KR970009897B1 - 저온처리에 의한 생체 임상의학용 키틴 및 키토산의 제조방법 - Google Patents

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Description

저온처리에 의한 생체 임상의학용 키틴 및 키토산의 제조방법

본 발명은 게 갑각으로부터 저온처리에 의해 고순도 및 고백색도로 키틴을 분리하는 방법 및 이로부터 고 순도, 고 분자량, 고 탈아세틸화도 및 고 백색도를 갖는 생체 임상의학용 키토산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

키틴은 지구상에 섬유소 다음으로 풍부한 천연고분자 물질로서, 갑각류 동물의 갑각으로부터 상업적으로 추출되는 고 부가가치의 생 고분자이다. 이러한 키틴은 수불용성이므로 활용에 큰 장애가 되고 있다. 따라서, 키토산을 탈아세틸화시켜 키토산을 얻음으로써 약산성 액성에서 수용성이 발현되는 키토산으로 전환시킬 수 있으며, 이러한 수용성 키토산이 산업적으로 키틴보다 더 유용하게 이용되고 있다.

최근들어 게 및 새우의 대량 어획으로 수산 폐기물인 갑각의 처분에 관심을 가지게 되면서 이로부터 추출 가능한 키틴의 이용도를 다양하게 개발하려 하게 되었다. 이들 키틴 및 키토산은 초기에는 식품 공장 폐수내의 유효물질(단백질 등)을 회수하는 응집제로 쓰였으나, 최근들어서는 식품 분야, 의료의학분야, 기능성막, 효소 및 미생물의 고정화 담체 등과 같은 생물공학 분야, 화장품 분야, 농업 분야, 화공 분야, 환경 분야 등 전 분야에 걸쳐 폭넓게 개발되고 있다.

지금까지 널리 이용되고 있는 키틴의 제법은 키틴의 주원료인 게나 새우 껍질을 전처리 한후 잘게 자르거나 부수어 결체 조직인 단백질을 제거하고, 이를 다시 염산 수용액중에 침지시켜 탄산 칼슘을 제거함으로써 키틴을 수득하고 것이다. 키틴의 구조식은 다음과 같다 :

상기 구조식의 키틴에서 생물학적 또는 화학적 처리에 의해 아세틸기를 제거하여 유리 아미노(-NH₂)를 생성시킴으로써 키토산을 쉽게 수득할 수 있다. 키토산의 구조식은 다음과 같다 :

상기 구조식에서 알 수 있듯이 키토산은 섬유소에 존재하는 수산기의 하나가 유리 아미노기로 치환된 상태이므로 그 화학적 반응성과 화학적 개질면에서 유리하다.

키틴의 일반적인 제조공정은 다음과 같다 : 게나 새우를 탈육시킨 후 제조 효율을 높이기 위해 0.5 내지 3cm의 크기로 분쇄시킨다. 이어서, 약 5%의 염산용액 중에서 실온하에 탈탄산칼슘 반응을 시킨 다음 5%의 수산화나트륨 수용액에 침지시켜 실온 또는 고온에서 수시간 동안 가열함으로써 단백질을 제거한다. 마지막으로 95% 에탄올 중에서 수시간 동안 환류시켜 키틴을 수득한다.

공지된 또 하나의 방법으로서, 갑각을 세척하고 50℃의 진공오븐에서 건조시킨 다음 분쇄시켜 10% NaOH 용액에 침지시킨다. 탈단백질된 키틴을 수세한 후 용매로 수회 세척한다. 수득된 생성물을 감압하에서 건조한 후 -20℃의 염산 수용액에서 4시간 유지시킨 후 세척한다. 염산에의 침지와 세척을 반복한다(휘슬러-베미러(Whistler BeMiller)법).

또 다른 방법은, 갑각을 세척하고 100℃에서 건조한 다음 실온에서 2N 염산용액으로 5시간 처리하고 세척 및 건조하여 미세 분말로 분쇄한다. 분말을 2N 염산 용액으로 0℃ 하에서 교반하면서 추출한 후 수거된 물질을 세척한 후 100℃ 하에서 1N NaOH 수용액으로 추출한다. NaOH 수용액 처리를 수회 반복한다(해크만(Hackman)법).

키토산은 불용성인 키틴을 탈아세틸화함으로써 수득할 수 있는데, 일반적으로 30% 내지 50%의 수산화나트륨 용액을 키틴량의 약 20배 정도 사용하여 5 내지 20시간 동안 처리한다.

