LU85161A1 - NOVEL VINBLASTIN CONJUGATES, THEIR PREPARATION PROCESS AND THEIR THERAPEUTIC USE - Google Patents
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Description
- 2 - ι i \ ' i- 2 - ι i \ 'i
La présente invention se rapporte à de nouveaux conjugués de la Vinblastine et-de certains de ses dérivés connus avec des protéines, leur , méthode d'obtention et leur utilisation en tant qu'agent anti-tumoral.The present invention relates to new conjugates of Vinblastine and of some of its known derivatives with proteins, their, method of obtaining and their use as an anti-tumor agent.
L'invention comprend également certains intermédiaires actifs en 5 chimiothérapie, et des dérivés aminés de ceux-ci.The invention also includes certain intermediates active in chemotherapy, and amino derivatives thereof.
La Vinblastine et certains de ses dérivés, en particulier la vincristine ou la vindésine, ont déjà été couplés à des protéines par exemple l'albumine ou diverses immunoglobulines. Il en résulte des produits de couplage ou 10 des composés dits "conjugués". Nous relevons notamment les références suivantes de la littérature : - J.D.Teaie, Jacqueline M.Clough et V.Marks, Br. J.Clin.Pharmac. 4, 169-172 ,1977 - C.H.J.Ford, C.E.Newman, J,R.Johnson, C.S.Woodhouse, T.A.Reeder, 15 C.F.Rowiand, R.G.Simmonds, Br.J.Cancer 47. 35-42, 1983 - M.J.Embleton, G.F.Rowland, R.G.Simmonds, E.Jacobs, C.H.Marsden, R.W.Baidwin Br.J.Cancer 47,43-49, 1983 -J.R.Johnson, C.H.J.Ford, C.E.Newman, C.S.Woodhouse, G.F.Rowland, R.G.Simmonds Br.J.Cancer , 44, 472-475, 1981 20 - Eli Lfîlv Eur.PEi.ADDiic. , Pub!. nc5€.322, 21 .07.82 - R.A. Conrad, G.J.Cuiiinan, K.Gerzon, G.A.Poore J.Med.Cnem. 22, 391, 1979Vinblastine and some of its derivatives, in particular vincristine or vindesine, have already been coupled to proteins, for example albumin or various immunoglobulins. This results in coupling products or so-called "conjugate" compounds. We note in particular the following references from the literature: - J.D.Teaie, Jacqueline M.Clough and V.Marks, Br. J.Clin.Pharmac. 4, 169-172, 1977 - CHJFord, CENewman, J, R.Johnson, CSWoodhouse, TAReeder, 15 CFRowiand, RGSimmonds, Br.J. Cancer 47. 35-42, 1983 - MJEmbleton, GF Rowland, RGSimmonds, E.Jacobs, CHMarsden, RWBaidwin Br.J. Cancer 47,43-49, 1983 -JRJohnson, CHJFord, CENewman, CSWoodhouse, GFRowland, RGSimmonds Br.J. Cancer, 44, 472-475, 1981 20 - Eli Lfîlv Eur.PEi.ADDiic. , Pub !. nc5 € .322, 21 .07.82 - R.A. Conrad, G.J.Cuiiinan, K.Gerzon, G.A.Poore J.Med.Cnem. 22, 391, 1979
Le couplage de ces dérivés bis-indoliques a été entrepris non seulement 25 dans le but de mettre au point de nouveaux réactifs immunologiques mais surtout en vue de la préparation de substances anti-tumorales plus 6 actives ,plus sélectives et moins toxiques.The coupling of these bis-indole derivatives has been undertaken not only for the purpose of developing new immunological reagents but above all for the preparation of more active, more selective and less toxic anti-tumor substances.
Dans cette dernière optique de nombreux conjugués protéiques avec 30 d'autres agents antitumoraux sont actuellement étudiés. Il en est en particulier ainsi avec des conjugués d'anticorps et d'un fragment de la ricîne ou de conjugués d'albumine et de méthotrexate (Demande de brevet français 2.437.213, C» M» Industries; B.C.F.Chu, S.B.Howell J. of Pharmacology and Exp. Therapeutics ,219 (2), 389-393, 1981).In this latter perspective, numerous protein conjugates with other anti-tumor agents are currently being studied. This is in particular the case with conjugates of antibodies and of a ricin fragment or of conjugates of albumin and methotrexate (French patent application 2,437,213, C »M» Industries; BCFChu, SBHowell J . of Pharmacology and Exp. Therapeutics, 219 (2), 389-393, 1981).
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Les anti-corps monoclonaux, en particulier ceux d'origine humaine, couplés aux médicaments anti-tumoraux connus sont plus particulièrement l'objet d'études diverses.Monoclonal antibodies, in particular those of human origin, coupled with known anti-tumor drugs are more particularly the subject of various studies.
5 On relèvera enfin que l'utilisation et l'évaluation de complexes 1:1 d'alcaloides bis-indoliques avec la tubuline a été décrite dans le brevet belge 854.053. Dans certains cas il peut en résulter une toxicité moindre et une activité chimiothérapique plus importante que celles des alcaloïdes libres correspondants.Finally, it will be noted that the use and evaluation of 1: 1 complexes of bis-indole alkaloids with tubulin has been described in Belgian patent 854,053. In some cases this may result in less toxicity and greater chemotherapeutic activity than that of the corresponding free alkaloids.
10 1 La présente invention se caractérise notamment par la préparation et l'utilisation de conjugués vinblastine-protéine dans lesquels le lien covalent qui unit la molécule active à la protéine jouant le rôle de vecteur chimiothérapique, est un lien du type ester au niveau de la 15 fonction hydroxyle en C-4 de la 0-4 désacétylvinblastine ou de ses dérivés.The present invention is characterized in particular by the preparation and use of vinblastine-protein conjugates in which the covalent link which unites the active molecule to the protein acting as a chemotherapeutic vector, is an ester type link at the level of 15 C-4 hydroxyl function of 0-4 deacetylvinblastin or its derivatives.
