LT6966B - Diagnostinis miRNR rinkinys skirtas periodontito uždegiminio aktyvumo vertinimui pacientuose su reumatoidiniu artritu - Google Patents
Diagnostinis miRNR rinkinys skirtas periodontito uždegiminio aktyvumo vertinimui pacientuose su reumatoidiniu artritu Download PDFInfo
- Publication number
- LT6966B LT6966B LT2021004A LT2021004A LT6966B LT 6966 B LT6966 B LT 6966B LT 2021004 A LT2021004 A LT 2021004A LT 2021004 A LT2021004 A LT 2021004A LT 6966 B LT6966 B LT 6966B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- mir
- samples
- periodontitis
- rna
- mirnas
- Prior art date
Links
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 title claims abstract description 172
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 title claims abstract description 119
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 title claims abstract description 74
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims description 111
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 title claims description 24
- 108091060382 miR-140 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108091030617 miR-140-1 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108091023370 miR-140-2 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 12
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims abstract 2
- 108091053592 miR-145-1 stem-loop Proteins 0.000 claims description 31
- 108091056559 miR-145-2 stem-loop Proteins 0.000 claims description 31
- 108091024530 miR-146a stem-loop Proteins 0.000 claims description 25
- 108091040069 miR-146a-1 stem-loop Proteins 0.000 claims description 20
- 108091081537 miR-146a-2 stem-loop Proteins 0.000 claims description 20
- 108091032392 miR-146a-3 stem-loop Proteins 0.000 claims description 20
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 10
- 230000021839 RNA stabilization Effects 0.000 claims description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L dipotassium;[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] phosphate Chemical class [K+].[K+].OC[C@H]1O[C@H](OP([O-])([O-])=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L 0.000 claims 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 61
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 20
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 108010034143 Inflammasomes Proteins 0.000 abstract description 2
- 210000003731 gingival crevicular fluid Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000012341 Quantitative reverse-transcriptase PCR Methods 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 41
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 28
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 description 24
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 19
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 14
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 12
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 12
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 9
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 8
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 7
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 108091028684 Mir-145 Proteins 0.000 description 6
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 6
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 108091044988 miR-125a stem-loop Proteins 0.000 description 5
- 108091032320 miR-146 stem-loop Proteins 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 238000003253 miRNA assay Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000001776 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 3
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 3
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 3
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 3
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 3
- 208000005888 Periodontal Pocket Diseases 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 3
- 108091043187 miR-30a stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091029750 miR-30a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091030035 miR-30a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091091870 miR-30a-3 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091067477 miR-30a-4 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 108091070482 Caenorhabditis elegans miR-39 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 102100032442 Protein S100-A8 Human genes 0.000 description 2
- 101710156987 Protein S100-A8 Proteins 0.000 description 2
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 206010043706 Thyroid cyst Diseases 0.000 description 2
- 208000008312 Tooth Loss Diseases 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000271897 Viperidae Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003435 antirheumatic agent Substances 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001680 brushing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000002988 disease modifying antirheumatic drug Substances 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- MGDKBCNOUDORNI-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;potassium Chemical compound [K].[K].OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O MGDKBCNOUDORNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 6alpha-methylprednisolone Chemical compound C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)CO)CC[C@H]21 VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 0.000 description 1
- QTXZASLUYMRUAN-QLQASOTGSA-N Acetyl coenzyme A (Acetyl-CoA) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1.O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QTXZASLUYMRUAN-QLQASOTGSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 1
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 1
- 229940124292 CD20 monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229940127291 Calcium channel antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 241001672694 Citrus reticulata Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 IL-Ιβ Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 1
- UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N Jacareubin Natural products CC1(C)OC2=CC3Oc4c(O)c(O)ccc4C(=O)C3C(=C2C=C1)O UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030411 Neutrophil collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710118230 Neutrophil collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 208000008274 Periodontal Attachment Loss Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 238000011869 Shapiro-Wilk test Methods 0.000 description 1
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710108790 Stromelysin-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102000052549 Wnt-3 Human genes 0.000 description 1
- 108700020985 Wnt-3 Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 210000001909 alveolar process Anatomy 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037979 autoimmune inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 1
- 239000000480 calcium channel blocker Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006718 epigenetic regulation Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 208000007565 gingivitis Diseases 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000006195 histone acetylation Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000016788 immune system process Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 201000007119 infective endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000013152 interventional procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000022275 macrophage chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- 108091043184 miR-1246 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091090583 miR-34c stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091084066 miR-34c-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091041657 miR-381 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091089984 miR-3917 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091028374 miR-550a-3 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008289 pathophysiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000006950 reactive oxygen species formation Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 101150091813 shfl gene Proteins 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N sulfasalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N 0.000 description 1
- 229960001940 sulfasalazine Drugs 0.000 description 1
- NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N sulfasalazine Natural products C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(N=NC=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004357 third molar Anatomy 0.000 description 1
- 210000001036 tooth cervix Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 239000002452 tumor necrosis factor alpha inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Šis išradimas susijęs su mikro-RNR (miRNR), konkrečiai miR-140-3p, -145-5p, -146a-5p ir -195-5p, pritaikymu periodontito (PD) diagnostikai. Išradimas apima metodą ir rinkinį, skirtus PD uždegimo aktyvumui nustatyti organizmo skysčių mėginiuose, įskaitant dantenų vagelės skystį, seiles ir kraujo plazmą, tiek reumatoidiniu artritu sergantiems, tiek nesergantiems asmenis. Išradimas įvardina metodologinius žingsnius ir medžiagas, reikalingas mėginių surinkimui, RNR skyrimui, kDNR sintezei, kiekybinei atvirkštinės transkriptazės PGR ir duomenų analizei, siekiant nustatyti santykinį PD specifinių miRNR, konkrečiai miR-140-3p, -145-5p, -146a-5p ir -195-5p, kiekį. Rezultatai rodo, kad išanalizavus anksčiau minėtas miRNR galima jautriai ir specifiškai nustatyti PD.
Description
TECHNIKOS SRITIS
Išradimas priskiriamas medicinos technologijų sričiai, žinomos medžiagos mikro-RNR (miRNR) medicininis panaudojimas skirtas periodontito uždegiminio aktyvumo diagnostikai sergantiems ir nesergantiems reumatoidiniu artritu ir kitomis sisteminėmis ligomis, remiantis modifikuota organizmo skysčiuose (dantenų vagelės skystyje, seilėse ir plazmoje) aptinkamų miRNR surinkimo, išskyrimo bei identifikavimo metodika.
TECHNIKOS LYGIS
Periodontites (PD) yra lėtinė infekcinė liga, apibūdinama jungiamojo audinio uždegimine destrukcija, dėl kurios netenkama periodonto jungties ir rezorbuojasi alveolinis kaulas. PD yra labiausiai paplitusi lėtinė uždegiminė liga, kurios dažnis siekia nuo 10 proc. iki 70 proc. suaugusiųjų populiacijoje, priklausomai nuo amžiaus ir tyrimuose naudojamų diagnostinių kriterijų (1). Ligos paplitimas didėja proporcingai gyventojų amžiui ~ nustatyta, kad 70 proc. vyresnių nei 65 metų gyventojų serga PD (2). Atsižvelgiant j populiacijos senėjimo tendenciją bei didėjantį rizikos veiksnių sirgti PD pasireiškimą (nutukimas, cukrinis diabetas ir kt), ateityje prognozuojamas didesnis PD paplitimas (3). Itin didelis PD paplitimas yra susijęs su ligos besimptome eiga, dėl kurios asmenys kreipiasi gydymui tik pasireiškus vėlyviesiems ligos požymiams puliavimui iš dantenų, dantų paslankumui, dantų netekimui irt.t. Nepaisant to, kad PD yra pagrindinė dantų netekimo priežastis, neigiama periodonto patologijos įtaka neapsiriboja vien pakitimais burnoje. Ilgai trunkantis, lėtinis anaerobinių bakterijų kiekio padidėjimas burnoje yra siejamas su didesne rizika sirgti bakterinės kilmės pneumonija, lėtine obstrukcine plaučių liga bei kitomis kvėpavimo sistemos ligomis bei vėžiniais susirgimais (4). Periodonto patogeninių bakterijų patekimas į kraujotaką kasdienių procedūrų metu (dantų valymo, kramtymo ir kt) prisideda prie aterosklerozinių pakitimų formavimosi, didina infekcinio endokardito bei infarkto išsivystymo riziką (5, 6). Visgi didžiausią neigiamą poveikį organizmui PD sukelia dėl mažo intensyvumo lėtinio uždegimo, kuris aktyvuoja imuninę sistemą ir lemia padidėjusią uždegiminių mediatorių produkciją (7). Padidėjusi navikų nekrozės veiksnio (angį, tumor necrosts factor a, TNF-α), interleukino-6 (IL-6) ir kitų uždegiminių citokinų produkcija yra pagrindinis PD ir autoimunines ligas siejantis patogenezės mechanizmas (8), Labiausiai su PD siejama autoimuninė uždegiminė liga reumatoidinis artritas (RA), PD dažnis pacientams, sergantiems RA, yra iki dviejų kartų didesnis lyginant su bendrąja populiacija bei gali paveikti net 97 proc, pacientų sergančių RA (9). Taip pat periodonto patologijos klinikinė eiga koreliuoja su RA ligos aktyvumu, o po sėkmingo periodontologinio gydymo stebimas RA klinikinio aktyvumo sumažėjimas (10). PD ir RA ligų metu nustatoma padidėjusi uždegiminių citokinų produkcija, kuri paskatina jungiamojo ir kaulinio audinio rezorbciją (8). Taip pat ligas sieja panaši epigenetinė reguliacija: IL-6 geno promotoriaus metilinimas yra mažesnis tarp pacientų sergančių RA bei PD, lyginant su sveikais asmenimis, dėl ko nustatomas padidėjęs IL-6 kiekis kraujo serume (11).
Yra žinoma, kad uždegimą periodonto audiniuose inicijuoja mikroorganizmų sankaupos ant danties paviršiaus. Šių mikroorganizmų veiklos produktai aktyvuoja žmogaus imuninę sistemą, paskatindami limfocitų, makrofagų bei polimorfonuklearų infiltraciją į uždegimo židinį. Bakterijų lipopolisacharidų paskatinti makrofagai išskiria didelius kiekius uždegiminių citokinų: interleukiną-1 (IL-1), TNF-o, prostaglandiną E2 (PGE2) ir t.t. Tuo tarpu T limfocitai, aktyvuoti patogeninių bakterijų, produkuoja IL-1 bei limfotoksiną. Uždegiminiai citokinai lemia katabolinius procesus periodonto pažeidimo židinyje - paskatinama metaloproteinazių ir kitų fermentų, gebančių ardyti kolageną, veikla (12). Tiek bakterijų tiesioginė veikla, tiek imuninės sistemos ląstelių atsakas prisideda prie periodonto audinių ardymo ir ligos progresavimo (13). Nepaisant reikšmingos mikroorganizmų įtakos PD pradinėse stadijose, yra manoma, kad mikroorganizmų akumuliacija periodonto audiniuose tik 20 proc. padidina riziką sirgti pažengusia periodonto liga (14). Nuo uždegiminio atsako intensyvumo priklauso tolesnis ligos progresavimo greitis bei bendras neigiamas poveikis organizmui.
