KR960001198B1 - 유로키나제 경구용 제제 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Description

유로키나제 경구용 제제 및 그의 제조방법

제1도는 발색측정법에 의하여 유로키나제 활성을 측정하는 원리를 나타내는 도식이다.

제2도는 유화제 성분들을 여러 농도로 첨가한 후, 각 농도별로 변화하는 유로키나제 활성을 측정한 결과를 나타내는 도식이다.

제3도는 유화제 성분의 유로키나제 분자구조에 대한 영향을 알아보기 위한 SDS-PAGE결과를 나타내는 사진이다.

제4도는 본 발명의 경구용 유로키나제를 투여한 후, 혈장(plasma)시료의 ELISA분석 결과를 나타내는 그래프이다.

제5도는 본 발명의 경구용 유로키나제를 투여한 후, 혈장시료의 FDP응집테스트 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 유로키나제 경구용 제제 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 유로 키나제를 유화(emulsification)시켜서 경구용 유화제제를 제조하는 방법과 그로부터 제조된 유로키나제 경구용 제제에 관한 것이다.

유로키나제(urokinase)는 411개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 54,000의 세린 프로테아제(serine protease)로서, 플라스미노겐(plasminogen)을 활성형의 플라스민(plasmin)으로 전환시키고, 이 플라스민은 혈관내 응고된 혈전(thrombus)의 피브린(fibrin)을 용해시킨다[참조 : White, W.F.et al., Biochemistry, 5, 2160(1966)]. 정제된 유로키나제는 지난 수십년간 혈관내 혈전형성으로 인한 심근경색증(myocardial infarction) 및 뇌졸중 등의 치료에 사용되어 왔다.

한편, 지질(lipid)이 팹티드 내지는 단백질 등의 생물학적 제제의 전달체계에 중요한 성질을 갖고 있다는 사실은 약 30여년 전부터 알려져 있으며, 특히 생물학적 활성이 있는 단백질의 체내투여에 있어서 여러 가지 시도, 즉 정맥내(intravenous)나 피하(subcutaneous)주사 및 최근에 대두되는 직장이나 경구투여에 의한 약물 전달체계가 활발히 연구되고 있다.

이러한 관점에서, 종래의 단백질성분의 생물학적 제제들의 경구용 투여를 위한 노력으로, 유로키나제는 물론, 효소, 인슐린, 소마토트로핀 및 기타 성장호르몬 등에서 여러 연구그룹들에 의하여 진행되어 왔다.

즉, 국제특허공개 제90/03164호(WO90/03164)에는 상기 물질들의 경구 혹은 직장 투여를 위해서 친수성 오일(water-in-oil) 마이크로에멀젼(microemulsion)을 사용한 방법이 공지되어 있는데, 이 마이크로에멀젼의 친수성 상(phase)은 생물학적 활성을 지닌 물질들을 포함하고 있고, 소수성 상은 카이로 마이크론(chylomicron)이나 투여후 소장 점막내에서 카이로마이크론을 형성할 수 있는 물질을 포함하고 있다.

국제특허공개 제87/01035호(WO87/01035)에는 지용성 약제와 비타민류의 마이크로에멀젼에 대하여 기술하고 있는데, 경구 투여되었을시 혈청에 존재하는 다양한 지단백질(lipoprotein)중의 활성성분 조성과 비슷한 분포를 가진다.

미국특허 제4755383호 및 제4639435호에는 세라티오펩티다제 (serratio peptidase), 시프로제(seaprose), 푸사리움 프로테아제(fusarium protease), 스페리카제(sfericase)와 유로키나제 및 칼리크레인(kallikrein)과 칼시토닌(calcitonin)의 효소 및 생리적으로 활성인 물질과 1-이소프로필-4-[4-(1,2,3,4-테트라하이드로나트톨록시)-벤조일]피페라진 메탄술포네이트를 함유하는 소장 흡수에 적절한 약제조성물을 개시하고 있다.

미국특허 제4762720호에는 소량의 인지질을 포함한 약제를 많이 보유할 수 있어서 안전한 약물치료를 가능케하는 리포좀(liposome)에 대하여 기술하고 있다.

일본특허공개 소화 55-17328호에는 중급 내지 고급지방 혹은 그의 에스테르 등과 인슐린을 함유한 유화제제에 대하여 공지되어 있다.

일본특허공고 평성 3-852호에는 소장 흡수성 유로키나제 조성물을 개시하고 있는데, 이 조성물은 활성성분인 유로키나제 외에 지방산, 폴리에틸렌 글리콜(polyt hylene glycol) 및 칼슘 등을 포함하고 있다.