Les composés de l'invention répondent plus particulièrement à la formule générale suivante 20 ch3ooc/ (\TQï i s . - ·' i ; - 4 - j: dans laquelle A représente un "bras" tel que -COCH2~, ’ -COCH2-CH2GO-., COCH2-CH2-CH2CO-,R.j représente un radical . protéique éventuellement modifié, un groupe amino NR^R^, un chlore ou ij un groupe ester d'acide aminé lié via la fonction amine et R_ représente ji ^ : 5 un groupe méthoxy, un groupe amino ou un radical ester d'acide alpha-aminé lié par une liaison de type amide et dont le groupe ester ' comporte de 1 à 6 atomes de carbone, R, et R^ représentent des groupes alkyle comportant de 1 à 3 atomes de carbone ou »ensemble, ur, groupe alkanediyle comportant de 3 à 5 atomes de carbone j ‘ίοThe compounds of the invention more particularly correspond to the following general formula 20 ch3ooc / (\ TQï is. - · 'i; - 4 - j: in which A represents an "arm" such as -COCH2 ~,' -COCH2- CH2GO-., COCH2-CH2-CH2CO-, Rj represents an optionally modified protein radical, an amino group NR ^ R ^, a chlorine or ij an amino acid ester group linked via the amine function and R_ represents ji ^: 5 a methoxy group, an amino group or an alpha-amino acid ester radical linked by an amide bond and the ester group of which contains from 1 to 6 carbon atoms, R 1 and R 1 represent alkyl groups comprising from 1 to 3 carbon atoms or »together, ur, alkanediyl group having from 3 to 5 carbon atoms j 'ίο
Dans l'art antérieur, la liaison était effectuée par l'intermédiaire d'un lien amide au niveau de la fonction vinblastinoyl-23 du dérivé bis-indolique. De manière surprenante nous avons constaté que l'activité anti-tumorale peut être mieux conservée lorsque la liaison est effectuée j 5 en C-4 plutôt qu'en C-23.In the prior art, the binding was carried out via an amide bond at the level of the vinblastinoyl-23 function of the bis-indole derivative. Surprisingly we have found that the anti-tumor activity can be better preserved when the binding is carried out at C-4 rather than at C-23.
Les dérivés de la présente invention sont obtenus, dans une première étape, par condensation du chlorure d'acide chloroacétiaue ou d'un anhydride, par exemple l'anhydride succinique ou glutarique, sur 20 l'hydroxyle en C-4 de la 0-4 désacétylvinblastine ou l'un des dérivés du type 0-4 désacétylvinblastine - carboxamide-3.The derivatives of the present invention are obtained, in a first step, by condensation of the chloroacetic acid chloride or of an anhydride, for example succinic or glutaric anhydride, on the C-4 hydroxyl of 0- 4 deacetylvinblastine or one of the derivatives of the type 0-4 deacetylvinblastine - carboxamide-3.
rilaughed
Les dérivés 4-chloroacétate hémisuccinate ou hémiglutarate ainsi obtenus sont alors condensés avec la protéine, l'acide aminé ou l'amine simple 25 dans un solvant dans lequel ces composés sont solubles. On peut à cette fin utiliser un mélange eau-dioxanne à un pH adéquat maintenu par un tampon , par exemple un tampon borate. La condensation est confirmée par chromatographie ou électrophorèse. Dans ce dernier cas on peut utiliser de la Vinblastine radio-active (par exemp t tritiée) afin 30 de faciliter la caractérisation.The 4-chloroacetate hemisuccinate or hemiglutarate derivatives thus obtained are then condensed with the protein, amino acid or simple amine in a solvent in which these compounds are soluble. To this end, it is possible to use a water-dioxane mixture at an adequate pH maintained by a buffer, for example a borate buffer. Condensation is confirmed by chromatography or electrophoresis. In the latter case, radioactive Vinblastine (for example tritiated) can be used in order to facilitate characterization.
L'obtention du chloro-acétate en C-4 de la Vinblastine est décrite par W.W.Hargrove Lloydia, 27 (4), 342, 1964. 11 peut ainsi être obtenu par action de l'anhydride chloroacétique sur la désacétyl Vinblastine dans le 35 . dichlorométhane.Obtaining the C-4 chloro-acetate from Vinblastine is described by W.W. Hargrove Lloydia, 27 (4), 342, 1964. It can thus be obtained by the action of chloroacetic anhydride on deacetyl Vinblastine in 35. dichloromethane.
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Du point de vue chimique la condensation avec les protéines peut s'expliquer par J'obtention de liens covalents résultant de la réaction des groupes amines de la lysine protéique avec le chlore activé de la fonction chloroacétate ou avec le groupe ester activé dérivé de l'hémïsuccinate ou 5 hémiglutarate. L'activation peut être effectuée de manière classique par traitement avec un chloroformïate. L'albumine de sérum bovin par exemple comprend 56 résidus aminés de lysine. Le nombre de molécule de Vinblastine par protéine variera en fonction des conditions opératoires mais sera généralement compris entre 1 et 20.From a chemical point of view, condensation with proteins can be explained by the obtaining of covalent bonds resulting from the reaction of the amino groups of the protein lysine with the activated chlorine of the chloroacetate function or with the activated ester group derived from the hemisuccinate or 5 hemiglutarate. Activation can be carried out conventionally by treatment with a chloroformate. Bovine serum albumin, for example, comprises 56 amino residues of lysine. The number of Vinblastine molecules per protein will vary depending on the operating conditions but will generally be between 1 and 20.
' 10'10
Le conjugué obtenu est isolé au moyen de méthodes classiques utilisées en chimie ou, dans le cas de conjugués protéiques, en biochimie. Le conjugué protéique est ainsi précipité du milieu réactionnel par addition d'acétone, puis centrifugé, rincé, lyophilisé et purifié par filtration sur 15 gel. Eventuellement on peut soumettre le dérivé ainsi obtenu à une réaction de succinylation classique qui permet d'éviter des problèmes d'aggrégation que caractérisent certaines protéines, conjuguées ou non.The conjugate obtained is isolated using conventional methods used in chemistry or, in the case of protein conjugates, in biochemistry. The protein conjugate is thus precipitated from the reaction medium by addition of acetone, then centrifuged, rinsed, lyophilized and purified by filtration on gel. Optionally, the derivative thus obtained can be subjected to a conventional succinylation reaction which makes it possible to avoid aggregation problems which characterize certain proteins, conjugated or not.
Les protéines qui peuvent être avantageusement utilisées sont en 20 particulier l'albumine de sérum bovin ou humain, la fétuine ou des immunoglobulines, ces dernières étant éventuellement obtenues par la technique des anti-corps monoclonaux. Dans ce dernier cas, l'utilisation d'anti-corps monoclonaux d'origine humaine et montrant une certaine spécificité vis à vis de tumeurs humaines s'avère particulièrement 25 intéressante.Proteins which can be advantageously used are in particular bovine or human serum albumin, fetuin or immunoglobulins, the latter possibly being obtained by the technique of monoclonal antibodies. In the latter case, the use of monoclonal antibodies of human origin and showing a certain specificity with respect to human tumors proves to be particularly advantageous.
Les protéines utilisées peuvent également être traitées afin d'être sélectivement modifiées. Ces modifications permettent d'obtenir des conjugués protéiques qui seront, lors de leur utilisation thérapeuticue 30 préférentiellement concentrées au niveau de certains tissus, par exerpie au niveau du foie. Il est par exemple possible, préalablement à la condensation du dérivé de la Vinblastine à la protéine, de galactosyier cette dernière. La galactosylation est effectuée en appliquant par exemple le mode opératoire décrit par G.Wilson dans The Journal of 35 ^ Biochemistry , 253 (7) 2070-2072, 1978.The proteins used can also be processed in order to be selectively modified. These modifications make it possible to obtain protein conjugates which, during their therapeutic use, are preferentially concentrated in certain tissues, by exerpy in the liver. It is for example possible, prior to the condensation of the derivative of Vinblastine with the protein, to galactosyier the latter. Galactosylation is carried out by applying, for example, the procedure described by G. Wilson in The Journal of 35 ^ Biochemistry, 253 (7) 2070-2072, 1978.
