KR970005326B1 - 신규 항바이러스제 - Google Patents

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Description

신규 항바이러스제

제1도는 N-아세틸-3-플루오로뉴라민산의 억제패턴을 보여주는 딕슨 플롯이다.

본 발명은 항바이러스제에 관한 것이다. 종래부터 당단백질 또는 당지질의 글리코-사슬의 끝에는 시알산이 위치하며 그것은 당사슬의 생리적 활성에 크게 관여하는 것으로 알려져 있다. 시알산의 기능을 설명하기 위해서는 시알산 유도체의 제조가 중요한 것으로 여겨진다.

2-위치에(M.N.Shana R. Eby, Carbohydr. Res., Vol. 127, p.201, 1984) 또는 9-위치에(M.Sharma W. Korytnyl, J. Carbohydr. Chem., Vol. 1, p.311, 1982-1983) 플루오르 원자를 가지고 있는 N-아세틸뉴라민산의 플루오르화 유도체는 이미 제조된 바 있다. 그러나, 3-위치에 플루오르 원자를 가지며, 그때의 입체구조가 정립되어 있는 유도체는 아직 제조된 것이 없다.

N-아세틸뉴라민산의 3-위치에 플루오르 원자를 입체적으로 및 선택적으로 도입할 목적으로 집중적인 연구조사를 한 결과, 본 출원인은 N-아세틸-3-플루오로뉴라민산을 제조하는 유용한 방법을 발견하였고 일본국 특허출원 제62-52358호로 출원하였다.

N-아세틸-3-플루오로뉴라민산의 생리적 활성등에 대하여 한층 더 연구 조사한 결과, 본 발명자들은 이 화합물이 바이러스 또는 박테리아 감염에 중요한 역할을 담당하는 시알리다제의 활성을 현저하게 억제한다는 것을 발견하였고, 본 발명은 이 발견을 토대로 완성되었다.

본 발명의 목적은 N-아세틸-3-플루오로뉴라민산 또는 그의 약리적으로 허용가능한 염을 포함하는 항바이러스제를 제공하는 것이다.

본 발명은 다음식(Ⅰ)의 N-아세틸-3-플루오로뉴라민산 또는 그의 약리적으로 허용가능한 염을 포함하는 항바이러스제에 관한 것이다.

상기식(Ⅰ)의 N-아세틸-3-플루오로뉴라민산은 예컨대 다음과 같이 제조된다 : 플루오르 함유 비활성 가스를 아세트산과 아세트산염의 혼합물에 도입함으로써 제조된 (1)플루오르함유 비활성가스 또는 (2)아세틸차아플루오르산염의 어느 하나를 다음식(Ⅱ)의 알킬 5-아세트아미도-2,6-안히드로-4,7,8,9-테트라-0-아세틸-2,3,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토-2-에노네이트의 아세트산수용액 또는 디클로로메탄용액에 도입시켜 첨가반응을 진행시킨다.

(식중, R⁴는 저급알킬기를 나타내고 Ac는 아세틸기를 나타낸다.)

상기 일반식 Ⅱ의 화합물은 예컨대, Dai-9-Kai T shitsu Symposium K en Yoshish (the 9th Glucide Symposium)p.B11에 기재된 바와 같은 방법에 의하여 제조된다.

플루오르 함유 비활성 가스로서는 1내지 2%의 플루오르를 함유하는 아르곤 가스가 사용된다. 가스를 아세트산 수용액 또는 디클로로메탄중에서 7℃정도의 저온에서 상기 일반식 Ⅱ의 화합물의 용액에 1 내지 2시간 동안 도입시켜, 시스-와 트란스- 형태로 2-위치에-OCOCH₃를 가지고 3-위치에 플루오르 원자를 가지는 2종류의 모노플루오르화 생성물뿐만 아니라 시스형태로 2-위치와 3-위치에 플루오르 원자를 가지는 디플루오르화 생성물을 형성한다. 아세틸차아플루오르산염이 사용되는 경우 주로 모노플루오르화 생성물이 형성된다.

모노플루오르화 생성물을 반응액으로부터 분리하여 감압하에 용매를 증류 제거함으로써 정제하고, 잔류물에 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 행하여, 생성물을 예컨대 에틸아세테이트/에테르 혼합물로 용출한 후 재결정화한다.

그렇게 형성된 모노플루오르화 생성물을 탈아세틸화하여 N-아세틸-3-플루오르뉴라민산 에스테르를 형성하고 그런 다음 그의 에스테르기를 제거하여 상술한 N-아세틸-3-플루오로뉴라민산을 얻는다.

