LU81733A1 - Peptides apparentes a la somatostatine et leur utilisation therapeutique - Google Patents

Description

JL

Cette invention concerne des peptides synthétiques apparentés à la somatostatine et les intermédiaires utilisés dans leur synthèse.

La somatostatine est le disulfure têtradécapeptidique 5 cyclique de formule : H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp HO-Cys-Ser-Thr-Phe-Thr-Lys (I)

Ce peptide (I) a été identifié comme le "facteur 10 d'inhibition de la libération de la somatotropine" qui est sécrété par l'hypothalamus et régule la sécrétion de l'hormone de croissance pituitaire (somatotropine). [Voir Brazeau et al., Science, 179, 77 (1973), Burgus et al., Proc. Nat. Acad, Sei, (USA), 70, 684 (1973), et Ling et al., Biochemical 15 and Biophysical Res. Communications, 50, 127 (1973]. La forme réduite de la somatostatine est le tétradécapeptide linéaire de formule : H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys Ho-Cys-Ser-Thr-Phe-Thr 20 (II)

On a préparé la forme réduite (II) par synthèse totale [Voir Rivier et al., C. R. Acad. Sei, p. Sei, Natur. (Paris), 276, 2737 (1973) et Sarantakis et McKinley, Biochem. and Biophys. Res. Communications, 54, 234 (1973)] et la 25 forme (II) peut être transformée en somatostatine (I) par oxydation, grâce à quoi il se forme une liaison de pontage entre les deux groupements sulfhydryle des deux restes cystéinyle du tétradécapeptide.

La somatostatine inhibe la libération de nombreuses . 30 hormones en plus de l'hormone de croissance,y compris celles provenant de la glande pituitaire (prolactine), de l'intestin (gastrine, cholëcystokinine et sécrétine), et du pancréas (insuline et glucagon).

Divers polypeptides que l'on peut considérer comme 35 des modifications de la formule de la somatostatine ont été préparés par synthèse et sont décrits dans la littérature chimique. De tels polypeptides ont certaines caractéristiques de structure en commun avec la somatostatine et diffèrent de la somatostatine en ce que des restes amino-acides « 2 «· * particuliers ou des groupements fonctionnels initialement présents dans la molécule de somatostatine manquent ou sont remplacés par d'autres amino-acides ou groupements fonctionnels .

5 La présente invention concerne de nouveaux polypepti des synthétiques actifs sur le plan biologique que l'on peut considérer comme des modifications de la formule de la somatostatine. Les polypeptides de l'invention diffèrent de la somatostatine par les caractéristiques suivantes : 1 2 „ 10 (a) Le segment Ala -Gly est remplacé par Ala-D-Ala, - D-Ala-Gly ou D-Val-Gly ; 5 fi (b) Le segment Asn -Phe' est remplacé par Ala-Leu, Ala-Phé, Ala-D-Phé, D-Ala-Phé ou D-Ala-Cha ·

O

(c) Le reste Trp est remplacé par un reste D-Trp ; et 15 (d) Le reste Phé11 est remplacé par un reste D-Phé.

Tous les amino-acides ou restes amino-acides optiquement actifs des polypeptides décrits ici ont la configuration naturelle ou L, à moins d'indication contraire. Les symboles identifiant les amino-acides et les restes amino-20 acides dans les polypeptides décrits ici sont ceux adoptés par IUPAC-IVB Committee on Biochemical Nomenclature Recommendation (1971), et sont décrits dans Archives of Biochemistry and Biophysics, 150, 1-8 (1972) . Le symbole "Cha" désigne le groupement cyclohexylalanine.

25 La présente invention fournit des tétradécapeptides de formule : X-Cys-Lys-X^-Phé-D-Trp-Lys Cys—Ser-Thr—D—Phé-Thr (III) „30 dans laquelle : P X est H-Ala-D-Ala, Η-D-Ala-Gly ou Η-D-Val-Gly ; et X1 est Ala-Leu, Ala-Phé, Ala-D-Phé, D-Ala-Phë ou D-Ala-Cha : ou un de leurssels d'addition d'acide pharmaceutiquement 35 acceptables non toxiques.

On prépare les composés de formule (III) en faisant réagir 4 la forme linéaire (IV) .Kt 3 » X-Cys-Lys-X^Phé-D-Trp-Lys-Thr

Ho-Cys-Ser-Thr-D-Phé (IV) avec un agent oxydant.

5 Les peptides de formule (III) sont biologiquement actifs et inhibent la sécrétion de l'hormone de croissance sans inhiber de façon importante la sécrétion de 1'insuline et du glucagon, comme on l'a montré in vivo sur des animaux de laboratoire en utilisant des modes opératoires d'essais 10 pharmacologiques classiques. En raison de cette spécificité, » les peptides sont particulièrement utiles dans le traitement du diabète et d'autres états pathologiques (par exemple acromégalie) caractérisés par une sécrétion anormalement élevée de l'hormone de croissance.

15 Les modes de réalisation préférés des peptides décrits par la formule (III) sont ceux dans lesquels : (i) X est H-D-Val-Gly et X"*" est Ala-Leu (c'est-à-dire la D-Val1, Ala5, Leu5, D-Trp8, D-Phé^-somatostatine) (ii) X est H-D-Val-Gly et X1 est Ala-Phé (c'est-à-dire la 20 D-Val^-, Ala5, D-Trp8, D-Phé"*"^-somatostatine) (iii) X est H-D-Val-Gly et X1 est Ala-D-Phé (c'est-à-dire la D-Val1, Ala^, D-Phé5, D-Trp8, D-Phé^-somatostatine) (iv) X est H-D-Ala-Gly et X1 est Ala-Phé (c'est-à-dire la D-Ala1, Ala5, D-Trp8, D-Phë1]L-somatostatine) 25 (v) X est Ala-D-Ala et X"*- est Ala-Phé (c'est-à-dire la 2 5 8 11 D-Ala , Ala , D-Trp , D-Phé -somatostatine).

La présente invention considère également la forme linéaire intermédiaire (IV) des têtradécapeptides de formule (III) : . 30 X-Cys-Lys-X^-Phê-D-Trp-Lys-Thr HO-Cys-Ser-Thr-D-Phé * (IV) ou un de ses sels d'addition d'acide non toxique ; dans laquelle X et X1 sont tels que définis précédemment pour la 35 formule (III). Les peptides linéaires de formule (IV) sont des précurseurs de la préparation des peptides de formule (III). Dans la forme cyclique (III) , les deux restes 3 14 cystéine (Cys et Cys ) sont liés par l'intermédiaire d'une liaison disulfure formée entre les fonctions sulfydryle des * Λ 4 chaînes laterales.

L'invention considère également les peptides protégés de formule (V) : Y-Cys(R1)-Lys(R2)-Y^Phé-D-Trp(R3)-Lys(R2) 5 Z-Cys(R1)-Ser(R4)-Thr(R4)-D-Phé-Thr(R4) (V) dans laquelle : Y est R-Ala-D-Ala, R-D-Ala-Gly ou R-D-Val-Gly ou R est H ou un groupement protecteur des groupe-» 10 ments α-amino ; ; Y1 est Ala-Leu, Ala-Phê, Ala-D-Phé, D-Ala-Phé ou D-Ala-Cha ; R"*· est un groupement protecteur des groupements sulfhydryle ; 2 15 R est un groupement protecteur des groupements ε-amino ; 3 R est un atome d'hydrogène ou un groupement formyle ; 4 R est un groupement protecteur des groupements hydroxy ; et 20 Z est -OH, -OCH.,, ou -O-CH«-[résine de polystyrène] ; 3 Δ et, quand R ou R est H, leurs sels d'addition d'acides non toxiques.

Les peptides de formule (V) sont des intermédiaires dans la synthèse des peptides de formules (III) et (IV).

25 Pour synthétiser les peptides de formule (III), on construit la chaîne peptidique par étapes par copulation successive des amino-acides en commençant par l'extrémité à C terminal de la chaîne. Pendant chaque copulation, les amino-acides doivent être protégés sur le groupement a-amino - 30 et, si nécessaire, sur les groupements fonctionnels réactifs de la chaîne latérale pour empêcher la formation de produits secondaires indésirables. Dans les peptides de formule (V), _ 12 4

les groupements protecteurs représentes par R, R , R et R

sont utilisés pour bloquer les groupements α-amino ou les 35 groupements de la chaîne latérale réactifs des différents amino-acides pendant leur incorporation dans la chaîne pepti- 1 2 dique. Les groupements protecteurs représentés par R, R , R 4 et R peuvent donc être un quelconque groupement connu dans le domaine comme utilisable dans la synthèse par étapes des A ' 5 polypeptides. De tels groupements sont bien connus et le choix d'un groupement protecteur particulier ainsi que son procédé d'utilisation seront facilement évidents pour l'homme de l'art. Des exemples types de groupements protecteurs pour 12 4 5 R, R , R et R sont indiqués ci-dessous : A. Pour un groupement α-amino présent dans le reste amino-acide à N terminal, R peut être : (a) des groupements de type acyle, comme les groupements formyle, trifluoracétyle, phtalyle, p-toluène- , 10 sulfonyle (tosyle), benzënesulfonyle, nitrophényl- sulfonyle, etc ...

