 나타남; 및 (iii) 입양 전달된 CD8+ T-세포는 형질전환 숙주로부터 빠르게 제거된다는 것이 확인되었다. 따라서, HBsAg의 다른 특성을 갖는 전이된 CD8+ T-세포는 간에 접근하여 그 자리에서 활성화될 수 있으나, 안정하게 흡수될 수는 없다.
실시예 2: HBsAg 에피토프 1 및 2를 인식하는 K b -제한된 CTL 은 비장 및 간에서 관찰되었다
백신-최적화 HBsAg-특이적 CD8+ T-세포가 정상 또는 형질전환된 HBsAg-발현(HBs-tg) B6 쥐의 간에 접근하는지에 대한 조사가 수행되었다(도 3). 비장 세포 및 비-실질 간 세포(NPC)를 미리 pCl/Sayw 백신으로 12-15일 면역화시킨 B6 쥐로부터 분리하였다. 에피토프 1 또는 에피토프 2에 특이적인 CD8+ T-세포는 정상적인 B6 쥐로부터 비장 및 간 CD8+ T-세포 개체군에서 발견되었다(도 3A). 상기 간 CD8+ T-세포 개체군 내에서 HBsAg-특이 CD8+ T-세포의 빈도수가 높음에도 불구하고, 그것들의 절대적인 수는 비장에서보다 더 낮았다(데이타 나타내지 않음). 반대로, 어떠한 CD8+ T-세포 반응성은 HBsAgayw를 코딩하는 DNA 백신(도 3B)으로 면역화된 HBsAgayw tg B6 쥐에서 설명되지 않았다(도 3). DNA 백신을 가진 세번의 촉진제 주입(3주 간격) 또는 HBsAg 항원 입자들 및 올리고뉴클레오티드 보강제(adjuvant)로의 반복적인 면역화는 둘 다 HBs-tg 쥐에서 HBsAg-특이 CD8+ T-세포 면역성을 일으키지 못했다(데이타 나타내지 않음). 따라서, 쥐가 내성을 가지는 동일한 HBsAg 변이체를 사용하는 접종 프로토콜이 효과적인 항-바이러스 CD8+ T-세포 면역성을 준비하지는 못한다.
실시예 3: HBsAgayw 및 HBsAgadw2 변이체의 에피토프에 대한 Kb-제한된 T세포 반응
HBV 단리체 유래이고, 226개의 아미노산 잔기를 갖는 단백질인 HBsAgayw 및 HBsAgadw2 단백질은 16개의 아미노산 잔기에서 차이가 있다(따라서, 그들의 아미노산은 93% 동일함). 사용된 HBsAgayw 단백질의 서열은 HBs-tg B6 쥐에 의해 발현된 형질전환-코딩된 HBsAgayw의 서열과 동일하다. 선택된 HBsAgayw 및 HBsAgadw2의 Kb-결합 에피토프 1 및 2의 서열은 각각 상기 에피토프 내의 1 및 2 아미노산 잔기에 의해 차이가 있지만, 동일한 인접(flanking) 서열을 갖는다(도 1A, B). HBsAgayw 및 HBsAgadw2의 S208-215-에피토프는 두 위치에서 차이가 있다: adw2에서는 위치 2의 발린(V) 잔기가 루신(L)으로 대체되고, 위치 6의 이소루신(I)이 루신(L) 잔기로 대체되었다(도 1B). Kb의 에피토프 1의 결합 친화도는 다소 낮고: 에피토프 1의 HBsAgadw2 변이체는 에피토프의 HBsAgayw 변이체보다 Kb에 대한 높은 친화도를 나타냈다(표 1). 반대로, Kb에 대한 에피토프 2의 결합 친화도는 높았다(표 1).
