KR970005585B1 - 신규한 재조합 발현벡터 및 그를 이용한 인간 알파 인터페론의 제조방법 - Google Patents

신규한 재조합 발현벡터 및 그를 이용한 인간 알파 인터페론의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

신규한 재조합 발현벡터 및 그를 이용한 인간 알파 인터페론의 제조방법
제1도는 본 발명의 재조합 발현벡터 △pMA를 구축하는 과정을 나타내는 도식이다.
제2도는 본 발명의 재조합 발현벡터 △pMA의 유전자 지도를 나타낸다.
제3도는 △pMA발현벡터의 araB프로모터 조절부위의 샤인-달가노염기서열과 번역개시부호(translational initiation codon)를 Nde I 제한효소 좌위로 변형(mutagenesis)시킨 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다.
제4도는 △pMA발현벡터의 araB 프로모터 하단 번역개시부호 이후에 존재하는 다클론부위(multiple cloning site : MCS)와 그 염기서열을 나타낸다.
제5도는 본 발명의 재조합 발현벡터 △pMAIFN α를 제조하는 일련의 과정을 나타내는 도식이다.
제6(a)도는 본 발명에 의하여 제조된 대장균 발현벡터인 △pMA 의 유전자 지도를 나타낸다.
제6(b)도는 △pMAIFN α상의 인간 알파 인터페론 유전자 삽입부위를 확대하여 나타낸 것이다.
제7도는 L-arabinose 유도에 의한 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 대조배양 균주들의 생장을 비교한 그래프이다.
제8도는 L-arabinose 유도를 통해 발현된 재조합 대장균의 총세포 단백질과 인간 알파 인터페론의 발현율을 대조배양 균주를과 비교한 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진이다.
제9도는 L-arabinose 유도를 통해 발현된 재조합 대장균의 총세포 단백질의 웨스톤 블롯 분석(Western bholt analysis) 결과를 나타내는 사진이다.
제10도는 △pMAIFN α 재조합 대장균으로부터 발현되는 인간 알파 인터페론의 염기서열을 나타낸다.
제11도는 △pMAIFN α재조합 대장균으로부터 생성된 인간 알파 인터페론의 봉입체(inclusion body)형성을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진이다.
제12도는 본 발명의 △pMAIFN α와 인간 알파 인터페론을 발현하는 이종의 발현벡터들간의 발현요율을 SDS-PAGE를 통해 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 재조합 대장균의 발현벡터 및 그를 이용한 인간 알파 인터페론의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 살모넬라(Salmonella) 균주의 L-arabinose 오페론을 이용한 유도성 발현벡터 및 이 벡터에 인간 알파 인터페론의 유전자를 삽입한 재조합 발현벡터로 형질전환된 미생물을 L-arabinose가 첨가된 배지에서 배양함으로써 인간 알파 인터페론을 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
유전공학적 기법을 이용하여 미생물로부터 유용한 단백질을 대량생산하는 발현체계는 다양하게 개발되어 왔으며, 이러한 발현체계는 필수적으로 외래유전자 산물을 생산하기 위한 발현벡터들로서 기본적으로 숙주세포내에서 자가복제에 필요한 염기서열과 형질전환 여부를 확인할 수 있는 선택표지 유전자를 보유하고, 생산하고자하는 단백질의 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터와 이를 조절하는 오퍼레이터(Operator) 및 전사종결부위(54anscriptional termination codeon)등의 염기서열들을 포함해야 한다.
현재까지 개발된 대장균용 발현벡터들에서 사용되어진 프로모터들의 경우, 람다(λ)-박테리오파지 유래의 λpL-프로모터(Simon et al, Gene, 28 : 55-64, 1984), 트립토판-락토스 혼성프로모터(Boer, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78 : 21, 1983) 및 T2박테리오파지 유래 프로모터(Studier, J. Mol. Biol., 189 : 113, 1986) 등이 인터페론 및 인슐린과 같은 생물학적 활성을 갖는 다양한 단백질의 제조에 이용되어 왔다. 그러나, 이들과 같은 기존의 발현벡터들을 이용하여 단백질을 생산하는 경우, 단백질의 종류와 성질에 따라 대장균 숙주세포내에서의 발현율이 크게 좌우되며 전술한 발현벡터들로서는 효율적인 생산에 도달하지 못하는 경우가 많이 존재하였다. 이러한 현상은 발현시키려는 외래유전자가 대장균내에서 조절되는 이종의 프로모터 및 전사조절 체계에 의하여 발현되고, 이렇게 전사된 mRNA의 번역(translation)을 수행하는 대장균 체계와 원래 자연상에 존재하는 상태와의 차이 및 외래유전자 산물에 대한 대장균숙주의 세포생리적인 반응성에서 오는 여러 요인들에 의하여 그 발현율이 결정되기 때문으로 알려져왔다.
