KR950013952B1 - 시료중의 과산화수소 측정용 시약 및 과산화수소 측정에 있어서의 그의 사용 방법 - Google Patents

시료중의 과산화수소 측정용 시약 및 과산화수소 측정에 있어서의 그의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

시료중의 과산화수소 측정용 시약 및 과산화수소 측정에 있어서의 그의 사용 방법
제 1 도는 본 발명의 시약과 통상적인 시약을 사용했을 때 과산화수소의 농도에 대한 방출 광량을 예시하는 그래프.
제 2 도는 본 발명의 시약과 통상적인 시약을 사용했을 때 시약을 과산화수소 수용액에 첨가한 후 16초에서 45초까지의 적분치인 방출 광량 대 과산화수소의 농도를 예시하는 그래프.
제 3 도는 여러 가지 농도(0, 10, 100 및 500U/ml)의 카탈라제로 처리한 시약을 사용했을 때, 방출 광량과 과산화수소 농도 사이의 관계를 예시하는 그래프.
제 4 도는 여러 가지 농도(0, 10, 100, 200 및 250U/ml)의 카탈라제로 처리한 시약을 사용했을 때 방출 광량과 과산화수소 농도 사이의 관계를 예시하는 그래프.
제 5 도는 100U/ml의 카탈라제로 처리한 시약을 사용했을 때, 시약을 과산화수소 수용액에 첨가한 후 1초부터 15초 및 16초부터 30초까지의 적분치인 방출 광량대 과산화수소 농도를 예시하는 그래프.
제 6 도는 과산화수소로 인한 방출 광량과 시간의 관계를 예시하는 그래프.
제 7 도 및 제 8 도는 본 발명의 시약을 사용하여 얻은 방출 광량과 시간의 관계를 예시하는 그래프.
제 9 도는 본 발명의 시약을 고정 카탈라제가 충전된 컬럼을 통해 통과시켰을 때, 방출 광량과 과산화수소 농도 사이의 관계를 예시하는 그래프.
제10도는 고정 카탈라제가 컬럼에 충전된 본 발명에 의한 장치의 적합한 실시형태의 개략도.
제11도는 본 발명의 시약이 나일론 네트 백(nylon net bag)에 충전된 고정 카탈라제로 처리했을 때, 방출 광량과 과산화수소 농도 사이의 관계를 예시한 그래프.
제12도는 나일론 네트 백의 고정 카탈라제를 넣은 1쌍의 탱크가 구비되어 있는, 본 발명에 의한 장치이 적합한 실시 형태의 개략도.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
1, 2 : 탱크 3, 14 : 펌프
4, 15 : 셀 5, 16 : 흑색 상자
6 : 컬럼 7, 17 : 시료
8, 18 : 광전자 증배관 11, 12 : 탱크
13 : 고정 카탈라제
본 발명은 시료중의 과산화수소 측정용 시약, 이 시약의 제조 방법 및 이 시약을 사용하여 시료중의 과산화수소를 측정하는 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 시료중의 미량의 과산화수소를 측정하는데 사용할 수 있는 시약에 관한 것이다.
임상 검사에서는 과산화수소의 함량을 측정하는 경우가 종종 있다. 유기체중의 글루코오스, 콜레스테롤, 아미노산, 폴리아민 등과 같은 성분을 정량 분석할 경우, 이 성분을 옥시다제와 반응시켜서 과산화수소를 생성시킨 다음, 이 과산화수소의 함량을 측정한다.
효소 면역 분석(Enzyme Immunoassay : EIA)법에서, 호르몬, 단백질 등과 같은 항원 또는 항체를 글루코오스 옥시다제와 같은 옥시다제로 표지화한 다음, 표시화된 것을 기질, 즉 옥시다제가 글루코오스 옥시다제인 경우 글루코오스와 반응시켜서 과산화수소를 생성시킨다. 이어서, 얻어진 과산화수소의 흡광도를 4-아미노 안티피린과 같은 염료를 사용하여 측정함으로써 과산화수소의 함량을 측정할 수 있으므로 항원 또는 항체를 분석할 수 있다.