* - 6 - I Les essais in-vitro effectués avec les composés de l'invention pour démontrer leur activité antl-tumorale indiquent que la formation du ! · conjugué par un lien en C-4 peut être plus avantageuse que lorsque ce lien est effectué en 03.* - 6 - I In vitro tests carried out with the compounds of the invention to demonstrate their antitumor activity indicate that the formation of! · Conjugated by a link in C-4 can be more advantageous than when this link is made in 03.
5 : Le couplage via le carbone 3 de la Vinblastine ou de ses dérivés | s'effectue de manière classique en formant, dans une première étape, l'hydrazîde en 023 (carboxhydrazide) puis l'azoture d'acide correspondant par nitrosation. L'azoture est alors directement couplé 10 avec la protéine, j5: Coupling via carbon 3 of Vinblastine or its derivatives | is carried out in a conventional manner by forming, in a first step, the hydrazide in 023 (carboxhydrazide) then the corresponding acid azide by nitrosation. The azide is then directly coupled with the protein, j
Cet azoture d'acide peut cependant aussi être condensé de manière également connue avec un ester d'acide aminé , par exemple un ester méthyliaue. La fonction ester de l'acide aminé peut être à son tour 15 soumise à une hydrazinolyse puis à une nitrosation. Le nouvel azoture d'acide du produit de couplage acide aminé-vinblastine est alors condensé avec la protéine. L'acide aminé constitue dans ce cas le lien unissant la protéine à la molécule de Vinblastine.This acid azide can however also be condensed in a manner also known with an amino acid ester, for example a methyl ester. The ester function of the amino acid can in turn be subjected to hydrazinolysis and then to nitrosation. The new acid azide from the amino acid-vinblastine coupling product is then condensed with the protein. The amino acid in this case constitutes the link uniting the protein with the Vinblastine molecule.
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On a ainsi obtenu des dérivés de condensation couplés en C-3 ou C-4 et 0-4-désacétyiés par exemple du type vinblastine-fétuine (Fét-VDS-C-3), vinblastine-tétuine succinylée (Fét(S)-VDS-C-3) 25 vinblastine-isoleucine-fetuine (Fét-lle-VDS-C-3) vinblastine-tryptophane-albumine de sérum bovin (BSA-TrpV-C-3) vinblastine-tryptophane-albumine de sérum bovin succinylée {BSA ( S ) -T rpV-C-3 ) vinblastine-isoleucine-albumine de sérum bovin succinylée (BSA(S)-Viie 30 C-4) vindésine-albumine de sérum bovin (BSA-VDS-C-4).There were thus obtained condensation derivatives coupled to C-3 or C-4 and 0-4-deacetylated for example of the vinblastine-fetuin (Fét-VDS-C-3), vinblastine-tetuin succinylated type (Fét (S) - VDS-C-3) 25 vinblastine-isoleucine-fetuin (Fet-lle-VDS-C-3) vinblastine-tryptophan-bovine serum albumin (BSA-TrpV-C-3) vinblastine-tryptophan-bovine serum succinylated { BSA (S) -T rpV-C-3) vinblastine-isoleucine-succinylated bovine serum albumin (BSA (S) -Life 30 C-4) vindesine-bovine serum albumin (BSA-VDS-C-4).
S ....S ....
vindésine-albumine de sérum bovin succinylée (BSA(S)-VDS-C-4).succinylated bovine serum albumin-albumin (BSA (S) -VDS-C-4).
i vindésine-albumine de sérum bovin galactosilée (BSA(G)-VD5-C-4)i galactosilated bovine serum albumin-albumin (BSA (G) -VD5-C-4)
s 35 Js 35 J
/ » - 7 -/ »- 7 -
En utilisant comme bras l'acide succinique on a également obtenu de nombreux conjugués protéiques, p.e. vindesine-albumine de sérum bovin.Using succinic acid as arm was also obtained many protein conjugates, e.g. vindesine-bovine serum albumin.
Les composés de l'invention ont été testés sur des souris BDF^ ou DBA2 5 auxquelles une leucémie P388 a été implantée par voie intra - péritonéale ou intra-veineuse, l'activité anti-tumorale étant mesurée par le pourcentage d'ILS (Increased Life Span, augmentation de la durée de survie des survivants/total).The compounds of the invention were tested on BDF ^ or DBA2 5 mice in which P388 leukemia was implanted intraperitoneally or intravenously, the anti-tumor activity being measured by the percentage of ILS (Increased Life Span, increased survivorship / total).
10 Ainsi des expériences effectuées avec ia vindésine, le N-(04-déacétyl-3- de(méthoxycarbonyl)- vinblastinoyl-23) tryptophanate d'éthyle (voir demande de brevet européen Publ. n°41.935, Omnichem), ainsi que d'autres dérivés en C-3 d'acides aminés, couplé via le carbone C-3 avec la fétuine ou l'albumine de sérum bovin dans un rapport variant de 2 à 15 6, démontrent que ces conjugués sont peu actifs sur les tumeurs P388 (voir tableau ). L'administration du conjugué a été effectuée par voie intra-péritonéale ou intra-veineuse, identique au mode d'injection de la tumeur.Thus, experiments carried out with vindesine, N- (04-deacetyl-3- from (methoxycarbonyl) - vinblastinoyl-23) ethyl tryptophanate (see European patent application Publ. No. 41.935, Omnichem), as well as other amino acid derivatives C-3, coupled via C-3 carbon with fetuin or bovine serum albumin in a ratio varying from 2 to 15 6, demonstrate that these conjugates are not very active on P388 tumors (See table ). The administration of the conjugate was carried out intraperitoneally or intravenously, identical to the mode of injection of the tumor.
20 Par contre ces mêmes substances pour lesquels le couplage est effectué en C-4 montrent, de manière inattendue, une activité significative a l'occasion de tests similaires. Des augmentations de durée de survie de plus de 70% ont été observées.On the other hand, these same substances for which the coupling is carried out in C-4 show, unexpectedly, significant activity during similar tests. Increases in survival time of more than 70% have been observed.