이러한 여러 요인들에 의해 조절되어지는 이종단백질의 발현율을 최대화하기 위하여는, 첫째, 강력한 프로모터와 이를 정확하게 조절할 수 있는 오페레이터 염기서열 ; 둘째, 전사되어진 mRNA와 리보좀과의 정확한 결합을 통해 번역을 최적화할 수 있는 리보솜 결합부위(ribosome binding site : RBS)의 염기서열을 필요로 한다. 그러나, 이들 염기서열들을 갖추고 있다고 알려진 기존의 대장균 발현벡터들 역시 이종단백질의 충분한 발현에 도달하지 못하여 왔다.
결국, 이러한 문제점을 극복하고자 유도성 발현벡터가 출현하게 되었으며, 외래단백질을 발현시키는 대장균 발현벡터중 유도성 발현벡터의 예로서는 lac-오퍼레이터를 함유하며 IPTG(isopropyl thiogalactoside)에 의하여 발현이 유도되는 벡터, T7RNA중합효소의 발현을 조절하여 T7프로모터와 결합된 이종단백질의 발현이 유도되는 벡터 및 온도 민감성에 따른 발현유도를 수행할 수 있는 λpL-프로모터 등이 제시되었다. 그러나, IPTG와 같은 값비싼 유도인자(inducer)를 사용할 때에는 발현율에 있어서 경제적 효율성에 못 미치며, 아울러 온도 민감성 발현 유도시엔 단백질의 성질에 따라 적용하는데 한계가 있으므로, 이들 유도성 발현벡터 역시 이종단백질을 충분히 발현시키지는 못하여 왔다. 따라서, 기존의 이러한 발현벡터들이 갖는 약점들을 극복하고 탁월한 발현조절능력으로 이종단백질을 경제적으로 대량생산할 수 있는 능력을 갖춘 발현벡터를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
한편, 박테리아인 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhymurium)에서 탄소원 대사과정의 하나인 L-arabinose 분해대사에 관여하는 일련의 효소들의 유전자 오페론이 이용되어 왔으며, 이는 원핵생물(prokaryote)의 유전자발현을 설명하는데 있어 대장균의 lac-오페론과 더불어 대표적인 오페론 시스템이 모델이 되고 있다. 특히, 살모넬라의 L-arabinose 오페론은 L-arabinose를 피루브산(pyruvate)으로 전환시키는데 관여하는 세가지 효소들이 이소머라제(isomerase), 키나제(kinase) 및 에피머라제(epimerase)가 각각 araB 및 araD 유전자에 의하여 코딩되며, 이들 모두는 araB 유전자의 프로모터에 의해 전사되어지는 하나의 오페론 구조를 이루어 폴리시스트로닉(polycistronic) mRNA를 만들어 낸다. 또한 이러한 전사조절은 또 하나의 구조 유전자인 araC에 의해 만들어지는 조절단백질(regulatory protein)이 세포내 L-arabinose의 존재 유무에 따라 araB 유전자의 프로모터 상부에 있는 조절부위서열(regulatory sequence)에 결합하여 DNA가닥을 뭘리적으로 만곡(looping)시키거나 선형화하여 전사를 조절한다. 즉, 서로 정반대의 방향으로 이루어진 araC와 araB프로모터 사이에는 기본적인 조절부위인 araI 염기서열이 존재하고, 이는 araI1과 araI2의 두 부분으로 구분되어 있다.
또한, araI 염기서열 상부에는 -100bp부위에 araO1과 -28Obp부위에 araO2라는 다른 조절부위가 있어, L-arabinose가 세포내에 존재하지 않을 경우에는 araC 조절단백질의 아단위(subunit)들이 araI1과 araO2부위에 결합하여 DNA의 만곡을 유도하여, araB프로모터에 의한 전사개시를 억제시키는 억제인자(repressor) 단백질로 작용하지만, L-arabinose가 세포내 존재할 경우 이와 결합한 araC 조절단백질은 구조적 변화를 일으켜 araB프로모터 상부에 있는 조절부위인 araI1,araI2염기서열에 결합하여 만곡된 DNA의 상태를 해소시켜줌으로써 RNA중합효소가 전사개시를 가능하게 작용한다.