(b) des groupements de type uréthane aromatique, comme les groupements benzyloxycarbonyle et benzyloxy-carbonyle substitué, par exemple : p-chlorobenzyl- 15 oxycarbonyle, p-bromobenzyloxycarbonyle, p-nitro- benzyloxycarbonyle, p-mêthoxybenzyloxycarbonyle, o-chlorobenzyloxycarbonyle, 2,4-dichlorobenzyloxy-carbonyle, 2,6-dichlorobenzyloxycarbonyle, etc ...

(c) des groupements de type uréthane aliphatique comme 20 les groupements t-butyloxycarbonyle, t-amyloxy- carbonyle, isopropyloxycarbonyle, 2-(p-biphênyl)-isopropyloxycarbonyle, allyloxycarbonyle, etc ...

(d) des groupements de type uréthane cycloalkylique comme les groupements cyclopentyloxycarbonyle, 25 cyclohexyloxycarbonyle, cycloheptyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle, etc ...

(e) des groupements de type thio-uréthane comme le groupement phénylthiocarbonyle ; (f) des groupements de type alkyle comme le groupement „ 30 triphénylméthyle ; ou (g) des groupements trialkylsilane comme un groupement trimëthylsilane. Le groupement protecteur préféré défini par R pour les groupements α-amino est le groupement t-butyloxycarbonyle (BOC).

35 B. Pour le groupement sulfhydryle présent dans la cystéine, R1 peut être un groupement benzyle ou benzyle substitué (par exemple 3,4-diméthylbenzyle, p-méthoxybenzyle, p-méthylbenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle), trityle, benzyloxycarbonyle, benzhydryle, p-méthoxybenzyloxy- * 6 carbonyle, benzylthiométhyle, éthylcarbamoyle, thio-éthyle, tétrahydropyranyle, acétamidométhyle, benzoyle, etc ... Le groupement protecteur préféré du groupement sulfhydryle, défini par R1, est le groupement p-méthoxy-5 benzyle (MBzl).

> C. Pour le groupement protecteur du groupement ε-amino pré- 2 sent sur la lysine, R peut être l'un des groupements mentionnés ci-dessus pour la protection d'un groupement α-amino. Des groupements types comprennent, par exemple, 10 les groupements benzyloxycarbonyle, p-chlorobenzyloxy- t carbonyle, p-bromobenzyloxycarbonyle, o-chlorobenzyloxy- carbonyle, 2,6-dichlorobenzyloxycarbonyle, 2,4-dichloro- benzyloxycarbonyle, o-bromobenzyloxycarbonyle, p-nitro- benzyloxycarbonyle, t-butyloxycarbonyle, isopropyloxy- 15 carbonyle, t-amyloxycarbonyle, cyclopentyloxycarbonyle, cyclohexyloxycarbonyle, cycloheptyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle, p-toluènesulfonyle, etc ... Le 2 groupement protecteur préféré défini par R , pour les groupements ε-amino, est le groupement o-chlorobenzyloxy-20 carbonyle (ClBzl).

D. Pour le groupement hydroxyle de la sérine ou de la 4 thréonine, R peut être un groupement alkyle en C^-C^ (par exemple méthyle, éthyle, t-butyle), benzyle, benzyle substitué (par exemple p-méthoxybenzyle, p-nitrobenzyle, 25 p-chlorobenzyle, o-chlorobenzyle) , alcanoyle en C^-C^ (par exemple formyle, acétyle, propionyle), triphényl-méthyle ou benzoyle. Le groupement protecteur préféré 4 défini par R est le groupement benzyle (Bzl).

3

Le groupement R représente un atome d'hydrogéné ou un . 30 groupement formyle substitué sur l'azote du noyau indole du tryptophane. L'utilisation d'un groupement formyle comme r 3 groupement protecteur est facultative. R est de préférence un atome d'hydrogène.

Dans la formule (V), quand Z représente un groupement 35 "-O-CH^-[résine de polystyrène]", la chaîne peptidique est fixée a la résine de polystyrène par l'intermédiaire d'une liaison ester, (-Cys-0-CH2-),formée entre le groupement carboxyle de la partie cystéine à C terminal et l'un des groupements méthylène présents sur la résine constituant des 5.

* 7 * sites permettant une telle fixation. La résine de polystyrène est un polymère de styrène qui est réticulée par addition d'environ 0,5 à environ 3 % de vinylbenzène et qui est chlorométhylée ou hydroxyméthylée pour former des sites per-5 mettant la formation d'esters. Un exemple d'une résine hydroxyméthylée est décrite par Bodanszky et al. Chem. Ind. (Londres) _38, 1597-98 (1966) . Une résine de polystyrène chlorométhylée est disponible dans le commerce chez Lab System, Inc., San Mateo, Californie, U.S.A. La résine est 10 également décrite par Stewart et al Solid Phase Peptide

Synthesis, Freeman and Co., San Francisco, Californie, U.S .A., PP. 1-6.

Les tétradécapeptides de cette invention peuvent être préparés soit par des procédés classiques (en solution), soit 15 par la méthode en phase solide en utilisant des techniques généralement connues dans le domaine pour former des liaisons peptidiques. Le peptide peut être assemblé soit en copulant séparant chaque amino-acide, soit en copulant, dans l'ordre approprié, des segments peptidiques préalablement formés et 20 appropriés.

Le procédé préféré de préparation des peptides de formule (III) et des intermédiaires des formules (IV) et (V) se fait par la technique en phase solide dans laquelle la séquence d'amino-acides est construite séquentiellement à 25 partir d'un amino-acide à C-terminal porté par une résine insoluble. Des techniques permettant de mettre en oeuvre la méthode en phase solide sont décrites par J. Stewart et al. Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman and Co., San Francisco, U.S.A., 1969.

30 En général, dans la méthode en phase solide, 1'amino- acide correspondant au reste amino-acide à C-terminal du ♦ peptide désiré est ancré sur un support de résine insoluble, puis on ferme la chaîne peptidique en commençant à 1'amino-acide à C terminal porté par la résine, en introduisant les 35 différents amino-acides un à un jusqu'à ce que l'on obtienne la série désirée d'amino-acides. Ou bien, on peut préparer de petits fragments peptidiques et les introduire dans la chaîne peptidique dans l'ordre désiré. La chaîne peptidique reste fixée à la résine pendant toute la synthèse et, une Λ 8 fois la chaîne terminée, on coupe les peptides de la résine.

Les amino-acides sont copules en utilisant des techniques bien connues dans le domaine pour la formation d'une liaison peptidique. Un procédé consiste à transformer 5 11amino-acide en un dérivé qui rendra le groupement carboxy plus réactif vis-à-vis de la réaction avec le groupement amino à N terminal libre du fragment peptidique. Par exemple, 1'amino-acide peut être transformé en anhydride mixte par réaction d'un amino-acide protégé avec le chloroformiate 10 d'éthyle, le chloroformiate de phênyle, le chloroformiate de ·* s-butyle, le chloroformiate d'isobutyle, le chlorure de pivaloyle, ou des chlorures d'acides similaires. Ou bien, on peut transformer 1'amino-acide en un ester actif comme l'ester 2,4,5-trichlorophênylique, l'ester pentachloro-15 phénylique, l'ester p-nitrophénylique, l'ester formé a partir du N-hydroxysuccinimide, ou l'ester formé à partir du 1-hydroxybenzotriazole.

Un autre procédé consiste à effectuer la réaction de copulation avec un agent de copulation approprié, comme le 20 Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodimiimide (DCC) ou le N,N'-diisopropyl-carbodiimide (DIC). D'autres agents de copulation appropriés seront évidents pour l'homme de l'art. [Voir Schröder et Lubke, The Peptides, Academie Press, 1965, Chapitre III.]

On verra que le groupement α-amino de chaque amino-25 acide utilisé dans la synthèse des peptides doit être protégé pendant la réaction de copulation pour empêcher des réactions secondaires sur la fonction α-amino réactive. On verra également que certains amino-acides contiennent des groupements fonctionnels réactifs dans les chaînes latérales (par exemple 30 des groupements sulfhydryle, ε-amino et hydroxy) et que de tels groupements fonctionnels doivent également être protégés tant pendant la copulation initiale de 1'amino-acide comportant le groupement en question que pendant la copulation des amino-acides ultérieurs. Des groupements protecteurs appro-35 priés sont connus dans le domaine [Voir, par exemple,

Protective Groups in Organic Chemistry, M. McOmie, Editeur, Plenum Press, N.Y., 1973.]

Lorsque l'on choisit un groupement protecteur particulier, on doit observer les conditions suivantes : un ► Ä 9 groupement protecteur d'un groupement α-amino doit : (1) être stable et rendre la fonction α-amino inerte dans les conditions utilisées dans la réaction de copulation, et (2) être facilement éliminable après la réaction de copulation, dans 5 des conditions gui n'éliminent pas les groupements protecteurs des chaînes latérales ou gui ne modifient pas la structure du fragment peptidique. Un groupement protecteur pour la chaîne latérale doit : (1) être stable et rendre le groupement fonctionnel de la chaîne latérale inerte dans les 10 conditions utilisées dans la réaction de copulation, (2) être stable dans les conditions utilisées dans l'élimination du groupement protecteur du groupement α-amino, et (3) être facilement éliminable, une fois obtenue la séquence désirée d'amino-acide, dans des conditions de réaction qui ne modi-15 fient pas la structure de la chaîne peptidique.