Uždegimas yra sudėtingas patofiziologinis mechanizmas, reguliuojamas įvairių mediatorių tarpusavio sąveikos. įprastai uždegimo metu aktyvuoti imuninių ląstelių membranose esantys patogenų atpažinimo receptoriai paskatina branduolio veiksnio kapa B (angį, nuc/ear factor kappa B, NF-κΒ) aktyvaciją (15). NF-κΒ ląstelės branduolyje, prisijungdamas prie specifinių DNR sekų, inicijuoja taikininių genų transkripciją (16). Dėl to ląstelėje paskatinama uždegiminių citokinų, chemokinų, antiapoptozinių veiksnių, adhezijos molekulių produkcija (16). Pagrindinių uždegiminių citokinų (TNF-a, IL-Ιβ, IL-6) koncentracijos padidėjimas lemia imuninių ląstelių diferenciaciją ir migraciją į uždegimo vietą bei tolesnį uždegimo progresavimą.
Kiekvienas uždegiminės kaskados etapas yra reguliuojamas neigiamais ir teigiamais grįžtamaisiais ryšiais. Ypač dideliu reguliaciniu potencialu pasižymi molekulės, veikiančios uždegimo mediatorius koduojančių genų transkripciją branduolyje ar transliaciją citoplazmoje. Pavyzdžiui, acetilkofermento A (Acetyl-CoA) paskatintas histonų acetilinimas lemia suaktyvėjusią interferono gama (IFN-γ) geno transkripciją branduolyje, o IFN-γ skatina imuninių T ląstelių diferenciaciją (17). Tuo tarpu branduolyje transkribuotų genų raiška gali būti reguliuojama kito epigenetinio veiksnio ~ miRNR (20), Tai nedidelės (vidutiniškai 22 nukleotidų ilgio), viengrandės, nekoduojančios RNR molekulės, kurios daugiausia neigiamai veikia genų raišką, prisijungdamos prie informacinės RNR (iRNR) ir, priklausomai nuo sekos atitikimo lygio, inicijuodamos transkripto degradaciją ar slopindamos transliaciją ribosomose ir tokiu būdu inhibuodamos specifinių baltymų sintezę (20). Uždegiminio atsako reguliavime dalyvauja įvairios miRNR. Remiantis 2018 metais atliktu Fushimi tyrėjų grupės tyrimu, miR-140-3p dalyvauja osteoblastų diferenciacijos procesuose, tarpininkaudama tarp Wnt3 ir TGF-p3 signalinių kelių, tačiau detalesnis mechanizmas kol kas dar nėra žinomas (19). Be to, Taguchi su bendraautoriais savo darbe išskiria šią miRNR kaip vieną iš potencialiausių biožymenų PD diagnostikai (20). Tuo tarpu miR-145 slopina IL-6 ir IL-8 raišką bei mažina IL-Ιβ paskatintą membranų degradaciją (21, 22). Eksperimentiniame tyrime su pelėmis miR-145 inhibicija lėmė didesnę makrofagų infiltraciją bei uždegimą kepenyse, ir priešingai - eksperimentinis miR-145 raiškos padidinimas slopino makrofagų diferenciaciją, infiltraciją ir bendrą uždegimo intensyvumą (23). Taip pat uždegimo reguliacijoje reikšmingai dalyvauja ir miR~146a (24). Nepakankama miR-146a raiška yra siejama su uždegiminėmis bei autoimuninėmis ligomis - RA, sistemine raudonąja vilklige bei psoriaze (25). NF-kB skatina miR-146a raiškos padidėjimą, kuri, savo ruožtu, jungiasi prie patogeną atpažįstančių membranos receptorių ir slopina tolesnę NF-kB aktyvaciją (26). Tokiu neigiamu grįžtamuoju ryšiu miR-146a slopina tolimesnį uždegiminio atsako progresavimą. Be to, miR-146a mažina IL-Ιβ, IL-6, IL-8 bei TNF-o produkciją, aktyviųjų deguonies formų susidarymą, makrofagų chemotaksį ir tokiu būdu prisideda prie hipererginio uždegiminio atsako slopinimo (27, 28). Dėl šių savybių miR-146a yra laikoma viena daugiausiai žadančių molekulių įvairių uždegiminių ligų diagnostikai bei gydymui.
Akivaizdu, kad uždegiminio atsako intensyvumas yra pagrindinis diagnostinis ir prognostinis rodiklis vertinant PD eigą, tolesnio progresavimo riziką bei neigiamą sisteminį poveikį viso organizmo sveikatai. Visgi šiuo metu periodontologinėje praktikoje plačiai naudojami klinikiniai metodai - pilnas periodontologinis ištyrimas ir radiologinis ištyrimas ~ yra paremti dėl periodonto ligos jau įvykusios audinių destrukcijos sunkumo įvertinimu, o ne uždegiminio aktyvumo nustatymu. Vienintelis ligos intensyvumo vertinimui naudojamas klinikinis parametras yra kraujavimo po zondavimo indeksas. Šis indeksas ne visada objektyviai atspindi ligos eigą, nes indekso tikslumas priklauso nuo daugelio veiksnių: klinicisto zondavimo įgūdžių, zondavimui naudojamos jėgos, paciento vartojamų vaistų ir kt. Verta išskirti, kad rūkančiam pacientui šio indekso taikymas nėra racionalus dėl dantenų kraujagyslių pokyčių. Akivaizdus naujų diagnostinių žymenų bei naujų diagnostinių metodų poreikis PD vertinti yra akcentuojamas 2018 m. Europos periodontologų draugijos (angį. European Federation of Pertodontology, EFP) ir Amerikos periodontologų akademijos (angį. American Academy of Penodontology, AAP) pasaulinio kongreso pranešime (29).
Seilės yra vienas iš organizmo skysčių ir laikomos tinkamiausia biologine terpe neinvazinei PD ir kitų, ligų diagnostikai dėl kelių priežasčių (30). Pirmiausia, seilių surinkimas pacientui nesukelia diskomforto bei gali būti atliekamas ne tik specializuotoje gydymo įstaigoje, bet ir pirminės sveikatos priežiūros įstaigose, dėl ko didėja tikimybė nustatyti ligą ankstyvoje stadijoje - iki vėlyvų ligos simptomų pasireiškimo. Be to, seilėse aptinkamos įvairios lokaliai išskiriamos organinės kilmės medžiagos, įskaitant baltymus, metabolitus bei genetinę medžiagą. Kooijman vadovaujama tyrėjų grupė taiko baltymų kombinacijų identifikavimą seilėse, siekiant nustatyti lengvą ir pažengusį periodontitą (EP3553525). Kiekybiškai ir kokybiškai nustatoma baltymų piruvatkinazės (PK), matrikso metaloproteinazės-9 (MMP-9), SI 00 kalcį surišančio baltymo A9 (S100A9), S100 kalcį surašančio baltymo A8 (S100A8), hemoglobiną sudarančių grandinių β (Hb-beta) kombinacija. Taip pat, siekiant atskirti lengvą PD nuo pažengusio, Chatterjea rekomenduoja seilėse aptinkamų IL-Ιβ, IL-6, MMP-9, MMP-3 baltymų kombinacijos kokybinį ir kiekybinį identifikavimą (EP3407068). Siekiant pagerinti diagnostinio rinkinio tikslumą, Bakker ir kt. rekomenduoja MMP-8 bei hepatocitų augimo veiksnio (HGF) koncentracijos įvertinimą derinti su demografiniais rodikliais (lytis, kūno masės indeksas) (EP3407070).
Jau minėtas miRNR potencialas reguliuoti įvairių organizmo procesų homeostazę bei itin palankios diagnostinės savybės (nedidelis molekulės dydis, nesudėtingas ir tikslus identifikavimas ir kt.) lėmė tai, jog miRNR yra vienos plačiausiai tiriamų ir diagnostikai taikomų genetinių medžiagų. Šiuo metu yra 5 komerciniai diagnostiniai rinkiniai, kurie sėkmingai praėjo klinikinių tyrimų etapus (31). „ThyraMIR“ (Interpace Diagnostics) yra 10 miRNR identifikavimu paremtas diagnostinis rinkinys, skirtas nustatyti skydliaukės cistų piktybiškumą ir įvertinti chirurginės intervencijos poreikį. Nuo 2018 m. „ThyraMIR“ testavimas JAV yra finansuojamas valstybės ir rekomenduojamas atlikti prieš skydliaukės cistų chirurginį šalinimą. Tuo tarpu „miRview mets“ (Oncotesf) yra skirtas piktybinių navikų metastazių miRNR identifikavimui, siekiant nustatyti naviko kilmę. Europos miRNR diagnostikos lyderis TAmiRNA siūlo kraujyje cirkuliuojančių miRNR kombinacijų identifikavimą osteoporozės („OsteomiR“), trombocitų funkcijos („ThrombomiR“) bei audinių toksinių pažeidimų („ToxomiR“) įvertinimui. Kiti diagnostiniai rinkiniai, skirti vėžinių susirgimų, Alzheimerio ligos, kepenų pažeidimo toksinais vertinimui, yra klinikinių tyrimų fazėse (31). Nors miRNR identifikavimu paremtų diagnostinių rinkinių PD nustatymui patentuota kol kas nėra, tyrimai rodo kai kurių miRNR potencialą būti panaudotoms, kaip biologiniams PD žymenims. Pavyzdžiui, remiantis 2019 m. Fujimori Ir bendraautorių straipsniu, miR-381-3p koncentracija seilėse galimai koreliuoja su periodontologinių kišenių zondavimo gyliu ir gali būti naudojama neinvazinei PD diagnostikai (32).
Minėtos PD diagnostinių rinkinių patentų paraiškos (EP3553525; EP3407068; EP3407070) buvo pateiktos patentavimui iki 2018 metų liepos mėnesio, kai buvo paskelbta EFP ir AAP patvirtinta naujoji periodonto ligų klasifikacija (29). Nuo 2018 m. galiojančioje periodonto ligų klasifikacijoje pateikiami esminiai pokyčiai, kuriais remiantis ligos diagnozė yra nustatoma ne pagal prarastų periodonto audinių kiekį (kaulo, dantenų, periodonto jungties), bet pagal esamu laiku nustatomą periodonto audinių sveikatą. įvesta diagnozė - atitinkama periodonto būklė su ankstesniu periodonto jungties netekimu (29). Remiantis 1999 m. sudaryta ir iki 2018 m. galiojusia klasifikacija ši diagnozė atitiktų vidutinį ar sunkų periodontitą (33). Pagal anksčiau galiojusią periodonto ligų klasifikaciją sudaryti diagnostiniai metodai nėra suderinami su šiuo metu naudojamais ligos klasifikavimo kriterijais bei neatspindi Ilgos aktyvumo, dėl to galimai yra ne visiškai tikslūs. Taip pat, nepaisant to, kad parinktos baltymų ar miRNR kombinacijos yra siejamos su uždegiminiais procesais, patys diagnostiniai rinkiniai yra pagrįsti ne uždegimo aktyvumo, o labiau PD stadijos vertinimu. Itin svarbu, kad vertinant minėtų diagnostinių rinkinių tikslumą nebuvo dokumentuojamas sisteminių priešuždegiminių bei imunitetą slopinančių vaistų poveikis. Yra žinoma, kad šie vaistai, mažindami uždegiminių mediatorių kiekį organizme, gali maskuoti PD sunkumą (9). Dėt Šios priežasties nurodyti diagnostiniai rinkiniai negali būti naudojami pacientų, vartojančių sisteminių priešuždegiminių bei imunitetą slopinančių vaistų (pvz., vartojamų sergant RA ar kitomis autoimuninėmis ligomis), PD diagnostikai.