한편, 라이(LAI)와 리(LEE) 등은 전술한 L-arabinose 오페론 발현기작을 응용한 대장균 발현시스템을 개발하여, 곤충으로부터 유래된 세크로핀(cecropin)이라는 펩티드 항생물질의 발현기에 성공한 바 있다[참조 : W086/04356]. 이들에 의해 개발된 araB 프로모터를 이용하는 벡터의 경우, 폴리시스트로닉 mRNA를 전사하는 발현체계로 설계되어 이종단백질을 생산할 수 있는 가능성을 제시하고 있으나, 실제적으로 응용되는데 있어서는 발현율과 유도조절의 측면에서 한계가 노출되어 왔다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 전술한 문제점들은 극복할 수 있는 신규한 살로넬라 L-arabinose 오페론을 이용한 유도성 발현벡터를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 다른 목적은 전기 발현벡터를 이용하여 대량으로 인간 알파 인터페론을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 기존의 이러한 araB 프로모터를 이용하면서 보다 발현율과 유도조절 기능이 탁월한 벡터를 개발하고자 연구 노력한 결과, L-arabinose 오페론 발현기작을 응용한 발현벡터를 다음과 같은 유전자조작을 통하여 제조하고 본 발명을 완성하게 되었다.
1) araB 프로모터와 전사조절부위 및 araC 조절단백질의 구조유전자를 모두 포함하는 연기서열을 벡터에 클로닝한다.
2) araB 프로모터의 하부에 존재하는 구조유전자와 발현하고자 하는 이종단백질의 유전자를 대치하여 araB 프로모터의 조절하에 전사가 가능하도록 한다.
3) araB 프로모터 조절하에 대치된 외래유전자 하단부에 전사종결 염기서열(transcriptional termination codon)을 연결하여 정확한 전사종결이 이루어지도록 한다.
이렇게 제조된 발현벡터 △pMA는 기존의 L-arabinose 유도성 발현벡터들보다 개선된 이상적인 발현벡터로서의 기능을 갖추게 되었다.
본 발명의 발현벡터 △pMA는
첫째, 야생형 araB 프로모터의 샤인-달가노(shine-Dalgarnon) 염기서열(5'-CTCG-3') 및 주변의 염기서열을 대장균에서 최적으로 발현가능한 샤인-달가노 염기서열 (5'-CTCG-3' : Gold and Stormo, Method in Enzymology, 185 : 89-93, 1990)로 변형된 염기서열;
둘째, 다양한 외래 유전자를 클로닝시킬 수 있는 다클론부위;
셋째, araC 단백질 유전자; 및
넷째, 정확한 조절을 위하여 대장균에서 유래한 강력한 전사종결자인 rrnBT1T2염기서열을 포함한다.
본 발명의 발현벡터 △pMA 체계와는 달리, araB 프로모터의 하부에 존재하는 구조유전자와 발현하고자 하는 이종단백질의 유전자를 대치함으로써 모노시스트로닉(monocistronic) mRNA를 형성할 수 있으며, 우수한 발현율과 탁월한 조절능력에 있어서 종래의 어떠한 발현벡터보다도 우수하며, 대장균의 T7및 트립토판 프로모터 발현시스템보다 높은 발현율과 정확한 유도조절을 보임을 확인하였다. 따라서, 발현벡터 △pMA는 인간 알파 인터페론 발현은 물론, 펩타이드 항생제, 인체호르몬, 각종 싸인토카인 및 항원 등과 같이 생물학적 활성을 갖는 다양한 단백질 생산에 유용한 발현벡터로 사용될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
발현벡터 △pMA의 제조
살모넬라 티피무리움 LT2 균주에서 염색체 DNA를 추출하고 이를 EcoRI 제한효소로 처리한 다음, T4DNA 연결효소로 pUC19(Maniatis et al., Molecular Cloning 2nd ed., 1989) 벡터의 EcoRI 제한효소 부위에 삽입하여 pUC-살모넬라 라이브러리를 제조하였다. pUC-살모넬라 라이브러리를 대장균 DH5α균주 (F' endA1 hsdR17(rk-mk+) supE44 thi-1 recA1 gyrA(NaF) U169△(lacZAY-argF) deoR)에 형질전환시켜 형질전환된 대장균 콜로니들을 얻었다. araB-C 조절부위와 araC 단백질의 아미노말단(N-terminal) 3번째 아미노산(Glu)까지를 포함할 수 있는 염기서열에 대한 15mer 인 5'-GCCATCGTCTTACTC-3'와 4mer인 5'-GCGTTTCAGCCATG-3'을 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 이들을 탐침자(probe)로 사용하며, 콜로니 혼성화(colony hybridization)를 실시하여 전기에서 제조된 pUC-살모넬라 라이브러리로부터 6.93kb의 araC 유전자를 포함하는 클론을 선별하였다. 