상술한 기존의 키틴 분리 방법들에 있어서, 틸탄산 칼슘 반응의 경우 염산 수용액 처리를 낮은 농도로 상온 또는 대략 10℃ 이상의 온도에서 수행하는데, 이는 탄산칼슘의 제거는 용이해지나 분자쇄의 절단이 증가되어 분자량이 높은 키틴을 얻기가 곤란하며, 단백질 제거를 위한 NaOH 용액 처리시에도 여러 단계에 걸쳐 12시간 이상의 장시간이 소요된다는 단점이 있다.

이러한 문제점을 극복하고자, 본 출원인은 염산 처리온도를 -10℃ 내지 10℃로 낮추고, 불활성 대기하에 NaOH 처리를 2단계로 수행하여 단시간에 고순도 및 고백색도의 키틴을 수득하고 이로부터 고분자량, 고탈아세틸화도 및 고백색도의 키토산을 수득하는 방법을 제시한 바 있다(대한민국 특허출원 제93-1657호).

그러나, 상기 방법들의 경우, -10℃ 이상의 HCl 처리온도에서는 갑각에 존재하는 적색의 제거가 용이하지 않기 때문에 고백색도를 얻기 위해 갑각의 HCl 처리후, 1차 NaOH 처리후 및 2차 NaOH 처리후의 3회에 걸쳐 유기용매 추출을 수행하여야 하는 번거로움이 따르게 된다.

따라서, 본 발명자들은 상술한 문제점을 해소하고, 고 순도, 고백색도 및 고 분자량을 필요로 하는 의약 및 식품용도에 적합한 키틴 및 키토산을 수득할 수 있는 방법에 대해 계속하여 연구한 결과, 키틴 제조시 HCl의 처리온도를 염산에 의한 키틴 분자쇄의 절단이 방지되는 -10℃ 이하로 낮추고 HCl 수용액의 농도를 2N 이상으로 상승시키면 HCl 처리후 유기용매 세척을 1회만 하여도 적색이 모두 제거되므로 키틴 제조공정수를 줄이고, 제조 단가를 현저히 낮출 수 있을 뿐 아니라 비교적 고순도, 고백색도의 키틴 및 이로부터 유도된 고탈아세틸화도, 고백색도 및 고반자량의 키토산을 수득할 수 있음을 알게되어, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 고 순도 및 고 백색도로 키틴올 수득하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 그렇게 수득된 키틴으로부터 고 백색도, 고 분자량 및 고 탈아세틸화도의 키토산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

즉, 본 발명은, 게 갑각을 건조시켜 보관하는 단계, 건조된 게 갑각을 분쇄시키는 단계, 분쇄된 게 갑각을 1.5 내지 7N의 염산 수용액으로 -40 내지 -10℃ 미만의 온도하에 3 내지 20시간 동안 처리하는 단계, 염산 처리된 게 갑각을 연속적으로 수세, 여과, 용매처리 및 건조하여 조 키틴을 수득하는 단계, 수득된 조 키틴을 NaOH 수용액에 침지시켜 가열 처리하는 단계 및 NaOH 처리된 키틴을 수세, 여과, 및 건조시키는 단계를 포함하는 고순도 및 고백색도를 가진 생체 임상의학용 키틴의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 상술한 바와 같은 방법에 의해 수득한 키틴에 NaOH 수용액을 가하여 80 내지 100℃의 온도에서 2 내지 12시간 가열처리한 후 수세 및 여과하는 단계, 수득된 조 키토산을 탈이온수에 이어 유기 용매의 수용액에 침지시킨 후 여과 및 건조시키는 단계 및 상기 NaOH 수용액 처리 및 유기 용매처리 공정을 반복하는 단계를 포함하는 키토산 제법에 관한 것이다.

본 발명을 더욱 자세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 갑각을 건조시키기 전에 갑각으로부터 육질 부분을 효과적으로 분리하기 위해 열수처리를 통상 수행하는데 일반적으로 갑각을 40 내지 50℃ 온도의 더운물 중에서 30분 내지 1시간 동안 침지시킴으로써 수행한다.

수거한 갑각을 수세한 후 탈수기로 건조시키고 상온에서 에탄올, 메탄올, 아세톤, 테트라히드로푸란(THF), 디옥산 또는 메틸에틸케톤(MEK)과 같은 유기 용매에 일정시간, 예를 들면 30분 내지 1시간 동안 침지한 후 그늘에서 건조(보통 수분함량 8 내지 12%)시킨 후 서늘한 상태로 보관하였다가 차후의 단계에 사용한다. 보관 상태가 불량하면 보존시 부패가 일어나므로, 분자량 저하가 수박되고 변질되어 높은 품질의 키틴을 얻기가 어렵다.