일본특허공개 소화 57-=4913호에는 알부민, 덱스트란 및 젤라틴 등과 혼합되어 리포좀 안에 들어있는 형태의 경구용 유로키나제가 공지되어 있다.

일본특허공고 평성 3-7359호에는 피브린과 높은 친화력을 가지며 혈전분해(fibrinolytic)활성이 증가된 혈액성분과 결합된 유로키나제에 대해 기술하고 있다.

미국특허 제4258030호와 일본특허공고 제58-4686호에는 트립신 저하제와 같은 단백질 가수분해효소 억제제를 함유하는 경구투여용 유로키나제에 관하여 설명하고 있다.

이밖에도 여러 논문들에 상술한 바와 유사한 연구들을 유로키나제를 대상으로 수행한 결과가 게재되어 있다[참조 : T.Abe, Folia Haematol.Leipzig., 113(1-2), 122-136(1986) ; T.Abe, New Istanbul Contrib. Clin.Sci., 13(3), 161-170(1982)].

이제까지 치료용으로 사용되어온 유로키나제제는 모두가 정맥주사용이었으며, 전술한 몇가지 경우만이 경구용으로 개발중에 있다. 그러나, 이들은 단백질 분해효소 재해제(protease inhibitors)와 폴리에틸렌 글리콜, 기타 안정제(stabilizer), 즉, 알부민, 덱스트린, 젤라틴 등으로 인켑슐레이션(encapsulation)하였거나, 단순히 지방산이나 인지질을 사용하여 리포좀 형태로 제조한 것에 불과하였다. 한편, 유로키나제의 혈중내반감기가 약 10여분이기 때문에 다량을 짧은 시간내에 사용하여야 효과를 볼 수 있었으므로, 정맥주사를 하는 경우, 혈전중이 발병한 후에 치료목적으로만 주로 사용되어 왔다.

따라서, 전술한 바와 같은 단백질 성분의 생물학적 제제로서 투여방법과 약제학적 한계 및 혈전증 치료시 정맥주사의 단점을 극복하고, 치료뿐만 아니라 예방의 목적으로도 사용가능하여 혈중내에서의 유로키나제 반감기를 지속시킬 수 있는 방법으로 유화제상태의 경구용 유로키나제를 개발하여야 할 필요성이 대두되어 왔다.

본 발명자들은 경구투여가 가능한 유화제 상태의 유로키나제를 개발하기 위하여 예의 연구한 결과, 동결건조 상태의 유로키나제를 단백질 분해효소 억제제인 아프로티닌(aprotinin)과 혼합한 후, 1차 유화제로서 DMPA(1,2-dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphate), DMPC(1,2-dimyristoy-sn-glycerol-3-phosph o choline), 라이소레시틴(lysolecithin)를 사용하여 친수성 오일형태로 1차 유화시켰다. 그런다음, POE(polyoxyethylated fatty acid), 스테아릭산(stearic acid)과 구연산(citric acid)으로 2차 유화시키고, 마지막으로 MCT오일(medium chain triglycerides oil), GMO(glycerolmonooleate) 및 참기름(sesame oil)등으로 3차 유화시키는 방법으로 유로키나제 경구용 제제를 제조하는 방법을 개발하게 되었다. 아울러, 본 발명자들은 전술한 방법으로 제조한 유로키나제가 놀라웁게도 생물학적 활성을 그대로 유지하면서 경구 투여시 소화효소에 영향을 거의 받지 않을 뿐 아니라, 혈중에서도 충분히 활성을 유지할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 혈전증 치료제로 많이 사용하고 있는 종래의 정맥주사용 유로키나제를 경구용으로 개발하기 위하여 유화시키는 방법과 그 방법에 의하여 제조된 유화제제에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 경구용 유로키나제 함유 유화제를 제조하기 위한 우선적 고려사항으로, 실험실 조건하(in vitro)에서 유화제의 각 성분들이 유로키나제 3차원적 분자구조 및 활성에 영향을 주지 않는가를 조사하였으며, 이어서, 유화제가 함유된 유로키나제 용액을 사용하여 활성을 분석할 수 있는 체계를 학립하려는 시도를 하였다.

현재 유로키나제 활성을 측정할 수 있는 방법은, 피브린 플레이트(fibrin plate)법 [참조 : Astrup et al., Arch.Biochem. Biophys., 40, 346(1952)]과 발색(chrom ogenic)측정법[참조 : D.C.Stemp et al., J.Biol. Chem., 261, 1267(1986)]이 가장 보편적으로 사용되고 있다.