N-아세틸-3-플루오로뉴라민산은 각종 바이러스 감염에 효과적이다. 이런 사실은 시알리다제(뉴라민다제)의 작용을 억제하는 효과에 의해 제공된다.(Tanpakushitsu Kakusau K so (Protein, Nucleic Acid and Enzyme), Vol. 25, No. 1(1980), p30-48참조).

N-아세틸-3-플루오로뉴라미사의 유효한 1회용량은 통상 1㎍ 내지 100㎎이다.

N-아세틸-3-플루오로뉴라민산은 각종 형태로도 사용가능하다. 그것은 주사, 흡입 또는 경구투여에 의해 투여된다.

본 발명의 항바이러스제를 제조하기 위하여 각종 첨가제가 약제에 함입될 수 있다. 그러한 첨가제는 희석제, 결합제, 붕괴제, 윤활제, 막형성제 등이다.

희석제로는 글루코스, 스타치, 락토스, 만니톨, 소르비톨, 슈크로스, 카올린, 덱스트린, 시클로덱스트린, 산화티탄, 무수인산 칼슘, 약무수성 규산염, 탈크, 천연수소화 규산마그네슘, 침전탄산칼슘, 알루민산 메타규산 마그네슘, 결정 셀룰로스, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로스, 및 그의 혼합물이 있다.

결합제로는 스타치, 덱스트린, 트라가칸트검,젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 메틸셀룰로스, 에틸셀롤로스, 히드록시에틸 셀롤로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 스타치, 결정 셀룰로스, 펙틴, 폴리펙틴, 폴리펙틴산 나트륨, 메타크릴산 폴리히드록시에틸, 카르복시메틸 셀롤로스, 소디움 카르복시메틸 셀롤로스, 아카시아검, 알긴산나트륨, 및 그의 혼합물이 있다.

붕괴제로는 스타치, 결정 셀롤로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 칼슘 카르복시메틸 셀롤로스, 카르복시메틸스타치, 히드록시프로필 스타치, 분말아가, 만난, 및 그의 혼합물이 있다.

윤활제로는 탈크, 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 및 칼슘, 수소화된 오일, 세사미 오일, 파라핀, 및 그의 혼합물이 있다.

막형성제로는 에틸셀룰로스(EC), 카르복시메틸 셀룰로스(CMEC), 아세트산 셀룰로스(CA), 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 히드록시프로필메틸 셀룰로스(HPMC), 메틸셀룰로스(MC), 히드록시프로필 셀룰로스(HPC) 같은 셀룰로스 유도체 ; 와 폴리비닐아세탈 디에틸아미노 아세테이트, 메타크릴산/에틸 아크릴레이트 공중합체, 메타크릴산/메틸 아크릴레이트 공중합체, 에틸 메타크릴레이트/메타크릴산 트리메틸 암모늄 클로라이드에틸 공중합체, 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트/메틸 아크릴레이트 공중합체 같은 폴리비닐 유도체가 있다.

약제위에 막형성제가 코팅되는 경우, 코팅이 만들어질 때 의약이 상호 점착되는 것을 방지하기 위한 기타의 각종 첨가제뿐만 아니라 가소제 같은 종래의 코팅 보조제가, 막형성제의 성질을 개선하고 코팅과정을 더 쉽게 만들기 위하여 본 발명의 약제에 첨가된다.

또한, 다음의 첨가제가 흡입 또는 주사제형태의 본 약제제조에 사용될 수 있다.

염화칼슘, 염화칼륨, 염화나트륨, 염산, 시트르산, 시트르산나트륨, 숙신산, 아세트산, 아세트산 칼륨, 아세트산나트륨, 타르타르산, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 분사수(水), 염화나트륨분사, 탄산나트륨, 중탄산 나트륨, 락트산, 락트산 나트름, 말레산, 황산, 인산, 인산칼륨, 인산나트륨, 인산수소칼륨, 인산수소칼슘, 인산중수소칼륨, 인산수소나트륨, 인산중수소나트륨, 아인산나트륨, 아인산중수소나트륨, 피로인산칼륨, 피로인산나트륨, 1-아르기닌, 정제 난황 레시틴, 정제 젤라틴, 젤라틴, 락토스, 사람혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 400, 1,500, 4,000 및 6,000, 폴리옥시에틸렌 수소화 카터유 60, 및 소디움 에틸렌디아민 테트라아세테이트.