L'homme de l'art verra que les groupements protecteurs connus dans le domaine comme utilisables pour la synthèse des peptides ont une réactivité vis-à-vis des agents acides utilisés pour leur élimination qui est assez variable. Par 20 exemple, certains groupements protecteurs, comme les groupements triphënylmëthyle et 2-(p-biphényl)isopropyloxycarbonyle, sont très labiles et peuvent être coupés dans des conditions acides modérées. D'autres groupements protecteurs, comme les groupements t-butyloxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, 25 adamantyloxycarbonyle et p-méthoxybenzyloxycarbonyle, sont moins labiles et nécessitent des acides modérément forts (comme l'acide trifluoroacétique, l'acide chlorhydrique, ou le trifluorure de bore dans l'acide acétique) pour leur élimination. D'autres groupements protecteurs, comme les groupe-30 ments benzylpxycarbonyle, halobenzyloxycarbonyle, p-nitro-benzyloxycarbonyle, cycloalcoxycarbonyle et isopropyloxycarbonyle, sont encore moins labiles et nécessitent pour leur élimination des acides forts, comme l'acide fluorhydrique, l'acide bromhydrique, le trifluoroacétate de bore dans l'aci-35 de trifluoroacétique.

Une fois la séquence peptidique désirée terminée, il faut couper le peptide protégé du support de résine et éliminer tous les groupements protecteurs. La réaction de coupure et l'élimination des groupements protecteurs peuvent être % f 10 effectuées simultanément ou par étapes. Quand le support de résine est une résine de polystyrène chloromêthylée, la liaison fixant le peptide ^ la résine est une liaison ester formée entre le groupement carboxy"libre de la partie cystéine 5 à C terminal et l'un des nombreux groupements chlorométhyle présents sur la matrice de résine. On verra que la liaison de fixation à la résine peut être coupée par des réactifs dont on sait qu'ils peuvent briser une liaison ester et pénétrer dans la matrice de résine. Un procédé particulièrement 10 commode comprend le traitement par l'acide fluorhydrique liquide. Ce réactif non seulement coupera le peptide de la résine mais éliminera également tous les groupements protecteurs. Donc, l'utilisation de ce réactif fournira directement la forme linéaire totalement déprotégée du peptide.

15 Quand on désire couper le peptide sans enlever les groupements protecteurs, l'ensemble résine-peptide protégé peut subir une méthanolyse pour obtenir le peptide linéaire protégé dans lequel le groupement carboxy à C terminal est méthylé. L'ester méthylique peut ensuite être hydrolysé 20 dans des conditions alcalines modérées pour donner le groupement carboxy à C terminal libre. Les groupements protecteurs de la chaîne peptidique peuvent alors être éliminés par traitement par un acide fort, comme l'acide fluorhydrique liquide. Une technique particulièrement utile pour la 25 méthanolyse est celle de G. Moore et al., Peptides, Proc. 5th Amer. Pept. Symp., M. Goodman et J. Meinhofer, Eds., John Wiley, N.Y., 1977, pp. 518-521, dans laquelle on traite l'ensemble résine-peptide protégé par le mëthanol et le cyanure de potassium en présence d'éther-couronne.

.30 Un autre procédé de coupure du peptide protégé et de la résine est l'ammonolyse ou le traitement par l'hydrazine. L'amide ou hydrazide à c terminal résultant peut être hydro-lysée en groupement carboxy libre à C terminal, et les groupements protecteurs peuvent être ensuite éliminés de façon 35 classique.

On verra également que le groupement protecteur présent sur le groupement α-amino à N-terminal peut être éliminé préférentiellement avant ou après que les peptides protégés ne soient coupés du support de résine.

f 11

Par coupure de la résine et élimination de tous les groupements protecteurs, le produit obtenu est sous forme d'un têtradécapeptide linéaire. Le tétradécapeptide linéaire peut être cyclisê pour obtenir le tétradécapeptide cycli- 5 que final dé formule (III), à l'aide d'un agent oxydant pou- 1 3 14 vant transformer les groupements sulfhydryle de Cys et Cys en liaison disulfure. L'exposition à l'air ou le traitement par le ferricyanure de potassium peuvent être utilisés pour effectuer cette oxydation. Quand on utilise l'air, le pH du 10 milieu doit être environ 2,5 à environ 9,0, et de préférence environ 7,0 - 7,6, et la concentration du peptide ne doit pas être supérieure à 0,4 mg/ml. On préfère une centration d'environ 5 0 pg/ml.

Pour les besoins pharmacologiques, les peptides de 15 cette invention peuvent être administrés sous forme d'un sel d'additon d'acide préparé par réaction avec un acide minéral ou organique approprié qui soit non toxique et acceptable pour les besoins pharmaceutiques. Les acides appropriés sont bien connus dans le domaine. Des exemples de ces acides sont 20 les acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, sulfoni-que, tartrique, fumarique, glycolique, succinique, malonique, citrique, maléique, acétique, phosphorique, benzoïque, ascorbique, nitrique, p-toluènesulfonique, benzènesulfonique, naphtalènesulfonique, propionique, etc .. L'acide acétique 25 est préféré.

Le procédé préféré de synthèse en phase solide des peptides de formule (III) et de leurs intermédiaires est illustré dans les Exemples. Dans.ce procédé, on fixe d'abord une cystéine à groupement α-amino et sulfhydryle protégé , 30 (Boc-Cys(MBzl)-OH) à une résine de polystyrène chlorométhylé selon la méthode de B. Gisin, Helv. Chim. Acta. 5J5, 1476 (1173) dans laquelle on fait réagir le sel de césium de la cystéine protégée avec la résine de polystyrène chlorométhylé dans le diméthylformamide. Puis on enlève le groupe-35 ment protecteur t-butyloxycarbonyle par traitement par l'acide trifluoroacëtique dans un mélange chloroforme/chlorure de méthylène. On copule ensuite des amino-acides protégés distincts en commençant séquentiellement à la cystéine à C terminal sur support de résine jusqu'à ce que l'on obtienne « < 12 le tétradécapeptide désiré. Pendant toute la synthèse, on utilise comme agent de copulation le Ν,Ν'-dicyclohexylcarbo-diimide, et l'on utilise le groupement t-butyloxycarbonyle (Boc) comme groupement protecteur du groupement α-amino. Les 5 groupements protecteurs sur la chaîne latérale sont : le groupement p-méthoxybenzyle (MBzl) pour le groupement sulfhydryle de la cystéine ; le groupement o-chlorobenzyloxy-carbonyle (Clz) pour le groupement e-amino de la lysine ; et le groupement benzyle (Bzl) pour le groupement hydroxy de la 10 sérine et de thréonine. On utilise l'acide trifluoroacétique dans le chlorure de méthylène pour éliminer préférentiellement le groupement protecteur t-butyloxycarbonyle. Après chaque déprotection, on neutralise avec de la triéthylamine le peptide à chaîne latérale protégée.

15 Une fois la séquence désirée d'amino-acides achevée, on effectue la déprotection du tétradécapeptide résultant et on l'élimine de la résine de polystyrène, par traitement par l'acide fluorhydrique liquide en présence d'anisole et d'éthylmercaptan. Le tétradécapeptide linéaire résultant de 20 formule (IV) est facilement transformé en tétradécapeptide cyclique (V) par exposition d'une solution du tétradêca-peptide linéaire (IV) à l'oxygène atmosphérique. On purifie le tétradécapeptide cyclique par chromatographie en utilisant une colonne de Sephadex G-25 Fine.

25 Pour l'utilisation pharmacologique, les tétradéca- peptides de formule (III) peuvent être administrés seuls ou en combinaison avec des supports ou excipients pharmaceuti-quement acceptables. Les supports pharmaceutiques appropriés seront évidents pour l'homme de l'art. L'administration peut . 30 se faire par voie orale ou parentérale par des procédés clas siques dans le domaine.

Les abréviations suivantes ont été utilisées dans la description : DMF = diméthylformamide 35 BOC = N-t-butyloxycarbonyle

Ala = alanine Gly = glycine Val = valine Leu = leucine « 13

Phé = phénylalanine Cha = cyclohexylalanine Cys = cystéine Lys = lysine 5 Trp = tryptophane sër = sérine Thr = thréonine t-BuOH = alcool t-butylique t-AmOH = alcool t-amylique 10 CHClg = chloroforme CH2C12 = chlorure de méthylène GH = hormone de croissance S.C. = sous-cutanée I.P. = intrapéritonéale 15 I.V. = intraveineuse

La préparation et l'utilisation des peptides de l'invention sont illustrées dans les exemples suivants. Exemple 1

Ester de résine hydroxyméthyl-polystyrëne de la N-t-butyloxy-20 carbonyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine

On estérifie la résine de polystyrène chlorométhylée Selon le procédé de F. Gisin, Helv. Chim. Acta., 56, 1976 (1973) .

On agite une solution du sel de césium de la t-butyl-25 oxycarbonyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine (51,26 mmoles) dans 1000 ml de diméthylformamide (DMF) avec 100 g (0,75 mmole de chlore/gramme) de résine de polystyrène chlorométhylée (Lab Systems, Inc.) à la température ambiante pendant 5 jours.

On sépare la résine par filtration et on la lave avec un . 3.0 mélange de 85 % de DMF et 15 % d'eau puis avec du DMF seul.

