LU84784A1 - NOVEL PROTEIN CONJUGATES OF VINBLASTIN, PROCESS FOR THEIR PREPARATION AND THERAPEUTIC USE - Google Patents
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Description
Γ f *Γ f *
NOUVEAUX CONJUGUES PROTEIQUES DE LA VINBLASTINE LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEUR UTILISATION THERAPEUTIQUENOVEL PROTEIN CONJUGATES OF VINBLASTIN, PROCESS FOR THEIR PREPARATION AND THERAPEUTIC USE
La présente invention se rapporte à de nouveaux conjugués de la Vinblastine et de certains de ses dérivés connus avec des protéines, leur méthode d'obtention et leur utilisation en tant qu'agent anti-tumoral.The present invention relates to new conjugates of Vinblastine and of certain of its known derivatives with proteins, their method of production and their use as an anti-tumor agent.
5 La Vinblastine et certains de ses dérivés, en particulier la vincristine ou la vindésîne, ont déjà été couplés à des protéines par exemple l'albumine ou diverses immunoglobulines. Il en résulte des produits de couplage ou des composés dits "conjugués". Nous relevons notamment les références suivantes de la littérature : 10 - J.D.Teale, Jacqueline M.CIough et V.Marks, Br.J.clin.Pharmac. 4, 169-172 ,1977 - C.H.J.Ford, C.E.Newman, J.R.Johnson, C.S.Woodhouse, T.A.Reeder, C.F.Rowland, R.G.Simmonds, Br.J.Cancer 47, 35-42, 1983 - M.J.Embleton, G.F.Rowland, R.G.Simmonds, E.Jacobs, C.H.Marsden, 15 R.W.Baldwin Br.J.Cancer 47,43-49, 1983 -J.R.Johnson, C.H.J.Ford, C.E.Newman, C.S.Woodhouse, G.F.Rowland, R.G.Simmonds Br.J.Cancer , 44, 472-475, 1981 - Eli Lilly Eur.Pat.Appiic. , Publ. n°56.322, 21 .07.82 - R.A. Conrad, G.J.Cullinan, K.Gerzon, G.A.Poore J.Med.Chem. 22, 20 391 , 1979.5 Vinblastine and some of its derivatives, in particular vincristine or vindésîne, have already been coupled to proteins, for example albumin or various immunoglobulins. This results in coupling products or so-called "conjugate" compounds. We note in particular the following references from the literature: 10 - J.D.Teale, Jacqueline M.CIough and V.Marks, Br.J.clin.Pharmac. 4, 169-172, 1977 - CHJFord, CENewman, JRJohnson, CSWoodhouse, TAReeder, CFRowland, RGSimmonds, Br.J. Cancer 47, 35-42, 1983 - MJEmbleton, GFRowland, RGSimmonds , E.Jacobs, CHMarsden, 15 RWBaldwin Br.J. Cancer 47,43-49, 1983 -JRJohnson, CHJFord, CENewman, CSWoodhouse, GFRowland, RGSimmonds Br.J. Cancer, 44, 472 -475, 1981 - Eli Lilly Eur.Pat.Appiic. , Publ. n ° 56.322, 21 .07.82 - R.A. Conrad, G.J.Cullinan, K.Gerzon, G.A.Poore J.Med.Chem. 22, 20 391, 1979.
Le couplage de ces dérivés bis-indoliques a été entrepris non seulement dans le but de mettre au point'de nouveaux réactifs immunologiques mais surtout en vue de la préparation de substances anti-tumorales plus 25 actives ,plus sélectives et moins toxiques.The coupling of these bisindole derivatives has been undertaken not only for the purpose of developing new immunological reagents but above all for the preparation of more active, more selective and less toxic anti-tumor substances.