이렇게 선별된 pUC-클론의 플라스미드 즉, 9.62Kb의 pUC19-ara에 AvaI 제한효소를 처리하고 클레노우(Klenow) 효소로 평활말단(blunt-end)화한 다음, SalI 제한효소를 처리하여 얻은 2.52kb의 DNA 단편; 및, pUC119(Maniatis et al., Molecular Cloning 2nd ed., 1989) 벡터에 HindⅢ 제한효소를 처리하고 클레노우 효소로 평활말단화한 다음, SaⅡ 제한효소를 처리하여 얻은 3.18kb의 DNA 단편을 T4DNA 연결효소로 연결하여 5.7kb의 pUC119-araBC 벡터를 제조하였다. 이를 대장균 CJ236 균주(F'cat(=pCJ105 ; M132Cmr)dut ungl thilrelal spoTl mcrA)에 형질전환시키고, 우라실-포함 DNA(Uracil-DNA)방법(Kunlel et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82 : 488-492, 1985)으로 단일가닥의 DNA(single strand DNA)을 얻었다. 효율적인 프로모터를 갖는 유전자 발현 카세트가 삽입된 벡터를 제조하기 위하여, araB 프로모터의 하단에 위치하는 araB 단백질 구조유전자의 번역개시부호에 NdeⅠ 제한효소가 자르는 염기서열인 5'-CATATG-3'와 araB 프로모터의 샤인-달가노 염기서열을 5'-TAAGGAGG-3'으로 변형시킬 수 있는 39mer인 5'-GCAATTGCCATATGTTATTCCTCCTTAATCCAGAAAAAC-3'를 합성하여, 우라실-포함 DNA(Uracil-DNA) 방법으로 전기에서 얻은 단일가닥의 DNA에 부위특이적 돌연변이(site-specific mutagenesis)를 야기시켰다. 이렇게 변형된 ara클론에 다시 EcoRⅠ-Pvu Ⅱ 제한효소를 처리하여, araB-C 유전자를 함유하는 2.61kb의 DNA 단편을 얻었다. 한편, pUC18에 PvuⅡ-HindⅢ 제한효소를 처리하여 얻은 228bp의 다클론부위를, pKK233-2 벡터(Pharmacia, Sweden)에 삽입시킴으로써 제조된 MpKL10 벡터에, Nde Ⅰ 제한효소를 처리한 다음, 클레노우 효소로 평활말단화하여 T4DNA 연결효소로 재결합시킨 벡터에, 다시 EcoRⅠ-PvuⅢ 제한효소를 처리하여 얻은 2.7kb의 DNA 단편을, 전기에서 얻은 2.61kb의 DNA단편에 T4DNA 연결효소로 연결시켜 클론(5.31kb)을 얻었으며, 이를 pMA라 명명하였다. pMA의 클론에 Nde I-EcoRⅠ제한효소를 처리한 다음, NdeⅠ-EcoRⅠ제한효소 부위의 중간에 NcoⅠ제한효소 부의를 십입하기 위하여 올리고뉴클레오티드 프라이며 쌓인 5'-TATGCCATGGG-3' 및 5'-AATTCCCATGGCA-3'을 어닐링(annealing)시키고, T4DNA 연결효소로 연결하여 완성된 벡터를 △pMA(5.32kb)라 명명하였다[참조 : 제1도 및 제2도]. 한편, △pMAI발현벡터의 araB 프로모터 조절부위의 샤인-달가노 염기서열과 번역개시부호(54anslational initiation codon)를 NdeⅠ제한효소 단일좌위(unique site)로 변형(mutagenesis)시킨 염기서열을 생거(Sanger) 등에 의한 방법(Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 7 : 5463, 1977)으로 확인하고 그 결과를 제3도에 나타내었다. 제4도에는 △pMA 발현벡터의 araB 프로모터 하단 번역개시부호 이후에 존재하는 다클론부위(multiple cloning site : MCS)와 그 염기서열을 나타내었다. 아울러, 전기에서 제조된 발현벡터 △pMA를 대장균 균주 MC1061(F-araD 139△(ara-leu)7696 galE15 galK16 △(lac)×74rpsL(Strr) hsdR2(rk -mk +) mcrA mcrBl)에 쿠시너(Kushner, Genetic engineering, P. 17, Elsevier/North-Holland, Amsterdam, 1978)의 방법으로 형질전환시켰다. 이 형질전환 미생물은 1994년 5월 6일 국제기탁기관인 사단볍인 한국종균협회(KCCM)에 기탁번호 KCCM-10054로 기탁되었다.
