LU600658B1 - Verfahren zur Kultivierung primärer neuraler Stammzellenhaufen aus dem Hippocampus erwachsener Primaten - Google Patents

Verfahren zur Kultivierung primärer neuraler Stammzellenhaufen aus dem Hippocampus erwachsener Primaten

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Zhongshan Ophthalmic Ct Sun Yat Sen Univ
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Abstract

Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Kultivierung primärer neuraler Stammzellenhaufen aus dem Hippocampus erwachsener Primaten, umfassend: Gewinnen von Hippocampus-Neuralstammzellen, Einpflanzen der Neuralstammzellen in eine Platte mit sechs Vertiefungen, die mit einer künstlichen Basismembran von 1,25% vorbeschichtet ist, Zugegen von 2 ml eines vollständigen Kulturmediums für die Neuralstammzellen zur Kultivierung, Austauschen halben Kulturmediums alle zwei Tage und kontinuierliches Kultivieren der Neuralstammzellen für vier Monate. Die vorliegende Erfindung verfügt über die folgenden Vorteile: sie ist in der Lage, die Fähigkeit zur Selbstproliferation und Differenzierung von Hippocampus-Organoiden im Gehirn erwachsener Primaten über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten, eine Population Neuralstammzellen im Hippocampus erfolgreich zu kultivieren und die Differenzierung und Proliferation von Hippocampus- Organoiden sowie spezifische Transkriptionsfaktoren, verschiedene Arten von Zellpopulationen und zugehörige Markerproteine, die während des Differenzierungs- und Proliferationsprozesses gebildet werden, nachzuweisen, und die vorliegende Erfindung stellt eine zuverlässige experimentelle Methode für die Untersuchung der Entwicklung neuraler Stammzellen, der Pathologie neurologischer Störungen und des Mechanismus der Regeneration neuraler Zellen dar und bietet ein ideales In-vitro-System für die Untersuchung der In-vitro-Reaktion von Stammzellen auf Medikamente.

Description

Verfahren zur Kultivierung primärer neuraler Stammzellenhaufen aus dem
Hippocampus erwachsener Primaten
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet der regenerativen Medizin, insbesondere die Kulturtechnik für neurale Stammzellen.
STAND DER TECHNIK
Der Hippocampus ist ein Teil des Gehirns im Zentralnervensystem von Säugetieren. Der
Hippocampus, der auch als Gyrus hippocampus, Hippocampusregion und zerebraler
Hippocampus bezeichnet wird, befindet sich zwischen dem Thalamus und dem medialen
Temporallappen des Großhirns und gehört zu einem Teil des limbischen Systems, und ist hauptsächlich fiir Funktionen wie die Speicherumwandlung und Orientierung des
Langzeitgedächtnisses verantwortlich. Seit Anfang des 20. Jahrhunderts haben
Wissenschaftler den Hippocampus in verschiedenen Bereichen wie Neuroanatomie,
Physiologie, Ethologie usw. untersucht und festgestellt, dass der Hippocampus nicht nur mit bestimmten Erinnerungen und dem Lernen in Verbindung gebracht wird, sondern auch mit
Anfällen bei Epilepsiepatienten und der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit. Darüber hinaus kann der Hippocampus durch Anämie und Hypoxie geschädigt werden. In Bezug auf sowohl Anatomie als auch auf die funktionale Struktur war der Hippocampus ein Gegenstand von Untersuchungen anderer kortikaler Systeme. Vieles von dem, was über die synaptische
Ubertragung im Zentralnervensystem bekannt ist, wurde durch Studien am Hippocampus gewonnen.