25 L'activité supérieure des conjugués protéiques de la présente invention aThe superior activity of the protein conjugates of the present invention has
également été mise en évidence sur des cellules L1210 in vitro en milieu RPMl contenant 10% de sérum de veau foetal. Après incubation, la technique adoptée consiste à mesurer le contenu en protéines cellulaires, estimation effectuée en adoptant la technique de Lowry. Ainsi après 2 30 jours à une concentration de 10-50 microgrammes/mL de BSA(S)-C4-VDSalso demonstrated on L1210 cells in vitro in RPMl medium containing 10% fetal calf serum. After incubation, the technique adopted consists of measuring the cellular protein content, an estimation carried out using the Lowry technique. So after 2 30 days at a concentration of 10-50 micrograms / mL of BSA (S) -C4-VDS
on obtient une inhibition de la croissance cellulaire, alors que la culture cellulaire non traitée s'est multipliée par un facteur 2,5.inhibition of cell growth is obtained, while the untreated cell culture has increased by a factor of 2.5.
- 8 -- 8 -
TABLEAUBOARD
ACTIVITES DE DERIVES DE LA VINBLASTINE POUR DES TUMEURS INDUITES CHEZ LA SOURIS.VINBLASTINE DERIVATIVE ACTIVITIES FOR INDUCED TUMORS IN THE MOUSE.
jj
I PRODUITS (a) (b) (c) SOURIS TUMEUR ILSI PRODUCTS (a) (b) (c) TUMOR MOUSE THEY
(d) (e) (f) (g) BSA-TrpV-C-3 2 10 423 DBA^ ΙΟ9 P388 iv 9,4 ! BSA(S)TrpV-C-3 2 6,3 261 DBA2 ΙΟ4 P388 iv -8 j Fét-VDS-C-3 6 15 298 BDF^ ΙΟ6 P388 ip 4,1 Fét(S)-VDS-C-3 2 15 298 BDF^ ΙΟ6 P388 ip 8,2 Fét-!Le-VDSC3 2 10 294 BDF^ ΙΟ6 P388 ip 2,6 BSA-VDS-C-4 1 ,7 8 398 BDF^ 106 P388 ip 2 2,7 16 500 BDF1 ΙΟ6 P3B8 ip 48 BSA(S)-VDS-C-4 2,5 10 332 BDF1 ΙΟ6 P388 ip 76 2,4 27.5 968 BDF1 106 P388 ip 71 BSA(S)-Vlle-C-4 1 ,3 3 165 BDF1 ΙΟ6 P388 ip 18 1 ,3 10 550 BDF1 ΙΟ6 P388 ip 20 1 ,3 14 771 BDF1 ΙΟ6 P388 ip 32 BSA-Succ-VDS 18 35 173 BDF. 108 P388 ,p 39 , 18 75 371 BDFj 10b P388 ip 79 • r j ! t.(d) (e) (f) (g) BSA-TrpV-C-3 2 10 423 DBA ^ ΙΟ9 P388 iv 9.4! BSA (S) TrpV-C-3 2 6.3 261 DBA2 ΙΟ4 P388 iv -8 j Fet-VDS-C-3 6 15 298 BDF ^ ΙΟ6 P388 ip 4.1 Fet (S) -VDS-C-3 2 15 298 BDF ^ ΙΟ6 P388 ip 8,2 Fét-! Le-VDSC3 2 10 294 BDF ^ ΙΟ6 P388 ip 2,6 BSA-VDS-C-4 1, 7 8 398 BDF ^ 106 P388 ip 2 2,7 16 500 BDF1 ΙΟ6 P3B8 ip 48 BSA (S) -VDS-C-4 2.5 10 332 BDF1 ΙΟ6 P388 ip 76 2.4 27.5 968 BDF1 106 P388 ip 71 BSA (S) -Vlle-C-4 1, 3 3 165 BDF1 ΙΟ6 P388 ip 18 1, 3 10 550 BDF1 ΙΟ6 P388 ip 20 1, 3 14 771 BDF1 ΙΟ6 P388 ip 32 BSA-Succ-VDS 18 35 173 BDF. 108 P388, p 39, 18 75 371 BDFj 10b P388 ip 79 • r j! t.
j j t i - 9 - TABLEAU (SUITE)j j t i - 9 - TABLE (CONTINUED)
(b) SOURIS TUMEUR ILS(b) TUMOR MOUSE THEY
VDS-Chioroacét 4 DBA2 FR ΙΟ5 P388 iv 24 8 DBA2 FR ΙΟ5 P388 iv 38 10 DBA2 FR 105 P388 iv 57 14 DBA2 FR ΙΟ5 P388 iv 70 12 DBA2 US 1Û5 P388 iv 63 5 BDF1 106 P388 ip 15 BDF1 ΙΟ6 P388 ip >60 VILE-Chloroacét 4 DBA2 ΙΟ6 P388 ip 2£.VDS-Chioroacét 4 DBA2 FR ΙΟ5 P388 iv 24 8 DBA2 FR ΙΟ5 P388 iv 38 10 DBA2 FR 105 P388 iv 57 14 DBA2 FR ΙΟ5 P388 iv 70 12 DBA2 US 1Û5 P388 iv 63 5 BDF1 106 P388 ip 15 BDF1 ΙΟ6 P388 ip> 60 VILE-Chloroacét 4 DBA2 ΙΟ6 P388 ip 2 £.
8 DBA2 ΙΟ6 P388 ip 52 12 DBA2 ΙΟ6 P388 ip 80 16 DBA2 ΙΟ6 P388 ip -29 DAVLB-Pyrroiidino 6,25 DBA2 10^ P388 iv 9 12.5 DBA2 ΙΟ5 P388 iv 20 25 DBA2 ΙΟ5 P388 iv 43 50 DBA2 ΙΟ5 P388 iv 82 (a) rapport molaire vinca:protéine (b) dose mg vinca/kg (c) dose mg protéine/kg (d) nombre de cellules injectées (e) type de la tumeur injectée, (f) voie d'injection (g) pourcentage d'augmentation du temps de survie des survivants comparativement à des souris non-traitées / - 10 -8 DBA2 ΙΟ6 P388 ip 52 12 DBA2 ΙΟ6 P388 ip 80 16 DBA2 ΙΟ6 P388 ip -29 DAVLB-Pyrroiidino 6.25 DBA2 10 ^ P388 iv 9 12.5 DBA2 ΙΟ5 P388 iv 20 25 DBA2 ΙΟ5 P388 iv 43 50 DBA2 ΙΟ5 P388 iv 82 ( a) vinca molar ratio: protein (b) mg vinca dose / kg (c) mg protein dose / kg (d) number of cells injected (e) type of tumor injected, (f) injection route (g) percentage increased survival time of survivors compared to untreated mice / - 10 -
La comparaison avec les cellules d'hépatome in vitro (300.000 cellules sur milieu hep 3B, incubation de 8 jours, estimation par la technique de ! Lowry) démontre que l'albumine de sérum humain couplé en C4 inhibe mieux la croissance que lorsqu'elle est couplée en C3 (0,395 5 microgrammes/mL de Vinblastine).Comparison with hepatoma cells in vitro (300,000 cells on hep 3B medium, 8-day incubation, estimation by the! Lowry technique) demonstrates that albumin of human serum coupled with C4 inhibits growth better than when it is coupled to C3 (0.395 5 micrograms / mL of Vinblastine).