IŠRADIMO ESMĖ
Mūsų sukurtas diagnostinis rinkinys yra paremtas su uždegimu susijusių miRNR identifikavimu organizmo skysčiuose, todėl yra mažai invazinis. Šis metodas yra unikalus tuo, kad jis leidžia identifikuoti PD uždegimo aktyvumą tiek reumatologiškai sveikiems, tiek asmenims, sergantiems su periodontitu patogenetiškal glaudžiai susijusia liga - RA. Mūsų sukurta su PD susijusio uždegiminio aktyvumo nustatymo metodika ir rinkinys susideda iš kelių pagrindinių etapų: mėginių surinkimo, RNR skyrimo ir miRNR analizės kiekybinės atvirkštinės transkriptazės polimerazinės grandininės reakcijos (AT-kPGR) metodu. Šiuo išradimu siekiama sukurti mažai invazinį miRNR identifikavimu paremtą diagnostinį metodą ir rinkinį, skirtą įvertinti PD uždegiminį aktyvumą asmenims, sergantiems PD ir (arba) reumatoidiniu artritu. Išradimas įgalins mažai invazinę PD diagnostiką, taip pat bus naudojamas identifikuoti PD aktyvumą, kuris aktualus renkantis tolimesnę periodontologinio gydymo taktiką. Išradimas pritaikytas RA sergantiems pacientams, siekiant greitai ir tiksliai įvertinti PD sukelto uždegimo intensyvumą. Šio tikslinei pacientų grupei skirto diagnostinio metodo ir rinkinio poreikis grindžiamas tuo, kad RA sergantiems pacientams bet kokios kilmės aktyvus uždegimas organizme neigiamai veikia RA ligos klinikinę eigą bei gali riboti RA ligos eigai modifikuoti skirtų medikamentų skyrimą (pvz., metotreksato, biologinės terapijos ir kt).
TRUMPAS PAVEIKSLŲ APRAŠYMAS pav. Tiriamųjų grupės pagal periodontito (PD) ir reumatoidinio artrito (RA) statusą. KT - sveiki asmenys (PD~RA~), PD+RA- - tik PD sergantys asmenys, PD+ ~ asmenys, sergantys PD, nepriklausomai nuo RA statuso, RA+PD- ~ tik RA sergantys asmenys, RA+ - asmenys, sergantys RA, nepriklausomai nuo PD statuso, ir PD+RA+ - asmenys, sergantys Ir PD, ir RA.
pav. miRNR raiškos profilis periodontitu (PD) ir reumatoidiniu artritu sergančių tiriamųjų audiniuose: ž 25% mėginių aptiktų miRNR raiškos profilis (N-760) (A), miRNR raiškos profilis, gautas palyginus PD+ vs. PD- atvejus (N-177, FCž1,5, P<0,050) (B).
pav. Santykinė miR-140-3p, -145-5p, -146a-5p ir -195-5p raiška tik periodontitu (PD) (PD+RA-), PD ir reumatoidiniu artritu (RA) (PD+RA+) sergančių, ir sveikų asmenų (KT) dantenų audiniuose. Juodi brūkšniai žymi medieną, * P<0,050, ** P<0,010.
pav. Santykinė miR-140-3p, -145-5p, -146a-5p ir -195-5p raiška sunkia periodontito (PD) forma (Iii ir IV stadijos) sergančių ir sveikų asmenų (KT) dantenų audiniuose. Juodi brūkšniai žymi medianą, * P<0,050, *** P<0,001.
pav. Santykinė miR-140-3p, -145-5p, -146a-5p ir-195-5p raiška periodontitu sergančių ir sveikų asmenų dantenų audiniuose pagal periodontito jungties netekimo lygio (CAL) (A), kišenių zondavimo gylio (PPD) (B), kraujavimo po zondavimo indekso (BOP) (C) ir rentgenologinio kaulo netekimo (BL) (D) rodiklius. Juodi brūkšniai žymi medianą, * P<0,050, ** P<0,010 ir *** P<0,001.
pav. MiR-140-3p, -145-5p, -146a-5p ir-195-δρ kiekio palyginimas tarp tik PD sergančių (PD+RA-) ir sveikų asmenų (KT) (A) ir tarp PD sergančių, nepriklausomai nuo RA statuso (PD+) ir periodontologiškai sveikų asmenų (PD~) (B) dantenų vagelės skysčio mėginių. Juodi brūkšniai žymi medianą, * P<0,050 ir ** P<0,010.
pav. MiR-140-3p, -145-5p, -146a-5p ir >195-5p kiekio palyginimas tarp sunkia periodontito (PD) forma (III ir IV stadijos) sergančių ir sveikų asmenų (KT) dantenų vagelės skysčio mėginių. Juodi brūkšniai žymi medianą, * P<0,050, ** P<0,010 ir *** P<0,001.
pav. MiR-140-3p, -145-5p, -146a-5p ir -195-5p kiekio palyginimas tarp skirtingomis periodontito (PD) formomis (I, II, III ir IV stadijos) sergančių ir sveikų asmenų (KT) dantenų vagelės skysčio mėginių. Juodi brūkšniai žymi medianą, * P<0,050, ** P<0,010 ir*** P<0,001.
pav. MiR-140-3p, -145-5p, -146a-5p ir -195-5p kiekio palyginimas periodontitu sergančių ir sveikų asmenų dantenų vagelės skysčio mėginiuose pagal periodontito jungties netekimo lygio (CAL) (A), kišenių zondavimo gylio (PPD) (B), kraujavimo po zondavimo indekso (BOP) (C) ir rentgenologinio kaulo netekimo (BL) (D) rodiklius. Juodi brūkšniai žymi medianą, * P<0,050, ** P<0s010 ir*** P<0,001.
pav. Svarbiausios asociacijos tarp miRNR kiekio tiriamųjų seilių mėginiuose ir klinikinių-patologinių periodontito (PD) rodiklių: miR-140-3p kiekio skirtumai taip asmenų, sergančių skirtingomis PD formomis (I ir IV stadijos) (A), miR-145-5p kiekio skirtumai tarp asmenų grupių su skirtingais kišenių zondavimo gylio (PPD) (B) ir rentgenologinio kaulų netekimo (BL) (C) rodikliais. Juodi brūkšniai žymi medianą, * P<0,050.
pav. MiR-145-5p ir -195-5p kiekio kraujo plazmoje palyginimas tarp tik periodontitu (PD) sergančių (PD+RA-)ir sveikų asmenų (KT) (A), sergančių PD, nepriklausomai nuo RA statuso (PD+) ir periodontologiškai sveikų asmenų (PD-) (B). Juodi brūkšniai žymi medianą, * P<0,050 ir ** P<0,010.
pav. MiR-145-5p (A), -195-5p (B) ir 146a-5p (C) kiekio palyginimas tarp skirtingomis periodontito (PD) formomis šaipančių (I, II, III ir IV PD stadijos) ir sveikų (KT) asmenų kraujo plazmos mėginių. Juodi brūkšniai dėžučių viduje žymi vidurkį, „ūsai“ ~ mažiausią ir didžiausią reikšmes, taškai ~ išskirtys, * P<0,050, ** P<0,010 Ir *** PO,001.
pav. MiR-145-δρ, ~146a~6p ir -195-5p kiekio palyginimas periodontitu sergančių ir sveikų asmenų kraujo plazmos mėginiuose pagal periodontito jungties netekimo lygio (CAL) (A), kišenių zondavimo gylio (PPD) (B) ir rentgenologinio kaulo netekimo (BL) (C) rodiklius. Juodi brūkšniai žymi medianą, * PO,050 ir ** ΡΟ,ΟΙΟ.
pav. Dantenų vagelės skystyje (DVS) cirkuliuojančių miRNR ROC kreivių analizė: miR-140-3p (A), miR~145-5p (B), miR-146a-5p (C) ir miR-195 -5p (D), miR145-5pM46a-5p (E) ir visų miRNR (F) derinys. AUC ~ plotas po ROC kreive.
pav. Kraujo plazmoje cirkuliuojančių miRNR ROC kreivių analizė: miR-1403p (A), miR-145-5p (B), miR-146a-5p (C) ir mlR-195-5p (D), miR-145-5p/-195-5p (E) ir visų miRNR (F) derinys. AUC ~ plotas po ROC kreive.
IŠSAMUS IŠRADIMO APRAŠYMAS
Šio tyrimo tikslas buvo ištirti miRNR raiškos profilį PD paveiktuose ir sveikuose dantenų audiniuose, įvertinant autoimuninės ligos ~ RA poveikį. Tiriamųjų miRNR diagnostinis potencialas buvo vertinamas dantenų vagelės skysčio (DVS), seilių ir kraujo plazmos mėginių atveju.
1. Tiriamieji
IŠ viso į tyrimą buvo įtraukta 240 Vilniaus universiteto Santaros ir Žalgirio klinikų pacientų. Dalyviai buvo suskirstyti į dvi grupes pagal periodonto būklę:
1) PD+ (tiriamoji) grupė -148 asmenys, kuriems PD diagnozuotas pagal 2018 m. Amerikos periodontologijos akademijos (AAP) ir Europos periodontologijos federacijos (EFP) periodonto ligų klasifikaciją [17].
2) PD- (kontrolinė) grupė ~ 92 periodontologiškai sveiki asmenys.
įvertinus tiriamuosius pagal 2010 m. ACR / EULAR reumatoidinio artrito klasifikavimo kriterijus [16], iš viso RA buvo diagnozuotas 64 asmenims PD+ grupėje Ir 30 - PD- grupėje. Visos tyrimo grupės parodytos 1 pav.
| tyrimą nebuvo įtraukti asmenys turintys mažiau nei 8 dantis, sergantieji cukriniu diabetu, asmenys, vartojantys periodonto audinius galinčius paveikti vaistus (kalcio kanalų blokatoriai, anti-epileptiniai vaistai) bei nėščios moterys.
Tyrimą patvirtino Vilniaus regioninis biomedicines tyrimų etikos komitetas (patvirtinimo Nr. 158200-18-922-500). Prieš tyrimo pradžią buvo gautas rašytinis visų tyrimo dalyvių sutikimas. Tyrimas buvo atliktas vadovaujantis 1975 m. Helsinkio deklaracijos, patikslintos 2013 m., principais.