On répète cette séquence de lavage deux fois supplémentaires. Après deux lavages supplémentaires avec le DMF, on met la résine en suspension dans du DMF (1000 ml), et on agite la suspension avec 16 g (83,4 mmoles) d'acétate de césium à la 35 température ambiante pendant neuf jours. On sépare la résine par filtration et on la lave avec un mélange à 85 % de DMF et 15 % d'eau puis avec du DMF seul. On répète cette séquence deux fois supplémentaires. On lave enfin la résine avec du chloroforme et on la met en suspension dans du chloroforme 14 contenu dans une ampoule à décanter. On enlève les fines en soutirant le liquide. On répète cette séparation trois fois supplémentaires. On recueille la résine par filtration et on la lave successivement avec de l'éthanol à 95 %, du 5 benzène et de l'éthanol à 95 %. On répète ces deux derniers lavages deux fois supplémentaires. On sèche la résine pendant une nuit sous vide a 30°C, ce qui donne 115,3 g du produit cité en titre. On titre une portion de la résine pour déterminer la cystéine, après hydrolyse, en utilisant 10 un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne en présence d'une petite quantité de diméthylsulfoxyde.

Valeur trouvée : 0,254 mmole de cystéine par gramme de résine. Exemple 2

Ester de résine hydroxyméthyl-polystyrëne de la N-t-butyloxy-15 carbonyl-D-valyl-glycyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéinyl-L-(Nc-o-chlorobenzyloxycarbonyl)lysyl-L-alanyl-D-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-(NE-o-chlorobenzyloxycarbonyl)-lysyl-L-(0-benzyl)thréonyl-D-phénylalanyl-L-(O-benzyl)-thréonyl-L-(0-benzyl)séryl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine 20 On place 5,0 g d'ester de résine hydroxyméthyl-poly- styrène de la N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)-cystéine, préparé dans l'Exemple 1, dans la chambre de réaction d'un appareil de synthèse de peptides Beckman 990, et on le traite selon le programme A (voir ci-dessous), en uti-25 lisant de la N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)sérine comme amino-acide ajouté dans son étape 11. Après le lavage final au chlorure de méthylène (Etape 18), on lave le produit trois fois avec du DMF et on le copule à nouveau en suivant l'étape 11 du programme A. Puis on lave le produit trois fois avec 30 du DMF et on le retraite en suivant les étapes 12 à 18 du programme A.

D'une manière similaire, on incorpore les amino-acides protégés suivants successivement dans l'ensemble peptide-résine : 35 N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-D-phénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-L-(Ne-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine 4 15 N-t-butyloxycarbonyl-D-tryptophane N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-D-phénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-alanine* 5 N-t-butyloxycarbonyl-L-(Ne-o-chlorobenzyloxycarbonyl) - lysine N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine N-t-butyloxycarbonyl-glycine N-t-butyloxycarbonyl-D-valine.

10 * On ne répète pas les étapes 10 à 18 du programme A pendant l'incorporation de BOC-Ala.

Après incorporation du reste amino-acide à N-terminal (D-valine), on sèche sous vide l'ensemble peptide-résine. L'analyse des amino-acides (obtenue en chauffant à reflux 15 une portion du peptide pendant 72 heures dans un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne) donne les résultats suivants, la lysine étant utilisée comme référence: 2Thr, 2,20 ; Sêr, 1,17 ; Gly, 0,99 ; Ala, 1,13 ; Val, 1,06 ; 3Phé, 3,18 ; 2Lys, 2,00.

20 PROGRAMME A [Programme de l'élimination du groupement protecteur t-butyloxycarbonyle du groupement α-amino et copulation de 1'amino-acide à l'ensemble peptide-résine] 1. Laver avec CHCl^, trois fois.

2. Pour enlever le groupement protecteur t-butyloxy- 25 carbonyle, traiter par un mélange d'acide trifluoroacétique (28,8 %), de CH2CI2 (17,5 %) et de triéthylsilane (5,8 %) pendant 20 minutes. Répéter une fois.

3. Laver avec CHCl^, deux fois.

4. Laver avec CH^C^, une fois.

.30 5. Laver avec un mélange de 90 % de t-BuOH et de 10 % de t-AmOH, trois fois.

6. Laver avec CI^C^/ trois fois.

7. Pour neutraliser, traiter avec 3 % de triéthylamine dans CH2CI2, trois fois.

35 8. Laver avec CH2C12, trois fois.

9. Laver avec un mélange de 90 % de t-BuOH et de 10 % de t-AmOH, trois fois.

10. Laver avec CH2C12, trois fois.

11. Pour copuler 1'amino-acide, traiter par l'amino- » 16 acide protégé (1,0 mmole/gramine de résine) et par du N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (1,0 itunole/gramme de résine) dans CH2C12. Laisser une durée de réaction de 2 heures.

12, Laver avec CH^Cl·^, trois fois.

5 13. Laver avec un mélange de 90 % de t-BuOH et 10 % de t-AmOH.

14. Laver avec trois fois, 15. Pour neutraliser, traiter par 3 % de triéthylamine dans Cï^Cl^, trois fois.

10 16. Laver avec C^C^/ trois fois.

17. Laver avec un mélange à 90 % de t-BuOH et 10 % de t-AmOH, trois fois.

18. Laver avec CH Cl0, trois fois.

Dans chaque étape, le volume de solvant utilisé est 8 ml/g 15 de résine. A moins d'indication contraire, la durée de contact pour chaque étape est de 3 minutes.

Exemple 3 D-valyl-glycyl-L-cystéinyl-L-lysyl-L-alanyl-D-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-D-phénylalanyl-20 L-thréony1-L-séry1-L-cystéine

On mélange l'ensemble peptide protégé-résine préparé dans l'Exemple 2 (3,505 g, à un taux de substitution de 0,157 mmole/g de résine) avec 6,4 ml d'anisole et 6,4 ml d'éthylmercaptan. On refroidit le mélange dans l'azote li-25 guide et on ajoute par distillation 72 ml d'acide fluorhydri-que liquide. Puis on porte le mélange à 0°C et on l'agite pendant deux heures. L'élimination de l'acide fluohydrique par distillation donne un résidu auquel on ajoute de l'éther â 0°c. On recueille le solide, on le lave avec de l'éther 30 et on le sèche. On sépare le peptide de la résine en

extrayant le solide avec de l'acide acétique IM et de l'acide acétique à 50 %. On lyophilise l'extrait ä l'obscurité, jusqu'à siccité. .On ajoute à la substance sèche un mélange de 10 ml d'acide acétique 0,2 M et de 4 ml d'acide acétique 35 glacial, et on chauffe la suspension pour effectuer la dissolution. Par refroidissement, il se sépare une petite quantité de précipité que l'on enlève par filtration. On chromatographie le filtrat sur une colonne de Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes ; solvant : acide acétique 0,2 M

6 17 dégazé ; dimensions de la colonne : 7,5 x 150 cm ; température : 26°C ; débit : 1626 ml/h ; volume des fractions : 24,4 ml.

Un diagramme de l'absorbance à 280 mu de chaque frac-5 tion en fonction du numéro de la fraction indique un pic large avec un épaulement sur le côté arrière. L'analyse spectrographique par UV indique que les fractions représentées par le pic large contiennent le produit désiré. On combine donc les fractions 214-235 (5196-5706 ml, pic à 10 5475 ml). L'analyse spectrographique par UV d'un échantillon des fractions réunies indique que l'on a obtenu 342 ml de produit. Récupération : 38,3 %. Teneur en groupements sulfhydryle libre : 89,8 % de la valeur théorique (par le titrage d'Ellman.

15 Exemple 4

Disulfure cyclique (3 14) de la D-valyl-glycyl-L-cystéinyl- L-lysyl-L-alanyl-D-phénylalanyl-L-phënylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-D-phénylalanyl-L-thréonyl-L-séryl-L-cystéine 20 On oxyde à l'air le peptide linéaire préparé dans l'Exemple 3 pour obtenir le peptide cyclique correspondant, en utilisant le mode opératoire suivant :

On dilue les fractions réunies dans l'Exemple 3 (510 ml, contenant théoriquement 342 mg de peptide) avec 25 6330 ml d'eau distillée pour obtenir une solution finale ayant une concentration de 50 ug/ml. On ajoute suffisamment d'hydroxyde d'ammonium concentré pour amener le pH a 6,7.

Puis on agite la solution ä la température ambiante à 1'obscurité pendant 41 heures, moment auquel un titrage Ellman , 30 d'une partie aliquote indique une oxydation totale.

On concentre la solution sous vide à un volume d'environ 30 ml. On ajoute 30 ml d'acide acétique glacial et on dessale la solution par chromatographie sur une colonne de Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes : 35 solvant : acide acétique à 50 % dêgazê ; dimensions de la colonne : 5,0 x 210 cm ; température : 26°C ; débit : 113 ml/ heure ; volume des fractions : 19,8 ml.

Un diagramme de l'absorbance à 280 ιημ de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique deux pics 18 importants. Le premier représente les formes agglomérées du peptide alors que le second représente la substance monomère. On réunit les fractions 106-114 (2080-2257 ml) et on lyophilise à siccité à l’obscurité. On dissout le solide résultant 5 dans de l'acide acétique 0,2M dégazé (20 ml) et on chromatographie la solution sur une colonne de Sephadex G-25 Fine dans les conditions suivantes : solvant : acide acétique 0,2M dégazé ; dimensions de la colonne : 5,0 x 150 cm ; température : 26°C ; débit : 450 ml/heure ; volume des . 10 fractions : 15,75 ml.