[실시예 2]
인간 알파 인터페론의 발현벡터 △pMAIFNα의 제조
실시예 1에서 제조된 △pMA에 제한효소 NdeⅠ-HindⅢ을 처리하여 얻은 5.3kb DNA 단편과 pMG α2(대한민국 특허출원 제92-23068호 ; KFCC 10777) 벡터에 제한효소 NdeⅠ-NdeⅢ를 처리하여 얻은 0.5kb의 DNA 단편(인간 알파 인터페론의 구조유전자)을 T4DNA 연결효소로 연결하여 araB 프로모터체계에 의해 발현조절 가능한 △pMAIFN α를 제조하고, 제한효소 지도분석과 염기서열 분석을 통하여 △pMAIFN α의 클론을 확인하였다[참조 : 제5도]. 제6(a)도는 △pMAIFN α의 유전자 지도를 나타내며, 제6(b)도는 △pMAIFN α상의 인간 알파 인터페론 유전자 삽입부위를 확대하여 나타낸 것이다.
[실시예 3]
재조합 인간 알파 인터페론의 발현
실시예 2에서 제조된 발현벡터 △pMAIFN α를 대장균 균주 MC1061에 쿠쉬너의 방법으로 형질전환시켰다. 이 형질전환 미생물은 1994년 5월 6일 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회(KCCM)에 기탁번호 KCCM-10053으로 기탁되었다. 형질전환된 미생물을 앰피실린(ampicillin)이 포함된 LB 평판비지에서 37℃ 온도로 배양하여 선별되어진 대장균 콜로니를 앰피실린이 포함된 LB 액체배양액에 접종하고, 37℃에서 180rpm으로 진탕배양하였다. 배양세포의 농도가 600nm에서 0.5 내지 0.6의 흡광도에 도달했을 때, 1%의 L-arabinose를 배양액에 첨가하여 인간 알파 인터페론의 발현을 유도하였다. 그런 다음, 6시간 내지 20시간 더 진탕배양하고, 4℃에서 원심분리하여 배양세포를 수득한 다음, 전기 대한민국 특허출원 제92-23068호에 기재된 방법으로 인간 알파 인터페론을 정제하였다.
[실시예 4]
재조합 인간 알파 인터페론의 확인
실시예 3에서 제조된 발현벡터 △pMAIFN α의 인간 알파 인터페론의 생산능력을 검증하기 위하여, 발현벡터 △pMAIFN α로 형질전환된 재조합 대장균 MC1061과 비형질전환 MC1061균주를 아래의 방법으로 배양하여 인간 알파 인터페론이 발현고 그 양상을 비교 분석하였다. 우선, 발현벡터 △pMAIFN α형질전환균주의 L-arabinose에 의한 유도 여부를 확인하기 위한 대조군으로는, △pMAIFN α 형질전환균주를 발현유도 배양조건(실시예 3)과 동일한 배양조건과 시간하에서 배양하되, 유도인자인 L-arabinose를 첨가하지 않은 배양체를 이용하였다. 아울러, 형질전환되지 않은 MC1061균주자체의 세포단백질발현양상을 확인하기 위한 대조군으로는, △pMAIFN α 형질전환균주에 대한 발현유도 및 비유도 배양조건과 동일하게 배양된 비형질전환 M1061균주의 배양체를 이용하였다. 본 발명의 발현벡터 △pMAIFN α 형질전환균주 및 대조군들의 배양시간에 따른 생장곡선을 600nm에서의 흡광도로서 확인하였다(제7도). 제7도에서, L-arabinose가 첨가된 배지에서 배양된 형질전환되지 않은 대장균 MC1061(), △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)(), △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B))의 생장곡선; 및, L-arabinose가 배제된 배지에서 배양된 형질전환되지 않은 대장균 MC1061(), △pMAIFN α로 형질전환된 대균 MC1061(A)), △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)()의 생장곡선을 나타낸다. 이때, △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)과 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)는 동일한 균주이며, 단지 재현성을 확인하기 위하여 배양하였다.