다음의 참고예와 실시예로 본 발명을 더욱 설명하기로 한다.

참고예 1

1.7%(6.1mmol)의 플루오르(F₂)를 함유한 아르곤 가스를 2.3g(4.8mmol)의 다음식(IIa)의 메틸 5-아세트아미도-2,6-안히드로-4,7,8,9-테트라-0-아세틸-2,3,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토-2-에노네이트의 아세트산 용액 25ml(7℃)에 24시간 동안 도입하였다.

(식중, Ac는 아세틸기를 나타낸다(이하 동일함).)

그런 다음, 감압하에 용매를 증류제거하여 2.5g의 시럽을 얻었다. 이 시럽을 실리카겔컬럼 크로마토그래피(250g의 G60, 머크 사 제품)에 따라 처리한 후 에틸 아세테이트와 에테르(부피비 : 3/1)의 혼합 용매로 추출하고 디클로로메탄과 이소프로필에테르의 혼합용매로부터 재결정화하여 다음의 3가지 생성물을 형성하였다 :

(1) 메틸 5-아세트아미도-4,7,8,9-테트라-0-아세틸-1,2,3,5-트리데옥시-2,3-디플루오로-D-에리트로-β-L-글루코-2-노눌로소네이트 :

[분자구조]

수율 : 900㎎(36%)

[물리적 성상]

융점 : 92℃

-48.12° (C=0.55, 클로로포름)

원소분석 : C₂₀H₂₇N₁O₁₁F₂

이론치 : C;46.97, H;5.32, N;2.73

분석치 : C;47.00, H;5.37, N;3.00

Rf=0.54 (에틸 아세테이트)

¹H-NMR δ (CDC1₃)

5.00(H-3, J₃,₄=9.85Hz)

5.39(H-4, J₄,₅=10.26Hz)

4.40(H-5, J_5,6=10.66Hz)

4.27(H-6, J_6,7=2.38Hz)

5.39(H-7, J_7,8=8.06Hz)

5.16(H-8, J_8,9=5.68Hz, J_8,9'=2.71Hz)

4.01, 4.32(H-9, H-9', J_9,9'=12.55Hz)

5.49(NH, J_NH,5=10.20Hz)

3.91(COOCH₃)

1.91(NCOCH₃)

2.05, 2.10, 2.11, 2.13(OAc)

(2) 메틸-5-아세트아미도-2,4,7,8,9-펜타-0-아세틸-3,5-디데옥시-3-플루오로-D-에리트로-β-L-글루코-2-노눌로소네이트 :

[분자구조]

수율 : 190㎎(7%)

[물리적 성상]

융점 : 119℃

- 56.5° (C=0.21, CHCl₃)

원소분석 : C₂₂H₃₀NO₁₄F

이론치 : C;47.91, H;5.48, N;2.53

분석치 : C;48.10, H;5.35, N;2.30

Rf=0.26

¹H-NMR δ (CDCl₃)

4.62(H-3, J_3,4=9.60Hz)

5.48(H-4, J_4,5=10.05Hz)

4.24(H-5, J_5,6=10.54Hz)

4.11(H-6, J_6,7=2.29Hz)

5.35(H-7, J_7,8=4.66Hz)

5.02(H-8, J_8,9=6.69Hz, J_8,9'=2.44Hz)

4.14, 4.51(H-9, H-9', J_9,9'=12.46Hz)

5.58(NH, J_NH,5=10.08Hz)

3.85(COOCH₃)

1.89(NCOCH₃)

2.04, 2.06, 2.10, 2.15, 2.24(OAc)

(3) 메틸-5-아세트아미도-2,4,7,8,9-펜타-0-아세틸-3,5-디데옥시-3-플루오로-D-에리트로-β-L-만노-2-노눌로소네이트 ;

[분자구조]

수율 : 30㎎(7%)

[물리적 성상]

융점 : 194℃

- 24.5 (C=0.19, 클로로포름)

원소분석 : C₂₂H₃₀NO₁₄F

이론치 : C;47.91, H;5.48, N;2.53

분석치 : C;47.85, H;5.53, N;2.55

Rf=0.23(에틸아세테이트)

¹H-NMR δ (CDCl₃)

4.94(H-3, J_3,4=2.57(Hz)

5.50(H-4, J_4,5=10.68Hz)

4.14(H-5, J_5,6=10.61Hz)