Kb에 대한 면역원성 HBsAg 에피토프의 결합 친화도
에피토프 HBsAg 변이체 펩타이드 서열 Kb-결합
(nM)
1 ayw ILSPFLPL 3400
1 adw2 IVSPFIPL 773
2 ayw VWLSVIWM 54
pCl/Sayw 또는 pCl/Sadw2 DNA 백신으로 면역화된 B6 쥐는 HBsAgayw 또는 HBsAgadw2 입자 또는 HBsAgayw 또는 HBsAgadw2의 항원 펩타이드 S208-215로 펄스된 초회감작된 비장 CD8+ T-세포의 5시간의 엑스 비보 재자극 후에 관찰된 Kb-결합 에피토프 1 관련된 CD8+ T-세포 반응을 나타냈다. 에피토프 1의 ayw 및 adw2 변이체는 교차-반응성이었는데, 이는 (i) 에피토프-1-특이 CTL이 pCl/Sayw 또는 pCl/Sadw2에 의해 초회감작(prime)되고; (ii) HBsAgayw 또는 HBsAgadw2 입자로 펄스되거나 펩타이드 ILSPFLPL(ayw) 또는 펩타이드 IVSPFIPL(adw2)로 펄스된 세포는 초회감작된 CD8+ T-세포에 대한 에피토프 1을 나타내기 때문이다. 따라서, 8-mer 에피토프 1 내의 두 개의 치환은 효과적인 프로세싱, Kb-결합 또는 상기 에피토프의 발현을 억제하지 않았다.
pCl/Sayw DNA 백신으로 초회감작된 CD8+ T-세포는 HBsAgayw 또는 HBsAgadw2의 에피토프 2(S190-197)를 인식했다(도 5A; 군 2). 이것은 펩타이드-펄스된 세포 또는 HBsAgayw를 발현한 트랜스펙턴트를 사용한 5시간의 재자극 후에 엑스 비보에서 증명되었다. 초회감작된 CD8+ T-세포는 내인성 HBsAgadw2를 발현한 트랜스펙턴트를 인식하지 못했다. pCl/Sadw2 DNA 백신으로의 면역화는 에피토프-2-특이적 T-세포를 초회감작하지 못했다(도 5A, 군 3). pCl/Sadw2(pCl/Sayw가 아니라) DNA 백신으로 초회감작된 CD8+ T-세포는 트랜스펙션에 의해 표현된 알려지지 않은 에피토프/제한 특성의 adw2-특이 에피토프를 인식했다; 이것은 더 조사되지는 않았다(도 5, 군 3). 따라서, 5번 위치의 아미노산 대체(소수성 아미노산 알라닌 A를 소수성 아미노산 발린 V으로 대체)는 Kb 분자[1]에 의해 나타내지 않은, 에피토프 2의 생성을 억제한다.
실시예 4: HBsAg 에피토프 1에 대한 교차-반응성 Kb-제한된 CD8+ T-세포 반응이 HBs-tg B6 쥐에서 초회감작된다
HBs-tg B6 쥐는 간에서 형질전환 유전자로부터 HBsAgayw를 발현한다. HBs-tg 쥐는 HBsAgayw(pCl/Sayw) 또는 HBsAgadw2(pCl/Sadw2)로 면역화한다(도 4, 5B). 상기 pCl/Sayw DNA 백신으로 HBs-tg B6 쥐의 반복된 면역화에 의해 어떠한 CD8+ T-세포 반응을 얻지 못했다(도 4, 5B, 군 2). 반면에, pCl/Sadw2 DNA 백신으로 HBs-tg B6 쥐의 면역화는 HBsAg에 대한 CD8+ T-세포 반응을 생성했다(도 4B, 군 3). 상기 교차-반응성 CD8+ T-세포 반응은 HBsAgayw 또는 HBsAgadw2 입자들 또는 펩타이드 형태에서 에피토프 1의 ayw 또는 adw2 변이체로 펄스된 세포를 인식했다(도 4B, 군 3). 상기 CD8+ T-세포들은 RBL5/Sayw 트랜스펙턴트 또는 Kb-결합 에피토프 2 S190-197을 인식하지 않았다(도 5B, 3군). RBL5/Sayw가 아니라 RBL5/Sadw2 트랙스펙턴트에 의해 표현된 미정된 결정기를 향한 서브타입-특이 반응성을 나타냈다(도 5B, 군 3). 이것은 HBsAg의 천연 변이체는 교차-반응성 T-세포 면역성의 초회감작에 의해 "내성 파괴" 할 수 있다는 것을 보여준다.
특이적 CD8+ T-세포 개체군이 pCl/Sadw2로 면역화한 형질전환 쥐의 항원-생성 간에서 나타날 수 있는지에 대한 조사가 수행되었다. pCl/Sadw2로 면역화한 HBs-tg B6 쥐의 비장 및 간 NMC에서, 특이 CD8+ T-세포 반응성이 수개월에 걸쳐 증명될 수 있다(도 6). 따라서, 입양 전달된 CD8+ T-세포(도 2)와 달리, 백신-초회감작된 항-HBV-특이 CD8+ T-세포는 3달 이상의 기간에 걸쳐 항원-보유 목표 기관에 접근하여 안정한 흡수를 나타낸다.