피브린 플레이트법의 원리는 피브린노겐(fibrinogen)과 트롬빈(thrombin)을 혼합하여 피브린 플레이트를 제조할 때 플라스미노겐을 첨가함으로써, 측정할 유로키나제를 플레이트에 반응시키면 유로키나제가 플라스미노겐을 활성형의 플라스민으로 전환되고, 이 전환된 플라스민이 피브린을 기질로 사용하여 용해시키는 것이다.

한편, 발색측정법의 원리는 유로키나제의 특이적 합성 발색기질인 pyroGly-Gly-Arg-para-nitroanilide(S-2444, Sigma Chemical Company, USA)를 이용하면, 유로키나제의 작용에 의해 아르기닌(arg)의 카르복실기(carboxyl group)으로부터 p-니트로아닐리드(p-nitroanilide)가 단리되는데, 이 단리된 물질이 405nm에서 발색을 나타내므로 이 성질을 이용하여 분광분석기로 측정하는 것이다(제1도). 그러나, 본 발명에서 유화제성분 중의 하나로 사용되는 아프로티닌은 일종의 단백질 분해효소 억제제로서 플라스민의 작용을 강하게 억제한다고 보고되었으며[참조 : Trautschold et al., Biochem. Pharm., 16, 59(1967)], 따라서 피브린 플레이트법을 사용할 수 없으므로 발색측정법을 이용하여야 한다. 그러나, 발색 측정법 역시 본 발명에서 사용된 유화제 성분들 중의 대부분이 완충용액에서 완전히 용해되지 않은 현탁상태로 존재하므로 분광기로 흡광도를 측정할 때 배경흡광(background)이 매우 높게 나타나는 문제가 있었다.

본 발명자들은 이러한 유로키나제 활성측정상의 당면한 문제를 해결하기 위하여, 각 유화제 상분들을 공통으로 동시에 용해시킬 수 있는 용매를 조사한 결과, 프로판올(propanol)을 5 내지 10배 첨가했을 때 배경흡광이 완전히 제거됨을 발견하였다. 따라서, 기존의 발색측정법을 채용하여 유화제 성분이 포함된 유로키나제 시료를 반응시킨 다음, 프로판올로 5배 희석하고 ELISA판독기(ELISA reader : SLT Instruments, model EAR 400, GERMANY)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

한편, 경구용 유로키나제 함유 유화제를 개발하기 위하여는 인체에서의 투여경로 및 흡수체계를 충분히 고안하여 약효가 충분히 유지되면서 혈중에서 충분히 활성을 나타낼 수 있도록 고려하여야 하므로, 본 발명자들은 이제까지 반복된 연구와 최근의 연구동향을 조사하여, 친수성 오일 마이크로에멀젼(water-in-oil microemulsion)법을 이용하는 경구투여법을 본 발명에 채용하였다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에 반드시 국한되는 것은 아니며, 본 발명의 요지에 따라 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의한 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 실시태양은 모두 본 발명의 범주에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

[실시예 1]

유화제 성분이 포함된 유로키나제의 활성 측정

사람의 소변으로부터 얻은 유로키나제를 동결건조시킨 후, 마이크로에멀젼을 형성할 수 있는 여러 물질들, 예를들면 레시틴, 소수성 계면활성제, 다중 에틸화된 지방산 및 항산화제와 혼합하여 발색측정법으로 그 활성을 측정하였다. 발색측정법에서 유로키나제의 기질은 S-2444(pGlu-Gly-Arg-pNA, Sigma Chemical Co., USA)로서 유화된 유로키나제를 첨가했을시, 405nm에서 흡광하는 성질을 가진 P-니트로아닐리드가 생성되므로, 그 흡광정도를 분석하여 유로키나제 활성을 측정하였다[참조 : 제1도].

한편, 유화제 성분들의 각각에 대하여, 또는 반 혼합물(submixture)와 최종 혼합물(final mixture)에 의한 유로키나제 활성의 영향을 상기 방법으로 조사한 결과, 대부분의 인지질(phospholipid)이 실험실 조건하에서 유로키나제 활성을 상당히 증가시킨다는 사실을 발견하였다. 이러한 사실의 배경은 유로키나제의 3차원적 구조를 인지질이 변화시켜 활성을 증가시키는 것으로 추정되고 있다. 반면에, 토코페릴 초산(tocopheryl acetate)과 올레산(oleic acid)은 유로키나제 활성을 급격히 감소시킨다는 사실을 발견하여, 이 두 물질은 유로키나제의 유화성분으로 사용할 수 없다는 사실을 알아내었다. 기타, 사용된 친수성 성분인 에탄올과 아프로티닌 및 구연산 등은 유로키나제 활성에 영향을 주지 않았다(표 1).