Laut dem Artikel "Erwachsene neurale Stammzellen aus der subventrikulären Zone: ein
Überblick über den Neurosphären-Assay Anat. Rec. 296, 1436-1452 (2013)" wurden neurale
Stammzellen aus dem Hippocampus von 14,5 Tage alten embryonalen Mäusen gereinigt, und die Zellen wurden in In-vitro-Zellkulturmedium kultiviert, um Neurosphären zu bilden, die das Potenzial haben, sich sowohl in vivo als auch ex vivo in andere neurale Zellen zu differenzieren, aber die Kultur in diesem Artikel war auf Nagetiere und Hippocampusgewebe von embryonalen Mäusen ausgerichtet. Auch in den beiden Artikeln "Einzelzellstudie von neuralen Stammzellen aus menschlichen iPSC zeigt unterschiedliche Vorläuferpopulationen mit neurogenem und gliogenem Potenzial. Genes Cells 24, 836-847(2019), Die spontane
Differenzierung und der Chromosomenverlust in iPSCs des menschlichen Trisomie 18-
Syndroms. Cell Death Dis. 8 e3149(2017)" waren die Kultivierungsobjekte jeweils die
Neuralstammzellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen und pluripotente
Stammzellen, die direkt aus menschlichem Fruchtwasser im Uterus gewonnen wurden, und nicht die Neuralstammzellen im Hippocampus.
Wenn neurale Stammzellen erfolgreich aus dem Hippocampus von Primaten isoliert und dann in vitro kultiviert werden können, um Neurosphären-Organoide zu bilden, und wenn die
Fähigkeit zur Proliferation und Differenzierung neuraler Stammzellen über einen langen
Zeitraum aufrechterhalten werden kann, wird dies eine zuverlässige experimentelle Methode für die Untersuchung der Entwicklung neuraler Stammzellen, der Pathologie neurologischer
Störungen und des Mechanismus der Regeneration neuraler Zellen darstellen und ein ideales
In-vitro-System für die Untersuchung der Reaktion von Stammzellen auf Medikamente bieten.
INHALT DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Ein Zweck der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Kultivierung primärer neuraler Stammzellenhaufen aus dem Hippocampus erwachsener Primaten zur Verfügung zu stellen, mit dem potenziell pluripotente neurale Stammzellen im Hippocampus erwachsener
Affen kultiviert werden können, um einen sich selbst erneuernden Stammzellenhaufen in vitro zu bilden, der in eine Vielzahl spezifischer Zelltypen differenziert werden kann, wodurch ein physiologisch relevantes System, d.h. ein organoides System, bereitgestellt wird.
Um den obigen Zweck erreichen, verwendet die vorliegende Erfindung die folgende technische Lösung: ein vollständiges Kulturmedium für Hippocampus-Neuralstammzellen erwachsener Primaten, das DMEM/F12, 25 pg/ml Insulin, 50 pg/ml Transferrin, 1,28 ng/ml Progesteron, 16 ng/ml
Putrescin, 0,52 pg/ml Natriumselenit, 20 ng/ml rekombinanten humanen epidermalen
Wachstumsfaktor, 20 ng/ml humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 2 pg/ml
Heparin, 0,5 mg/ml primäres Zellantibiotikum enthält.
Vorzugsweise wird das DMEM/F12 aus DMEM und F12 in einem Volumenverhältnis von 1:1 hergestellt.
Ein Herstellungsverfahren für das vollständige Kulturmedium für Hippocampus-
Neuralstammzellen erwachsener Primaten, umfassend die folgenden Schritte: zuerst wird ein Stammzellen-Grundmedium hergestellt, das DMEM/F12, 25 pg/ml Insulin, 50 ug/ml Transferrin, 1,28 ng/ml Progesteron, 16 ng/ml Putrescin und0,52 pg/ml Natriumselenit enthält; dann werden in dem Stammzellen-Grundmedium rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor mit einer Endkonzentration von 20 ng/ml, humaner basischer
Fibroblasten-Wachstumsfaktor mit einer Endkonzentration von 20 ng/ml, Heparin mit einer
Endkonzentration von 2 ug/ml und primäres Zellantibiotikum mit einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml hinzugefügt, um ein vollständiges Kulturmedium für Hippocampus-
Neuralstammzellen erwachsener Primaten zu erhalten.
Vorzugsweise wird das DMEM/F12 durch Formulierung von DMEM und F12 in einem
Volumenverhältnis von 1:1 erhalten.