La présente invention s'étend donc également aux applications industrielles et notamment pharmaceutiques des composés bisindoliques 10 nouveaux.The present invention therefore also extends to industrial and in particular pharmaceutical applications of new bisindolic compounds.
Les composés de l'invention présentent en effet des propriétés antitumorales particulièrement intéressantes et susceptibles d'être utilisées en thérapeutique humaine.The compounds of the invention indeed have particularly advantageous antitumor properties which can be used in human therapy.
'15'15
Ces dérivés de la Vinblastine peuvent être , en particulier, utilisés pour le traitement des leucémies, de gliomes, de lymphosarcomes ou d'autres tumeurs malignes, y compris les tumeurs dites "solides".These Vinblastine derivatives can, in particular, be used for the treatment of leukemias, gliomas, lymphosarcomas or other malignant tumors, including so-called "solid" tumors.
20 En thérapeutique humaine , ils sont ainsi utilisés pour le traitement de la maladie de Hodgkin et pour d'autres tumeurs pouvant bénéficier d'un traitement avec la Vinblastine, la vincristine ou la vindésine.In human therapy, they are thus used for the treatment of Hodgkin's disease and for other tumors which may benefit from treatment with Vinblastine, vincristine or vindesine.
Pour leur application thérapeutique, les composés de l'invention, 25 éventuellement sous forme lyophilisée, sont de préférence administrés par voie parentérale, dissous dans un solvant pharmaceutiquement acceptable. Parmi les sels d'addition, on préférera, les sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables, tels que les sels d'acides minéraux comme l'acide chlorhydrique, l'acide phosphorique et l'acide 30 sulfurique ou d'acides organiques comme l'acide acétique, propionique, . ;For their therapeutic application, the compounds of the invention, optionally in lyophilized form, are preferably administered parenterally, dissolved in a pharmaceutically acceptable solvent. Among the addition salts, non-toxic pharmaceutically acceptable salts are preferred, such as the salts of mineral acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid and sulfuric acid or organic acids such as acid. acetic, propionic,. ;
» X»X
XX
. - X ^ \ -11- L'eau physiologique ou d'autres solutions salines tamponnées, par exemple aved un phosphate, sont des solvants appropriés.. Physiological water or other buffered saline solutions, for example with phosphate, are suitable solvents.
La substance active est généralement administrée à une posologie pouvant 5 varier de 50 mg à plusieurs grammes . Les composés de l'invention peuvent en outre être utilisés en combinaison avec d'autres agents anti-tumoraux.The active substance is generally administered in a dosage which can vary from 50 mg to several grams. The compounds of the invention can also be used in combination with other anti-tumor agents.
Les exemples suivants illustrent de manière non limitative le procédé 10 conduisant aux composés de l'invention.The following examples illustrate, without limitation, the process leading to the compounds of the invention.
Exemple 1 0-¾ chloroacétate de vindésine (VDS-Chloroacét) 15Example 1 0-¾ vindesine chloroacetate (VDS-Chloroacét) 15
Dans un ballon, on introduit 0,92 M de vindésine , 25 mL de CH2CI2 et 4,1 mM d'anhydride chloroacétique. La solution est agitée en absence c'e lumière pendant 1¾ h. On ajoute 25 mL de méthanol (aicoolyse de l'excès d'anhydride). On agite à température normale pendant deux heures. Le 20 solvant est évaporé sous vide et le résidu dissout dans 500 mL de CH2C12, lavé par une solution aqueuse de NH^OH dilué à froid. Après évaporation de la phase organique le résidu est dissout dans 47 mL de méthanol contenant 11,2 mL d'eau et 2,33 g de silice. Le mélange est agité 6 h à température normale. La silice est séparée par filtration et 25 lavée à plusieurs reprises reprises avec du méthanol chaud. Le filtrat est concentré sous vide, alcalinisé avec une solution d'ammoniaque diluée et extrait au CH2C12· Les extraits sont réunis, séchés sur Na^Q^ et évaporé à siccité. La purification est effectuée sur colonne de silice en eluant avec un mélange CH2CI2:5% MeOH. Rendement 88 %.0.92 M of vindesin, 25 mL of CH2Cl2 and 4.1 mM of chloroacetic anhydride are introduced into a flask. The solution is stirred in the absence of light for 1 h. 25 ml of methanol are added (aicoolysis of the excess anhydride). The mixture is stirred at normal temperature for two hours. The solvent is evaporated in vacuo and the residue dissolved in 500 ml of CH2Cl2, washed with an aqueous solution of NH 4 OH diluted cold. After evaporation of the organic phase the residue is dissolved in 47 ml of methanol containing 11.2 ml of water and 2.33 g of silica. The mixture is stirred for 6 h at normal temperature. The silica is filtered off and washed several times with hot methanol. The filtrate is concentrated in vacuo, basified with a dilute ammonia solution and extracted with CH2C12 · The extracts are combined, dried over Na ^ Q ^ and evaporated to dryness. The purification is carried out on a silica column, eluting with a CH2Cl2: 5% MeOH mixture. Yield 88%.
30 • IR : 3470, 3040, 2970, 2880, 1740, 1690, 1615, 1510, 1500, 1430, 1225, 1190, 1010, 740 cm“1 I Spectre de masse 830 (M + -1), 813, 796, 773, 754, 297, 277, 293, 108 ”1 c/ ' ! - I 2 - i - !' I RMN : ppm 8(lH,s,NHind), 7,45(lH,d), 7,2-7,0(4H,m), 6,9(1H,d), '] * 6,5(1H,s, 'C14-H), 6,05(1H,s,C17-H), 5,8(1H,m,C7-H), 5,5 (1H,m,C4-H), 5,28(1H,d,C6-H), 4,0(2H,CH2Cl), 3,7(3H,s,-C02CH3), ; 3,55(3H,s,0CH3), 2,8(3H,s,NCH3}, 0,9-0,65(8H,m).30 • IR: 3470, 3040, 2970, 2880, 1740, 1690, 1615, 1510, 1500, 1430, 1225, 1190, 1010, 740 cm “1 I Mass spectrum 830 (M + -1), 813, 796, 773, 754, 297, 277, 293, 108 ”1 tsp! - I 2 - i -! ' I NMR: ppm 8 (1H, s, NHind), 7.45 (1H, d), 7.2-7.0 (4H, m), 6.9 (1H, d), '] * 6.5 (1H, s, 'C14-H), 6.05 (1H, s, C17-H), 5.8 (1H, m, C7-H), 5.5 (1H, m, C4-H), 5.28 (1H, d, C6-H), 4.0 (2H, CH2Cl), 3.7 (3H, s, -C02CH3),; 3.55 (3H, s, 0CH3), 2.8 (3H, s, NCH3}, 0.9-0.65 (8H, m).