[표 1]

*유화제가 없는 천연상태의 유로키나제 활성을 100으로 보고, 각각의 유화제를 가했을 때의 유로키나제 활성을 측정하였다.

[실시예 2]

유화제 성분들이 유로키나제 활성에 미치는 영향

여러 유화제 성분들을 각기 다른 농도로 유로키나제에 첨가하고 유로키나제 활성의 변화를 발색법으로 측정한 결과, POE-40-스테아릭산, 레시틴, GMO, 트윈 80 및 에탄올은 유로키나제 활성을 증가시킨 반면, 토코페릴 아세테이트, 올레산 및 위약에멀젼(placebo emulsion)은 활성을 저하시켰다[참조 : 제2도]. 이때, 유로키나제 기질로서는 S-2444를 사용하였으며, 유로키나제 반응은 역가 3001U/ml로 30분간 수행하였다.

또한, 유화제 성분들이 유로키나제의 분자구조에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여 가장 간편한 방법으로, SDS-폴리아크릴아미이드 겔 전기영동버버(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)을 수행한 결과, 모든 유화단계에서 밴드가 확인되었으나, 올레산이 함유된 상태에서는 심하게 유로카니제의 구조를 변경시켰다는 사실을 직접 확인할 수 있었다[참조 : 제2도). 유로키나제은 분자량이 53,000달톤인 2종사슬 구조로 되어 있어, 2-머켑토에탄올과 같은 환원제로 처리하면, 33,000달톤과 20,000달톤의 밴드가 나타났다. 아울러, 환원상태에서도 절단되지 않은 53,000달톤의 밴드가 나타나지 않았는데, 이것은 단쇄의 유로키나제(single-chain urokinase)이거나, 환원이 완전하게 되지 않은 상태의 이본쇄의 유로키나제(two-chain urokinase)일 가능성이 크다고 볼 수 있었다.

제2도에서 제1레인은 표준 유로키나제, 제2레인 마이크로에멀젼 안의 C형의 유로키나제, 제3레인은 마이크로에멀젼 안의 C형의 위약, 제4레인은 올레산 중의 유로키나제, 제5레인은 MCT오일 중의 유로키나제, 제6레인은 참기름 중의 유로키나제 및 제7레인은 소혼합물 1(submix 1 : DMPA, DMPC, L-라이소레시틴, 아프로티닌)중의 유로키나제이며, S는 분자량 지표를 각각 나타낸다.

이상에서 기술한 사실들은 유로키나제의 유화과정에서의 각각의 유화제 성분들에 대한 활성과 구조변화등을 실험실 조건하에서 관찰한 최초의 결과이었다.

[실시예 3]

유로키나제 함유 유화제의 제조

유로키나제 함유 유화제는 동결건조시킨 유로키나제를 단백질 분해효소 억제제와 혼합하고 각각 1차, 2차 및 3차 유화제로 유화시켜 제조하였다.

우선, 다음 표 2와 같은 1차 유화혼합물에 유로키나제 100,000 내지 3,000,000IU, 보다 바람직하게는 약 300,000IU와 아프로티닌 1,000 내지 20,000TIU(trypsin inhibitor unit : 트립신 저해제 역가), 보다 바람직하게는 약 4,000TIU를 혼합한 다음, 0.9%(v/v) 에탄올에 녹여 최종부피가 200ml이 되도록 하고 완전히 용해시켰다.

[표 2]

한편, 다음 표 3과 같은 2차 유화혼합물을 역시 0.9% 에탄올에 녹여 최종 200ml이 되도록 제조하였다.

[표 3]

끝으로, 다음표 4와 같은 3차 유화혼합물을 최종부피가 500ml이 되도록 제조하였다.

[표 4]

상기와 같이 제조된 각 1차, 2차 및 3차 유화혼합물을 먼저, 1차 및 2차 유화혼합물을 혼합한 다음, 3차 혼합물을 첨가하여 최종 유화혼합물을 제조하였다. 이때, 경구용 유화제의 입자크기는 1마이크론 정도로 균일해야 효과가 있으므로, 마이크로플루이다이저(Microfluidizer, 마이크로플루이딕스사, Model M-110Y, USA)를 사용하여 1회 300ml씩, 5,000psi압력하에서 250 내지 600ml/분의 속도로 5회 연속 통과시켜 최종 유화제를 제조하였다.