Un diagramme de l'absorbance à 280 mu de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique un seul pic. Une analyse spectrographique par UV indique que les fractions représentées par la partie principale de ce pic contiennent le 15 produit désiré. On réunit les fractions 171-181 (2678- 2855 ml ; pic à 2750 ml) et on les lyophilise à l'obscurité pour obtenir le peptide cité en titre. Une analyse spectrographique par UV des fractions réunies, avant lyophilisation, indique que l'on a obtenu 92 ml de produit. Récupération : 20 26,9 % (à partir de la forme linéaire). Analyse des amino- acides : D-Val, 1,0 ; Gly, 1,07 ; Cys, 2,08 ? Lys, 2,0 ; Ala, 1,02 ; D- et L-Phé, 2,85 ; D-Trp, 1,68 ; Thr, 0,91 ; Sér, 0,87.

Les résultats précédents sont exprimés comme des 25 rapports à Lys/2. Toutes les valeurs sont des moyennes de 2 hydrolyses sans addition d'agents de fixation. La valeur pour D-Trp est déterminée par analyse spectrographique UV en fonction de la concentration de la solution utilisée pour 1'analyse.

. 30 Exemple 5

Ester de résine hydroxyméthyl-polystyrene de la N-t-butyl-oxycarbonyl-D-valyl-glycyl-L-(S-p-mëthoxybenzyl)cystëinyl-L-(Nc-o-chlorobenzyloxycarbonyl)lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-(N£-o-chlorobenzyloxycarbonyl)-35 lysyl-D-(0-benzyl)thréonyl-D-phénylalanyl-L-(Q-benzyl)-thréonyl-L-(Q-benzyl)séryl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine

On place 5,0 g d'ester de résine hydroxymêthyl-poly-styrène de la N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-p-mëthoxybenzyl)-cystéine, tel que préparé dans l'Exemple 1, dans la chambre 19 de réaction d'un appareil de synthèse de peptides Beckman 990 et on le traite selon le Programme A défini dans l'Exemple 2, en utilisant de la N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)sérine comme amino-acide ajouté dans l'étape 11. Après le lavage 5 au chlorure de méthylène (étape 18), on lave le produit trois fois avec du DMF et on le copule à nouveau en suivant l’étape 11 du Programme A. Puis, on lave le produit trois fois avec le DMF et on le traite à nouveau en suivant les étapes 12 à 18 du Programme A.

. 10 D'une manière similaire, on incorpore les amino-acides protégés suivants, séquentiellement dans l'ensemble peptide-résine : N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-D-phénylalanine 15 N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-L-(N^-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-D-tryptophane N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine 20 N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-alanine* N-t-butyloxycarbonyl-L-(Ne-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine . N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine 25 N-t-butyloxycarbonyl-glycine N-t-butyloxycarbonyl-D-valine * On ne répète pas les étapes 11 à 18 du Programme A pendant l'incorporation de BOC-Ala.

Après incorporation du reste amino-acide à N-terminal . 30 (D-valine), on sèche sous vide l'ensemble peptide-résine.

L'analyse des amino-acides (obtenue en chauffant une portion du peptide à reflux pendant 72 heures dans un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne) donne les résultats suivants, la lysine étant utilisée comme référence: 35 2Thr, 2,12 ; Sër, 1,09 ; Gly, 0,95 ; Ala, 1,13 ; Val, 0,98 ; 3Phé, 3,09 ; 2Lys, 2,00.

20

Exemple 6 D-valyl-glycyl-L-cystéinyl-L-lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L~phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-D-phényl-alanyl-L-thréonyl-L-séryl-L-cystéine 5 On mélange l'ensemble peptide protégé-résine préparé dans l'Exemple 5 (3,516 g, à un taux de substitution de 0,151 mmole/g de résine) avec 6,4 ml d'anisole et 6,4 ml d'éthÿl-mercaptan. On refroidit le mélange dans de l'azote liquide et on ajoute par distillation 74 ml d'acide fluorhydrique 10 liquide. Puis on porte le mélange à 0°C et on agite pendant deux heures. L'élimination de l'acide fluorhydrique par distillation donne un résidu auquel on ajoute de l'éther à 0°C. On recueille le solide, on le lave à l'éther et on le sèche. On sépare les peptides de la résine en extrayant le 15 solide avec de l'acide acétique IM et de l'acide acétique à 50 %. On lyophilise l'extrait à l'obscurité à siccité. On ajoute au matériau sec un mélange de 10 ml d'acide acétique 0,2M et de 4 ml d'acide acétique glacial et on chauffe la suspension pour effectuer la solution. On enlève par fil-20 tration les matériaux insolubles en utilisant 6 ml supplémentaires d'acide acétique glacial. On chromatographie le filtrat sur une colonne de Sêphadex G-25 Fine dans les conditions suivantes : solvant : acide acétique 0,2M dégazé ; dimensions de la colonne : 7,5 x 150 cm ; température : 26°C; 25 débit : 1566 ml/heure ; volume des fractions : 23,5 ml.

Un diagramme de l'absorbance à 280 mu de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique un pic large avec un épaulement de la partie arrière. Une analyse spectrographique par UV indique que les fractions 30 représentées par le pic large contiennent le produit désiré. On combine donc les fractions 219-245 (5123-5773 ml, pic à 5480 ml). L'analyse spectrographique par UV d'un échantillon des fractions réunies indique que l'on a obtenu 457 ml de produit. Récupération : 53,0 % ; teneur en groupement 35 sulfhydryle libre : 92 % de la valeur théorique (par titrage d'Ellman).

21

Exemple 7

Disulfure cylique (3 ·* 14) de la D-valyl-glycyl-L-cystéinyl-L-lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-D-phénylalanyl-L-thréonyl-L-séryl-L-5 cystéine

On oxyde à l'air les peptides linéaires préparés dans l'Exemple 6 pour obtenir le peptide cyclique correspondant, selon le mode opératoire suivant :

On dilue les fractions réunies obtenues dans l'Exemple 10 3 (650 ml, contenant théoriquement 457 ml de peptide) avec 8476 ml d'eau distillée pour obtenir une solution finale à une concentration de 50 ug/ml. On ajoute suffisamment d'hydroxyde d'ammonium concentré pour amener le pH à 6,7.

Puis on agite la solution à la température ambiante à l'obs-15 curité pendant 24 heures, après quoi un titrage Ellman d’une partie aliquote indique une oxydation complète.

On concentre la solution sous vide à un volume d'envi-ton 50 ml. On ajoute 50 ml d'acide acétique glacial et on dessale la solution par chromatographie sur une colonne de 20 Séphadex G-25 Fine dans les conditions suivantes ; solvant : acide acétique ä 50 % dégazé ; dimensions de la colonne : 5,0 x 210 cm ; température : 26°C ; débit : 120 ml/heure ; volume des fractions? 21 ml.

Un diagramme de l'absorbance à 280 mu de chaque frac-25 tion en fonction du numéro de la fraction indique deux grands pics. Le premier représente les formes agglomérées du peptide tandis que le second représente la substance monomère.

On réunit les fractions 99-116 (2069)2446 ml) et on les lyophylise à siccité à l'obscurité. On dissout le solide 30 résultant dans 20 ml d'acide acétique 0,2M dëgazé et on chromatog?japhie la solution sur une colonne de Séphadex G-25 Fine dans les conditions suivantes : acide acétique dégazé . 0,2M ; dimensions de la colonne : 5,0 x 150 cm ; température: 26°C ; débit : 446 ml/heure ; volume des fractions : 15,6 ml. 35 Un diagramme de l'absorbance a 280 mu de chaque frac tion en fonction du numéro de la fraction indique un seul pic. L'analyse spectrographique UV indique que les fractions représentées par la partie principale de ce pic contiennent le produit désiré. On réunit les fractions 167-179 (2590- 4 22 2796 ml ; pic à 2680 ml) et on les lyophilise à l'obscurité pour obtenir le peptide cité en titre. L'analyse spectrogra-phique UV des fractions réunies, avant lyophilisation, indique que l'on a obtenu 182 ml de produit. Récupération : 5 39,8 % (par rapport à la forme linéaire).

Analyse des amino-acides : D-val, 1,0 ; Gly, 1,0 ; Cys, 1,52 ; Lys, 2,0 ; Ala, 1,03 ; D- et L-phé, 2,94 ; D-Trp, 1,04 ; Thr, 1,98 ; Sér, 0,84

Les résultats précédents sont exprimés sous forme de , 10 rapport à Lys/2. Toutes les valeurs sont les moyennes de deux hydrolyses, sans addition d'agents de fixation. La valeur pour D-Trp est déterminée par analyse spectrographique UV basée sur la concentration de la solution utilisée pour 1'analyse.

15 Exemple 8

Ester de résine hydroxyméthyl-polystyrëne de la N-t-butyloxy-carbonyl-D-valyl-glycyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéinyl-L-(Νε-o-chlorobenzyloxycarbonyl)lysyl-L-alanyl-L-leucyl-L-phényl-alanyl-D-tryptophyj-L-(Νε-o-chlorobenzyloxycarbonyl)lysyl-L-20 (0-benzyl)thrëonyl-D-phénylalanyl-L-(0-benzyl)thréonyl-L-(0-benzyl)séryl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine

On place 5,0 g d'ester de résine hydroxyméthyl-poly-styrène de la N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)-cystéine, tel que préparé dans l'Exemple 1, dans la chambre 25 de réaction d'un appareil de synthèse de peptides Beckman 990 et on le traite selon le Programme A décrit dans l'Exemple 2, en utilisant la N-t-butyloxycarbonyl-L-(0-benzyl)sérine comme amino-acide ajouté dans l'étape 11. Après le lavage final au chlorure de méthylène (Etape 18), on lave le produit trois - 30 fois avec du DMF et on le copule à nouveau en suivant l'étape ; Il du Programme A. On lave ensuite le produit trois fois avec du DMF et on le traite ä nouveau en suivant les étapes 12 à 18 du Programme A.