Dans cette dernière optique de nombreux conjugués protéiques avec d'autres agents antitumoraux sont actuellement étudiés, il en est en particulier ainsi avec des conjugués d'anticorps et d'un fragment de la 30 rïcine ou de conjugués d'albumine et de méthotrexate (Demande de brevet * français 2.437.213, C M Industries; B.C.F.Chu, S.B.Howell J. of jP Pharmacology and Exp. Therapeutics ,219 (2), 389-393, 1981).In this latter perspective, numerous protein conjugates with other antitumor agents are currently being studied, this is in particular the case with conjugates of antibodies and a fragment of ricin or of conjugates of albumin and methotrexate (Request French Patent No. 2,437,213, CM Industries; BCFChu, SBHowell J. of jP Pharmacology and Exp. Therapeutics, 219 (2), 389-393, 1981).
Il - 2 - rIt - 2 - r
Les anti-corps monoclonaux, en particulier ceux d'origine humaine, couplés au médicaments anti-tumoraux connus sont plus particulièrement l'objet d'études diverses.Monoclonal antibodies, in particular those of human origin, coupled with known anti-tumor drugs are more particularly the subject of various studies.
5 On relèvera enfin que l'utilisation et l'évaluation de complexes 1:1 d'alcaloides bis-indoliques avec la tubuline a été décrite dans le brevet belge 854.053. Dans certains cas il peut en résulter une toxicité moindre et une activité chimiothérapique plus importante que celles des alcaloïdes libres correspondants.Finally, it will be noted that the use and evaluation of 1: 1 complexes of bis-indole alkaloids with tubulin has been described in Belgian patent 854,053. In some cases this may result in less toxicity and greater chemotherapeutic activity than that of the corresponding free alkaloids.
1010
La présente invention se caractérise par la préparation et l'utilisation de conjugués vinblastine-protéine dans lesquels le lien covalent qui unit la molécule active à la protéine jouant le rôle de vecteur chimiothérapique, est un lien du type ester au niveau de la fonction hydroxyle en C-4 de 15 la 0-4 désacétylvinblastine ou de ses dérivés.The present invention is characterized by the preparation and use of vinblastine-protein conjugates in which the covalent link which unites the active molecule to the protein playing the role of chemotherapeutic vector, is an ester type link at the hydroxyl function level. C-4 de 15 la 0-4 desacetylvinblastine or its derivatives.
Les composés de l'invention répondent plus particulièrement à la formule générale suivante 20 ^ -The compounds of the invention more particularly correspond to the following general formula 20 ^ -
OkX~?t jOkX ~? T j
VNCVNC
H /^LaJvHH / ^ LaJvH
Cl-taOOC / CH3° clVhH0tÔCHrR'Cl-taOOC / CH3 ° clVhH0tÔCHrR '
JJ
i %i%
TLTL
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Γ - 3 - dans laquelle représente un radical protéique et R2 représente un groupe méthoxy, un groupe amino ou un radical ester d'acide ! alpha-aminé lié par une liaison de type amide et dont le groupe ester comporte de 1 à 6 atomes de carbone.Γ - 3 - in which represents a protein radical and R2 represents a methoxy group, an amino group or an acid ester radical! alpha-amino linked by an amide bond and whose ester group contains from 1 to 6 carbon atoms.
55
Dans l'art antérieur, la liaison était effectuée par l'intermédiaire d'un lien amide au niveau de la fonction vinblastinoyl-23 du dérivé bis-indolique. De manière surprenante nous avons constaté que l'activité anti-tumorale est mieux conservée lorsque la liaison est effectuée en C-4 10 plutôt qu'en C-23.In the prior art, the binding was carried out via an amide bond at the level of the vinblastinoyl-23 function of the bis-indole derivative. Surprisingly we have found that the anti-tumor activity is better preserved when the binding is carried out in C-4 10 rather than in C-23.