육질이 제거된 갑각은 보다 효과적인 염산 처리를 위해 분쇄하는 것이 바람직하다. 일반적으로 통상의 분쇄기에 의해 0.5 내지 3mm의 크기 또는 200 내지 300메쉬(mesh)의 크기로 분쇄하여 반응시키는 것이 바람직하다.

이어서, 갑각으로부터 석회질(CaCO₃)을 제거하기 위해, 1.5 내지 7N의 염산 수용액을 -40 내지 -10℃미만, 바람직하게는 -35 내지 -10℃ 미만의 온도로 조절한 다음 기계적 교반기로 교반하면서 갑각(통상 수분함량 8 내지 12%)을 첨가하고 그 온도에서 3 내지 20시간 동안 유지함으로써 갑각의 염산처리 단계를 수행한다.

본 발명에서 사용한 염산 수용액의 농도 및 온도가 1.5 내지 7N의 고농도 및 -40 내지 -10℃ 미만의 저온이라는 것이 본 발명의 중요한 특징이며, 반응 시간을 단축시킬 수 있게 하는 요인이다. 염산 처리시 기계적 교반기는 50 내지 200rpm, 보통 100rpm의 속도로 교반하며, 처리공정 중 적절한 시기에 새로운 염산 수용액으로 1,2회 교환하는 것이 바람직하다. 또한 교반속도가 200rpm 이상이 되면 염산 처리 효능이 저하되므로 주의하여야 한다.

염산 처리에 의해 석회질이 제거된 갑각은 이어서 잔류하는 염산 성분을 제거시킨다. 갑각을 물에 침지한 후 NaOH 수용액을 적가하여 게 갑각 침지 수용액의 pH를 7 내지 8로 조절한 후 탈이온수 중에서 일정시간, 예를 들 면 1 내지 6시간 방치한 다음, 여과하여 유기 용매, 예를 들면 에탄올, 메탄올, 아세톤, THF, 디옥산, MEK 등의 용매로 1 또는 2회 세척한 후 건조시킨다. 상기 용매 세척으로 게 갑각의 적색은 거의 완전히 제거된다.

이렇게 하여 수득된 조 키틴은 단백질 제거 공정에 들어가게 되는데, 이는 수득한 조 키틴올 NaOH 수용액에 침지시켜, 가열처리 함으로써 수행한다. NaOH 수용액의 농도는 2 내지 10중량%가 적합하며, 반응 온도는 80 내지 100℃ 범위이고, 가열 시간은 2 내지 4시간이 일반적이다. 이 공정은 불활성 기체, 예를들면 질소, 아르곤, 헬륨 또는 네온 기체를 연속적으로 주입하면서 수행하는 것이 바람직하다. 이렇게 함으로써 키틴의 분자쇄 절단을 방지할 수 있다.

이어서, 조 키틴을 탄이온수로 세척하고, 염산 용액을 적가하여 조 키틴 침지 수용액의 pH를 7 내지 8로 조절한 후 탈이온수중에 일정 시간, 예를들면 20 내지 30시간 침지시킨다. 이어서, 조 키틴을 여과한 후, 2차로 상술한 NaOH용액 처리하고 탈이온수로 세액이 중성이 될 때까지 세척한 후 키틴의 백색도를 높히기 위해 탈이온수에 2일 이상 침지시키고 여과 및 건조하여 생체 임상의학용 키틴을 수득한다.

본 발명에 따라 수득한 생체 임상의학용 키틴으로부터 다음과 같이 하여 고백색도를 갖고 고분자량이면서 탈아세탈화도가 높은 키토산을 얻을 수 있다.

우선, 상기 수득된 키틴에 예를들면 30 내지 50%의 NaOH 수용액을 가하고 80 내지 100℃의 온도하에 2 내지 12시간 가열한 후, 세액의 pH가 중성이 될 때까지 탈 이온수로 세척하고 여과한다. 이때 불활성기체, 예를들면 질소, 아르곤, 헬륨 또는 네온 가스를 연속적으로 주입하면서 수행하는 것이 바람직하다. 또한, NaOH 수용액 처리시 온도 및 시간이 상기 범위를 벗어나면 분자쇄가 절단될 염려가 있다.

이어서, NaOH 수용액 처리된 조 키토산을 탈이온수에 침지시킨 후 여과하여, 키토산의 백색도를 높히고 불순물의 용해 제거를 위해 유기 용매, 예를들면 아세톤, 에탄올, 메탄올 , 이소프로판올, 디옥산, THF, MEK 등의 용매의 수용액(통상 5 내지 30중량%의 농도)중에 침지시킨 다음 여과하여 건조시킨다.