D'une manière similaire, on incorpore les amino-acides 35 protégés suivants, séquentiellement dans l'ensemble peptide-résine : N-t-butyloxycarbonyl-L-(0-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-D-phênylalanine N-t-butyloxycarbonyl-D-(0-benzyl)thréonine < 23 * N-t-butyloxycarbonyl-L-(Nfc-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-D-tryptophane N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine 5 N-t-butyloxycarbonyl-L-leucine N-t-butyloxycarbonyl-L-alanine* N-t-butyloxycarbonyl-L-(NE-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-p-mêthoxybenzyl)cystéine , 10 N-t-butyloxycarbonyl-glycine N-t-butyloxycarbonyl-D-valine * On ne répète pas les étapes il à 18 du Programme A pendant l'incorporation de BOC-Ala.

Après incorporation du reste amino-acide à N-terminal 15 (D-valine), on sèche sous vide l’ensemble peptide-résine.

L'analyse des amino-acides (obtenue en chauffant une portion du peptide à reflux pendant 72 heures dans un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne) donne les résultats suivants, la lysine étant utilisée comme référence: 20 2Thr, 1,88 ; Sér, 1,22 ; Gly, 1,06 ; Ala, 1,17 ; Val, 1,05 ; Leu, 1,17 ; 2Phé, 2,24 ; 2Lys, 2,00.

Exemple 9 D-valyl-glycyl-L-cystéinyl-L-lysyl-L-alanyl-L-leucyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-D-phénylalanyl-25 L-thréonyl-L-séryl-L-cystéine

On mélange l'ensemble peptide protégé-résine préparé dans l'Exemple 8 (3,506 g, à un taux de substitution de 0,160 mmole/g de résine) avec 6,4 ml d'anisole et 6,4 ml d'éthylmercaptan. On refroidit le mélange avec de l'azote - 30 liquide et on ajoute par distillation 74 ml d'acide fluorhy-drique liquide. Puis on porte le mélange à 0°C et on l'agite pendant deux heures. L'élimination de l'acide fluorhydrique par distillation donne un résidu auquel on ajoute de l'éther à 0°C. On recueille le solide, on lave avec de l'éther et 35 on le sèche. On sépare le peptide de la résine en extrayant le solide avec de l'acide acétique IM et de l'acide acétique à 50 %. On lyophylise l'extrait à siccité à l'obscurité. On ajoute au matériau sec un mélange de 10 ml d'acide acétique 0,2M et de 4 ml d'acide acétique glacial et on chauffe la 24 suspension pour effectuer la dissolution. On chromatographie le filtrat sur une colonne Séphadex G-25 Fine dans les conditions suivantes : solvant : acide acétique 0,2M dégazé ; dimensions de la colonne : 7,5 x 150 cm ; température : 26°C; 5 débit : 1640 ml/heure ; volume des fractions : 24,6 ml.

Un diagramme de l’absorbance à 280 my de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique un grand pic avec un épaulement du côté avant et un pic arrière. L'analyse spectrographique UV indique que les fractions reprê-10 sentées par le pic contiennent le produit désiré. On réunit donc les fractions 214-233 (5240-5728 ml, pic ä 5500 ml). Une analyse spectrographique UV d'un échantillon des fractions réunies indique que l'on a obtenu 426 mg de produit. Récupération ï 47,8 % ; teneur en groupements sulfhydryle libre : 15 96,0 % de la valeur théorique (par titrage d'Ellman).

Exemple 10

Disulfure cyclique (3 -> 14) de la D-valyl-glycyl-L-cystéinyl-L-lysyl-L-alanyl-L-leucyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-D-phénylalanyl-L-thréonyl-L-séryl-L-cystéine 20 On oxyde à l'air les peptides linéaires préparés dans l'Exemple 9 pour obtenir le peptide cyclique correspondant, selon le mode opératoire suivant :

On dilue les fractions réunies obtenues dans l'Exemple 9 (488 ml, contenant théoriquement 426 mg de peptide) avec 25 8032 ml d'eau distillée pour obtenir une solution finale ayant une concentration de 50 yg/ml. On ajoute suffisamment d'hydroxyde d'ammonium concentré pour porter le pH à 6,7.

Puis, on agite la solution à la température ambiante à l'obscurité pendant 64 heures, moment auquel un titrage d'Ellman 30 d'une partie aliquote indique une oxydation complète.

On concentre la solution sous vide à un volume d'environ 27 ml. On ajoute 28 ml d'acide acétique glacial et on dessale la solution par chromatographie sur une colonne Séphadex G-25 Fine dans les conditions suivantes : 35 solvant : acide acétique à 50 % dégazé ; dimensions de la colonne : 5,0 x 210 cm ; température : 26°C ; débit : 116 ml par heure ; volume des fractions : 20,3 ml.

Un diagramme de l'absorbance à 280 my de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique deux pics 25 impartants. Le premier représente les formes agglomérées du peptide et le second représente la substance monomère. On réunit les fractions 105-115 (2109-2330 ml) et on.les lyophilise à siccité à l'obscurité. On dissout le solide résultant 5 dans 20 ml d'acide acétique 0,2M dégazé et on chromatographie la solution sur une colonne de Séphadex G-25 Fine dans les conditions suivantes : Solvant : acide acétique 0,2M dégazê ; dimensions de la colonne : 5,0 x 150 cm ; température : 26°C; débit : 458 ml/h ; volume des fractions : 16,0 ml.

, 10 Un diagramme de l'absorbance à 280 mu de chaque frac tion en fonction du numéro de la fraction indique un seul pic. Une analyse spectrographique UV indique que les fractions représentées dans la partie principale de ce pic comprennent le produit désiré. On réunit les fractions 159-167 (2534— 15 2678 ml ; pic à 2622 ml) et on les lyophilise à l'obscurité pour obtenir le peptide cité en titre. L'analyse spectrographique UV des fractions réunies avant lyophilisation indique que l'on a obtenu 135 ml de produit. Récupération : 31,7 % (par rapport à la forme linéaire).

20 Analyse des amino-acides : D-Val, 1,01 ; Gly, 1,0 ; Cys, 1,56 ; Lys, 2,0 ; Ala, 1,02 ; Leu, 1,02 ; D- et L-Phë, 2,0 ; D-Trp, 1,11 ; Thr, 1,94 ; Sér, 0,85.

Les résultats précédents sont exprimés comme des rap-25 ports à Lys/2. Toutes les valeurs sont les moyennes de deux hydrolyses, sans addition d'agents de fixation. La valeur pour D-Trp est déterminée par analyse spectrographique UV par rapport à la concentration de la solution utilisée pour l'analyse.

. 30 Exemple 11

Ester de résine hydroxymëthyl-polystyrëne de la N-t-butyloxy-carbonyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine

On estérifie une résine de polystyrène chlorométhylée selon le procédé de F. Gisin, Helv. Chim. Acta. 56, 1976 35 (1973) .

On agite une solution du sel de césium de la t-butyl-oxycarbonyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine (26,5 mmoles) dans 500 ml de DMF avec 51 g (0,75 mmole de Cl/g) de résine de polystyrène chlorométhylée (Lab Systems, Inc.) à la tempéra- > 26 ture ambiante pendant six jours. On sépare la résine par filtration et on la lave trois fois avec un mélange de 90 % de DMP et 10 M d'eau, trois fois avec de l'éthanol à 95 %, puis trois fois avec du DMF seul. On met la résine en suspension 5 dans 500 ml de DMF et l'on agite la suspension avec 10,5 g d'acétate de césium à la température ambiante pendant six jours. On sépare la résine par filtration et on la lave une fois avec du DMF aqueux. Puis, on la lave trois fois avec chacun des solvants suivants : mélange à 90 % de DMF et 10 % 10 d'eau ; éthanol à 95 % ; chlorure de méthylène et chloroforme. On met la résine en suspension dans du chloroforme contenu dans une ampoule à décanter. On élimine les fines en soutirant le liquide. On répète cette séparation trois fois supplémentaires. On recueille la résine par filtration et on 15 la sèche pendant une nuit sous vide à 40°C, ce qui donne 44,8 g du produit cité en titre. On analyse une partie de la résine pour déterminer la teneur en cystéine, après hydrolyse en utilisant un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne en présence d'une petite quantité de 20 diméthylsulfoxyde.

Valeur trouvée : 0,25 mmole de cystéine par gramme de résine. Exemple 12

Ester de résine hydroxyméthyl-polystyrëne de la N-t-butyloxy-carbonyl-L-alanyl-D-alanyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystëinyl-L-25 (N£-o-chlorobenzyloxycarbonyl)lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L-phénylalany1-D-(N-formy1)tryptophy1-L-(Nε-o-chlorobenzyloxy-carbonyl)lysyl-L-(O-benzyl)thréonyl-D-phénylalanyl-L-(0-benzyl)thréonyl-L-(0-benzyl)séryl-L-(S-p-méthoxybenzyl) cystéine 30 On place 3,5 g de résine d'hydroxyméthyl-polys.tyrène de la N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine, tel que préparé dans l'Exemple 11, dans la chambre de réaction d'un appareil de synthèse de peptides Beckman 990 et on traite selon le Programme A de l'Exemple 2, en utilisant de 35 la N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)sérine comme amino-acide utilisé dans l'Etape 11. Après le lavage final au chlorure de méthylène (Etape 18), on lave le produit trois fois avec du diméthylformamide (DMF) et on le copule à nouveau suivant l'Etape 11 du Programme A. Puis on lave le produit trois » 27 fois avec du DMF et on le traite à nouveau en suivant les Etapes 12-18 du Programme A.