55
Exemple 2 a) Couplage en C-4 de la O-4-désacétyl-vindésine (BSA-VDS-C-4) [ j q L'alpha-chloroacétate en C-4 de la 0-4 désacétyl-vindésine radioactive (150 mg), dissous dans 5 mL de dioxanne est ajouté goutte à goutte à une solution de 216 mg de BSA (albumine de sérum bovin, Cal Biochem) dans 5 mL de tampon borate 0,4 M pH 9,0. Le mélange est ajouté à température ambiante pendant 48 h. Le conjugué est précipité par j 5 addition de 6 volumes d'acétone et centrifugé 30 min à 1300 rpm. Le précipité est lavé 2 fois dans l'acétone et centrifugé dans les mêmes conditions. Après ces deux rinçages le précipité est lyophilisé et purifié par filtration sur gel G-25 (3x90 cm) équilibré dans une solution de NH4HC03 0,1 M pH 7,8. Le pic exclu est récupéré et lyophilisé. Le 20 contenu en protéine est mesuré par la technique de Lowry et le contenu en alcaloïde estimé par mesure de la radioactivité. Le conjugué obtenu contient 2,5 moles de vindésine par mole de BSA. Par chromatographie sur gel d'agarose on démontre que la radioactivité est bien associée aux protéines.Example 2 a) Coupling in C-4 of O-4-deacetyl-vindesine (BSA-VDS-C-4) [jq Alpha-chloroacetate in C-4 of radioactive 0-4 deacetyl-vindesine (150 mg ), dissolved in 5 mL of dioxane is added dropwise to a solution of 216 mg of BSA (bovine serum albumin, Cal Biochem) in 5 mL of 0.4 M borate buffer pH 9.0. The mixture is added at room temperature for 48 h. The conjugate is precipitated by the addition of 6 volumes of acetone and centrifuged 30 min at 1300 rpm. The precipitate is washed twice in acetone and centrifuged under the same conditions. After these two rinses the precipitate is lyophilized and purified by filtration on a G-25 gel (3 × 90 cm) equilibrated in a solution of 0.1 M NH 4 HCO 3 pH 7.8. The excluded peak is recovered and lyophilized. The protein content is measured by the Lowry technique and the alkaloid content estimated by measuring the radioactivity. The conjugate obtained contains 2.5 moles of vindesine per mole of BSA. By chromatography on agarose gel, it is demonstrated that radioactivity is well associated with proteins.
25 b) Succinylation ( BSA(S)-VDS-C-4 )B) Succinylation (BSA (S) -VDS-C-4)
Le conjugué est dissous dans l'eau à une concentration de 100 mg/5ml et le pH de la solution porté à 7 avec une solution de NaOH 0,1 N. 30 55 mg d'anhydride succinique sont alors ajoutés par petites fractions.The conjugate is dissolved in water at a concentration of 100 mg / 5 ml and the pH of the solution brought to 7 with a 0.1 N NaOH solution. 55 mg of succinic anhydride are then added in small portions.
Le pH est maintenu à 7 par addition de NaOH 0,1 N. Lorsque le pH est stabilisé on ajoute encore 55 mg d'anhydride succinique. La solution est agitée 1 h à température ambiante, dialysée à l'eau à 0°C pendant une nuit et lyophilisée. Les contenus en protéines et en alcaloïdes sont 35 J estimés selon les techniques décrites en a).The pH is maintained at 7 by adding 0.1 N NaOH. When the pH is stabilized, another 55 mg of succinic anhydride is added. The solution is stirred for 1 h at room temperature, dialyzed with water at 0 ° C overnight and lyophilized. The protein and alkaloid contents are estimated by the techniques described in a).
i - 13 - *i - 13 - *
Exemple 3 0-4 chloroacétate de N(04-désacétyl- decarbomethoxy-3 vinblastin-23-oyl) L- isoleucinate d'éthyle (BSA(S)-VIle-C-A) 5Example 30-4 N (04-deacetyl-decarbomethoxy-3 vinblastin-23-oyl) L-chloroacetate ethyl isoleucinate (BSA (S) -VIle-C-A) 5
En suivant le mode opératoire de l'exemple 1, à partir du dérivé j correspondant de la Vinblastine (voir brevet belge 889.136), on obtient le dérivé ci-dessus avec un rendement de 85% .By following the procedure of Example 1, from the corresponding derivative j of Vinblastine (see Belgian patent 889,136), the above derivative is obtained with a yield of 85%.
10 IR : 3470, 3410, 3040, 2970, 2880, 1740, 1680, 1615, 1500, 1460, 1430, 1300, 1225, 1190, 1150, 1010, 740 cm”110 IR: 3470, 3410, 3040, 2970, 2880, 1740, 1680, 1615, 1500, 1460, 1430, 1300, 1225, 1190, 1150, 1010, 740 cm ”1
Spectre de masse : 988 (M+17), 973(M+2), 939, 917, 391 , 236, 94 15 RMN : ppm 9,85 (1H ,s,C3-OH), 8,6(1H,s,NH), 7,55(1H,d), 7,4(1H,d], 7,2-7,0 (m,3H), 6,65(1 H,s,C14H), 6,1 (1H,s,C17H), 5,85(1 H,m,C7H), j 5,58(1 H ,s,C4H), 5,32(1 H ,m,C6H), 4,6(lH,q), 4,2(2H,m,C02CH2-), 1 4,0(2H, C02CH2CI), 3,78(3H,s,-C02CH3), 3,1(3H,s,-OCH3), | 2,7(3H,s,NCH3), 1,28(3H,t,C02CH2CH3), 1,0-0,8(14H,m).Mass spectrum: 988 (M + 17), 973 (M + 2), 939, 917, 391, 236, 94 15 NMR: ppm 9.85 (1H, s, C3-OH), 8.6 (1H, s, NH), 7.55 (1H, d), 7.4 (1H, d], 7.2-7.0 (m, 3H), 6.65 (1H, s, C14H), 6, 1 (1H, s, C17H), 5.85 (1H, m, C7H), j 5.58 (1H, s, C4H), 5.32 (1H, m, C6H), 4.6 ( 1H, q), 4.2 (2H, m, C02CH2-), 1.4 (2H, C02CH2CI), 3.78 (3H, s, -C02CH3), 3.1 (3H, s, -OCH3) , | 2.7 (3H, s, NCH3), 1.28 (3H, t, C02CH2CH3), 1.0-0.8 (14H, m).
20 ' Exemple 420 'Example 4
Formation de l'hémisuccinate en 0-4 de la vindésïne et couplage avec 1' 25 albumine de sérum bovin (BSA). (BSA-Succ-VDS)0-4 hemisuccinate formation of vindesin and coupling with bovine serum albumin (BSA). (BSA-Succ-VDS)
Dans un ballon, on introduit 0,125 mM de vindésine, 0,187 mM d'anhydride succinique et 4 mL de Ci^C^ anhydre. La solution est égitée à l'abri de la lumière à température ambiante pendant 14 h.0.125 mM of vindesin, 0.187 mM of succinic anhydride and 4 ml of anhydrous C 1 -C 4 are introduced into a flask. The solution is stirred away from light at room temperature for 14 h.