4.25(H-6, J_6,7=1.84Hz)

5.35(H-7, J_7,8=5.13Hz)

5.13(H-8, J_8,9=6.60Hz, J_8,9'=2.20Hz)

4.57(H-9, J_9,9'=12.46Hz)

4.43(NH, J_NH,5=8.79Hz)

3.84(COO

)

1.92(NCO

)

2.04, 2.05, 2.11, 2.17, 2.18(OAc)

참고예 2

아세트산 칼륨과 아세트산의 혼합물을 함유하는 카트리지에 1.5%(10mmol)의 플루오르(F₂)를 함유하는 아르곤가스를 넣어 아세틸차아플루오르산염(AcOF)을 형성하였다.

메틸 5-아세트아미도-2,6-안히드로-4,7,8,9-테트라-0-아세틸-2,3,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토-2-에노네이트 480㎎(1.0mmol)의 아세트산용액(실시예1에서 사용된 것과 같은 용액임) 10ml에 실온에서 1시간 동안 AcOF를 도입하였다. 그리고나서 60℃, 감압하에서 용매를 증발시켜 520㎎의 시럽을 얻었다.

이 시럽을 실리카겔(G60 60g : Merck Co. 제품)로 컬럼크로마토그래피 처리하고 에틸아세테이트와 에테르혼합용매(부피비 : 3/1)로 용출시킨 뒤 디클로로메탄과 이소프로필에테르 혼합용매로부터 재결정화하여 다음과 같은, 참고예 1에 형성되었던 것과 같은 생성물을 형성시킨다.

(1) 메틸 5-아세트아미도-4,7,8,9-테트라-0-아세틸-2,3,5-트리데옥시-2,3-디플루오로-D-에리트로-β-L-글루코-2-노눌로소네이트

[수율 : 40㎎(7.7%)]

(2) 메틸 5-아세트아미도-2,4,7,8,9-펜타-0-아세틸-3,5-디데옥시-3-플루오로-D-에리트로-β-L-글루코-2-노눌로소네이트

[수율 : 190㎎(34%)]

참고예 3

2mmol의 메톡시화나트륨(NaOCH₃)을 함유하는 메탄올 1ml를 무수메탄올 중의 55㎎의 메틸 5-아세트아미도-2,4,7,8,9-펜타-0-아세틸-3,5-디데옥시-3-플루오로-D-에리트로-β-L-글루코노눌로소네이트[참고예 1 또는 2에서 제조한 (2)] 용액 3ml에 첨가하고 혼합물을 실온에서 30분간 교반하였다. 약간 과량의 Dowex 50[H⁺]을 반응액에 가해주고 혼합액을 교반하였다. 여과시켜 수지(resin)를 얻고 메탄올 5ml로 세척하였다. 이 여과액을 감압하에서 농축시키고 메탄올, 에틸아세테이트 및 석유 에테르의 혼합용매로 부터 재결정하여 다음 화합물 (6)을 얻었다. [수율 : 24㎎(75%)]

(6) 메틸 5-아세트아미도-3,5-디데옥시-3-플루오로-D-에리트로-β-L-글루코-2-노눌로소네이트

[분자구조]

[물리적 성상]

융점 : 209℃(메탄올, 에틸아세테이트, 석유에테르의 혼합용매로 부터 재결정화함)

- 41.14° (C=0.86, H₂O)

원소분석 : C₁₂H₂₀NO₈F

이론치 : C;42.23, H;5.9, N;4.1

분석치 : C;42.37, H;6.0, N;4.3

¹H-NMR δ (D₂O)

4.75(H-3, J_3,4=8.98Hz)

4.09-4.18(3H, H-4, H-5, H-6)

3.56(H-7, J_6,7=1.10Hz)

3.71(H-8, J_7,8=8.79Hz

J_8,9=6.05Hz,

J_8,9=3.43Hz)

3.63, 3.8(H-9, H-9', J_9,9'=11.9Hz)

참고예 4

참고예 1 또는 2에서 제조한 메틸 5-아세트아미도-2,4,7,8,9-펜타-0-아세틸-3,5-디데옥시-3-플루오로-D-에리트로-β-L-글루코-누눌로소네이트 20㎎(0.036mmol)을 1N NaOH 수용액을 20% 함유하는 메탄올 용액 1ml에 가하고, 결과혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다.