실시예 5: HBsAg 에피토프 1에 대해 특이작 CD8+ T-세포 반응성을 나타내는 면역화된 HBs-tg 쥐의 간의 조직 변화
HBsAg-특이 CD8+ T-세포는 HBsAg-생성 간에서 염증성 반응을 유도했다. 미처리 B6 쥐는 정상적인 조직구도(histology)를 나타냈다(도 7A, B). HBs-tg B6 쥐로부터의 간세포는 확대되고 미세한 입경의 옅은 호산성 혈장을 나타내는데, 상기 호산성 혈장은 인간의 HBV 감염의 경우에도 관찰되는 "연마된 유리 간 세포(ground glass liver cell)"의 특징이 있다. 어떠한 염증성 침윤도 관찰되지 않았다.
pCl/Sadw2(pCl/Sayw가 아니라) DNA 백신으로 면역화한 HBs-tg 쥐는 심각한 간 조직 변화를 나타냈다(도 7E). 실질(도 7F) 및 문맥 주위(도 7G)에서 발견되는 염증성 침윤은 주로 단핵 세포(도 7F)로 이루어졌다. 다수의 작은, 임파계 세포는 실질 및 문맥 주위에 분포되었다. 편재된 염증성 세포 군들은 세포자멸성 간세포를 둘러쌌다(도 7H). 간세포의 확대 및 수증성(hydropic) 팽창은 처리되지 않은 HBs-tg 쥐에서보다 면역화된 HBs-tg 쥐에서 더 컸다. 작은 핵에 대한 어떤 배지는 응축된 염색질(chromatin) 및 핵 주위의 후광(halo)을 나타냈다(도 7F 화살표). 더욱이, 세포자멸성 간 세포를 대표하는 다수의 Councilman's 바디들이 관찰되었다(도 7H, 화살표). 몇몇 간세포는 핵의 액포화(vacuolisation)를 나타냈다(도 7, 화살표). 현저한 담즙 분비 중지(cholestasis)는 명백하지 않았다.
실시예 6: HBs-tg 쥐에서 HBsAg-특이적 CD8+ T-세포의 초회감작은 항원혈증의 감소와 관련이 있다
미처리 HBs-tg 쥐는 30-50ng/ml의 HBsAg 혈청 수준을 나타낸다(도 8A). HBsAgadw2 면역화 후에 에피토프 1에 대한 교차-반응성 CD8+ T-세포 반응을 보이는 쥐는 감소된 항원혈증(antigenaemia; 5-15ng/ml 범위의 수준)를 나타내는 반면, 어떠한 HBsAg-특이 CD8+ T-세포 면역성을 보이지않는, HBsAgayw로 면역화된 동물들은 항원혈증 수준에 아무런 변화도 나타내지 않았다(도 8A). 따라서, 면역화된 형질전환 쥐에서 항원혈증의 부분적인 조절은 특이 CD8+ T-세포의 발현과 관련이 있다.
실시예 7: 항-HBsAg 혈청 항체는 HBsAgadw2로 면역화된 HBsayw-tg 쥐에서 발생된다
T-세포 면역성 외에도, 체액성의(humoral) 항-HBsAg 면역성은 항원혈증을 조절하는데 있어서 역할을 할 수 있다. 백신화된 정상 및 형질전환 쥐에서 항-HBsAg 혈청 항체의 발생이 관찰되었다. 정상의(비-형질전환의) B6 쥐 및 고유유전자 HBs-tg B6 쥐는 pCL/Sayw 또는 pCL/Sadw2 DNA 백신으로 두 차례 면역화되었다. HBsAg에 특이화된 그들의 혈청 항체 역가(titres)는 다른 서브타입의 HBsAg를 결정하는 ImxAUSAB 테스트(Abbott)를 사용한 마지막 면역화 후에 두 주(two weeks)에 결정되었다. pCL/Sayw 또는 pCL/Sadw2 플라스미드 DNA로 면역화된 비-형질전환 쥐가 HBsAg에 대해 높은 혈청 항체 수준을 보이는 반면, HBs-tg 쥐는 단지 pCL/Sadw2(pCL/Sayw가 아닌) 플라스미드 DNA로 면역화한 후 항-HBsAg 혈청 항체 반응을 나타냈다(도 8B). 유사한 항체 반응이 HBsAgayw 또는 HBsAgadw2 입자들로 면역화된 쥐들에서 관찰되었다(데이타 표시 안함). 서브타입-특이 ELISA(HBsAgayw 또는 HBsAgadw2 입자-코팅된 플레이트)는 정상적인 쥐에서 모든 백신에 의해 생성된 항체 반응 중 95% 이상이 HBsAg의 "a" 결정기에 향해 있고; HBs-tg 쥐에서 항체 반응 중 90% 이상이 adw2-특이 결정기에 향해 있다는 것을 보여주었다(데이타 표시 안함).