30 La solution est ensuite plongée dans un bain de glace. On y ajoute 0,250 mM de triéthylamine ,0,250 mM de chloroformiate d'éthyle et 5 mL de dioxanne. On agite pendant 1/2 h. D'autre part, on prépare une solution de 90 mg de BSA dans 17,3 mL d'h^O et 17,3 mL de dioxanne y sont ajoutés goutte à goutte. Le pK est ajusté à 8,5 avec de la soude 1 35 I N. La solution est refroidie à 5°C. Après 1/2 h l'ester activé est Λ - 14 - ajouté à la solution de BSA. La solution est agitée pendant 4 h à 5°C, tandis que le pH est maintenu à 8,5 par addition de NaOH IN. La précipitation. du conjugué et sa caractérisation sont effectués comme précédemment décrits. Le rapport molaire est d'environ 18 et reste I 5 constant après chromatographie sur sépharose 6B en présence de guanidine 6M.The solution is then immersed in an ice bath. 0.250 mM of triethylamine, 0.250 mM of ethyl chloroformate and 5 ml of dioxane are added thereto. The mixture is stirred for 1/2 h. On the other hand, a solution of 90 mg of BSA in 17.3 ml of H 2 O and 17.3 ml of dioxane are prepared therein dropwise. The pK is adjusted to 8.5 with 1 35 I N sodium hydroxide solution. The solution is cooled to 5 ° C. After 1/2 h the activated ester is added to the BSA solution. The solution is stirred for 4 h at 5 ° C., while the pH is maintained at 8.5 by addition of IN NaOH. Precipitation. of the conjugate and its characterization are carried out as previously described. The molar ratio is approximately 18 and remains constant after chromatography on sepharose 6B in the presence of 6M guanidine.
Exemple 5 10 Vinblastine 0-4 hémisuccinate pyrrolidine (DAVLB-Pyrrolidino) A une solution de 500 mg (0,651 mM) de 0-4 déacétylvinblastine dans 15 mL de dichlorométhane anhydre, on ajoute 97,6 mg (0,976 mM) d'anhydride succinique. La solution est agitée 20 h à t ambiante. On 15 refroidit ensuite à 0°C par un bain de glace et ajoute goutte à goutte successivement une solution de 131,5 mg (1 ,303 mM) de triéthylamine dans 8 mL de dichlorométhane et une solution de 141,2 mg (1 ,302 mM) de chloroformiate d'éthyle dans 8 mL de dichlorométhane. On agite 1 h 30 έ 0°C et ajoute 92,5 mg (1 ,302 mM) de pyrrolidine en solution dans 8 mL 2 0 de dichlorométhane. On laisse revenir à t ambiante et agite le mélange 2 heures. On ajoute 50 mL de dichlorométhane et 50 mL d'une solution aqueuse à 10% de carbonate de sodium. On agite, décante et sépare ic phase organique. La phase organique est extraite 3 fois par du dichlorométhane. Les phases organiques réunies sont lavées par une 25 solution aqueuse saturée en NaCI et séchées sur MgSO^. Le résidu que“ l'on obtient après évaporation est purifié par chromatographie sur colonne de Si02 (élution dichlorométhane/méthano! 92:8). Après trituration dans un mélange acétate d'éthyle/ cyclohexane, on obtient ainsi 386 mg de produit pur sous forme d'une poudre amorphe. 30 Rendement : 64%.Example 5 10 Vinblastine 0-4 hemisuccinate pyrrolidine (DAVLB-Pyrrolidino) To a solution of 500 mg (0.651 mM) of 0-4 deacetylvinblastine in 15 ml of anhydrous dichloromethane, 97.6 mg (0.976 mM) of succinic anhydride is added . The solution is stirred for 20 h at room t. It is then cooled to 0 ° C. in an ice bath and a solution of 131.5 mg (1.303 mM) of triethylamine in 8 ml of dichloromethane and a solution of 141.2 mg (1, 3) are added dropwise successively. 302 mM) of ethyl chloroformate in 8 ml of dichloromethane. Stirred 1 h 30 at 0 ° C and added 92.5 mg (1.302 mM) of pyrrolidine dissolved in 8 mL 2 0 of dichloromethane. The mixture is left to return to room temperature and the mixture is stirred for 2 hours. 50 ml of dichloromethane and 50 ml of a 10% aqueous solution of sodium carbonate are added. The organic phase is stirred, decanted and separated. The organic phase is extracted 3 times with dichloromethane. The combined organic phases are washed with a saturated aqueous NaCl solution and dried over MgSO 4. The residue which “is obtained after evaporation is purified by chromatography on a column of SiO2 (elution dichloromethane / methano! 92: 8). After trituration in an ethyl acetate / cyclohexane mixture, 386 mg of pure product are thus obtained in the form of an amorphous powder. Yield: 64%.
Spectre de masse : DCI (isobutane) : 936 (M + 14), 922 (M) : - IR (CHCI,, 5%): 3477, 3015, 2980, 2885, 1741 , 1635, 1505, 1450, 1250 /-1 J cm - 15 - ! * RMN (CDCI3, 360 MHz, ppm) : 8,05 (NH, 1H), 7,53 (1H), 7,16(3H), 6,66 (1H), 6,10 fl H), 5,85 (1H) et 5,45(1H)(H14,H15), 5,51 (1H,H17), 3,95 (1H,H17'a), 3,78 (3H,OMe), 3,75 (3H,OMe). 3,60 (3H,OMe), 3,70(1H,H2), 3,43(7H), 3,11(2H, H5'b+H6'b), 2,78 (2H, H21a'+H21,b). 5 2,70 (3H,NMe), 2,61 (1H, H21), 2,25 (1H,H17·), 1,90 (2H,CH2-CO), 1,80(2H,CH2CO), 1,73 (2H, beta pyrrolidine), 1,28 (2H,idem), 1,45 (1H, H15'a), 1,37 (1H, H14'b), 0,86(3H,CH3), 0,80(3H,CH3), 0,76(1 H,H14').Mass spectrum: DCI (isobutane): 936 (M + 14), 922 (M): - IR (CHCI ,, 5%): 3477, 3015, 2980, 2885, 1741, 1635, 1505, 1450, 1250 / - 1 J cm - 15 -! * NMR (CDCI3, 360 MHz, ppm): 8.05 (NH, 1H), 7.53 (1H), 7.16 (3H), 6.66 (1H), 6.10 fl H), 5, 85 (1H) and 5.45 (1H) (H14, H15), 5.51 (1H, H17), 3.95 (1H, H17'a), 3.78 (3H, OMe), 3.75 ( 3H, OMe). 3.60 (3H, OMe), 3.70 (1H, H2), 3.43 (7H), 3.11 (2H, H5'b + H6'b), 2.78 (2H, H21a '+ H21 , b). 5 2.70 (3H, NMe), 2.61 (1H, H21), 2.25 (1H, H17 ·), 1.90 (2H, CH2-CO), 1.80 (2H, CH2CO), 1 , 73 (2H, beta pyrrolidine), 1.28 (2H, same), 1.45 (1H, H15'a), 1.37 (1H, H14'b), 0.86 (3H, CH3), 0 , 80 (3H, CH3), 0.76 (1H, H14 ').