Ein Verfahren zur Kultivierung primärer neuraler Stammzellenhaufen aus dem Hippocampus erwachsener Primaten unter Verwendung des Kulturmediums, umfassend die folgenden
Schritte: Gewinnen von Hippocampus-Neuralstammzellen, Finpflanzen der
Neuralstammzellen in eine Platte mit sechs Vertiefungen, die mit einer künstlichen
Basismembran mit einem Volumenanteil von 1,25% vorbeschichtet ist, Zugegen von 2 ml eines vollständigen Kulturmediums für die Neuralstammzellen zur Kultivierung, Austauschen halben Kulturmediums alle zwei Tage und kontinuierliches Kultivieren der
Neuralstammzellen für vier Monate.
Ferner umfasst der Schritt zum Gewinnen der Hippocampus-Neuralstammzellen Folgendes: (1) Verwenden eines sterilen Skalpells und einer chirurgischen Schere, Entnehmen von
Hirngewebe von einem experimentellen erwachsenen Primaten, schnelles Schneiden des
Hippocampusgewebes und Einbringen in vorgekühlte Hank's balancierte Salzlôsung, Spülen des Hippocampusgewebes mit Hank's balancierter Salzlôsung für 5 Male, Einbringen in eine 10-cm-Petrischale, die 10 ml vollständiges Kulturmedium für die Neuralstammzellen enthält, und Kultivieren des Gewebes bei 37°C für 30 Minuten in einem Zellkultur-Inkubator mit 5%
COz; (2) Entfernen der Hirnhäute im Hippocampus unter einem Stereomikroskop nach dem
Abschluss des Schritts 1 und Schneiden des verbleibenden Gewebes in kleine Stücke, und zuerst wird das Hippocampus-Gewebe mit Trypsin EDTA mit einem Massenanteil von 0,25% bei 37°C für 20 Minuten enzymatisch aufgeschlossen, dann wird die Verdauungslösung durch 40 U/mL Papain mit 7,5 mg/mL DNAase I ersetzt, und das Gewebe wird bei 37°C für weitere 30 Minuten verdaut, und die Gewebesuspension wird während der enzymatischen Verdauung alle 10 Minuten vorsichtig geschüttelt; (3) Zugeben eines gleichen Volumens an vollständigem Kulturmedium für die
Neuralstammzellen in der Gewebesuspension nach der enzymatischen Verdauung und vorsichtiges Mischen, dann Zentrifugieren in einer Zentrifuge bei 180 g/min für 5 Minuten, um den Überstand zu entfernen, und Zugeben von frischem Kulturmedium für die
Neuralstammzellen in dem Niederschlag; vorsichtiges Mahlen der Gewebesuspension mit einer Pasteurpipette und anschließendes Filtern durch einen 70-um-Filter, um die
Neuralstammzellen zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Verwendung des Neuralstammzellenhaufens, das durch das Kultivierungsverfahren erhalten wird, bei der Untersuchung der Entwicklung der Neuralstammzellen, der Pathologie neurologischer Krankheiten und der
Regenerationsmechanismen neuraler Zellen zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Verwendung des Neuralstammzellenhaufens, das durch das Kultivierungsverfahren erhalten wird, bei der Untersuchung von In-vitro-
Arzneimittelreaktionen zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung verfügt über die folgenden Vorteile: mit Hilfe der
Primärkulturtechnologie können Organoide erwachsener Primaten für Experimente in vitro kultiviert werden, was es uns ermöglicht, die Proliferation und Differenzierung von
Hippocampus-Neuralstammzellen im Gehirn erwachsener Primaten in vitro zu untersuchen und zu beobachten, nämlich die Kultivierung und Entwicklung von Hippocampus-
Organoiden, und jederzeit die schnellen und kontinuierlichen Veränderungen auf molekularer
Ebene während des Wachstums von Hippocampus-Neuralstammzellen in erwachsenen
Primaten zu überwachen, wodurch eine zuverlässige experimentelle Methode zur
Untersuchung der Entwicklung Neuralstammzellen, der Pathologie neurologischer
Krankheiten und des Regenerationsmechanismus neuraler Zellen und ein ideales In-vitro-
System zur Untersuchung der Reaktion von Stammzellen auf Medikamente geboten werden.