이어서, 건조된 조 키토산을 다시 NaOH 수용액 처리 및 유기용매 수용액 처리하여 고 탈아세틸화도의 최종 키토산을 수득한다.

키토산의 탈아세틸화도를 보다 높히기 위해 상술한 1차 및 2차 NaOH 수용액 처리 및 세척 공정을 2회 이상 반복 시행할 수도 있다.

이상에서 기술한 바와 같이, 본 발명에서는 매우 낮은 온도, 즉, -40 내지 -10℃미만에서 고농도의 HCl수용액을 사용함으로써 갑각 중의 CaCO₃성분등을 단시간에 제거할 수 있으며, 따라서 키틴 및 키토산 제조공정을 줄이고 제조단가를 현저히 낮출 수 있으며, 수득된 키틴이 고순도, 고백색도이고 이로부터 제조된 키토산 역시 고백색도, 고분자량 및 고 탈아세틸화도 가진다는 잇점이 있다.

본 발명을 하기 실시예로 예시하며, 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니다.

실시예에서, 키틴 중의 잔류 CaCO₃함량은 키틴을 800℃에서 1시간 연소시킨 후의 강열 감량으로서 측정하였으며, 단백질 함량은 바이오-래드(Bio-Rad)사의 단백질 분석 키트(kit)를 이용하여 브래드포드(Bradford)법에 따라 미국 휴렛트-패커드(Hewelett-Packard)사의 UV/VIS 분광분석계로 측정하였다. 또한, 금속 함량은 일본 세이코사의 ICP-AES 및 미국 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)사의 AA분광계를 사용함으로써 측정하였다. 탈아세틸화도는 논문[J. Appl. Polym. Sci. 28, 1909(1983)]에 게재된 IR 이용법(Mima법)에 의거하여 측정하였다. 경시 백색도는 30일 이상 경과한 후의 외관상태를 육안으로 관별하여 극히 우수(투명도와 광택이 우수한 백색), 우수(백색), 보통(투명도와 광택도가 낮은 백색) 및 불량(옅은 황색을 띰)으로 나누어 평가하였다. 또한, 점도는 브룩필드(Brookfield)점도계에서 #4 스핀들을 이용하여 60rpm으로 1% 아세트산용액 중의 0.5% 키토산 용액으로써 측정하였다.

실시예 1

홍게(학명 : Chionoecetes opilio)의 갑각 300g을 40 내지 50℃의 수욕중에 30분간 방치한 후 게의 육질이 부유되지 않을 때까지 수세하였다. 탈수기로 수분을 제거하고 에탄올욕에 1시간 동안 침지한 후 다시 칼수기로 잔류 에탄올과 수분을 제거하여 그늘에서 10일간 건조시켜 건조 홍게 갑각 200g을 얻었다.

별도로, HCl 1600ml, 탈이온수 1400ml, 에탄올 200ml의 비율로 HCl, 탈이온수 및 에탄올을 혼합하여 6N의 HCl수용액을 제조하였다.

이어서, 건조된 상기 홍게 갑각(수분 함량 10%) 200g을 분쇄기(디츠-모토렌사(Dietz-Motoren GmbH Co. KG)의 Mot. WRB 90LB/4P)로 0.5 내지 3mm의 입경으로 분쇄한 후, 기계적 교반기가 장착된 반응 용기에 넣은 다음 여기에 -30℃로 냉각된 상기 제조된 6N 염산 수용액 5ℓ를 가하고 50rpm의 속도로 교반하면서 그 온도에서 3시간 동안 반응시켰다.

염산 처리된 홍게 갑각을 여과한 후 물에 침지시켜 5중량% NaOH 수용액으로 침지액의 pH가 7 내지 8이 되도록 조절한 후 그 상태로 2 내지 3시간 방치한 후 여과하였다. 여과된 조 키틴을 아세톤 3ℓ로 2회 세척한 후 여과하여 공기중에서 10 내지 12시간 동안 건조시켰다.

건조된 조 키틴을 5중량%의 NaOH 수용액 6ℓ에 침지시킨 후 질소 기체를 주입시키면서 3시간 동안 90℃로 가열한 다음, 탈이온수로 세척하고 탈이온수에 침지시켜 2N 염산 수용액을 가해 조 키틴 침지 수용액의 pH를 7 내지 8로 조절하고 6ℓ의 탈이온수 중에 24시간 동안 침지시킨 다음 여과하였다. 1차 NaOH 수용액 처리된 키틴에 대해 다시 상술한 NaOH 수용액 처리 공정을 반복하였다. 2차 NaOH 수용액 처리된 키틴을 탈이온수로 중성이 될 때까지 세척한 후 탈 이온수 6ℓ에 2일 동안 방치 한 후 여과 및 진공 오븐하에서 건조하여 생체 임상의학용 키틴 50g을 최종적으로 수득하였다.