2. Periodontologinis vertinimas
Klinikinį periodontologinį vertinimą atliko tyrėjas periodontologas, atlikdamas viso burnos zondavimą šešiuose taškuose bei rentgenologinj ištyrimą. Apskaičiuotas klinikinio ištyrimo vidinio suderinamumo Kappa koeficientas siekė 0,86 remiantis periodonto jungties netekimo (angį, clinical attachment toss, CAL) pakartotiniu vertinimu.
Apžiūros metu buvo vertinami šie rodikliai: 1) GAL, 2) kišenių zondavimo gylis (angį, pocket probing depth, PPD), 3) kraujavimas po zondavimo (angį, bleeding on probing, BOP), 4) rentgenologinis kaulo netekimas (angį, bone toss, BL), 5) netektų dantų skaičius. Tretieji krūminiai dantys ir implantai nebuvo vertinami. Remiantis klinikinio ištyrimo parametrais, tiriamieji buvo grupuojami atsižvelgiant į 2018 m.
AAP/EFP gaires. Asmeniui buvo diagnozuojamas PD, nustačius su periodontitu susijusį CAL dviejuose ar daugiau ne šalia esančiuose tarpdančiuose arba nustačius CAL £3 mm bei zonduojant >3 mm gylio kišenes bukaliniuose paviršiuose prie daugiau nei dviejų dantų. Pacientai buvo suskirstyti į keturias grupes pagal PD išsivystymo lygį: I stadija - pradinė, II stadija - vidutinė, III stadija - sunki, IV stadija - pažengusi sunki PD. Uždegimo aktyvumas periodonto audiniuose buvo nustatytas įvertinus PPD ir BOP rodiklius periodontologinio ištyrimo metu.
Vidutinės BL vertės gautos remiantis standartizuotu Rydeno ir jo kolegų pateiktu protokolu [19]. Buvo vertinami pirmųjų ir antrųjų krūminių dantų distaliniai ir metaliniai paviršiai. Prieš ištyrimą, atliktų dantų nuotraukų vaizdo kokybė buvo suskirstyta j tris grupes (puiki, priimtina ir nepriimtina), remiantis pakeistomis 1997 m. Kalifornijos odontoiogų asociacijos gairėmis (20). j periodontologinio ištyrimo vertinimą buvo įtrauktos tik dantų vietos, kurių nuotraukų vaizdo kokybė buvo priimtina ar puiki bei dantys su aiškiai matomais vainikėliais. Alveolinio kaulo rezorbcija buvo įvertinta sudarant proporciją ir vertinant atstumą nuo cemento emalio jungties iki aiveoiinio kauto ketros ir lyginant šį atstumą su visu šaknies ilgiu.
Anketa buvo naudojama užregistruoti antropometrinius ir sociodemograflnius rodiklius (amžių, lytį, kūno masės indeksą, išsilavinimą, rūkymo statusą, alkoholio vartojimo ir burnos sveikatos priežiūros įpročius (dantų valymo dažnumą ir metinę dantų priežiūros profilaktiką).
3. Reumatologinis įvertinimas
Tiriamųjų klinikinę RA būklę vertino gydytojas reumatologas, nustatant ligos aktyvumo indeksą (angį, disease activity score, DAS28), vizualinę analogų skalę (VAS, 100 mm) bei C-reaktyviojo baltymo koncentraciją (CRB, mg/l) [21]. Taip pat buvo registruojama RA ligos trukmė, arba taikomas RA gydymas gliukokortikoidais (prednizolonas, metilprednizolonas), sintetiniais ligą modifikuojančiais antireumatiniais vaistais (angį, synthetic disease-modifying antirheumatic drugs, sDMARD) (metotreksatas, sulfasalazines ir kt), ir (arba) biologiniais ligą modifikuojančiais antireumatiniais vaistais (angį, biologic disease-modifying antirheumatic drugs, bDMARD) (TNF-α inhibitoriai, IL-6 receptorių antagonistai, anti-CD20 monokloniniai antikūnai). Be to, siekiant įvertinti RA įtaką sergančiųjų gyvenimo kokybei ir pačiai ligai, buvo naudojami RA ligos poveikio (angį. RA impact of disease, RAID) ir sveikatos vertinimo (angį, health assessment questionnaire, HAQ) klausimynai [22, 23],
Informacija apie RA ligos seropozityvumą (teigiamą reumatoidinį faktorių (RF) ir (arba) antikūnus prieš ciklinį citrulininį peptidą (anti-CCP)) ir CRB koncentraciją buvo surinkta iš sergančiųjų medicininių duomenų.
4. Mėginių surinkimas
Dantenų mėginiai buvo surinkti iš visų tyrimo dalyvių. Audinių biopsijos mėginiai iš PD sergančių asmenų buvo renkami iš giliausios periodonto kišenės periodontologinės apžiūros metu. Dantenų audiniai iŠ periodontaliai sveikų asmenų buvo paimti chirurginio vainiko prailginimo ar kitų intervencinių su tyrimu nesusijusių procedūrų metu. Surinkti dantenų audinių biopsijos mėginiai buvo talpinami ir iki naudojimo laikomi RNR stabilizavimo tirpale RA/A/ater™ (Thermo Fisher Scientific (TFS), JAV).
DVS mėginiai buvo renkami pašalinus supragingivalines apnašas, seiles ir izoliavus dantis medvilniniais kaiščiais. Šio organizmo skysčio surinkimui iš PD sergančių asmenų į periodonto kišenę buvo patalpinami sterilūs skystį absorbuojantys popieriniai kaiščiai ir laikomi 30 sekundžių. PD nepaveiktiems asmenims DVS buvo rinktas žandikaulio kaplių gomurinėje pusėje. Vienam tiriamojo DVS surinkimui buvo naudojami bent 5 popieriniai kaiščiai. Visi krauju užteršti kaiščiai buvo išmesti. Tyrimui tinkami kaiščiai buvo sudėti į 2 ml mėgintuvėlį su 20 pi RNA/ater ™ tirpalo.
Seilių mėginiai buvo surinkti iš visų į tyrimą įtrauktų asmenų. Dalyvių buvo paprašyta mažiausiai 2 valandas prieš seilių surinkimą susilaikyti nuo valgymo ir gėrimo. Pirmiausia, tiriamieji 1 minutę skalavo burną distiliuotu vandeniu, kurį po to išspjovė. Tuomet dalyvių buvo paprašyta į sterilų mėgintuvėlį išspjauti mažiausiai 2 ml seilių. Po surinkimo, seilių mėginiai buvo 15 min. centrifuguojami 2600 * g greičiu. Nuo ląstelinės fazės atskirtas supernatantas buvo perkeltas į sterilių 2 ml mėgintuvėlį, pridėjus RNazių slopikiio SUPERase ™ (TFS, JAV).
Plazmos mėginiai taip pat buvo surinkti iš visų į tyrimą įtrauktų asmenų. Kraujo mėginiai buvo renkami į sterilius BD Vacutainer® mėgintuvėlius su etilendiamintetraacto rūgšties dikalio druskos (K2-EDTA) antikoaguliantu (BectonDickinson, Barricor ™, JAV), naudojant 21 G adatą. Surinkti kraujo mėginiai buvo 15 min. centrifuguojami 2000 * g greičiu. Po centrifugavimo plazma buvo perkelta į sterilius 2 ml mėgintuvėlius.
Visi paruošti mėginiai buvo užkoduoti, paženklinti ir iki panaudojimo saugomi
-80 °C temperatūroje.
5. Visuminės RNR skyrimas
Užšaldyti dantenų mėginiai pirmiausia buvo mechaniškai homogenizuojami iki smulkių miltelių, panaudojant grūstuvėlę ir piestelę. Visuminės RNR skyrimui buvo naudojamas TR/zo/™ (Invitrogen, TFS, JAV) reagentas, remiantis gamintojo rekomendacijomis.
RNR gryninimui iŠ DVS, seilių ir kraujo plazmos mėginių buvo naudojamas miRNeasy Mini Kit (Qiagen) rinkinys, remiantis gamintojo protokolu. Trumpai, DVS, seilių ir plazmos mėginiai buvo užpilami Q/Azo/® Ilzės reagentu (Qiagen) ir 5 min. inkubuojama. Tuomet, įpylus 200 p! chloroformo inkubuota dar 2-3 min. ir įnešta 25 fmol cel-miR-39 (TaąManTM MicroRNA Assay, Applied Biosystems (ABI), TFS; gamintojo kodas 000200), kuri buvo naudojama kaip RNR gryninimo efektyvumo kontrolė. Išskirta RNR iki panaudojimo buvo saugoma -80 °C temperatūroje. Visuminės RNR kokybė ir kiekis buvo vertinami naudojant NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, JAV) spektrofotometrą ir Qubit 4 (Invitrogen, TFS) fluorometrą.
6. Visuminė miRNR raiškos analizė miRNR mikrogardelėmis
Visuminei miRNR raiškos profilio analizei iš viso buvo pasirinkta ir ištirta 16 mėginių. Trumpai, 100 ng visuminės RNR buvo maišoma su sintetine kontroline miRNR Spike-ln tirpalo (Agilent Technologies (AT), JAV), defosforilinta, denatūruota ir žymėta 3-pCp cianino dažais, laikantis miRNA Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit (AT) protokolo. Žymėti mėginiai išdžiovinami koncentratoriuje, resuspenduojami ir hibridizuojami ant Human microRNA Microarray 8 x 60K formato mikrogardelių (AT). Po 20 vai. 55 °C hibridizavimo krosnyje, mikrogardelės plaunamos genų raiškos gardelių plovimo rinkinio buferiais (AT) ir skenuojamos naudojant Agilent SureScan skenerį ir Agilent Microarray Scan Control programinę įrangą.