그리고나서 메톡시화나트륨 2mmol을 함유하는 메탄올 용액 1ml을 반응용액에 가하고 혼합물을 실온에서 30분간 교반하였다. 약간 과량의 Dowex 50[H⁺]을 반응용액에 가하고 혼합물을 교반하였다. 여과한 후에 10ml의 물로 수지를 세척하고 여과액은 감압하에 농축시키고 잔류물은 물에 용해시켰다.

용액에 소량의 활성탄을 가하고 혼합물을 교반한 후 활성탄을 여과제거하고 진공중에서 여과액을 건조시켜 다음과 같은 화합물(7)[수율 : 9㎎(76%)]을 얻었다.

(7) 5-아세트아미도-3,5-디데옥시-3-플루오로-D-에리트로-β-L-글루코-2-노눌로손산

[분자구조]

[물리적 성상]

융점 : 205℃

- 40.02° (C=0.86, H₂O)

원소분석 : C₁₁H₁₈NO₉F

이론치 : C;40.37, H;5.54, N;4.27

분석치 : C;40.07, H;5.51, N;4.21

¹H-NMR δ (D₂O)

4.71(H-3, J_3,4=8.42Hz)

4.10-4.15(3H, H-4, H-5, H-6)

3.54(H-7, J_6,7=0 Hz)

3.73(H-8, J_7,8=8.79Hz

J_8,9=6.05Hz,

J_8,9=2.75Hz)

3.63, 3.83(H-9, H-9', J_9,9'=11.91Hz)

2.06(NCOCH₃)

실시예 1

다음 구조식 :

의4-메틸룸벨리페릴-N-아세틸뉴라민산(4-MU-NeuAc)(Nakarai Kagaku Co., Ltd 제품)의 0.5mM 용액 100ul, 200mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.2) 100ul와 400uM N-아세틸-3-플루오로뉴라민산(화합물1) 4 100ul를 시험관내에서 아트로박터 우레아파시엔스(Arthrobactor ureafaciens)로부터 생성된 시알리다제(Nakarai kagaku Co., Ltd. 제품)의 효소용액(100ml)(10mU/ml)에 가하고 37℃의 물중탕에서 15분간 반응을 진행시켰다. 그리고나서 200mM 글리신/NaOH) 완충액(pH 10.4) 3.6ml를 시험관 안에 있는 반응혼합물에 가해 반응을 종결시켰다. 반응용액 속에서 형성된 4-메틸룸벨리페론의 농도는 형광분광계(Hitachi, Ltd 제품)로 측정하여 여기 파장 360nm와 발광파장 440nm의 형광강도로부터 측정하였다. 유리 시알산의 양은 이값에 의해 결정하였다.

시알리다제 억제율은 다음식에 따라 측정하였다.

이 결과를 표1과 제1도에 표시한다. 화합물1이 시알리다제의 활성을 현저하게 억제하는 것이 표1에서 명백하다.

제1도는 화합물1의 존재하에 2개의 다른 기질농도를 사용하여 얻어진 반응속도를 보이는 딕슨플롯이다.

제1도로부터 화합물1의 억제가 기질에 대해 경합적임이 분명하다.

실시예 2와 3

비브리오 콜레라(Vibrio colerae)와 스트렙토코커스(Streptococcus) 종(Species)에 의해 생성된 시알리다제를 사용하는 것을 제외하고 실시예1과 똑같은 과정을 반복하였고, 화합물1의 억제율을 측정하였다.

다음의 표2와 3에 그 결과를 표시한다.

위의 표에서 화합물1이 여러가지 미생물들에 의해 생성된 시알리다제에 대하여 억제효과를 가지고 있음이 명백하다.

(급성독성)

암컷 마우스에 화합물1을 정맥주사하여 급성독성검사를 실시하였다.

실험조건

사용동물 : 암컷 ICR 마우스 (생후 6주)

약제농도 : 증류수중에 13 내지 15W/V%

각 농도에 대한 마우스의 수 : 10

관찰기간 : 14일

결과

표 4에 있는 결과를 보면 화합물1의 독성이 매우 낮음을 알 수 있다.

Claims (3)

1. 다음식(I)의 N-아세틸-3-플루오로뉴라민산 또는 그의 약리적으로 허용가능한 염을 포함하는 항바이러스제.

   
2. 제1항에 있어서, 상기 N-아세틸-3-플루오로뉴라민산이 1ug 내지 10㎎의 양으로 함유되는 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
3. 제1항에 있어서, 주사제, 흡입제 또는 경구 투여제에 형태인 것을 특징으로 하는 항바이러스제.

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