1010
Exemple 6Example 6
Vinblastine 0-4 hémisuccinate-ethyl tryptophanate amide A une solution de 0,310 g (0,403 mM) de 04-déacétylvinblastine dans 7 mL de dichlorométhane anhydre, on ajoute 52 mg (0,524 mM) d'anhydride succinique. La solution est agitée 15 heures à t ambiante puis refroidie à 0°C. Après addition successive d'une solution de 81 mg (0,806 mM) de trïéthylamine dans 5 mL de dichlorométhane et d'une solution de 87 mg 20 de chloroformiate d'éthyle dans 5 mL de dichlorométhane, le mélange réactionnel est agité 1 h 30 à 0°C. On ajoute ensuite 187 mg (0,806 mM) de L-trypfophanate d'éthyle en solution dans 7 mL de dichlorométhane. On laisse revenir à t ambiante et agite le mélange pendant 15 h. La solution est ensuite traitée comme dans l'exemple 5. Le résidu obtenu 25 est purifié par chromatographie sur colonnede SiO^ (élution éther-méthanol saturé en N92:8). On obtient ainsi 305 mg du produit pur sous forme d'une poudre blanche après trituration dans l'isopropanol. Rendement 70%.Vinblastine 0-4 hemisuccinate-ethyl tryptophanate amide To a solution of 0.310 g (0.403 mM) of 04-deacetylvinblastine in 7 ml of anhydrous dichloromethane, 52 mg (0.524 mM) of succinic anhydride are added. The solution is stirred for 15 hours at room temperature and then cooled to 0 ° C. After the successive addition of a solution of 81 mg (0.806 mM) of triethylamine in 5 ml of dichloromethane and of a solution of 87 mg of ethyl chloroformate in 5 ml of dichloromethane, the reaction mixture is stirred for 1 hour 30 minutes. 0 ° C. Then 187 mg (0.806 mM) of ethyl L-trypfophanate dissolved in 7 ml of dichloromethane is added. The mixture is left to return to room temperature and the mixture is stirred for 15 h. The solution is then treated as in Example 5. The residue obtained is purified by chromatography on a column of SiO 4 (elution ether-methanol saturated with N92: 8). 305 mg of the pure product are thus obtained in the form of a white powder after trituration in isopropanol. Yield 70%.
” ji.”Ji.
-16- t | k Spectre de masse (DCI, isobutane): 1097 (M+14), 1083 (M) IR (CHCI3) : 3460, 2995, 2960, 2870, 1735, 1669, 1613, 1502, 1457, 1331, 1251 , 1167, 1010 cm"1 UV (méthanol, max, log ): 216 (4,87), 265 (4,27), 288 (3,01) 5 j RMN (360 MHz,CDCI3) : 8,44(1H,NH), 8,08(1H,NH). 7,52(2H), 7,33(1H), 7,10(6H), 6,66(1 H ,H9), 6,06(1 H ,H12), 5,86 (1H,H14), 5,50(1H,H17), 5,38(1H ,H15), 4,91(1H), 4,10(2H,CH2-O), 3,76{3H ,OMe), 3,72 (3H,OMe), 3,63 (3H,OMe), 3,13 (2H,5'b,6'b), 2,80(H2V), 2,68 (NCH3), 10 0,90 (CH3,3H), 0.78(CH3,3H), 0,74 (H14*).-16- t | k Mass spectrum (DCI, isobutane): 1097 (M + 14), 1083 (M) IR (CHCI3): 3460, 2995, 2960, 2870, 1735, 1669, 1613, 1502, 1457, 1331, 1251, 1167, 1010 cm "1 UV (methanol, max, log): 216 (4.87), 265 (4.27), 288 (3.01) 5 d NMR (360 MHz, CDCI3): 8.44 (1H, NH ), 8.08 (1H, NH) 7.52 (2H), 7.33 (1H), 7.10 (6H), 6.66 (1H, H9), 6.06 (1H, H12 ), 5.86 (1H, H14), 5.50 (1H, H17), 5.38 (1H, H15), 4.91 (1H), 4.10 (2H, CH2-O), 3.76 {3H, OMe), 3.72 (3H, OMe), 3.63 (3H, OMe), 3.13 (2H, 5'b, 6'b), 2.80 (H2V), 2.68 ( NCH3), 10.90 (CH3.3H), 0.78 (CH3.3H), 0.74 (H14 *).
Exemple 7Example 7
Vindésine 0-4 hémisuccinate-pyrrolidine amide 15Vindesin 0-4 hemisuccinate-pyrrolidine amide 15
En partant de la vindésine et en appliquant un mode opératoire analogue à celui de l'exemple 1 on obtient le conjugué correspondant avec un rendement de 62%.Starting from vindesine and applying a procedure analogous to that of Example 1, the corresponding conjugate is obtained with a yield of 62%.
20 Spectre de masse (DCI, isobutane) : 921 (M+14), 907 (M) IR (CHCI3. 4%): 3400, 2975, 2882, 1732, 1693, 1632, 1503, 1462, 1380, 1247 cm“1 RMN (360 MHz, CDCI3) 8,05 (1H,NH), 7,50(1H), 7,15(3H), 6,10 (1H,H12), 5,86 (1H,H14), 5,53 (1H,H17), 5,46(1H,H15), 3,96 25 (1H,H17'a), 3,80(3H,OMe), 3,64(3H,OMe), 3,45 (4CH2-pyrrolidine), 2,88 • (3H,N-CH,), 0,95 (3H.CH-), 0,83(3H,CH,).20 Mass spectrum (DCI, isobutane): 921 (M + 14), 907 (M) IR (CHCI3. 4%): 3400, 2975, 2882, 1732, 1693, 1632, 1503, 1462, 1380, 1247 cm “ 1 NMR (360 MHz, CDCI3) 8.05 (1H, NH), 7.50 (1H), 7.15 (3H), 6.10 (1H, H12), 5.86 (1H, H14), 5 , 53 (1H, H17), 5.46 (1H, H15), 3.96 (1H, H17'a), 3.80 (3H, OMe), 3.64 (3H, OMe), 3.45 (4CH2-pyrrolidine), 2.88 • (3H, N-CH,), 0.95 (3H.CH-), 0.83 (3H, CH,).
ΛΛ
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