염료 대신에, 촉매 존재하에서 과산화수소와 반응하여 광을 방출하는 루미놀, 루시게닌 등과 같은 화학발광 물질을 과산화수소 측정용으로 사용할 수 있다. 이들 방법은 과산화수소 함량을 정확하게 측정할 수 있으므로 유기체의 화학 성분 분석에 효과적이다.
유기체의 성분을 상기 방법으로 분석하는 경우, 시료중의 과산화수소 함량을 정확하게 정량하는 것이 매우 중요하다.
과산화수소 함량을 상기 방법으로 측정하는 경우, 시료를 측정하기 전에, 미리 정량된 여러가지 농도의 과산화수소의 발광 시약 및 촉매를 혼합한다. 이어서, 촉매 존재 하에서 발광 시약과 과산화수소의 반응에 의해 방출되는 광량을 측정한다. 이 결과를 기초로 해서, 과산화수소와 방출 광량 사이의 관계를 나타내는 검정 곡선을 만든다. 이어서, 시료와 옥시다제 사이의 반응에 의해 생성된 과산화수소 함량을 이 검정 곡선에 기초하여 정량한다.
그러나, 과산화수소의 함량을 상기 방법의 촉매 존재하에 발광 물질이 빛을 내도록 하여 측정하는 경우, 시료중의 과산화수소 함량이 적을 경우, 즉 10-6몰/ι경우 그 함량을 정확히 정량하기가 어렵다. 발광 물질중에는 소량의 과산화수소가 함유되어 있기 때문에, 시료중의 과산화수소 함량이 낮은 경우, 발광 물질 및 촉매를 함유하는 수용액중의 과산화수소의 시료중의 과산화수소에 대한 비가 비교적 높다.
그러므로, 본 발명의 주 목적은 시료중의 과산화수소를 측정하는데 사용되는 개선된 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적을 시료중에 저농도로 존재하는 과산화수소를 종래의 시약보다 더 정확하게 측정할 수 있는 개선된 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 과산화수소 측정에 사용되는 시약의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 시약을 사용하여 과산화수소의 함량을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 촉매 존재하에 시료와 시약 사이의 반응에 의해 방출되는 광량을 측정하는 장치를 제공하는 것이다.
기타 다른 목적과 잇점은 이하 나타날 것이다.
상기 목적 및 잇점은 본 발명에 의해 용이하게 얻어진다.
본 발명의 특징에 의하면, 시료중의 과산화수소 함량 측정 방법은, 과산화수소를 함유하는 시약을 카탈라제와 혼합하여 시약중의 과산화수소를 분해시키는 단계, 상기 시약과 카탈라제의 혼합물에 카탈라제와 과산화수소 사이의 반응을 중단시키는 억제제를 첨가하는 단계, 시약을 시료에 첨가하는 단계와, 이어서 시료중의 과산화수소 함량을 측정하는 단계로 이루어진다.
이 경우, 억제제는 아지드화나트륨이 적당하다.
본 발명의 또다른 특징에 의하면, 시료중의 과산화수소 함량 측정 방법은, 과산화수소를 함유하는 시약을 전체 용적에 기초하여 10 내지 200U/mι농도의 카탈라제와 혼합하여 시약중의 과산화수소를 분해시키는 단계, 시약을 시료에 첨가하는 단계와, 이어서 시료중의 과산화수소 함량을 측정하는 단계로 이루어진다.
본 발명의 또 하나의 특징에 의하면, 시료중의 과산화수소 함량 측정 방법은, 과산화수소를 함유하는 시약을 고정 카탈라제와 접촉시켜서 시약중의 과산화수소를 분해시키는 단계, 시약을 시료에 첨가하는 단계와, 이어서 시료중의 과산화수소 함량을 측정하는 단계로 이루어진다.
시약을 고정 카탈라제가 충전된 컬럼을 통해 통과시켜서 고정 카탈라제와 접촉시켜도 좋다. 고정 카탈라제는 수불용성 담체와 다기능성 시약사이의 반응에 의해 형성된 담체 상에 고정된 카탈라제가 될 수 있다.
본 발명의 또다른 특징에 의하면, 시료중의 과산화수소 측정에 사용되는 시약은 발광 시약 및 전체 용적에 기초하여 10 내지 200U/ml의 농도의 카탈라제로 된다.