Les dérivés de la présente invention sont obtenus,dans une première étape, par condensation du chloroacétate en C-4 de la 0-4 désacétylvinblastine ou l'un de ses dérivés 0-4 désacétylvinblastine -carboxamide-3.The derivatives of the present invention are obtained, in a first step, by condensation of the C-4 chloroacetate of 0-4 deacetylvinblastin or one of its 0-4 derivatives deacetylvinblastin -carboxamide-3.
Les dérivés 4-chloroacétate ainsi obtenus sont alors condensés avec la protéine dans un solvant dans lequel ces composés sont solubles. On peut à cette fin utilisé un mélange eau-dioxanne à un pH adéquat 20 maintenu par un tampon , par exemple un tampon borate. La condensation est confirmée par électrophorèse et par chromatographie, i Dans ce dernier cas on peut utilisé de la Vinblastine radio-active (par exemple tritiée).The 4-chloroacetate derivatives thus obtained are then condensed with the protein in a solvent in which these compounds are soluble. For this purpose, a water-dioxane mixture can be used at a suitable pH maintained by a buffer, for example a borate buffer. Condensation is confirmed by electrophoresis and by chromatography, i In the latter case, radioactive Vinblastine (for example tritiated) can be used.
25 L'obtention du chloro-acétate en C-4’ de la Vinblastine est décrite par W.W.Hargrove Lloydia, 27 (4), 342, 1964. Il peut ainsi être obtenu par action de l'anhydride chloroacétique sur la désacétyl Vinblastine dans le , dichlorométhane.The production of the C-4 'chloro-acetate from Vinblastine is described by WWHargrove Lloydia, 27 (4), 342, 1964. It can thus be obtained by the action of chloroacetic anhydride on deacetyl Vinblastine in , dichloromethane.
, 30 Du point de vue chimique la condensation peut s'expliquer par l'obtention de liens covalents résultant de la réaction des groupes amines de la lysine protéique avec le chlore activé de la fonction chloroacétate. L'albumine de sérum bovin comprend par exemple 56 résidus aminés de lysine. Le nombre de molécule de Vinblastine par protéine variera en ^5 , fonction des conditions opératoires mais sera généralement compris entre ^ 1 et 8.From a chemical point of view, condensation can be explained by obtaining covalent bonds resulting from the reaction of the amino groups of the protein lysine with the activated chlorine of the chloroacetate function. Bovine serum albumin comprises, for example, 56 amino lysine residues. The number of Vinblastine molecules per protein will vary in ^ 5, depending on the operating conditions but will generally be between ^ 1 and 8.
fr - 4 -en - 4 -
Le conjugué obtenu est isolé au moyen de méthodes classiques utilisées en biochimie. Le conjugué est ainsi précipité du milieu réactionnel par addition d'acétone, puis centrifugé, rincé, lyophilisé et purifié par filtration sur gel. Eventuellement on peut soumettre le dérivé ainsi obtenu à une réaction de succinylation classique qui permet d'éviter - des problèmes d'aggrégation que caractérisent certaines protéines, conjuguées ou non.The conjugate obtained is isolated using conventional methods used in biochemistry. The conjugate is thus precipitated from the reaction medium by addition of acetone, then centrifuged, rinsed, lyophilized and purified by filtration on gel. Optionally, the derivative thus obtained can be subjected to a conventional succinylation reaction which makes it possible to avoid - aggregation problems which characterize certain proteins, conjugated or not.
Les protéines qui peuvent être avantageusement utilisées sont en particulier l'albumine de sérum bovin ou humain, la fétuine ou des immunoglobulines, ces dernières étant éventuellement obtenues par la technique des anti-corps monoclonaux. Dans ce dernier cas, l'utilisation d'anti-corps monoclonaux d'origine humaine et montrant une certaine ! spécificité vis à vis de tumeurs humaines s'avère particulièrement intéressante.The proteins which can be advantageously used are in particular bovine or human serum albumin, fetuin or immunoglobulins, the latter possibly being obtained by the technique of monoclonal antibodies. In the latter case, the use of monoclonal antibodies of human origin and showing some! specificity with respect to human tumors is particularly interesting.