7. Kopijinės DNR (kDNR) sintezė
Pasirinktų miRNR raiškos analizei dantenų audinių biopsijos mėginiuose reikalinga kDNR buvo sintetinama atvirkštinės transkripcijos (AT) (angį, reverse transcription, RT) reakcijos metu, naudojant TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit rinkinį ir specifinį RT Primer Pool pradmenų mišinį (ABI, TFS), remiantis gamintojo protokolu. į paruoštą, sumaišytą ir nucentrifuguotą reakcijos mišinį (12 μΙ/1 reakcijai) įnešama 3 μ! (350 ng) visuminės RNR ir 5 min. inkubuojama ant ledo. AT atlikta termocikleryje gamintojo rekomenduojamu temperatūrinio režimu: 30 min. 16 °C, 30 min. 42 °C, 5 min. 85 °C ir pasibaigus reakcijai laikoma 4 °C temperatūroje.
kDNR sintezei skysčių biopsijos mėginiuose taip pat buvo naudojamas TagMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit rinkinys kiekvienam genui ir mėginiui renkant atskiras reakcijas. Reakcijoje buvo naudojami specifiniai atrinktų miRNR (miR140-3p, -145, -146a ir-195) smeigtuko formos pradmenys TagMan® MicroRNA Assay (gamintojo kodai: 002234,002278,000468 ir 000494, atitinkamai), remiantis gamintojo protokolu (viskas iš ABI, TFS) (1 lentelė), j paruoštą reakcijos mišinį (3,5 pl/1 reakcijai) įnešama 1,5 μΙ kiekvienai tiriamajai miRNR specifinių AT reakcijos pradmenų ir 2,5 pi (1-10 ng) visuminės RNR. Nucentrifugavus inkubuojama termocikleryje anksčiau minėtomis sąlygomis. Susintetinta kDNR buvo iškart naudojama tolimesniuose tyrimo etapuose arba iki panaudojimo saugoma -20 °C temperatūroje.
lentelė. Atvirkštinės transkripcijos reakcijos metu naudojamų TaqMan® Assays pradmenų (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, JAV) gamintojo kodai ir subrendusios miRNR sekos.
| miRNR pavadinimas | Kodas | Subrendusios miRNR nukleotidų seka |
| miR-140-3p | 002234 | UACCACAGGGUAGAACCACGG |
| miR-145-5p | 002278 | GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU |
| miR-146a-5p | 000468 | UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU |
| miR-195-5p | 000494 | UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC |
8. Kiekybinė atvirkštinės transkriptazės polimerazinė grandininė reakcija (ATkPGR)
Atrinktų miRNR raiška dantenų audinių mėginiuose buvo vertinama naudojant TagMan® mažo tankio gardeles (angį. Customized TaqMan® Low Density Arrays), remiantis gamintojo protokolu (ABI, TFS). Kiekvienam mėginiui buvo ruošiamas atskiras reakcijos mišinys, sudarytas iš 2x TaqMan Universal Master Mix II, No
AmpErase UNG, vandens be nukleazių ir kDNR, į paruoštos gardelės užpildymo rezervuarą suleidžiama 100 μΙ reakcijos mišinio ir centrifuguojama 2 min. 2000 rpm greičiu. Užsandarintos gardelės patalpinamos į VfiA7™ Real-Time PCR sistemą, ir naudojant ViiA 7 Software v1,2 programinę įrangą (ABI, TFS) paleidžiama reakcijos vykdymo programa gamintojo rekomenduojamu temperatūriniu režimu: 2 min. 50 °C, 10 min. 95 °C, 40 ciklų po 15 s 95 °C, ir 1 min. 60 °C temperatūroje.
miRNR kiekis skysčių biopsijos mėginiuose buvo nustatytas atliekant ATkPGR, naudojant pradmenų ir zondų mišinius TaqMan™ MicroRNA Assays, remiantis gamintojo protokolu. Kiekviena miRNR buvo tiriama atliekant tris pakartojimus. Taršos nustatymui buvo naudojama kontrolė, kai vietoj mėginio įnešamas vanduo (angį, notemplate control, NTC). 20 μΙ/1 reakcijai paruošto reakcijos mišinio, kurį sudarė 2 χ TaqMan ™ Universal Master Mix II, No AmpErase UNG, 20 * TaqMan™ MIcroRNA Assay (abu iš ABI, TFS), vanduo be nukleazių ir 1,33 pl kDNR buvo įnešama į atitinkamus plokštelės šulinėlius. Reakcijos sąlygos ir naudojama įranga atitinka anksčiau aprašytas, vietoj 40 ciklų, naudojant 50.
9. Statistinė analizė
Visi duomenys buvo analizuojami naudojant SPSS v20.0 (IBM, Armonk, NY), GeneSpnng GX v14.9 (AT), GenEx v7.0 (MultiD Analyzes AB, Švedija). Siekiant patikrinti dispersijos homogeniškumą, buvo atliktas Shapiro-Wilk'o testas. Organizmo skysčių tyrime pradiniai duomenys buvo papildomai normalizuojami pagal sintetinę kontrolę ~ cel-miR-39. Normalizuoti ir į logaritminę skalę (logs) konvertuoti įverčia! buvo analizuojami ΔΔΟΐ metodu. miRNR raiškos ir kiekio analizei tarp tiriamųjų grupių bei pagal klinlkinius-patologinius, tiriamąją ligą modifikuojančius ir demografinius rodiklius taikytas t testas. Skirtumai laikyti statistiškai reikšmingais, kai P reikšmė buvo <0,050, oFC>1,5.
Diagnostinis atrinktų miRNR potencialas buvo vertinamas atliekant ROC (angį. receiver operating characteristic) kreivių analizę, apskaičiuojant jautrumą, specifiškumą bei plotą po kreive AUC (angį, area under the ROC curve). Analizė atlikta naudojant GraphPad Prism v8.4.2 (GraphPad Software, Inc,, San Diego, CA) programinę įrangą. Logistinė regresinė analizė biožymenų deriniams buvo atlikta MedCalc (MedCalc Software bv, Ostend, Belgium) programa.
IŠRADIMO ĮGYVENDINIMO PAVYZDŽIAI pavyzdys. miRNR derinio pasirinkimas ir validavimas minimaliai ir neinvazinei PD diagnostikai
Visuminė miRNR raiškos analizė dantenų audiniuose miRNA raiška buvo analizuota 16 dantenų audinių mėginių, surinktų iš PD sergančiųjų (PD+) (N-8) ir periodontologiškai sveikų asmenų (PD-) (N-8). Iš 2569 tirtų miRNR, atrinkus tik tas, kurių raiška vyko £25 % mėginių, toliau buvo analizuojamos 760 miRNR (2A pav.). miRNR raiškos analizė dantenų mėginiuose atskleidė 177 statistiškai reikšmingai pakitusios raiškos miRNR PD paveiktus audinius palyginus su periodontologiškai sveikais dantenų audiniais (PD+ vs. PD-) (2B pav.). Didžiosios dalies miRNR (N-140,79,1%), pavyzdžiui miR-30a-5p, -125a-3p, -126-5p, -1273g-3p, -140-3p, -145-5p , -146a-5p, -155-5p, -195-Sp, -575, -630, -3917 ir kt., raiška buvo padidėjusi >2 kartus. Specifiškumas PD buvo įvertintas palyginus tik PD sergančių asmenų grupę (PD+RA-, N-4) su kontroline sveikų asmenų grupe (KT, N=4). Iš viso buvo nustatyta 118 pakitusios raiškos miRNR, iš kurių 77 (65,3%) buvo padidėjusios (miR-140-3p, -550a-3-5p, -765, -1273g-3p, -3917 ir kt.), o 41 (34,7%) (miR-1246, -2103p, -375 Ir kt.) - sumažėjusios raiškos. Siekiant nustatyti miRNR sąsajas su uždegiminėmis ligomis buvo lyginami abiejomis ligomis sergančių pacientų (PD+RA+, N-4) ir KT grupės dantenų mėginiai. Nustatyta, kad 22 (miR-550a-3-5p, -140-3p, -765 ir kt.) iš 29 pakitusios raiškos miRNR buvo padidėjusios raiškos. Palyginus asmenis, sergančius tik RA (N=4) su KT grupe, nustatytos 56 reikšmingai pakitusios raiškos miRNR, iš kurių 50 (89,3%) buvo sumažėjusios (miR-34c-5p, -3620-5p, -330-5p ir kt.), o 6 (10,7%) - išaugusios raiškos miRNR (mlR-339-3p, -711, -4701-5p ir kt.).
miRNR mikrodalelių analize taip pat buvo siekta nustatyti su PD susijusias miRNR RA sergančių ir reumatologiškai sveikų asmenų dantenų audiniuose, remiantis raiškos pokyčiu kartais (angį, fold change), P reikšmingumo rodikliu bei potencialiu miRNR vaidmeniu uždegiminiuose ar autoimuniniuose procesuose. Atlikus PD+ vs. PD-, PD+RA- vs. KT ir PD+RA+ vs. KT palyginimus buvo atrinktos labiausiai išaugusios raiškos miRNR, iš kurių 9 (miR-30a-5p, -125a-3p, -145-5p, -146a-5p, -1555p, -195-5p, -423-5p, -575 ir -630) buvo padidėjusios raiškos PD+ vs. PD- ir PD+RA+ va. KT, o 4 (miR~126-5p, -195-5p, -1273g-3p ir -3917) - PD+ vs. PD- PD+RA- va. KT palyginimuose. Reikšmingai išaugusi miR-140-3p ir -765 raiška buvo nustatyta atitinkamai visose trijose aukščiau paminėtose grupėse ir PD+RA- va. KT. Be to, abiejų šių miRNR raiška buvo padidėjusi PD+RA+ vs. KT atveju. Sumažėjusi visų 15 atrinktų miRNR raiška buvo nustatyta abiejose su RA susijusiose lyginamosiose grupėse (PD-RA+ vs. KT ir RA+ vs. RA-). Vis dėlto tik miR-140-3p atveju nustatyti raiškos pokyčiai (FO-1,8, P-0,033), palyginus tik RA sergančiųjų asmenų grupę su KT grupe (PD-RA+ vs. KT), buvo statistiškai reikšmingi.
Atsižvelgiant j visuminės miRNR raiškos analizės rezultatus, tolesniam tyrimo etapui buvo pasirinktos 15 miRNR: miR-30a-5p, -1250-¾ -126-5p, -140-3p, -145-5p, ~146a~5p, -155-5p, -195-5p, -423-5p, -550a-3-5p, -575, -630, -765, -1273g-3p ir-3917. Toliau, nustatyti pokyčiai buvo vaizduojami didesnėje dantenų audinių mėginių imtyje (N-80) AT-kPGR metodu.
miRNR raiškos vaizdavimas dantenų audiniuose ir miRNR atranka
AT-kPGR metodu ištyrus 80 dantenų audinių mėginių nustatyta, kad dalis tirtų miRNR buvo reikšmingai susijusios su PD. Šiame etape, kaip ir visuminės miRNR raiškos analizės atveju, tik PD sergančių asmenų audiniuose (N~25), nustatyta padidėjusi miR-145-5p Ir miR-140-3p raiška (atitinkamai FC~2,1, P<0,0001 ir FC~1,4, P=0,019), palyginus su KT (N~25) grupe (3 pav.). Mikrogardeiių analizėje gautus rezultatus atitiko ir išaugusi miR-140-3p raiška (FC-1,5, P-0,017), kuri buvo nustatyta palyginus PD+RA+ tiriamosios grupės audinius (N-23) su KT dantenų audinių mėginiais (3 pav.). Vis dėlto, miR-125a-3p ir miR-1273g-3p raiška buvo sumažėjusi (FC<-1,5; P<0,05) PD+RA+ vs. KT ir PD+ vs. PD- (N=32 vs. 48) lyginamosiose grupėse. Statistiškai reikšmingų miR-146a-5p raiškos pokyčių dantenų audinių mėginiuose nustatyta nebuvo.
miR-145-5p ir miR-140-3p raiška dantenų audiniuose buvo reikšmingai išaugusi sunkia PD forma (III ir IV stadijos) sergančių asmenų grupėje. Palyginus su KT grupe, sunkia PD forma sergančių asmenų grupėje nustatyta reikšmingai padidėjusi miR-145-5p ir miR-140-3p raiška (atitinkamai FC-2,2, P<0,001 ir FC-1,3, P=0,026) (4 pav.), ir sumažėjusi miR-125a-3p raiška (FC-2,2, P<0,001). Reikšmingai pakitusi miR-145-5p raiška buvo nustatyto sunkia PD forma sergančiųjų dantenų audiniuose, palyginus su vidutinio sunkumo PD (II stadija) sergančiųjų asmenų audiniais (FC-2,0, P=0,007). Atlikus vidutinio sunkumo PD ir KT atvejų palyginimą nustatyta statistiškai reikšmingai išaugusi miR-195-5p (FC=1t7, P=0,038) ir sumažėjusi miR-125a-3p (FC--3,5, P-0,013) raiška.