발광 시약은 루미놀이 적합하다.
본 발명의 또다른 특징에 의하면, 시료중의 과산화수소 측정에 사용되는 시약은 발광 시약 및 고정 카탈라제로 된다.
고정 카탈라제는 수불용성 담체와 다기능성 시약사이의 반응에 의해 형성된 담체 상에 고정된 카탈라제가 될 수 있다. 수불용성 담체는 아미노프로필-CPG(조절공극 유리)가 적합하다. 다기능성 글루타르알데히드가 적합하다. 발광 시약은 루미놀이 적합하다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 시료중의 과산화수소 측정에 사용되는 시약의 제조 방법은, 과산화수소를 함유하는 발광 시약을 제공하는 단계와, 상기 발광 시약에 카탈라제를 첨가하는 함유되어 있는 과산화수소를 분해시킨 후, 발광 시약중에 남아 있는 상기 카탈라제를 제거하는 단계로 이루어진다.
본 발명의 또 하나의 특징에 의하면, 시료중의 과산화수소 측정에 사용되는 시약의 제조 방법은, 과산화수소를 함유하는 발광 시약을 제공하는 단계와, 상기 발광 시약에 카탈라제를 첨가하여 함유되어 있는 과산화수소를 분해시킨 후, 카탈라제와 발광 시약에 함유되어 있는 과산화수소 사이의 반응을 중단시키는 단계로 이루어진다.
적합하기로는, 카탈라제의 발광 시약중의 과산화수소 사이의 반응을 중단시키는 억제제를 카탈라제 및 발광 시약의 혼합물에 첨가한다. 억제제는 아지드화나트륨이 적합하다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 시료중의 과산화수소 측정에 사용되는 시약의 제조 방법은, 과산화수소를 함유하는 발광 시약을 제공하는 단계와, 발광 시약중의 과산화수소를 분해시키기에는 충분하지만 시약을 시료에 첨가했을 때 시료중의 과산화수소에는 영향을 주지 않도록 미리 조절된 양의 카탈라제를 상기 발광 시약에 첨가하여 발광 시약중의 과산화수소를 분해시키는 단계로 이루어진다.
카탈라제의 농도는 발광 시약과 카탈라제의 전체 용적에 기초하여 10 내지 200U/ml가 적합하다.
본 발명의 또다른 특징에 의하면, 시료중의 과산화수소 측정에 사용되는 시약의제조 방법은, 과산화수소를 함유하는 발광 시약을 제공하는 단계와, 발광 시약을 고정 카탈라제가 충전된 컬럼을 통해 통과시켜서 발광 시약중의 과산화수소를 분해시키는 단계로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 시료중의 과산화수소 측정에 사용되는 시약의 제조 방법은, 과산화수소를 함유하는 발광 시약을 제공하는 단계와, 고정 카탈라제를 발광 시약에 첨가하여 발광 시약중의 과산화수소를 분해시키는 단계로 이루어진다.
고정 카탈라제는 수불용성 담체와 다기능성 시약 사이의 반응에 의해 형성된 담체 상에 고정된 카탈라제가 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 시료중의 과산화수소 함량 측정에 이용되는 촉매 존재하에서 발광 시약과 시료중의 과산화수소 사이의 반응에 의해 발생되는 빛을 검출하는 장치는, 발광 시약을 저장하는 제 1 용기, 촉매를 저장하는 제 2 용기, 셀이 위치하는 광학적으로 밀폐가능한 중공실을 형성하는 하우징 수단, 발광 시약 및 촉매중의 과산화수소 분해에 활성인 고정 카탈라제로 충전된 컬럼, 제 1 용기 및 제 2 용기로부터 발광 시약 및 촉매를 상기 하우징 실 중의 셀 중으로 주입하는 제 1 수단 및 촉매 존재하에 발광 시약과 시료중의 과산화수소사이의 반응에 의해 발생되는 광량을 측정하기 위한 제 2 수단으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 시료중의 과산화수소 함량을 측정하기 위해 이용되는 촉매 존재하에 발광 시약과 시료중의 과산화수소 사이의 반응에 의해 발생되는 빛을 검출하는 장치는, 발광 시약과 발광 시약중의 과산화수소 분해에 활성인 고정 카탈라제를 저장하는 제 1 용기, 촉매와 촉매중의 과산화수소 분해에 활성인 고정 카탈라제를 저장하는 제 2 용기, 내부에 셀이 위치하는 광학적으로 밀폐가능한 중공실을 형성하는 하우징 수단, 제 1 용기 및 제 2 용기로부터 발광 시약과 촉매를 상기 하우징 실 중의 셀 중으로 주입하는 제 1 수단 및 촉매 존재하에 발광 시약과 시료중의 과산화수소사이의 반응에 의해 발생되는 광량을 측정하기 위한 제 2 수단으로 이루어진다.