D'une manière similaire, on incorpore les amino-acides protégés suivants, séquentiellement dans l'ensemble peptide-5 résine : N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-D-phénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)thréonine N-t-butyloxycarbonyl-L-(NE-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- 10 lysine N-t-butyloxycarbonyl-D-(N-formyl)-D-tryptophane N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-phénylalanine N-t-butyloxycarbonyl-L-alanine* 15 N-t-butyloxycarbonyl-L-(Ne-o-chlorobenzyloxycarbonyl)- lysine N-t-butyloxycarbonyl-L-(S-p-méthoxybenzyl)cystéine N-t-butyloxycarbonyl-D-alanine N-t-butyloxycarbonyl-L-alanine 20 * On ne répète pas les Etapes 11-18 du Programme A pendant l'incorporation de BOC-Ala.

Après incorporation du reste amino-acide à N-terminal (L-alanine), on sèche l'ensemble peptide-résine sous vide. L'analyse des amino-acides (obtenue en chauffant à reflux 25 une portion du peptide pendant 72 heures dans un mélange 1:1 d'acide chlorhydrique concentré et de dioxanne) donne les résultats suivants, la lysine étant utilisée comme référence: 2Thr, 2,64 ; Sêr, 1,19 ; 3Ala, 3,96 ; 3Phé, 3,18; 2Lys, 2,00; Val, 1,06 ; Trp, 0,85.

- 30 Exemple 13 L-alanyl-D-alanyl-L-cystéinyl-L-lysyl-L-alanyl-L-phényl- alanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-D- phënylalanyl-L-thrëonyl-L-sëryl-L-cystéine

On mélange l'enseirfole peptide protégé-résine préparé 35 dans l'Exemple 12 (2,831 g à un taux de substitution de 0,160 mmole/g de résine) avec 5,0 ml d'anisole et 5,0 ml d'éthylmercaptan. On refroidit le mélange dans de l'azote liquide et on ajoute par distillation 58 ml d'acide fluorhy-drique liquide. Puis on porte le mélange à 0°C et on l'agite ; 28 t pendant une heure et demie. L'élimination de l'acide fluorhydrigue par distillation donne un résidu auquel on ajoute de l'éther à 0°C. On recueille le solide, on le lave avec de l'éther et on le sèche. On sépare le peptide de la 5 résine en extrayant le solide avec de l'acide acétique IM et de l'acide acétique glacial. On lyophilise l'extrait à l'obscurité jusqu'à siccité. On ajoute au matériau sec un mélange de 10 ml d'acide acétique 0,2M et de 4 ml d'acide acétique glacial et l'on chauffe la suspension pour effectuer * 10 la dissolution. Le matériau n'est pas complètement soluble.

On enlève les substances insolubles par filtration en ajoutant 3 ml d'acide acétique 0,2M, On chromatographie le filtrat sur une colonne de Séphadex G-25 Fine dans les conditions suivantes : solvant : acide acétique 0,2M dégazé ; 15 dimensions de la colonne : 7,5 x 150 cm ; température : 26°C; débit : 673 ml/heure ; volume des fractions : 22,8 ml.

Un diagramme de l'absorbance à 280 mu de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique un large pic avec un êpaulement du côté arrière. Une analyse spec-20 trographique UV indique que les fractions représentées par le pic large contiennent le produit désiré. On combine donc les fractions 228-252 (5187-5758 ml), pic à 5492 ml). Une analyse spectrographique UV d'un échantillon des fractions réunies indique que l'on a obtenu 262 mg de produit. Récu-25 pération : 35,7 % ; teneur en groupements sulfhydryle libre: 82 % de la valeur théorique (par titrage d'Ellman).

Exemple 14

Disulfure cyclique (3 14) de la L-alanyl-D-alanyl-L- cystéinyl-L-lysyl-L-alanyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D- • 30 tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-D-phénylalanyl-L-thrëonyl-L- séryl-L-cystéine

On oxyde à l'air le peptide linéaire préparé dans l'Exemple 13 pour obtenir le peptide cylique correspondant, selon le mode opératoire suivant : 35 On dilue les fractions réunies obtenues dans l'Exemple 13 (571 ml, contenant théoriquement 262 mg de peptide) avec 300 ml d'eau distillée pour obtenir une solution finale ayant une concentration de 51 ug/ml. On ajoute suffisamment d'hydroxyde d'ammonium concentré pour amener le pH à 6,7.

4 29 puis on agite la solution à la température ambiante ä l'obscurité pendant 64 heures, après quoi un titrage d'Ellman d’une partie aliquote indique une oxydation complète.

On concentre la solution sous vide jusqu'à un volume 5 d'environ 20 ml. On ajoute 20 ml d'acide acétique glacial et on dessale la solution par chromatographie sur une colonne Séphadex G-25 Fine dans les conditions suivantes : solvant : acide acétique à 50 % dégazë ; dimensions de la colonne : 5,0 x 90 cm ; température : 26°C ; débit : 280 ml/h ; volume 10 des fractions : 16,35 ml.

Un diagramme de l'absorbance à 280 mu de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique deux pics importants. Le premier représente les formes agglomérées du peptide et le second représente la substance monomère. On 15 combine les fractions 51-65 (817-1063 ml) et on les lyophilise à siccité à l'obscurité. On dissout le solide résultant dans 15 ml d'acide acétique 0,2M dégazé, et on chromatographie la solution sur une colonne de Séphadex G-25 Fine dans les conditions suivantes : solvant : acide acétique 0,2M dégazé ; 20 dimensions de la colonne : 5,0 x 150 cm ; température: 26°C ; débit : 486 ml/h ; volume des fractions : 17 ml.

Un diagramme de l'absorbance à 280 mu de chaque fraction en fonction du numéro de la fraction indique un seul pic. L'analyse spectrographique UV indique que les fractions 25 représentées par la partie principale de ce pic contiennent le produit désiré. On réunit les fractions 155-168 (2618-2856 ml ; pic à 2687 ml) et on les lyophilise à l'obscurité , pour obtenir le peptide cité en titre. L'analyse spectrographique UV des fractions réunies avant lyophilisation , 30 indique que l'on a obtenu 111 mg de produit. Récupération de 42,4 % (à partir de la forme linéaire),.

Analyse des amino-acides : D- et L-Ala, 2,97 ; Cys, 2,0 ; Lys, 2,04 ; D- et L-Phé, 2,88; D-Trp, 0,90 ; Thr, 1,90 ; Sér, 0,80.

35 Les résultats précédents sont exprimés sous forme de rapports à (D- et L-Ala + Lys)/2. Toutes les valeurs sont les moyennes de deux hydrolyses (avec agents de fixation diméthylsulfoxyde et acide thioglycolique) sauf pour D-Trp, Phé, D-Phê, Sér (avec seulement utilisation d'acide 30 thioglycolique)· et Cys (avec seulement diméthylsulfoxyde). Exemple 15

Les effets des tétradécapeptides de Formule (III) sur l’inhibition de la sécrétion de l’hormone de croissance, 5 de l’insuline et du glucagon peuvent être démontrés par les modes opératoires d’essais suivants : A. Inhibition de l’hormone de croissance chez les rats :

Cet essai est une modification de la méthode de P. Brazeau et al., Endocrinology, 94, 184 (1974). On sépare des . 10 rats mâles (pesant 100-110 g) en trois groupes de huit rats . chacun. On administre à chaque rat du pentobarbital sodique à une dose de 4 mg/rat (I.P.) pour stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance. Simultanément, un groupe de rats reçoit le composé d’essai (S.C.) ; le second groupe reçoit 15 de la somatostatine (S.C.) et le troisième groupe (témoin) reçoit du sérum physiologique (S.C.). Vingt minutes après, on décapite les animaux et on recueille le sang. On détermine la concentration de l'hormone de croissance dans le sérum par dosage radioimmunologique. On détermine la con-20 centration moyenne en hormone de croissance (- l'écart-type) pour chaque groupe. Le pourcentage d’inhibition de la libération de l'hormone de croissance (par rapport aux témoins ayant reçu le sérum physiologique) est ensuite calculé pour le composé d'essai et pour la somatostatine. Quand 25 on les teste comme décrit précédemment, les peptides des

Exemples 4, 7, 10 et 14, qui sont représentatifs des peptides de Formule (III) donne les résultats indiqués ci-dessous dans le Tableau I.

i » 31 d o

•H

•p H --.- Λ

H

Λ d H c\ vû lt m en co

•H ^ ^ u. ·* <·. -V

- cor- co ο | r~- ld -^-^1 *0 co cn co ir^rr oo co l 0\0 g û) P d P O 'QJ | en o a>