Taip pat, nustatytos reikšmingos pasirinktų miRNR asociacijos su klinikiniaispatologiniais PD rodikliais, tokiais kaip CAL, PPD, BOP ir BL. Daugiau nei 2,2 karto padidėjusi miR-145-5p raiška (P<0,001) ir 1,6 karto sumažėjusi miR-3917 (P-0,022) raiška buvo nustatyta tiriamųjų, kurių CAL buvo £2,5 mm, atveju, palyginus su asmenimis, kurių CAL - <2,5 mm (5A pav.). MiR-145”5p raiškos padidėjimas (FC-2,1, P<0,001) dantenų audinyje taip pat buvo nustatytas asmenims, kurių PPD buvo £3 mm, palyginus su tiriamaisiais, kurių PPD buvo <3 mm (5B pav.). Daugiau negu 2 kartus padidėjusi miR-145-5p (P<0,001) ir miR-140-3p (P-0,009) bei tiek pat kartų sumažėjusi miR-125a-3p (P«0,001) raiška nustatyta grupėje, kurią sudarančių tiriamųjų BOP buvo £33 %, palyginus su atvejais, kurių BOP yra <33 % (5C pav.). MiR145-5p (P<0,001) ir miR-140-3p (P~0t007) raiškos padidėjimas (5D pav.) bei miR125a-3p sumažėjimas (P~0,001) buvo nustatytas palyginus tiriamųjų, kurių BL rodikliai buvo £20 % ir <20 %, grupes.
Palyginus tik RA sergančių asmenų grupę (PD-RA+) su KT grupe, statistiškai reikšmingai pakitusios raiškos miRNR nustatyta nebuvo. Atlikus RA+ vs. RA~ palyginimą nustatytas miR-1273g-3p raiškos padidėjimas (FC—1,6, P<0,001) RA sergančiųjų grupėje. Be to, buvo pastebėtos kai kurių miRNR raiškos pokyčių sąsajos su RA klinikiniais rodikliais. Tiriamųjų, kuriems buvo nustatytas didelis RA aktyvumas (DAS28£5,1), irtų, kuriems nustatyta DAS28 remisija (DAS28<2,6) audiniuose miR145~5p raiška buvo sumažėjusi (FC—3,1, P-0,026). Taip pat buvo pastebėta, jog RA sergančių bDMARD vaistais negydytų asmenų audiniuose miR-140-3p raiška buvo 1,6 karto didesnė (P-0,004), palyginus su bDMARD vartojusiais tiriamaisiais.
Keturios miRNR ~ miR-140-3p, -145-5p, -146a-5p ir-195, kurių raiška dantenų audiniuose buvo išaugusi labiausiai, buvo pasirinktos tolimesnei analizei organizmo skysčių biopsijos mėginiuose: DVS (N=120), seilėse (N-173) ) ir kraujo plazmoje (N-151). Minėtos miRNR atrinktos remiantis raiškos pokyčiu kartais lyginamosiose grupėse, reikšmingumo rodikliu P, sąsajų su PD klinikiniais-patologiniais rodikliais bei potencialia jų funkcija uždegiminiuose ar autoimuniniuose procesuose.
Cirkuliuojančių miRNR analizė organizmo skysčiuose
1. miRNR analizė dantenų vagelės skystyje (DVS)
Ištyrus tik PD (PD+RA-) sergančiųjų asmenų DVS mėginius nustatyta reikšmingai mažiau miR-146a-5p (P-0,044), palyginus su KT grupe (6A pav,). Taip
LT 6066 B pat, sumažėjęs miR-146a-5p (P<0,001) ir padidėjęs miR-145-5p (P-0,027) kiekis buvo pastebėtas PD+ vs. PD- lyginamosios grupės atveju (68 pav.). Abiejose minėtose PD paveiktose tiriamųjų grupėse nustatyta daugiau miR-140-3p ir mažiau miR-195~5p, tačiau skirtumai nebuvo statistiškai reikšmingi.
Nustatyta koreliacija tarp DVS miRNR kiekio ir PD ligos sunkumo: padidėjęs miR-140-3p (P-0,001), miR-145-5p (P=0,001) ir sumažėjęs miR-146a-5p (P<0,001) ir miR-195-5p (P-0,042) kiekis buvo užfiksuotas sunkia PD forma sergančiųjų DVS mėginiuose, palyginus su KT grupės mėginiais (7 pav.).
Statistiškai reikšmingos asociacijos taip pat buvo nustatytos tarp DVS miRNR ir skirtingų PD ligos sunkumo stadijų. Tarpusavyje palyginus asmenis, sergančius II ir I stadijos PD, nustatytas reikšmingai didesnis kiekis miR-140-3p (P-0,002). Be to, III stadijos PD sergančių asmenų grupės DVS mėginiuose buvo nustatytas reikšmingas miR-140-3p lygio padidėjimas (FC-1,5, P-0,001) ir miR-146a-5p kiekio sumažėjimas (FC-1,7, P = 0,010). Daugiau miR-140-3p (FC=1,6, P<0,001) ir miR-145-5p (FO1S6, P=0,030) bei mažiau miR-195-5p (FC =-1,5, P=0,002) ir miR-146a-5p (FO-1,7, P=0,004) nustatyta pažengusia sunkia PD forma (IV stadija) sergančių asmenų DVS mėginiuose, palyginus su pradine (I) PD stadija sergančių tiriamųjų grupe. 8 pav. iliustruoja miR-140-3p (A), -145-5p (B), -146a-5p (C) ir -195-5p (D) kiekio pokyčius DVS skirtingų PD stadijų atveju.
Reikšmingos asociacijos taip pat buvo nustatytos tarp DVS miRNR ir PD klinikinių rodiklių - CAL, PPD, BOP ir BL, grupuojant tiriamuosius pagal kiekvieno rodiklio ribines reikšmes. Asmenys, kurių CAL buvo ž2,5 mm, turėjo didesnį DVS miR140-3p (P<0,001) ir miR-145-5p (P=0,025) bei mažesnį miR-146a-5p (P=0,002) ir miR195-5p (P=0,042) kiekį, palyginus su asmenimis, kurių CAL buvo <2,5 mm (9A pav.). Analogiški skirtumai pastebėti tiriamųjų, kurių PPD rodiklis buvo ž3 mm, atveju: padidėjęs miR-140-3p (FC=1,4, P<0,001) ir miR-145-5p (FC=1,8, P<0,001) bei sumažėjęs miR-195-5p (FC=-1,5, P<0,001) ir miR-146a-5p (FC-1,7, P<0,001) kiekis (98 pav,). miR-140-3p (P=0,012) ir miR-145-5p (P=0,026) kiekio padidėjimas ir miR146a-5p ~ sumažėjimas (P=0,002) buvo nustatytas asmenų, kurių BOP rodiklis buvo >33 %, atveju (9C pav.). Išanalizavus miRNR kiekio skirtumus tarp tiriamųjų pagal BL rodiklį, daugiau miR-140-3p (P<0,001) ir miR-145-5p (P=0,001) bei mažiau miR-1955p (P = 0,012) Ir miR-146a-5p (P<0,001) nustatyta tiriamųjų, kurių BL buvo ė20 %, DVS mėginiuose (9D pav.),
Reikšmingas miR«140-3p kiekio sumažėjimas (P=0,018) nustatytas tik RA sergančių asmenų DVS mėginiuose, palyginus KT grupe. Panašios asociacijos pastebėtos ir palyginus tiriamųjų grupes pagal RA klinikinius rodiklius. Šios miRNR kiekio sumažėjimas (P~0,013) užfiksuotas aukštesniu HAQ indeksu įvertintų tiriamųjų grupėje, palyginus su KT grupe. Be to, pastebėta, jog bDMARD vaistais gydyti asmenys turėjo reikšmingai daugiau DVS miR-146a-5p (FC = 1,7, P = 0,023), nei minėtais vaistais negydyti RA sergantieji.
2. miRNR analizė seilėse
Atrinktų miRNR analizė seilių mėginiuose parodė, kad tik PD (PD+RA-) arba abejomis ligomis sergančių (PD+RA+) tiriamųjų grupėse buvo nustatyta daugiau miR145-5p, -195-5p ir mažiau miR~146a~5ps palyginus su KT grupe. Analogiški skirtumai buvo nustatyti atlikus PD+ vs. PD™ palyginimą, tačiau rezultatai nebuvo statistiškai reikšmingi (P>0,050), Taip pat, pastebėtos sąsajos tarp miRNR kiekio seilėse ir skirtingų PD ligos sunkumo stadijų: palyginus IV PD stadiją su I stadija, nustatyta 1,5 karto daugiau seilių miR-140-3p (P=0,016) (10A pavj.
Atlikta analizė taip pat atskleidė reikšmingas seilių miRNR sąsajas su PD klinikiniais-patologiniais rodikliais, tokiais kaip PPD ir BL. Seilėse cirkuliuojančios miR145-5p kiekis buvo 1,5 karto didesnis asmenų su didesniais PPD (£3 mm) ir BL (ž20 %) rodikliais atveju (atitinkamai 10B ir 10C pav.; abiejuose palyginimuose P=0,034).
Reikšmingos asociacijos buvo nustatytos tarp RA sergančiųjų seilių miRNR ir HAQ indekso. Asmenų, kurių HAQ indeksas buvo vidutinis arba aukštas, seilėse buvo aptikta daugiau mlR-140~3p (FC-1,7, P-0,013). Be to, palyginus su visiškai sveikų (KT) asmenų grupe, tiriamųjų, kurių HAQ jverčiai buvo žemi, vidutiniai ir aukšti, seilėse buvo nustatytas reikšmingas miR-195-5p kiekio padidėjimas (FC=1,8, P=0,017).
3. miRNR analizė kraujo plazmoje
AT-kPGR analizė kraujo plazmoje atskleidė miR-145-5p kiekio padidėjimą (FO2,3, P-0,002) ir miR-195-5p sumažėjimą (FO-2,6, P-0,001) tik PD sergančių asmenų kraujo plazmos mėginius palyginus su KT grupe (11A pav.). Analogiški skirtumai buvo pastebėti ir PD+ vs. PD- lyginamojoje grupėje (11B pav.).