본 발명의 적합한 실시예에 첨부된 도면에 따라 본 발명을 더 상세히 이해할 수 있다.
본 발명은 시료중의 과산화수소 함량을 측정하는 데 사용되는 신규 시약에 관한 것이다. 이 신규 시약은 과산화수소를 거의 함유하지 않으므로, 이 신규 시약을 사용함으로써 극소 농도의 과산화수소를 측정할 수 있다.
본 발명의 적합한 제 1 실시 형태에 의하면, 발광 시약을 카탈라제와 반응시켜서 발광 시약중의 과산화수소를 분해시킨다. 이어서, 카탈라제와 시약중의 과산화수소 사이의 반응을 중지시킨다. 반응을 중단시키기 위해서, 반응을 중단시키는 억제제를 카탈라제와 시약의 혼합물에 첨가한다. 억제제는 아지드화나트륨이 적합하다.
전체 용적에 기초하여 100U/mι농도의 카탈라제를 발광 시약으로서 작용하는 루미놀 2×10-7몰/ι에 첨가하고, 루미놀을 실온에서 카탈라제와 1시간 동안 반응시킨다. 이어서, 전체 용적에 기초하여 0.01몰/ι농도의 아지드화나트륨(NaN3)를 반응 생성물에 첨가하여 본 발명의 시약을 형성시킨다. 본 발명의 시약은 마이크로퍼옥시다제와 같은 촉매 존재하에 과산화수소와 반응하여 빛을 방출한다. 방출된 빛을 측정하여 과산화수소 함량을 정량한다.
카탈라제 농도를 10 내지 200U/ml로 조절할 경우, 카탈라제를 시약으로부터 제거할 필요가 없으며, 또한 카탈라제와 시약중의 과산화수소 사이의 반응을 중단시킬 필요가 없다.
본 발명의 적합한 제 2 실시 형태에 의하면, 발광 시약 및(또는) 촉매를 고정 카탈라제와 반응시켜서 함유된 과산화수소를 분해시킨다.
수불용성 담체를 다기능성 시약과 반응시킨 후, 여기에 카탈라제를 고정시킨다. 아미노프로필-CPG(조절된 다공성 유리 ; Controlled Porous Glass)와 글루타르 알데히드가 각각 수불용성 담체와 다기능성 시약으로서 적합하게 사용될 수 있다. 아미노프로필-CPG 1g을 2.5% 글루타르알데히드 25ml와 실온에서 3시간 동안 반응시켜서 알데히드 CPG를 형성시킨다. 이어서, 알데히드 CPG를 100, 000U/ml의 카탈라제 용액 2ml와 실온에서 3시간 동안 반응시켜 고정 카탈라제를 생성시킨다. 이 고정 카탈라제를 사용하여 루미놀 용액 및(또는) 촉매 용액중의 과산화수소를 분해시킨다. 즉, 루미놀 용액 및(또는) 촉매 용액을 고정 카탈라제가 충전된 컬럼을 통해 통과시켜서 본 발명의 시약을 형성한다. 다른 방법으로서, 고정 카탈라제를 나일론 네트 백 중에 넣고, 루미놀 및(또는) 촉매를 함유하는 용액(들)에 첨가하여 본 발명의 시약을 제조한다.
본 발명의 효과를 다음 실시예로 설명한다. 하기 실시예에서, 카탈라제로서는 미합중국 소재 시그마 케미칼 캄파니(SIGMA CHEMICAιCONPANY)로부터 상품명 CATALASE C 3155(소의 간으로부터 얻음)로 시판되는 제품을 사용하였고, 마이크로퍼옥시다제로서는 시그마 케미칼 캄파니로부터 상품명 MICROPEROXIDASE(MP-11) M 6756으로 시판되는 제품을 사용하였다.