실시예 8: HBsAg 단백질 입자들로 면역화함으로써 HBs-tg B6 쥐에서 HBsAg 에피토프 1에 대한 교차-반응성 Kb-제한된 CD8+ T-세포 반응의 효과적인 초회감작화
서브타입 ayw 또는 adw2의 HBsAg 단백질 입자로 정상적인 B6 쥐를 면역화하는 것은 Kb-결합 에피토프 1(S208-215)에 대한 CD8+ T-세포-매개된 면역 반응(immune response)을 초래한다(도 9A). 따라서 백신(단백질 입자 또는 DNA)의 특성에 무관하게, 다른 서열을 갖는 에피토프는 교차-반응성 T-세포 반응을 초회감작할 수 있다는 것을 알 수 있다. DNA 백신에 의한 면역화(도 5)와 유사하게, 서브타입 ayw의 HBsAg 단백질 입자들에 의한 B6 쥐의 백신화는 HBsAg Kb-결합 에피토프 2(S190-197)에 대한 CD8+ 세포 반응을 초회감작하지만 서브타입 adw2의 HBsAg 단백질 입자로 백신화는 그렇지 않다(도 9A).
HBsayw-tg 쥐를 서브타입 ayw 또는 서브타입 adw2 중 하나에 상응하는 HBsAg 단백질 입자 백신으로 면역화하였다. HBsAgayw 단백질 백신으로 반복적인 면역화 후에 어떠한 CD8+ T-세포 반응도 발생되지 않는 반면에, 이종성 HBsAgadw 단백질 항원으로의 면역화는 에피토프 1에 대한 HBsAg-특이적 CD8+ T-세포 반응을 일으켰다(도 9B). 따라서, HBsAg의 천연 변이체는 단백질 서브타입 백신화에 의한 교차-반응성 T-세포 반응의 초회감작에 의해 기존의 내성을 파괴할 수 있다는 것이 증명되었다.
실시예 9: HBsAg의 천연 변이체 혼합물로 면역화함으로써 HBs-tg B6 쥐에서 HBsAg 에피토프 1에 대한 교차-반응성 Kb-제한된 CD8+ T-세포 반응의 효과적인 초회감작
HBsayw-tg 쥐는 서브타입 ayw, adw2 및 adr의 혼합물을 함유하는 HBsAg 단백질 입자 백신(도 10B)뿐만 아니라 세 가지 서브타입 ayw(pCl/Sayw), adw2(pCl/Sadw2) 및 adr(pCl/Sadr)에 대해 코드된 DNA 백신으로 면역화되었다. HBsAg의 천연 변이체의 혼합물은 DNA 및 단백질 입자들로 면역화한 후 에피토프 1에 대한 교차-반응성 Kb-제한된 CD8+ T-세포 반응을 초회감작했다.
실시예 10: HBsAg의 천연 변이체의 혼합물로 면역화 후 HBs-tg 쥐에서 항원혈증의 감소
미처리 HBs-tg 쥐에서, 30-50 ng/ml 혈청 농도가 관찰된다. 이종성 HBsAg 백신(HBsAgadw2) 또는 천연 HBsAg 변이체의 혼합물로 면역화한 후, 에피토프 1에 교차-반응성 CD8+ T-세포 반응을 보이는 동물은 감소된 항원혈증을 나타낸다(5-17 ng/ml HBsAg 수준). 동종성 HBsAgayw로만 면역화되어 HBsAg-특이 T-세포 면역성을 일으킬 수 없는 동물에서는, 혈청에 있는 항원의 어떠한 양 변화도 관찰되지 않는다. 따라서 HBsAg의 천연 변이체의 혼합물로의 면역화가 항원혈증 감소를 일으킬 수 있다.