1515
Les essais ïn-vitro effectués avec les composés de l'invention pour démontrer leur activité anti-tumorale indiquent que la formation du conjugué par un lien en C-4 peut être plus avantageuse que lorsque ce lien est effectué en C-3.In vitro tests carried out with the compounds of the invention to demonstrate their anti-tumor activity indicate that the formation of the conjugate by a C-4 link may be more advantageous than when this link is made in C-3.
2°2 °
Le couplage via le carbone 3 de la Vinblastine ou de ses dérivés s'effectue de manière classique en formant, dans une première étape, l'hydrazide en C-23 (carboxhydrazide) puis l'azoture d'acide correspondant par nitrosation. L'azoture est alors directement couplé 25 avec la protéine.The coupling via carbon 3 of Vinblastine or its derivatives is carried out in a conventional manner by forming, in a first step, the C-23 hydrazide (carboxhydrazide) then the corresponding acid azide by nitrosation. The azide is then directly coupled with the protein.
Cet azoture d'acide peut cependant aussi être condensé de manière également connue avec un ester d'acide aminé , par exemple un ester méthylique. La fonction ester de l'acide aminé peut être à son tour soumise à une hydrazinolyse puis à une nitrosation. Le nouvel azoture d'acide du produit de couplage acide aminé-vinblastine est alors condensé avec la protéine. L'acide aminé constitue dans ce cas le lien unissant la /protéine à la molécule de vinblastine.This acid azide can however also be condensed in a manner also known with an amino acid ester, for example a methyl ester. The ester function of the amino acid can in turn be subjected to hydrazinolysis and then to nitrosation. The new acid azide from the amino acid-vinblastine coupling product is then condensed with the protein. The amino acid in this case constitutes the link uniting the / protein with the vinblastine molecule.
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On a ainsi obtenu des dérivés de condensation couplés en C-3 ou C-4 et . O-4-désacétylés par exemple du type* vinblastine-fétuine (Fét-VDS-C-3), vinblastine-fétuine succinylée (Fét(S)-VDS-C-3) vinblastine-isoleucine-fetuine (Fét-IIe-VDS-C-3) ^ vinblastine-tryptophane-albumine de sérum bovin (BSA-TrpV-C-3) vinblastine-tryptophane-albumine de sérum bovin succinyiée (BSA(S)-T rpV-C-3) " vinblastine-isoleucine-albumine de sérum bovin succinylée (BSA(S)-Vile C-U) ^ vin.dësine- albumine de sérum bovin (BSA-VDS-C-1»).We thus obtained condensation derivatives coupled in C-3 or C-4 and. O-4-deacetylated, for example of the type * vinblastine-fetuin (Fet-VDS-C-3), vinblastine-fetin succinylated (Fét (S) -VDS-C-3) vinblastine-isoleucine-fetuine (Fét-IIe-VDS -C-3) ^ vinblastine-tryptophan-bovine serum albumin (BSA-TrpV-C-3) vinblastine-tryptophan-succinated bovine serum albumin (BSA (S) -T rpV-C-3) "vinblastine-isoleucine- bovine serum albumin succinylated (BSA (S) -Vile CU) ^ wine. resin- bovine serum albumin (BSA-VDS-C-1 ").
vin désine--albumine de sérum bovin succinylée (BSA(S)-VDS-C-4).desine wine - succinylated bovine serum albumin (BSA (S) -VDS-C-4).
Les composés de l'invention ont été testés sur des souris BDF^ ou DBA^ auxquelles une leucémie P388 a été implantée par voie intra - péritonéale * ^ ou intra-veineuse, l'activité anti-tumorale étant mesurée par le pourcentage d'ILS (Increased Life Span, augmentation de la durée de survie des survivants/total).The compounds of the invention were tested on BDF ^ or DBA ^ mice in which P388 leukemia was implanted by intraperitoneal * ^ or intravenous route, the anti-tumor activity being measured by the percentage of ILS (Increased Life Span, increased survivorship / total).