,d H H

S

1-1 |2 ^ co ro 'T'^TiNcno orntN

mmrrtË ** ** »* v ** *s «, nrrtrrt'S1'01^ Lnr-~ Γ" co cn coco en q .MCN -a· m tN i—i en en g 8e! +1+1 +1 +1+1 +I. + I +1 cn -h d w h 4j ffl h ^ ο o r- Γ" mcoo 0 (d 0+1 V *- V. *>- v·' w S-iduî H cm nnoœ·«· o H en u +j -h a) <+ r- rHHoncn cn co r"· d 0 d 1-1 1-1 1-1 Q) (U d d 'Ü U ü 0 d >1 eu 000 d u -d g

o S P

r-4 O

Λ — Γ*< ** tn 3 1-1 <

H 0 51 O CN O CN | O CN OCNI

S m Ln I en m l ^ d o a) •h en -p o

h Q

Λ

-H

Λ ~ ~ g d d “i o m 0 en -h g d i g rd >-t \φ H O \cd H « 4J < -P 4-1 <! td ^ cd ^ * Q (D * g d)

-"il P H -0 P

HQ Ö1 H en U1

(Ö H td I -H

i> tn > m Cn 1 CO — O 1 >-t o

0)00)0 0 H Q '0 0 H

rd'-Pd d λ d o

•P EH Ή ·Η Ή Q Ή -H

+> N14J4J 0*1 +) tn A^Qtd td l>i r- Q td >1 0 -P +) rd +) rd

Ph 0-tn 0 O)0*0tn O

H co O O tHoOdO

O)'0-P +> g Pj O, -P 4J g

grdtd Cd P g P -P rd P

0 Q g g P 0 Eh td g P

X 1 0 0 '0X1+10 \0 w Q 0 co co w q cn co co <3 ffl 32 ψ fl Ο "Η +> Η Λ Ή rfl fl Η - rn η r- ehr- σ\ ο ι r« ο rocni ο\° c\ m οο ι un r\j σι τ ι

0) I

fl U 0 '0) —. ë tn H

fi e O Q) \ . fl H tn g h en —-fl O) fl · ^ 1,3 ^ a ui r^iritnvO'T ouo

Q) PJ (D 1 N V s 1» V

OOUH CNcn r-imt-'.cricn m en en

jH.j.jj-j CNi—1 un OJ 1-1 vo CNVQ

cnflwH +1+1 +1+1 +1 +1+1 +1+1 +1 m P w •H +J -H (U tnœ uo uo m co r-i r— en

OflOfl ^ s ^ .V

M(üMfl roeN m en un r- cn cn^v OOüfl c\ œ r-i'crmr'fn >—iooud

fl >1 r-t 1-1 ri r—I

Λ Q) O 0) 0 φ ΰ Uflg s §

§ I

W fi HO —

Xi tn fl - Λ! fl H \ tu tn

Hfl S OCN O CN | O CM O (N I

Λ ^ m in i lo en l fl

Eh fl 0 O tfl •H 0

+> P

•H

Λ •H >—«w xi fl fl

fl I -H I -H

H 1» r-ι O - W O

m H g un o g fl \<D \fl fl +> \CL)

H Xi -P r-l fl 4J

cp —ce ^

I O

> Q 0) ·» tn φ h fl m l fl

* i—I 1- tJ1 iH »H

G) (Ö CO 1H fd r-i ·Η Ό > Λ <υ tn > ΐφ tn Η I ' fl fl O I rfl Ο

+1 ΡΕηΉ Q) Η Û P (U H

ft I +> fl 0^1 fl 0

û) Q fl -H -H Q H -H

P r5> +) -P tfl 1> +> tfl r-1 1> tfl fl >ι ^ ^ fl >1

O -P Λ '-ioocu 4-1 X

û)uû 4-> tfl O, OiPfl tfl fil H fl fl ο H Μ -H o ft^g-PgPEn+l+lg g M O fl fl S I fl fl fl

fl. ω g M fl Q 4-> g U

>; O \fl X Ο Ά W W CO W tn in · C pq * 33 B. Inhibition de l'insuline et du glucagon sur les chiens On fait jeûner un chien normal pendant une nuit. On commence une perfusion I.V. du composé d'essai (dissous dans le sérum physiologique). Trente minutes après, on commence 5 une perfusion supplémentaire de L-alanine (dissoute dans la solution saline) et on poursuit pendant un total de 15 minutes, de sorte que l'on administre une dose totale d'environ 1 mmole de L-alanine par kg de poids corporel. On poursuit la perfusion de composé d'essai pendant 15 minutes supplé-10 mentaires.

On prélève périodiquement des échantillons de·sang avant (à -20, -10 et -1 minute) et après (5, 10, 15, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 90, 120 et 150 minutes) le début de la perfusion du composé d'essai. On détermine par dosage radio-15 immunologique les concentrations en insuline et en glucagon dans le sérum sanguin. On fait un diagramme des concentrations du glucagon et de 1'insuline en fonction du temps.

On compare le diagramme obtenu pour le composé d'essai à des diagrammes obtenus pour la somatostatine et le sérum physio-20 logique (témoins) dans des expériences similaires.

La perfusion de L-alanine (en l'absence de somatostatine ou de composé d'essai actif) provoque une augmentation brutale des concentrations d'insuline et de glucagon dans le sérum. Les concentrations reviennent aux niveaux de 25 base une fois que l'on a arrêté la perfusion de L-alanine.

La perfusion de somatostatine (seule) provoque une diminution des concentrations de base d'insuline et de glucagon dans le sérum. En présence de L-alanine, la somatostatine inhibe l'augmentation des concentrations d'insuline et de glucagon 30 produite par la L-alanine.

«

Quand on les essaie selon le mode opératoire décrit précédemment, les peptides des Exemples 4, 7, 10 et 14, représentatifs des peptides de Formule (III), ne produisent pas d'inhibition significative de la concentration d'insuline 35 et de glucagon. Les doses utilisées sont les suivantes :

Exemple 4 : 0,147 ug/kg/mn

Exemple 7 : 0,182 ug/kg/mn

Exemple 10 : 0,247 ug/kg/mn €

V

34 f

Exemple 14 : 0,092 gg/kg/mn ; 0,126 gg/kg/mn ; 0,128 gg/kg/mn ; 0,198 gg/kg/mn ; et 0,305 gg/kg/mn (5 doses d'essai).

Les composés de Formule (III) présentent une faible 5 toxicité et conviennent pour l'administration à des mammifères à sang chaud dans des compositions pharmaceutiquement acceptables, par exemple des compositions administrées par voies sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire ou orale.

On prépare ces compositions en utilisant des excipients , 10 courants bien connus de l'homme de l'art.

t

Claims (14)

1. Tétradêcapeptide cyclique de formule : X-Cys-Lys-X1-phê-D-Trp-Lys I l Cys-Sér-Thr-D—Phé-Thr (III) dans laquelle 5. est H-Ala-D-Ala, H-D-Ala-Gly ou H-D-Val-Gly ; et X1 est Ala-Leu, Ala-Phé, Ala-D-Phé, D-Ala-Phé ou D-Ala-Cha ; ou un de ses sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables non toxiques. 10

2. D-Val-Gly-Cys-Lys-Ala-D-Phé-Phé-D-Trp Cys-Sêr-Thr-D-Phé-Thr— Lys

3. D-Val-Gly-Cys-Lys-Ala-Phé-Phé-D-Trp l , i Cys-Ser-Thr-D-Phë-Thr-Lys 15

4. D-Val-Gly-Çys-Lys-Ala-Leu-Phé-D-Trp Cys-Sér-Thr-D-Phé-THr-Lys

5. Ala-D-Ala-Cys-Lys-Ala-Phé-Phé-D-Trp i 1 Cys-Sér-Thr-D-Phë-Thr-Lys

6. Procédé de préparation d'un composé selon la 20 revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un tétradêcapeptide linéaire de formule : X-Cys-Lys-X^-Phé-D-Trp-Lys-Thr-D-Phê-Thr-Sér-Cys-OH (IV) dans laquelle : 25. et X1 sont tels que défini précédemment, ou un de ses sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables non toxiques, avec un agent oxydant.

7. Procédé selon la revendication 6 , caractérisé en ce que l'agent oxydant est l'air.

8. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle comprend un tétradêcapeptide cyclique de formule (III) tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 , et un support pharmaceutiquement acceptable.

9. Méthode d'inhibition de la sécrétion de l'hormone ; 35 de croissance chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle consiste à administrer un tétradêcapeptide cyclique de 7 formule (III) selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 16 * ’ **

10. Tëtradecapeptide Linéaire de formule : X-Cys-Lys-X1-Phé-D-Trp-Lys-Thr-D-Phé-Thr-Sér-Cys-OH (IV) dans laquelle 5. est H-Ala-D-Ala, H-D-Ala-Gly ou H-D-Val-Gly ; et X"*· est Ala-Leu, Ala-Phë, Ala-D-Phé, D-Ala-Phé ou D-Ala-Cha ; ou un de ses sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables non toxiques ; 10

11. D-Val-Gly-Cys-Lys-Ala-D-Phé-Phé-D-Trp * HO-Cys-Sér-Thr-D-Phê-Thr—Lys

12. D-Val-Gly-Cys-Lys-Ala-Phé-Phé-D-Trp HO-Cys-Sér-Thr-D-Phé-Thr-Lys

13. D-Val-Gly-Cys-Lys-Ala-Leu-Phé-D-Trp

15 HO-Cys-Sër-Thr-D-Phë-Thr-Lys

14. Ala-D-Ala-Cys-Lys-Ala-Phé-phé-D-Trp HO-Cys-Sér-Thr-D-Phé-THr-Lys »