Taip pat buvo nustatyta, kad I ir II PD stadijos siejosi su reikšmingu miR-1955p kiekio sumažėjimu (atitinkamai FO-4,8, P<0,001 ir FC-2,3, P=0,013) ir miR-1455p padidėjimu (atitinkamai FC-4,8, P<0,001 ir FC-1,8, P-0,037,), palyginus su KT grupe. IV PD stadija sergančių asmenų kraujo plazmoje nustatyti didesni miR-195-5p (FC=4,2, P<0,001), -146a-5p (FO1.6, P-0,003) ir mažesni miR-145-5p (FC=-5,6, P0,001) kiekiai palyginus su I PD stadija sergančiaisiais. Analogiški miR-195-5p (FC~4,7, PO,001) ir -145~5p (FC=M,7, PO,001) kiekių skirtumai nustatyti palyginus III PD stadijos atvejus su I stadijos PD. Asmenų, sergančių IV PD stadija kraujo plazmoje nustatyta patikimai daugiau miR-146a-5p (ΡΟ,ΟΙβ), palyginus III PD stadijos atvejais. 12 pav. iliustruoja miR-145-δρ (A), -195-5p (B) ir -146a-5p (C) kiekio pokyčius plazmos mėginiuose skirtingų PD stadijų atveju.
Analizė atskleidė ir atrinktų miRNR sąsajas su PD klinikiniais rodikliais. Tiriamųjų, kurių CAL buvo £2,5 mm, kraujo plazmoje buvo nustatytas reikšmingas miR146a-5p kiekio padidėjimas (P-0,011) ir miR-145-5p sumažėjimas (PO,014) (13A pav.). Daugiau miR-195-5p (FC-1,8, PO,039) ir-146a-5p (FC-1,3, PO,024) ir mažiau miR-145-5p (FC--2.2, PO,002) nustatyta tiriamųjų, kurių PPD buvo £3 mm, grupėje (13B pav.). Analogiški skirtumai buvo nustatyti analizuojant sąsajas su BL rodikliais (13Cpav.).
Taip pat RA sergančiųjų kraujo plazmoje buvo nustatytas dvigubai didesnis miR-145-5p kiekis nei KT grupėje (PO,036). Reikšmingų asociacijų taip atrinktų miRNR ir RA klinikinių rodiklių užfiksuota nebuvo.
Cirkuliuojančių miRNR diagnostinio potencialo vertinimas
Siekiant įvertinti diagnostinį atrinktų miRNR potencialą buvo atlikta ROC analizė, apskaičiuojant plotą po kreive (angį, area under the curve, AUC) bei įvertinant jautrumo ir specifiškumo rodiklius kiekvienai miRNR ir jų deriniams DVS, seilių ir kraujo plazmos mėginiuose.
DVS atveju, įvertinus kiekvieną miRNR atskirai, didžiausiu diagnostiniu potencialu pasižymėjo miR-146a-5p, kurios AUC vertė siekė 0,640 (P~0,016). Aukšta diagnostinė vertė buvo nustatyta ir DVS miR-145-5p (AUC®0,616, P=0,044), Vis dėlto, didesniais jautrumo ir specifiškumo pasižymėjo miR-146a-5p, palyginus su miR-1455p (atitinkamai 61,90 % vs. 58,33 % ir 61,11 % vs. 58,33 %). įvertinus miR-145-5p/146a~5p derinio diagnostinį potencialą, nustatyta AUC vertė buvo 0,645 (PO,012), o jautrumo ir specifiškumo rodikliai, atitinkamai 61,90 % ir 61,11 %, Apjungus visas keturias tirtas miRNR, nustatyta didžiausia AUC vertė - 0,666 (PO,007), o jautrumo ir specifiškumo įvarčiai panašūs j aukščiau minėtų miR-146a-5p ir miR-145»5pM46a
5p derinio atveju (14 pav.)).
Iš visų keturių atskirai kraujo plazmoje tirtų miRNR didžiausia AUC vertė ~ 0,617 (P~0,020) buvo nustatyta miR-195-5p atveju, su 57,84% jautrumo ir 57,14% specifiškumo rodikliais. Panašios jautrumo ir specifiškumo vertės, tačiau šiek tiek aukštesnė AUC (0,622, P-0,015) reikšmė buvo gauta miR-145-5p/-195-5p deriniui, {vertinus visų keturių miRNR derinio diagnostinį potencialą nustatyta šiek tiek mažesnė AUC vertė - 0,619 (P=0,018), tačiau didesni jautrumo (61,76%) ir specifiškumo (61,22%) rodikliai (15 pav.).
Statistiškai reikšmingų rezultatų seilių miRNR atveju nustatyta nebuvo.
pavyzdys. Diagnostikos rinkinys uždegiminiam PD aktyvumui nustatyti
Rinkinj PD uždegiminiam aktyvumui nustatyti sudaro:
a) sterilūs mėgintuvėliai, popieriaus kaiščiai DVS mėginių surinkimui ir RNR stabilizavimo tirpalas; sterilūs mėgintuvėliai su antikoaguliantu kraujo mėginių surinkimui; sterilūs mėgintuvėliai su RNazių slopikliu seilių mėginių surinkimui ir RNR stabilizavimui;
b) silikagelio kolonėlės RNR skyrimui iš organizmo skysčių mėginių;
c) pradmenys, fermentai ir buferiai kDNR sintezei;
d) pradmenų ir hidrolizės zondų bei PGR mišiniai kiekybiniam su PD susijusių miRNR nustatymui.
Mes ištyrėme miRNR raiškos profilį PD paveiktuose ir sveikuose dantenų audiniuose, neatsižvelgiant į RA statusą. Atlikus visuminės miRNR analizės metu gautų raiškos pokyčių validavimą buvo atrinktos keturios miRNR (miR-140-3p, -1455p, -146a~5p ir -195-5p), kurių raiška PD paveiktuose audiniuose buvo reikšmingai pakitusi, palyginus su sveikais dantenų audiniais. Minėtos miRNR dalyvauja imuninės sistemos ir uždegiminių procesų reguliacijoje ir atlieka svarbų vaidmenį kituose su PD susijusiuose procesuose, tokiuose kaip periodonto audinių nykimas ir osteoklastogenezė. Atrinktų miRNR analizė organizmo skysčių biopsijos (DVS, seilių ir plazmos) mėginiuose parodė, kad tirtų miRNR kiekiai reikšmingai skiriasi tarp PD sergančių ir sveikų asmenų, o didesni jų kiekiai koreliuoja su prastesnę PD ligos eigą indikuojančiais klinikiniais-patologiniais rodikliais, {vertinus miR-140-3p, -145~5p,
146a-5p ir -195-5p diagnostinį potencialą, nustatyta, kad šios keturios miRNR derinyje gali būti naudojamos kaip biologiniai žymenys mažai invazinei PD diagnostikai asmenims sergantiems ir nesergantiems RA. Optimalios atrinktų miRNR derinio santykinės raiškos ribinės reikšmės DVS ir kraujo plazmos mėginiuose yra atitinkamai - 0,290 (14F pav.) ir 0,380 (15F pav.). Be to, tai įgalina įvertinti PD aktyvumą, kuris yra svarbus tolesnės periodonto gydymo taktikos pasirinkime. Pažymėtina, kad šios srities specialistams galima atlikti kai kurias modifikacijas nenukrypstant nuo šio išradimo taikymo srities, todėl išradimo apsaugos apimtis atsispindi pridedamoje apibrėžtyje.
Literatūra:
R. C, Page, P. I. Eke. Case definitions for use in population-based surveillance of periodontitis. J Periodontal. 2007;78:1387-99.
P. I. Eke, 8.A. Dye, L. Wei, G. O. Thornton-Evans, and RJ. Genco. Prevalence of Periodontitis in Adults in the United States: 2009 and 2010. J DENT RES 2012 Oct;91 (10):91420
Tonetti MS, Jepsen S, Jin L, Otomo-Corgei J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. J Clin PerindontoL 2017:44(5):456-462. doi:10.1111/jcpe. 12732
Bansal M, Khatri M, Taneja V. Potential role of periodontal infection in respiratory diseases - a review. J Med Life. 2013;6(3):244-248.
Sanz M, Marco Del Castillo A, Jepsen S, et al. Periodontitis and cardiovascular diseases: Consensus report. J Clin Periodontal. 2020:47(3):268-288. dok10.1111/jGpe,13189
Dhotre S V, Davane M S, Nagoba B S. Periodontitis, Bacteremia and Infective Endocarditis: A Review Study, Arch Pediatr Infect Dis. 2017 ; 5(3):e41067. dot: 10.5812/pedinfect.41067.
Chapple IL. Time to take periodontitis seriously. BMJ 2014;348:g2645.
C. Xiu-Min, H. Qing-Chun, Y, Sheng-Li, C. Yong-Liang, Y. Yu-Hong, H. Ling, H. Yu, H. Run-Yue, PhD. Role of Micro RNAs tn the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis Medicine (Baltimore). 2015 Aug; 94(31): 1326
Hussain S8, Botelho J, Machado V, et al. Is there a bidirectional association between rheumatoid arthritis and periodontitis? A systematic review and meta-analysis. Semin Arthritis Rheum. 2020:50(3):414-422. doM0.1016/j.semarthrit.2020.01.009
Cosgarea R, Tristiu R, Dumitru RB, et al. Effects of non-surgical periodontal therapy on periodontal laboratory and clinical data as well as on disease activity in patients with rheumatoid arthritis. C/m Ora/ Investig. 2019;23(1):141-151. doi: 10.1007/s00784-018-2420-3
K. Ishida, T. Kobayashi, S. Ito, Y. Komatsu, T. Yokoyama, M. Okada, etai. Interleukin6 gene promoter methylation in rheumatoid arthritis and chronic periodontitis. J Periodontol. 2012:83(7):917-25.
I. Silosi, M. Cojocaru, L. Foia, M. V. Boldeanu, F. Petrescu, P. Surlin, V. Biciusca. Significance of Circulating and Crevicular Matrix Metalloproteinase-9 in Rheumatoid ArthritisChronic Periodontitis Association. Journal of Immunology Research. 2015; 218060 - 6.
S. O. Geerts, V. Legrand, J. Charpentier, A. Albert, E. H. Rompen. Further evidence of the association between periodontal conditions and coronary artery disease. J Periodontol 2004;75:1274-80.
Lang NP, Bartold PM. Periodontal health. J Clin Periodontol. 2018:45 Suppl 20:S9S16. doi:10.1111/jcpe.12936
Saresella M, La Rosa F, Piancone F, et al. The NLRP3 and NLRP1 inflammasomes are activated in Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 2016:11:23. Published 2016 Mar 3. doi: 10.1186/s13024-016-0088-1
Liu T, Zhang L, Joo D, Sun SC. NF-κΒ signaling in inflammation. Signal Transduct Target Then 2017:2:17023-. doi: 10.1038/sigtrans.2017.23
Gaber T, Strehl C, Buttgereit F. Metabolic regulation of inflammation. Nat Rev Rheumatol. 2017; 13(5):267-279. doi: 10.1038/nrrheum.2017.37
R. Dai, S. A. Ahmed. MicroRNA, a new paradigm for understanding immunoregulation, inflammation, and autoimmune diseases. Transl Res 2011; 157:163-179.