Ainsi des expériences effectuées avec la vindésine, le N-ÎO^-déacétyl-S- y fi de(méthoxycarbonyl)- vinblastinoyl-23) tryptophanate d'éthyle (voir demande de brevet européen Publ. η0ίΠ.935. Omnichem), ainsi que d'autres dérivés en C-3 d'acides aminés, couplé via le carbone C-3 avec la fétuine ou l'albumine de sérum bovin dans un rapport variant de 2 à 6, démontrent que ces conjugués sont" inactifs sur les tumeurs P388 (voir y r tableau ). L'administration du conjugué a été effectuée par voie intra-péritonéale ou intra-veineuse, identique au mode d'injection de la tumeur.Thus experiments carried out with vindesine, N-ÎO ^ -déacétyl-S- y fi de (méthoxycarbonyl) - vinblastinoyl-23) ethyl tryptophanate (see European patent application Publ. Η0ίΠ.935. Omnichem), as well as other C-3 amino acid derivatives, coupled via C-3 carbon with fetuin or bovine serum albumin in a ratio varying from 2 to 6, demonstrate that these conjugates are "inactive on P388 tumors (see table) The administration of the conjugate was carried out intraperitoneally or intravenously, identical to the mode of injection of the tumor.
Par contre ces mêmes substances pour lesquels le couplage est effectué en C-4 montrent, de manière inattendue, une activité significative à l'occasion de tests similaires. Des augmentations de durée de survie de ,plus de 70% ont été observées.On the other hand, these same substances for which the coupling is carried out in C-4 show, unexpectedly, significant activity during similar tests. Increases in survival time of over 70% have been observed.
" À /r « fSr - 6 - «"À / r" fSr - 6 - "
TABLEAUBOARD
ACTIVITES DE CONJUGUES PROTEINE-VINBLASTINE POUR DES TUMEURS INDUITES CHEZ LA SOURIS.PROTEIN-VINBLASTIN CONJUGATES ACTIVITIES FOR INDUCED TUMORS IN MICE.
PRODUITS (a) (b) (c) SOURIS TUMEUR ILSPRODUCTS (a) (b) (c) TUMOR MOUSE THEY
(d) (e) (f) (g) BSA-TrpV-C-3 2 10 423 DBA2 ΙΟ4 P388 iv 9,4 BSA(S)TrpV-C-3 2 6,3 261 DBA^ 104 P388 iv -8 Fét-VDS-C-3 6 15 298 BDF^ ΙΟ6 P388 ip 4,1 Fét(S}-VDS-C-3 2 15 298 BDF. 106 P388 ip 8,2 Fét-ILe-VDSC3 2 10 294 BDF^ ΙΟ5 P388 ip 2,6 BSA-VDS-C-4 1 ,7 8 398 BDF^ ΙΟ6 P388 ip 2 BSA-VDS-C-4 2,7 16 500 BDF^ ΙΟ6 P388 ip 48 BSA(S)-VDS-C-4 2·;5 10 332 BDF^ ΙΟ6 P388 ip 70 BSA(S)-VI Ie-C-4 1 ,3 3 165 BDF^ ΙΟ6 P388 ip 18 BSA(S]-VIIe-C-4 1 ,3 14 771 BDF^ ΙΟ6 P388 ip 32 (a) rapport molaire vinca:protéine (b) dose mg vinca/kg (c) dose mg protéine/kg . (d) nombre de cellules injectées (e) type de la tumeur injectée, (f) voie d'injection (g) pourcentage d'augmentation du temps de survie des survivants f; comparativement à des souris non-traitées i * t i î ' / ! t/(d) (e) (f) (g) BSA-TrpV-C-3 2 10 423 DBA2 ΙΟ4 P388 iv 9.4 BSA (S) TrpV-C-3 2 6.3 261 DBA ^ 104 P388 iv -8 Fét-VDS-C-3 6 15 298 BDF ^ ΙΟ6 P388 ip 4,1 Fét (S} -VDS-C-3 2 15 298 BDF. 106 P388 ip 8,2 Fét-ILe-VDSC3 2 10 294 BDF ^ ΙΟ5 P388 ip 2.6 BSA-VDS-C-4 1, 7 8 398 BDF ^ ΙΟ6 P388 ip 2 BSA-VDS-C-4 2.7 16 500 BDF ^ ΙΟ6 P388 ip 48 BSA (S) -VDS-C- 4 2 ·; 5 10 332 BDF ^ ΙΟ6 P388 ip 70 BSA (S) -VI Ie-C-4 1, 3 3 165 BDF ^ ΙΟ6 P388 ip 18 BSA (S] -VIIe-C-4 1, 3 14 771 BDF ^ ΙΟ6 P388 ip 32 (a) molar ratio vinca: protein (b) dose mg vinca / kg (c) dose mg protein / kg. (D) number of cells injected (e) type of tumor injected, (f) route of injection (g) percentage increase in survival time of survivors f; compared to untreated mice i * ti î '/! t /