Die Kultivierung von Hippocampus-Organoiden in erwachsenen Primaten kann dazu führen, dass autologe und allogene Zelltherapien möglich werden, und birgt großes Potenzial im
Bereich der regenerativen Medizin. In der Präzisionsmedizin haben sich Organoide, die aus patienteneigenen Stammzellen gewonnen werden, ebenfalls als wertvolle
Diagnoseinstrumente erwiesen. Aus Patienten gewonnene Organoide können für In-vitro-
Arzneimittelreaktionen verwendet werden, um individualisierte Behandlungsmöglichkeiten für die Krankheit eines Patienten zu bieten. Daher kann die Kultivierung von Hippocampus-
Organoiden den Forschern helfen, eine experimentelle Grundlage für die Untersuchung verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen und die Entwicklung von Medikamenten für die Behandlung neurologischer Erkrankungen zu schaffen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die hier erläuterten beigefügten Zeichnungen bieten ein weiteres Verständnis der vorliegenden Erfindung, stellen einen Bestandteil der vorliegenden Anmeldung dar und bilden 5 keine unpassende Beschränkung für die vorliegende Anmeldung.
Figur 1 zeigt ein experimentelles Diagramm eines erfolgreich kultivierten Hippocampus-
Neuralstammzellenhaufens aus dem Gehirn eines erwachsenen Primaten.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden in Verbindung mit den beigefügten
Zeichnungen sowie spezifischen Ausführungsbeispielen detailliert beschrieben, wobei schematische Ausführungsbeispiele und Beschreibungen der vorliegenden Erfindung zur
Erläuterung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, aber nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung dienen.
Herstellen von vollständigem Kulturmedium für Hippocampus-Neuralstammzellen erwachsener Primaten
Zuerst werden 50mL Stammzellen-Grundmedium hergestellt, das DMEM/F12, das aus
DMEM und F12 in einem Volumenverhältnis von 1:1 hergestellt ist, 25 pg/ml Insulin, 50 pg/ml Transferrin, 1,28 ng/ml Progesteron, 16 ng/ml Putrescin und0,52 Natriumselenit enthält. Dann werden in dem Stammzellen-Grundmedium rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor (R&D Systems, Minneapolis, MN) mit einer Endkonzentration von 20 ng/ml, humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor bFGF (R&D Systems) mit einer Endkonzentration von 20 ng/ml, Heparin mit einer Endkonzentration von 2 ng/ml und primäres Zellantibiotikum mit einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zugegeben.
Gewinnen von Neuralstammzellen: 1. Verwenden eines sterilen Skalpells und einer chirurgischen Schere, Entnehmen von
Hirngewebe aus einem erwachsenen Affen, schnelles Schneiden des Hippocampusgewebes und Einbringen in vorgekühlte Hank's balancierte Salzlôsung. Spülen des
Hippocampusgewebes mit Hank's balancierter Salzlôsung für 5 Male, Einbringen in eine 10- em-Petrischale, die 10 ml vollständiges Kulturmedium für die Neuralstammzellen enthält, und
Kultivieren des Gewebes bei 37°C für 30 Minuten in einem Zellkultur-Inkubator mit 5% COz;
2. Entfernen der Hirnhäute im Hippocampus unter einem Stereomikroskop nach dem
Abschluss des Schritts 1 und Schneiden des verbleibenden Gewebes in kleine Stücke, und zuerst wird das Hippocampus-Gewebe mit Trypsin EDTA mit einem Massenanteil von 0,25% bei 37°C für 20 Minuten enzymatisch aufgeschlossen, dann wird die Verdauungslösung durch 40 U/mL Papain mit 7,5 mg/mL DNAase I ersetzt, und das Gewebe wird bei 37°C für weitere 30 Minuten verdaut, und die Gewebesuspension wird während der enzymatischen Verdauung alle 10 Minuten vorsichtig geschüttelt; 3. Zugeben eines gleichen Volumens an vollständigem Kulturmedium für die
Neuralstammzellen in der Gewebesuspension nach der enzymatischen Verdauung und vorsichtiges Mischen, dann Zentrifugieren in einer Zentrifuge bei 180 g/min für 5 Minuten, um den Überstand zu entfernen, und Zugeben von frischem Kulturmedium für die
Neuralstammzellen in dem Niederschlag; vorsichtiges Mahlen der Gewebesuspension mit einer Pasteurpipette und anschließendes Filtern durch einen 70-um-Filter, um die
Neuralstammzellen zu erhalten.