그런 다음, 이 균체들의 용혈물(lysate)을 라맬리(Lamaeli, Nature, 227 : 680, 1970)에 의한 방법으로 SDS-폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylaminde gel) 전기영동한 다음, 코마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하여, 이들 균체들의 총세포단백질 발현양상을 비교하였다(제8도). 제8도에서, 제1레인에서부터 제3레인까지는 L-arabinose가 첨가된 배지에서 2시간 배양한 균주들의 총단백질 양상이며, 제1레인은 대장균 MC1061, 제2, 3레인은 각각 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)이다. 제4레인에서부터 제6레인까지는 L-arabinose가 참가되지 않은 배지에서 2시간 배양한 균주들이 총단백질 양상이며, 제4레인은 대장균 MC1061, 제5, 6레인은 각각 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)이다. 제7레인은 단백질 표준 시료물질로서 a는 포스포릴라제 B(106kDa), b는 소혈청알부민(80kDa), c는 오발부민(49.5kDa), d는 카보닉 안하이드라제(32.5kDa), e는 소이빈 트립신 억제자(27.5kDa), f는 리소자임(18.5kDa)을 나타내며, 제8레인은 상업적으로 판매되고 있는 인간 α-인터페론(그린알파, 녹십자)이다. 제9레인에서부터 제11레인까지는 L-arabinose가 첨가된 배지에서 4시간 배양한 균주들의 총단백질 양상이며, 제9레인은 대장균 MC1061, 제10, 11레인은 각각 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)이다. 제12레인에서부터 제14레인까지는 L-arabinose가 첨가되지 않은 배지에서 4시간 배양한 균주들의 총단백질 양상이며, 제12레인은 대장균 MC1061, 제13, 14레인은 각각 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와△pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)이다. 제15레인에서부터 제17레인까지는 L-arabinose가 첨가된 배지에서 6시간 배양한 균주들의 총단백질 양상이며, 제15레인은 대장균 MC1061, 제16, 17레인은 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)이다. 제18레인에서부터 제20레인까지는 L-arabinose가 첨가되지 않은 배지에서 6시간 배양한 균주들의 총단백질 양상이며, 제18레인은 대장균 MC1061, 제19, 20레인은 각각 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)이다. 제8도에서 보듯이, L-arabinose가 첨가된 배지에 배양된 △pMAIFN α 형질전환 균주들의 인간 알파인터페론 유전자 발현이 L-arabinose에 의해 유도됨을 확인하였다.
또한, 이들을 웨스톤 블롯(Western blot : Maniatis et al, Molecular Cloning Ⅲ, 18 : 60, 1989) 분석용실시하였으며, 이때 인간 알파 인터페론에 대한 항체는 안티-인터페론-α(Anti-Interferon-α : Boeringer Mannheim, Cat. No. 853569, Germany)를 사용하였다. 웨스톤 블럿분석을 통해 L-arabinose로 유도된 △pMAIFN α로 형질전환된 균주에서만이 진정한 알파 인터페론을 발현하며, 약 18,000달톤(dalton)의 인터페론 특이성(interferon-specific) 단일밴드 형성을 확인하였다(제9도). 제9도에서, 제1레인에서부터 제3레인까지는 L-arabinose가 첨가된 배지에서 2시간 배양한 균주들의 총단백질 양상이며, 제1레인은 대장균 MC1061, 제2, 3레인은 각각 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)이다. 제4레인에서부터 제6레인까지는 L-arabinose가 첨가되지 않은 배지에서 2시간 배양한 균주들의 총단백질 양상이며, 제4레인은 대장균 MC1061, 제5, 6레인은 각각 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)이다. 제7레인은 단백질 표준 시료물질로서 a는 포스포릴라제 B(106kDa), b는 소혈청알부민(80kDa), c는 오발부민(49.5kDa), d는 카보닉 안하이드라제(32.5kDa), e는 소이빈 트립신 억제자(27.5kDa), f는 라소자임(18.5kDa)을 나타내며, 제8레인은 정제된 α-인퍼페론이며 제8도에서와 동일한 것이다. 제9레인에서부터 제11레인까지는 L-arabinose가 첨가된 배지에서 4시간 배양한 균주들의 총단백질 양상이며, 제9레인은 대장균 MC1061, 제10, 11레인은 각각 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)이다. 제12레인에서부터 제14레인까지는 L-arabinose가 첨가되지 않은 배지에서 4시간 배양한 균주들의 총단백질 양상이며, 제12레인은 대장균 MC1061, 제13, 14레인은 각각 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)이다. 제15레인에서부터 제17레인까지는 L-arabinose가 첨가된 배지에서 6시간 배양한 균주들의 총단백질 양상이며, 제15레인은 대장균 MC1061, 제16, 17레인은 각각 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)이다. 제18레인에서 부터 제20레인까지는 L-arabinose가 첨가되지 않은 배지에서 6시간 배양한 균주들의 총단백질 양상이며, 제18레인은 대장균 MC1061, 제19, 20레인은 각각 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)이다. 전술한 음성대조군들과 정제된 인간 알파인터페론(3㎍)을 양성대조군으로 하여, △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(A)와 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061(B)에서 인간 알파 인터페론이 발현됨을 확인하였다. 한편, △pMAIFN α재조합 대장균으로부터 발현되는 인간 알파 인터페론의 염기서열을 생거(Sanger)의 방법에 의하여 염기서열을 결정하고 제10도에서 나타내었다.