JJ
- 7 - .- 7 -.
La présente invention s'étend donc également aux applications industrielles et notamment pharmaceutiques des composés bisindoliques nouveaux.The present invention therefore also extends to industrial and in particular pharmaceutical applications of new bisindolic compounds.
5 Les composés de l'invention présentent en effet des propriétés antitumorales particulièrement intéressantes et susceptibles d'être utilisées en thérapeutique humaine.The compounds of the invention indeed have particularly advantageous antitumor properties which can be used in human therapy.
»"
Ces dérivés de la Vinblastine peuvent être , en particulier, utilisés pour . 10 le traitement des leucémies, de gliomes, de lymphosarcomes ou d'autres tumeurs malignes, y compris les tumeurs dites ''solides".These Vinblastine derivatives can, in particular, be used for. 10 the treatment of leukemias, gliomas, lymphosarcomas or other malignant tumors, including so-called "solid" tumors.
En thérapeutique humaine , ils sont ainsi utilisés pour le traitement de la maladie de Hodgkin et pour d'autres tumeurs pouvant bénéficier d'un traitement avec la Vinblastine, la vincristine ou la vindésine.In human therapy, they are thus used for the treatment of Hodgkin's disease and for other tumors which may benefit from treatment with Vinblastine, vincristine or vindesine.
Pour leur application thérapeutique, les composés de l'invention, éventuellement sous forme lyophilisée, sont de préférence administrés par voie parentérale, dissous dans un solvant pharmaceutiquement 20 acceptable. Parmi les sels d'addition, on préférera, les sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables, tels que les sels d'acides minéraux comme l'acide chlorhydrique, l'acide phosphorique et l'acide sulfurique ou d'acides organiques comme l'acide acétique, propionique, succinique, tartrique, oxalique, méthanesulfonïque ou benzènesulfonique. 25 L'eau physiologique ou d'autres solutions salines tamponnées, par exemple avec un phosphate, sont des solvants appropriés.For their therapeutic application, the compounds of the invention, optionally in lyophilized form, are preferably administered parenterally, dissolved in a pharmaceutically acceptable solvent. Among the addition salts, non-toxic pharmaceutically acceptable salts, such as the salts of mineral acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid and sulfuric acid or organic acids such as acetic acid, will be preferred. , propionic, succinic, tartaric, oxalic, methanesulfonic or benzenesulfonic. Physiological water or other saline solutions buffered, for example with phosphate, are suitable solvents.
• r, , La substance active est généralement administrée à une posologie pouvant 20 varier de 50 mg à plusieurs grammes . Les composés de l'invention peuvent en outre être utilisés en combinaison avec d'autres agents anti-tumoraux.• r,, The active substance is generally administered in a dosage which can vary from 50 mg to several grams. The compounds of the invention can also be used in combination with other anti-tumor agents.