Kultivieren von Neuralstammzellen:
Einpflanzen der Neuralstammzellen in eine Platte mit sechs Vertiefungen, die mit einer künstlichen Basismembran (Matrixgel) mit einem Volumenanteil von 1,25% vorbeschichtet ist, Zugegen von 2 ml eines vollständigen Kulturmediums für die Neuralstammzellen zur
Kultivierung. Austauschen halben Kulturmediums alle zwei Tage und kontinuierliches
Kultivieren der Neuralstammzellen für vier Monate. Es wurde beobachtet, dass sich
Neurosphären aus sich frisch teilenden Zellen bildeten. Die scRNA-seq-Analyse von 6988
Neurosphären-Zellen zeigte die Proliferationsfähigkeit und Pluripotenz der Neurosphären, und Figur 1 zeigt Neuralstammzellenhaufen erwachsenem Hippocampus, die mit der vorliegenden Erfindung erfolgreich kultiviert wurden. In der UMAP-Visualisierung identifizierten wir eine aktiv proliferierende Population, die den Proliferationsmarker MK167 und den RGL-Zyklusmarker HMGB2 exprimierte, und verschiedene Zelltypen, die sich innerhalb von vier Monaten durch organoide Proliferation differenzierten. Das Vorhandensein von Hippocampus-Organoiden in erwachsenen Primaten wurde bestätigt.
Die vorliegende Erfindung verfügt über die folgenden Vorteile: die Wachstums- und
Entwicklungsumgebung der Neuralstammzellen in vivo wird in hohem Maße simuliert, so dass sie in der Lage ist, die Fähigkeit zur Selbstproliferation und Differenzierung von
Hippocampus-Organoiden im Gehirn erwachsener Primaten über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten, eine Population Neuralstammzellen im Hippocampus erfolgreich zu kultivieren und die Differenzierung und Proliferation von Hippocampus-Organoiden sowie spezifische Transkriptionsfaktoren, verschiedene Arten von Zellpopulationen und zugehôrige
Markerproteine, die während des Differenzierungs- und Proliferationsprozesses gebildet werden, nachzuweisen, was das erste Experiment zur Erfassung der Neurogenese erwachsener
Primaten in vitro darstellt.
Oben wird die von den Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung bereitgestellte technische Lôsung näher erläutert. In der Beschreibung werden spezifische Beispiele verwendet, um das Prinzip der Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung und die
Ausführungsformen zu erläutern, und die Erläuterung der obigen Ausführungsbeispiele dient nur dazu, das Verstehen der Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zu unterstützen; gleichzeitig wird der Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet anhand der
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung eine Änderung an den spezifischen
Ausführungsformen und dem Verwendungsbereich durchführen. Zusammenfassend gesagt, sollte der Inhalt der Beschreibung nicht als Beschränkung für die vorliegende Erfindung verstanden werden.

Claims (8)

Ansprüche
1. Vollständiges Kulturmedium für Hippocampus-Neuralstammzellen erwachsener Primaten. dadurch gekennzeichnet, dass es DMEM/F12, 25 pg/ml Insulin, 50 pg/ml Transferrin, 1,28 ng/ml Progesteron, 16 ng/ml Putrescin, 0,52 pg/ml Natriumselenit, 20 ng/ml rekombinanten humanen epidermalen Wachstumsfaktor, 20 ng/ml humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 2 pg/ml Heparin, 0,5 mg/ml primäres Zellantibiotikum enthält.
2. Vollständiges Kulturmedium für Hippocampus-Neuralstammzellen erwachsener Primaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das DMEM/F12 aus DMEM und F12 in einem Volumenverhältnis von 1:1 hergestellt wird.