Fushimi S, Nohno T, Nagatsuka H, Katsuyama H. Involvement of miR-140-3p in Wnt3a and TGF£3 signaling pathways during osteoblast differentiation in MC3T3-E1 cells. Genes Cells. 2018;23:517-27
Taguchi YH, Murakami Y. Principal component analysis based feature extraction approach to identify circulating microRNA biomarkers. PLoS One. 2013;8(6):e66714
O’Leary L, Sevinę K, Papazoglou IM, Tildy B, Detillieux K, Halayko AJ, et al. Airway smooth muscle inflammation is regulated by microRNA-145 in COPD. REBS Lett (2016) 590:1324—34. doi: 10.1002/1873-3468.12168
Yang B, Kang X, Xing Y, Dou C, Kang F, Li J, et al. Effect of microRNA-145 on IL-1 βinduced cartilage degradation In human chondrocytes. FEBS Lett (2014) 588:2344-52.
doi:10.101 ^.febslet.ŽOI4.05.033
He M, Wu N, Leong MC. et ai. miR-145 improves metabolic inflammatory disease through multiple pathways. J Mol Cell Biol. 2020; 12(2): 152-162. doi:10.1093/|mcb/mjz015
Kutty RK, Nagineni CN, Samuel W, Vijayasarathy C, Jaworski C, Duncan T, et al. Differential regulation of microRNA~146a and microRNA-146b-5p in human retinal pigment epithelial cells by interieukin-ΐβ, tumor necrosis factor-α, and interferon-γ. Mol Vis (2013) 19:737-50.
Xu W-D, Lu M-M, Pan H-F, Ye D-Q. Association of MicroRNA-146a with autoimmune diseases. Inflammation (2012) 35(4):1525-9. doi :10.1007/s10753-012-9467-0
Haumik D, Scott G, Schokrpur S, Patil C, Campis! J, Benz C. Expression of microRNA-146 suppresses NF-κΒ activity with reduction of metastatic potential in breast cancer cells. Oncogene (2008) 27:5643-7. doi:10.1038/onc.2008.171
Zheng C, Shu Y, Luo Y, Luo J. The role of miR-146a in modulating TRAF6-induced inflammation during lupus nephritis. Ear Rev Med Pharmacol Sci (2017) 21:1041-8.
Li M, Wang J, Fang Y, Gong S, Li M, Wu M, et ai. MicroRNA-146a promotes mycobacterial survival in macrophages through suppressing nitric oxide production. Sci Rep (2016) 6:23351. doi:10.1038/srep23351
Caton J.G., Armitage G., Berglundh T., Chappie I.L.C., Jepsen S., Kornman K.S., Mealey B.L, Papapanou P.N., Sanz M., Tonetti M.S, A new classification scheme for periodontal and peri-implant diseases and conditions —Introduction and key changes from the 1999 classification. J. Clin. Periodontal. 2018;45:S1-S8. doi: 10.1111/jcpe.12935
Ji S, Choi Y. Point-of-care diagnosis of periodontitis using saliva: technically feasible but still a challenge. Front Cell Infect Microbiol, 2015:5:65. Published 2015 Sep 3. doi: 10.3389/fcimb.2015.00065
Bonneau E, Neveu B, Kostantin E, Tsongalis GJ, De Guire V. How close are miRNAs from clinical practice? A perspective on the diagnostic and therapeutic market. EJIFCC. 2019:30(2):114-127. Published 2019 Jun 24,
Armitage GC. Development of a classification system for periodontal diseases and conditions. Ann Periodontal. 1999; 4: 1-6.
Claims (7)
- Būdas, skirtas diagnozuoti uždegiminį periodontito aktyvumą reumatoidiniu artritu sergančių ir nesergančių asmenų organizmo skysčių mėginiuose, apimantis šiuos žingsnius: a. RNR skyrimą iš dantenų vagelės skysčio, seilių ar veninio kraujo mėginių, naudojant mažiausiai penkis sterilius popierinius kaiščius, vandeninį RNR stabilizavimo tirpalą, RNazių slopiklį ir antikoaguliantą, pagal RNR skyrimo procedūrą; b. kDNR sintezės atlikimą atvirkštinės transkripcijos metodu; c. AT-kPGR atlikimą, siekiant aptikti su periodontitu susijusias miRNR minėtuose mėginiuose; d. duomenų analizę, siekiant nustatyti periodontitui-specifinių miRNR kiekį.
- Būdas pagal 1 punktą, kur naudojamas antikoaguliantas yra etilendiamintetraacto rūgšties dikalio druska.
- Būdas pagal 1 punktą, kur naudojamas RNR stabilizavimo tirpalas stabilizuoja RNR nepažeistuose mėginiuose ir yra suderinamas su atliekamomis RNR skyrimo procedūromis.
- Būdas pagal 1 punktą, kur minėta RNR skyrimo procedūra apima mėginių lizavimą fenolio/guanidino tirpalu gryninimui naudojant silikagelio kolonėles, kuriomis išskiriama visuminė RNR, įskaitant <200 nt ilgio RNR.
- Rinkinys, skirtas periodontito uždegiminio aktyvumo nustatymui, apimantis: a. sterilius mėgintuvėlius ir popierinius kaiščius dantenų vagelės skysčio mėginiams surinkti ir tirpalą RNR stabilizavimui; sterilius mėgintuvėlius su antikoaguliantu veninio kraujo mėginiams surinkti; sterilius mėgintuvėlius seilių mėginiams surinkti ir RNazių slopiklį seilių RNR stabilizavimui; b. silikagelio kolonėles RNR gryninimui iš organizmo skysčių mėginių; c. pradmenis, fermentus ir buferius kDNR sintezei; d. pradmenų ir hidrolizės zondų bei PGR mišinius kiekybiniam periodontitui-specifinių miRNR nustatymui.
- Būdas pagal 1 punktą ir rinkinys pagal 6 punktą, kur organizmo skysčiai yra dantenų vagelės skystis, seilės ir kraujo plazma.
- Būdas pagal 1 punktą ir rinkinys pagal 6 punktą, kur periodontitui-specifinės miRNR yra: miR-140-3p, miR-145-5p, miR-146a-5p ir miR-195-5p.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2021004A LT6966B (lt) | 2021-02-11 | 2021-02-11 | Diagnostinis miRNR rinkinys skirtas periodontito uždegiminio aktyvumo vertinimui pacientuose su reumatoidiniu artritu |
| EP21158255.6A EP4043587A1 (en) | 2021-02-11 | 2021-02-19 | Diagnostic micro-rna kit for the evaluation of the inflammatory activity of periodontitis in patients with rheumatoid arthritis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2021004A LT6966B (lt) | 2021-02-11 | 2021-02-11 | Diagnostinis miRNR rinkinys skirtas periodontito uždegiminio aktyvumo vertinimui pacientuose su reumatoidiniu artritu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT2021004A LT2021004A (lt) | 2022-08-25 |
| LT6966B true LT6966B (lt) | 2022-12-27 |
Family
ID=74672239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2021004A LT6966B (lt) | 2021-02-11 | 2021-02-11 | Diagnostinis miRNR rinkinys skirtas periodontito uždegiminio aktyvumo vertinimui pacientuose su reumatoidiniu artritu |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4043587A1 (lt) |
| LT (1) | LT6966B (lt) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017195268A1 (ja) * | 2016-05-10 | 2017-11-16 | 株式会社アイシーエレクトロニクス | ｍｉＲＮＡをマーカーとする歯周炎検査キット、及び検査方法 |
| EP3407070A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-28 | Koninklijke Philips N.V. | Diagnostics of periodontitis based on salivary hgf and mmp-8 |
| EP3407068A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-28 | Koninklijke Philips N.V. | Diagnostics of mild or advanced periodontitis based on salivary il-1beta and mmp-9 |
| EP3553525A1 (en) | 2018-04-12 | 2019-10-16 | Koninklijke Philips N.V. | Diagnostics of mild or advanced periodontitis |
-
2021
- 2021-02-11 LT LT2021004A patent/LT6966B/lt unknown
- 2021-02-19 EP EP21158255.6A patent/EP4043587A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| LT2021004A (lt) | 2022-08-25 |
| EP4043587A1 (en) | 2022-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107849610B (zh) | 早期阿尔茨海默病或轻度认知障碍诊断方法 | |
| Chan et al. | MicroRNAs: new insights into the pathogenesis of endodontic periapical disease | |
| Rovas et al. | Analysis of periodontitis-associated miRNAs in gingival tissue, gingival crevicular fluid, saliva and blood plasma | |
| CN110241208A (zh) | Trem2作为早期诊断冠心病的分子标志物的应用 | |
| US20240271216A1 (en) | Salivary extracellular rna biomarkers for gingivitis | |
| Kang et al. | [Retracted] The Expression of miR‐23a and miR‐146a in the Saliva of Patients with Periodontitis and Its Clinical Significance | |
| Louzada et al. | Teeth with vital pulps and stage III periodontitis unresponsive to therapy exhibit a pulpal inflammatory profile similar to symptomatic irreversible pulpitis | |
| Lee et al. | Oral microbiome profiles of gingivitis and periodontitis by next-generation sequencing among a group of hospital patients in Korea: A cross-sectional study | |
| CN108841951A (zh) | 一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的rnase2基因引物对及其试剂盒 | |
| CN111647673A (zh) | 微生物菌群在急性胰腺炎中的应用 | |
| Balu et al. | Cytokine levels in gingival tissues as an indicator to understand periodontal disease severity | |
| Jeon et al. | Transcriptomic profiles and their correlations in saliva and gingival tissue biopsy samples from periodontitis and healthy patients | |
| CN102639715B (zh) | 人源化抗-TNFα抗体药物针对类风湿性关节炎的药效预测方法及药效预测装置 | |
| JP2022061491A (ja) | 慢性副鼻腔炎の患者を分類するためのデータの取得方法、およびその利用 | |
| LT6966B (lt) | Diagnostinis miRNR rinkinys skirtas periodontito uždegiminio aktyvumo vertinimui pacientuose su reumatoidiniu artritu | |
| US11104946B2 (en) | DNA sequences related to diagnosis and treatment of systemic inflammatory response syndrome | |
| Bachtiar et al. | ACE2 gene expression and inflammatory conditions in periodontal microenvironment of COVID-19 patients with and without diabetes evaluated by qPCR | |
| Sehrawat | New perspectives of human saliva as genetic biomarker in early disease diagnostics | |
| CN118406751A (zh) | 用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的tsRNA、试剂盒及其应用 | |
| WO2010038840A1 (ja) | 関節リウマチに対する抗ＴＮＦα抗体薬の薬効予測方法、及び薬効予測装置 | |
| CN113584193B (zh) | 毛螺菌属作为评估慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物疗效的标志物的应用 | |
| EP3365462B1 (en) | Detection of bacterial infection | |
| JP3771502B2 (ja) | 精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸を解析する方法 | |
| JP2011004743A (ja) | 関節リウマチ患者におけるインフリキシマブ薬効の有効性を判別する方法 | |
| Harbood et al. | Salivary Fractalkine Differentiating Periodontitis from Periodontally Healthy Subjects |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB1A | Patent application published |
Effective date: 20220825 |
|
| FG9A | Patent granted |
Effective date: 20221227 |
|
| PD9A | Change of patent owner |
Owner name: VSI VILNIAUS UNIVERSITETO LIGONINE SANTAROS KLINIKOS, SANTARISKIU G. 2, 08406 VILNIUS, LT Effective date: 20250114 |