[실시예 5]
재조합 인간 알파 인터페론의 단백질 봉입체(inclusion body)형성
L-arabinose 유도에 의하여 발현된 인간 알파 인터페론이 대장균 세포내에서 봉입체를 형성함을 다음과 같이 확인하였다. 다음의 각 균체들의 용혈물 및 그들의 봉입체들을 라맬리에 의한 방법으로 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동한 다음, 코마시 브릴리언트 블루로 염색하여 이들 균체들 및 봉입체들의 총세포단백질 양상을 비교하였다(제11도). 제11도에서, 제1레인은 당백질 표준 시료물질로서 a는 오발부빈(43kDa), b는 카보닉 안하이드라제(29kDa), c는 베타-락트알부민(18.4kDa), d는 리소자임(14.3kDa)를 나타내며, 제2레인은 L-arabinose를 첨가한 배지에서 6시간 배양 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061에 리소자임(100㎍/g cell)을 처리하고 초음파 파쇄(sonication)한 다음, 15,000rpm으로 원심분리하여 얻은 상등액의 단백질 양상이며, 제3레인은 L-arabinose를 첨가한 배지에서 6시간 배양한 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061로부터 분리한 단백질 봉입체의 단백질 양상이다. 제4레인은 L-arabinose를 첨가한 배지에서 20시간 배양한 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061에 리소자임(100ug α/g cell)을 처리하고 초음파 파쇄한 다음, 15,000rpm으로 원심분리하여 얻은 상등액의 단백질 양상이며, 제5레인은 L-arabinose를 첨가한 배지에서 20시간 배양한 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061로부터 분리한 단백질 봉입체의 단백질 양상이다. 제11도에서 보듯이, 단백질 봉입체의 단백질 양상을 보여주는 제3레인과 제5레인에서 인간 알파 인터페론의 단백질 띠를 확인할 수 있다.