실시예 11: HBsAg 천연 변이체 혼합물로 면역화한 후 HBs-tg 쥐에서 항-HBsAg 혈청 항체의 유도
정상적인 B6 쥐는 HBsAgayw, HBsAgadw2, HBsAgadr의 혼합물뿐 아니라 HBsAgayw, HBsAgadw2, HBsAgadr(표시 안함)을 가지고 면역화한 후 표지된 항체 반응을 나타낸다.
면역화 후에 HBs-tg 쥐에서 HBsAg-특이 혈청 항체의 형성이 조사되었다. HBs-tg 쥐는 단지 천연 HBsAg 변이체의 혼합물 또는 이종성(heterologus) 서브타입 adw2로 면역화한 후 혈청 반응을 나타냈다. 동종성 서브타입 ayw로 면역화한 후에는 어떠한 항-HBsAg 반응도 유도되지 않았다. 서브타입-특이 ELISA(HBsAgayw 및 HBsAgadw2 단백질 입자로 코팅된 마이크로역가 플레이트)는 HBs-tg 쥐에서 HBsAg-특이적 항체 반응의 〉90%가 adw2-특이적 항원결정기에 대항하여 유도된 것임을 나타냈다(데이타 나타내지 않음).
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Claims (26)

  1. 적어도 두 개의 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg), 적어도 50개의 아미노산 및 T-세포 에피토프를 함유하는 이들의 단편들(fragments), 이들을 코딩하는(encoding) 핵산, 또는 이들 모두를 포함하는 B형 간염 바이러스(HBV)-감염 또는 HBV-매개 질병의 치료 또는 예방 처치용 약제학적 조성물로서, 상기 HBsAg 각각은 균질한(homogeneous) 입자 형태로 존재하고, HBsAg의 S 영역, 프리(pre)-S1 영역, 또는 이들 모두의 영역에서 HBV 유전자형이 다르며, 상기 단편들은 적어도 20개의 아미노산을 공통으로 가지지만 하나 이상의 아미노산이 서로 다른 것이며, 그리고 상기 조성물은 HBV 코어 항원(HBcAg) 또는 그 항원을 코딩하는 핵산을 함유하지 않는 것인, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 두 개의 HBsAg, 적어도 50개의 아미노산 및 T-세포 에피토프를 함유하는 적어도 두 개의 이들의 단편들, 또는 이들 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단편들은 HBsAg의 "a 결정기(a determinant)"를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 HBsAg 또는 적어도 50개의 아미노산 및 T-세포 에피토프를 함유하는 이의 단편들을 코딩하는 적어도 두 개의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 3개의 다른 HBsAg, 적어도 50개의 아미노산 및 T-세포 에피토프를 함유하는 이들의 단편들, 이들을 코딩하는 핵산, 또는 이들 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 모든 알려진 HBV 유전자형의 HBsAg, 적어도 50개의 아미노산 및 T-세포 에피토프를 함유하는 이들의 단편들, 이를 코딩하는 핵산, 또는 이들 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 HBsAg을 코딩하는 핵산 또는 적어도 50개의 아미노산 및 T-세포 에피토프를 함유하는 이들의 단편들은 포유동물(mammal) 세포에서 HBsAg를 발현하기 위한 프로모터의 조절하에 있는 벡터에 존재하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드(plasmids), 아데노바이러스(adenoviruses), 종두 바이러스(vaccinia viruses), 배큘로바이러스(baculoviruses), 홍역 바이러스(measles viruses) 및 레트로바이러스(retroviruses)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 프로모터는 항시성(constitutive) 및 유도성의 프로모터로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 각각의 성분을 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 약제학적 조성물의 제조방법.
  16. 삭제
  17. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제1항에 있어서, 상기 HBV 감염은 만성적으로 지속되는(persistent) B형 간염인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 HBV-매개 질병은 급성 만성 B형 간염, 간의 간경변(cirrhosis) 또는 1차 간세포 암종(carcinoma)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 근육내(intramuscularly), 피하(subcutaneously), 피내(intradermally), 정맥내(intraveneously), 점막(mucosally) 또는 경구적(orally)으로 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
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