실시예 2 및 3

실시예 1에서 염산 수용액 처리 공정을 각각 6시간 및 14.5시간 동안 수행한 점을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

실시예 4,5 및 6

실시예 1에서 염산 수용액 처리 온도를 -20℃로 하고 처리 시간을 각각 3시간, 6시간 및 14.5시간으로 한다는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

실시예 7,8 및 9

실시예 1에서 염산 수용액의 농도를, 물과 에탄올 1 : 1 부피비의 혼합액으로 3배 희석하여 2N로 하고, 처리온도를 -10℃로 하고, 처리시간을 각각 3시간, 6시간 및 14.5시간을 한다는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

실시예 10 및 11

실시예 1에서 염산 수용액의 농도를, 물과 에탄올 1 : 1 부피비의 혼합액으로 2배 희석하여 3N로 하고, 처리온도를 -20℃로 하고, 처리시간을 각각 6시간 및 14.5시간으로 한다는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

상기 표에서 알 수 있듯이, 본 발명의 방법에 의해 수득된 키틴은 고순도 및 우수한 백색도를 갖는다.

실시예 12 내지 22

상기 실시예 1 내지 11에서 수득한 키틴 45g을 4ℓ 용량의 3구 플라스크에 넣고 40중량% NaOH 수용액 3ℓ를 첨가한 후 질소 가스를 연속 주입하면서 90℃의 온도로 7시간 가열하였다. 침지 수용액의 pH가 중성이 될 때까지 탈 이온수로 조 키토산을 수세한 후 여과하여 탈이온수 3ℓ 속에 2일간 방치한 다음 여과하여 즉시 10% 에탄올 수용액 3ℓ 중에 3일간 침지시켰다. 침지된 키토산을 여과하여 40℃의 진공오븐에서 2일간 건조시켰다(1차 NaOH수용액 처리).

건조된 키토산에 40중량% NaOH 수용액 3ℓ를 첨가한 후 질소가스를 연속 주입하면서 90℃의 온도로 3시간 가열하였다. 침지 수용액의 pH가 중성이 될 때까지 탈 이온수로 수세한 후 탈이온수 욕에 2일간 침지시킨 다음 여과하여, 10% 에탄올 수용액 중에 3일간 침지시킨 후 여과 및 건조시켰다(2차 NaOH 수용액 처리). 이렇게 하여 탈아세틸화도가 90% 이상인 키토산을 얻었다.

상기 1차 및 2차 NaOH 수용액 처리를 1회 더 반복하여 탈아세틸화도가 92% 이상인 키토산을 얻었다.

상기 실시예 12 내지 22에 사용된 실험조건 및 수득된 키토산의 특성들을 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따라 NaOH 수용액의 처리 및 용매세척 공정을 반복함으로써 높은 탈아세틸화도, 순도 및 분자량을 가진 키토산을 수득할 수 있으며, 본 발명의 방법에 의해 제조된 키토산은 키토산의 순도가 중요한 의학 분야에 특히 유용하다.

Claims (4)

1. (1) 한국산 홍게 갑각을 건조시켜 보관하는 단계, (2) 건조된 게 갑각을 분쇄시키는 단계, (3) 분쇄된 게 갑각을 1.5 내지 7N의 염산 수용액으로 -40 내지 -10℃ 미만의 온도에서 3 내지 20시간 동안 처리하는 단계, (4) 염산 처리된 게 갑각을 수세 및 여과시키는 단계, (5) 여과시킨 게 갑각을 유기용매처리 및 건조하여 조 키틴을 수득하는 단계, (6) 건조된 조 키틴을 NaOH 수용액에 침지시켜 가열 처리하는 단계 및 (7) NaOH 처리된 키틴을 수세, 여과 및 건조시키는 단계를 포함하는, 게 갑각으로부터 키틴을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 염산 처리 단계(3)에서 처리 온도가 -35 내지 -10℃ 미만인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 염산 처리 단계(3)에 사용하기 위한 염산 수용액을, 농염산, 탈이온수 및 유기 용매를 혼합함으로써 제조하는 방법.
4. 제1항에 또는 제3항에 있어서, 상기 유기 용매가 에탄올, 메탄올, 부탄올, 이소프로필알콜, 아세톤 또는 메틸에틸케톤으로 구성되는 그룹으로 선택되는 유기용매 하나 이상인 방법.