[실시예 6]
이종의 재조합 인간 알파 인터페론 발현벡터와의 발현율 비교
인간 알파 인터페론에 대한 발현 효율을 비교하기 위하여, 본 발명에 의하여 제조된 재조합 인간 알파 인터페론 발현벡터 △pMAIFN α와 △pMAIFN α에 삽입되어 있는 인간 알파 인터페론과 동일한 유전자의 발현을 각각 트립토판 프로모터와 T7프로모터로 조절하는 발현벡터를 이용하여 인간 알파 인터페론에 대한 발현효율을 비교하였다(제12도). 제12도에서, 제1레인과 제2레인은 T7프로모터에 의해 조절되는 pRSET 벡터(Invitrogen, USA)에 인간 알파 인터페론 유전자가 삽입된 발현벡터 pMG α2로 형질전환된 대장균 BL21 ; pLysE(hadS gal(λcIts 857 indl Sam7 nin5 lacUV5-T7genel))의 배양시, IPTG를 첨가하지 않음으로써 인간 알파 인터페론의 발현을 억제한 대조군의 총단백질 양상이며, 제3레인과 제4레인은 T7프로모터에 의해 조절되는 인간 알파 인터페론 발현벡터 △pMGα2로 형질전환된 대장균 BL21 ; pLysE 배양시, IPTG를 첨가하여 발현 유도시킨 다음 12시간 더 배양한 균주의 총단백질의 양상이며, 제5레인은 형질전환되지 않은 대장균 BL21 ; pLyseE 균주의 총단백질의 양상이며, 제6레인은 trp 프로모터 의해 조절되는 인간 알파 인터페론 발현벡터인 pTrp-α(Method in Enzymology, 185 : 55060, 1990)로 형질전환된 대장균 DH5α 균주의 배양시, 1AA(β-indole acrylrim acid)를 첨가하여 발현 유도시킨 다음 14시간 더 배양한 균주의 총단백질 양상이며, 제7레인은 정제된 인간 알파 인터페론(그린알파, 녹십자)이며, 제8레인은 단백질 표준 시료물질로서 a는 포스포릴라제 B(106kDa), b는 소혈청알부민(80kDa), c는 오발부민(49.5kDa), d는 카보닉 안하이드라제(32.5kDa), e는 소이빈 트립신 억제자(27.5kDa), f는 리소자임(18.5kDa)을 각각 나타낸다. 제9레인은 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061의 배양시에 L-arabinose 첨가하지 않음으로써 인간 알파 인터페론의 발현을 억제한 균주의 총단백질 양상이며, 제10레인은 △pMAIFN α로 형질전환된 대장균 MC1061의 배양시에 L-arabinose를 첨가하여 발현을 유도한 다음, 6시간 더 배양한 총단백질 양상이다. 제11레인은 형질전환되지 않은 대장균 MC1061의 총단백질 양상이다. 또한, 이들 발현벡터들이 생산한 인간 알파 인터페론의 역가를 측정한 결과, T7및 trp 프로모터를 이용한 발현벡터에서는 약 9.6×105I.U./ml, araB 프로모터를 이용한 △pMAIFN α 발현벡터에서는 약 5.6×107I.U./ml의 역가를 나타내어, 본 발명의 △pMAIFN α벡터가 T7및 trp 프로모터를 이용한 발현벡터보다 알파 인터페론의 발현효율이 약 60배 이상됨을 확인하였다. 따라서 인간 알파 인터페론 발현에 있어서, T7및 54p 프로모터를 이용한 발현시스템에 비하여, 본 발명의 araB 프로모터를 이용한 △pMAIFN α 발현벡터가 인간 알파 인터페론의 발현에 효과적임을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 살모넬라의 L-arabinose 오페론을 이용한 유도성 발현벡터 △pMA 및 그를 이용한 인간 알파 인터페론의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 발현벡터에 인간 알파 인터페론 유전자를 삽입하여 제조한 벡터 △pMAIFN α로 대장균을 형질전환시켜 배양하여 인간 알파 인터페론을 발현시켰을 때, 기존의 어떠한 발현벡터보다도 인간 알파 인터페론의 발현율이 높고 유도조절이 정확하였다. 따라서, 본 발명의 △pMA를 이용하여 펩타이드 항생제 및 인체호르몬, 각종 싸이토카인 및 항원 등과 같이 생물학적 활성을 갖는 다양한 단백질을 대량 생산할 수 있을 것으로 예상되며, 아울러, △pMA에 인간 알파 인터페론 유전자가 삽입된 △pMAI α는 인간 알파 인터페론의 산업적 생산에 이용될 수 있을 것이다.

Claims (5)

  1. i) 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhymurium)의 L-arabinose 오페론으로부터 유래한 샤인-달가노 염기서열이 변형된 araB 프로모터 ; ii) 다양한 외래 유전자를 클로닝시킬 수 있는 다클론부위 ; iii) araC 단백질 유전자 ; 및. ⅳ)대장균으로부터 유래한 rrnBT1T2전사종결 유전자를 포함하는 L-arabinose유도성 발현벡터 △pMA.
  2. 제1항의 대장균 발현벡터 △pMA에 인간 알파 인터페론 유전자를 삽입시켜 제조한 △pMAIFN α.
  3. 제1항의 △pMA로 형질전환된 대장균(Escherchia coli) 균주 MC1061(KCC
    M-10054).
  4. 제2항의 △pMAIFN α으로 형질전환된 대장균(Escherchia coli) 균주 MC1061(KCCM-10053).
  5. L-arabinose를 첨가하고 제4항의 대장균을 배양하는 공정을 포함하는 인간 알파 인터페론을 제조하는 방법.
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