[실시예 4]

유로키나제 함유 유화제의 경구투여 및 급성독성

효과 지속시간을 알아보기 위해 유로키나제를 3가지 다른 용량으로 경구투여한 후, 50,000IU의 유로키나제를 정맥주사한 경우와 비교하였다. 먼저, 총 복용량 51,700IU의 유로키나제를 약 30분 간격으로 한 회에 17,241IU씩 세 번에 나누어 경구투여하였고, 두 번째로 총 복용량 77,585IU를 첫 번째의 경우와 같은 방법으로 25,861IU씩 세 번에 걸쳐 투여하였다. 마지막으로, 103,446IU의 총 복용량을 상기 두 경우와 동일한 방법으로 34,482IU씩 경구투여하였다. 그 결과, 비록 투여 상한선은 더 높아질 수도 있겠으나, 일반적으로 성인의 경우 총 투여량이 체중 1kg당 약 500 내지 50,000IU, 보다 바람직하게는 약 2,000 내지 10,000IU가 적절한 투여량이라는 것을 확인하였으며, 아울러 정맥주사한 경우와 비교하여 혈중에서의 반감기가 연장되었음을 확인하였다.

한편, 본 발명의 유로키나제 경구용 제제의 급성독성(LD₅₀)은 유로키나제의 역가(IU) 기준으로 상기 적절한 투여량의 약 100 내지 1,000배를 투여하도라도 안정성은 문제가 되지 않으므로 무시할 정도라 볼 수 있었다.

[실시예 5]

유로키나제 함유 유화제의 임상효과

경구투여한 유로키나제 함유 유화제의 임상효과는 ELISA법 및 FDP응집테스트를 통해 분석하였다.

1. ELISA법

다른 두 종류의 단클론 항체(monoclonal antibody)를 사용하여 항원을 검출하는 방법인 ELISA법으로 혈정내의 유로키나제 항원을 분석하였으며, 경구투여 방법은 실시예 4에 기술하였다. 제4도에서 보듯이, 유로키나제 함유 유화제를 경구투여 했을시의 혈장내 생활성도(bioactivity)가 정맥주사했을 때보다 높음을 알 수 있었다. 제4도에서 화살표는 각각 0시간, 24시간 및 48시간 경과후에 투여 혹은 주사한 것을 나타낸다.

2. FDP응집테스트

FDP응집테스트는 항원에 특이한 항체가 코팅된 라텍스(latex) 분자에 피브린(피브리노겐) 분해산물(FDP)이 결합하는 성질을 이용하여 유로키나제 역가를 검출, 정량하는 방법이다. 제5도에서 보듯이, ELISA 테스트 결과와 마찬가지로 경구투여한 유로키나제의 생활성도가 정맥주사한 경우보다 현저히 높았다. 제5도에서도 상기와 마찬가지로 화살표는 각각 0시간, 24시간 및 48시간 경과후에 투여 혹은 주사한 것을 나타낸다.

전술한 각 실시예 및 약물학적, 약제학적 결과에 나타난 바와 같이, 본 발명은 각종 혈전증 치료에도 수십년 동안 보편적으로 사용되어온 유로키나제를 경구로 투여할 목적으로 유화시키는 방법과 그 방법에 의해 제조된 유로키나제 경구용 제제를 사용하여 임상에 사용할 수 있도록 제반기술을 제공하는 동시에, 유로키나제를 치료목적 뿐만 아니라 예방과 치료를 동시에 수행할 수 있도록 한다.

Claims (1)

1. 동결건조시킨 유로키나제와 아프로티닌(aprotinin)을 DMPA(1,2-dimyristo yl-sn-glycerol-3-phosphate), DMPC(1,2-dimyristoyl-sn-glycerol-3-phos ph ochline) 또는 라이소레시틴(lysolecith-in)으로 1차 유화시킨 다음, POE(poly xyethylated fatty acid), 스테아릭산(stearic acid) 또는 구연산(citric acid)으로 2차 유화시키고, MCT오일(medium chain triglycerides oil), GMO(glycer olmonooleate) 또는 참기름(sesame oil)으로 3차 유화시키는 공정에 의해 제조된 유로키나제 경구용 제제.