L'exemple suivant illustre de manière non limitative le procédé conduisant 35 aux composés de l'invention.The following example illustrates, without limitation, the process leading to the compounds of the invention.
K__K__
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Exemple t a) Couplage en 04 de la O-4-désacétyl-vindésine L'alpha-chloroacétate en 04 de la 0-4 désacétyl-vindésine radioactive 5 (150 mg), dissous dans 5 mL de dioxanne est ajouté goutte à goutte à une solution de 216 mg de BSA (albumine de sérum bovin, Cal Biochem) dans 5 mL de tampon borate 0,4 M pH 9,0. Le mélange est ajouté à * température ambiante pendant 48 h. Le conjugué est précipité par addition de 6 volumes d'acétone et centrifugé 30 min à 1300 rpm. Le 10 précipité est lavé 2 fois dans l'acétone et centrifugé dans les mêmes conditions. Après ces deux rinçages le précipité est lyophilisé et purifié par filtration sur gel G-25 (3x90 cm) équilibré dans une solution de NH^HCO^ 0,1 M pH 7,8. Le pic exclu est récupéré et lyophilisé. Le contenu en protéine est mesuré par la technique de Lowry et le contenu * 15 en alcaloïde estimé par mesure de la radioactivité. Le conjugué obtenu contient 2,5 moles de vindésine par mole de BSA. Par chromatographie 1 sur gel d’agarose on démontre que la radioactivité est bien associée aux protéines.Example ta) Coupling in 04 of O-4-deacetyl-vindesin The alpha-chloroacetate in 04 of radioactive 0-4 deacetyl-vindesin 5 (150 mg), dissolved in 5 ml of dioxane is added dropwise to a solution of 216 mg of BSA (bovine serum albumin, Cal Biochem) in 5 ml of 0.4 M borate buffer pH 9.0. The mixture is added at * room temperature for 48 h. The conjugate is precipitated by adding 6 volumes of acetone and centrifuged 30 min at 1300 rpm. The precipitate is washed twice in acetone and centrifuged under the same conditions. After these two rinses the precipitate is lyophilized and purified by filtration on a G-25 gel (3 × 90 cm) equilibrated in a solution of 0.1 M NH 2 HCO 4 pH 7.8. The excluded peak is recovered and lyophilized. The protein content is measured by the Lowry technique and the alkaloid content * 15 estimated by measurement of the radioactivity. The conjugate obtained contains 2.5 moles of vindesine per mole of BSA. By chromatography 1 on agarose gel, it is demonstrated that radioactivity is well associated with proteins.
20 b) Succinylation -B) Succinylation -
Le conjugué est dissous dans l'eau à une concentration de 100 mg/5ml ^0 et le pH de la solution porté à 7 avec une solution de NaOH 0,1 N.The conjugate is dissolved in water at a concentration of 100 mg / 5 ml ^ 0 and the pH of the solution brought to 7 with a 0.1 N NaOH solution.
55 mg d'anhydride succinique sont alors ajoutés par petites fractions.55 mg of succinic anhydride are then added in small portions.
25 Le pH est maintenu à 7 par addition de NaOH 0,1 N. Lorsque le pH25 The pH is maintained at 7 by adding 0.1 N NaOH. When the pH
est stabilisé on ajoute encore 55 mg d'anhydride succinique. La solution 1 est agitée 1 h à température ambiante, dialysée à l'eau à 0°C pendant une nuit et lyophilisée. Les contenus en protéines et en alcaloïdes sont e estimés selon les techniques décrites en a).is stabilized, another 55 mg of succinic anhydride is added. Solution 1 is stirred for 1 h at room temperature, dialyzed with water at 0 ° C overnight and lyophilized. The protein and alkaloid contents are estimated using the techniques described in a).
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UU
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