3. Herstellungsverfahren fiir das vollständige Kulturmedium fiir Hippocampus- Neuralstammzellen erwachsener Primaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: zuerst wird ein Stammzellen-Grundmedium hergestellt, das DMEM/F12, 25 pg/ml Insulin, 50 ug/ml Transferrin, 1,28 ng/ml Progesteron, 16 ng/ml Putrescin, 0,52 ug/ml Natriumselenit enthält; dann werden in dem Stammzellen-Grundmedium rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor mit einer Endkonzentration von 20 ng/ml, humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor mit einer Endkonzentration von 20 ng/ml, Heparin mit einer Endkonzentration von 2 pg/ml und primäres Zellantibiotikum mit einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml hinzugefügt, um ein vollständiges Kulturmedium fiir Hippocampus- Neuralstammzellen erwachsener Primaten zu erhalten.
4. Herstellungsverfahren fiir das vollständige Kulturmedium für Hippocampus- Neuralstammzellen erwachsener Primaten nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das DMEM/F12 aus DMEM und F12 in einem Volumenverhältnis von 1:1 hergestellt wird.
5. Verfahren zur Kultivierung primärer neuraler Stammzellenhaufen aus dem Hippocampus erwachsener Primaten unter Verwendung des Kulturmediums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: Gewinnen von Hippocampus-Neuralstammzellen, Einpflanzen der Neuralstammzellen in eine Platte mit sechs Vertiefungen, die mit einer künstlichen Basismembran mit einem Volumenanteil von 1,25% vorbeschichtet ist, Zugegen von 2 ml eines vollständigen Kulturmediums für die Neuralstammzellen zur Kultivierung, Austauschen halben Kulturmediums alle zwei Tage und kontinuierliches Kultivieren der Neuralstammzellen für vier Monate.
6. Kultivierungsverfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt zum Gewinnen der Hippocampus-Neuralstammzellen Folgendes umfasst: (1) Verwenden eines sterilen Skalpells und einer chirurgischen Schere, Entnehmen von Hirngewebe von einem experimentellen erwachsenen Primaten, schnelles Schneiden des Hippocampusgewebes und Einbringen in vorgekühlte Hank's balancierte Salzlösung, Spülen des Hippocampusgewebes mit Hank's balancierter Salzlösung für 5 Male, Einbringen in eine 10-cm-Petrischale, die 10 ml vollständiges Kulturmedium für die Neuralstammzellen enthält, und Kultivieren des Gewebes bei 37°C für 30 Minuten in einem Zellkultur-Inkubator mit 5% CO2; (2) Entfernen der Hirnhäute im Hippocampus unter einem Stereomikroskop nach dem Abschluss des Schritts 1 und Schneiden des verbleibenden Gewebes in kleine Stücke, und zuerst wird das Hippocampus-Gewebe mit Trypsin EDTA mit einem Massenanteil von 0,25% bei 37°C für 20 Minuten enzymatisch aufgeschlossen, dann wird die Verdauungslösung durch 40 U/mL Papain mit 7,5 mg/mL DNAase I ersetzt, und das Gewebe wird bei 37°C für weitere 30 Minuten verdaut, und die Gewebesuspension wird während der enzymatischen Verdauung alle 10 Minuten vorsichtig geschüttelt; (3) Zugeben eines gleichen Volumens an vollständigem Kulturmedium für die Neuralstammzellen in der Gewebesuspension nach der enzymatischen Verdauung und vorsichtiges Mischen, dann Zentrifugieren in einer Zentrifuge bei 180 g/min für 5 Minuten, um den Überstand zu entfernen, und Zugeben von frischem Kulturmedium für die Neuralstammzellen in dem Niederschlag; vorsichtiges Mahlen der Gewebesuspension mit einer Pasteurpipette und anschließendes Filtern durch einen 70-um-Filter, um die Neuralstammzellen zu erhalten.
7. Verwendung des Neuralstammzellenhaufens, das durch das Kultivierungsverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 6 erhalten wird, bei der Untersuchung der Entwicklung der Neuralstammzellen, der Pathologie neurologischer Krankheiten und der Regenerationsmechanismen neuraler Zellen.
8. Verwendung des Neuralstammzellenhaufens, das durch das Kultivierungsverfahren einem der Ansprüche 5 bis 6 erhalten wird, bei der Untersuchung von In-vitro- Arzneimittelreaktionen.
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