[실시예 I]
카탈라제를 발광 시약으로서 작용하는 루미놀 2×10-7몰/ι및 탄산 0.2몰/ι 함유하는 완충 용액에 첨가하여 전체 용적에 기초하여 100U/ml의 카탈라제를 얻고, 루미놀을 실온에서 1시간 동안 카탈라제와 반응시켰다. 이어서, 아지드화나트륨(NaN3)를 반응 생성물에 첨가하여 전체 용적에 기초하여 아지드화나타륨 0.01몰/ι를 얻었다. 이 용액을 "A 용액"이라고 한다. A 용액 0.5mι및 촉매로서 작용하는 마이크로퍼옥시다제 5×10-6몰/ι를 함유하는 수용액 0.5ml를 시험하고자 하는 여러가지 농도(10-3내지 10-9몰/ι의 과산화수소를 함유하는 용액 0.1ml에 첨가하였다. 마이크로퍼옥시다제 존재하에 루미놀과 과산화수소 사이의 반응에 의해 각각 방출된 광량을 광도계 UPD-8000[가부시끼가이샤 메이데나(KABUSHIKI KAISHA MEIDENSHA)제품]을 사용하여 혼합 후 15초 동안의 적분치로서 측정하였다.
대조예로서, 카탈라제로 처리하지 않은 루미놀 2×10-6몰/ι를 함유하는 수용액 0.5mι및 4×10-6몰/ι마이크로퍼옥시다제 0.5ml를 여러가지 농도(10-3내지 10-9몰/ι)의 과산화수소를 함유하는 용액 0.1ml에 첨가하였다. 각각의 반응에 의해 방출된 광량을 실시예 1과 유사한 방법으로 측정하였다(대조예 I).
제 1 도는 과산화수소 농도의 각각의 반응에 의해 방출된 광량과의 관계를 나타낸다.
대조예 I에 있어서, 과산화수소 수용액의 농도가 10-7몰/ι미만과 같이 비교적 낮은 경우, 루미놀 및 마이크포퍼옥시다제에 실제로 첨가된 과산화수소 수용액에 대한 루미놀에 함유된 과산화수소의 비는 비교적 크다. 결과적으로, 방출 광량은 루미놀 및 마이크로퍼옥시다제에 실제로 첨가된 과산화수소 수용액에 의한 방출 광량보다 훨씬 더 크다. 즉, 과산화수소 농도가 10-7몰/ι미만인 경우, 백그라운드(background) 광이 측정치에 상당한 영향을 미치므로, 이와 같은 저농도의 과산화수소의 실제 함량을 측정하기가 어렵다. 한편, 실시예 I 에 있어서, 과산화수소의 농도가 약 10-8몰/ι인 경우, 백그라운드 광은 측정치에 거의 영향을 주지 않았다. 그러므로, 본 발명의 시약을 사용함으로써 최대로 약 10-8몰/ι까지의 저농도에서도 과산화수소 함량을 정확히 측정할 수 있다.
[실시예 Ⅱ]
실시예 I이 A 용액 0.5mι및 촉매로서 작용하는 페리시안화칼륨 6×10-3몰/ι를 함유하는 수용액 0.5ml를 여러가지 농도(10-4내지 10-9몰/ι)의 과산화수소를 함유하는 용액 0.1ml에 첨가하였다. 15초 후, 페리시안화칼륨 존재 하에서 루미놀과 과산화수소 사이의 반응에 의한 방출 광량을 광도계 UPD-8000으로 30초 동안 측정하여 그 적분치를 얻었다.
실시예 II와 비교하기 위해, 카탈라제로 처리하지 않은 2×10-7몰/ι의 루미놀 용액 0.5mι및 6×10-3몰/ι페리시안화칼륨 용액 0.5ml를 여러가지 농도(10-4및 10-9몰/ι)의 과산화수소 용액 0.1ml에 첨가하였다. 각각의 반응에 의한 방출 광량을 실시예 Ⅱ와 유사한 방법으로 측정하였다(대조예 Ⅱ).
제 2 도는 과산화수소 농도와 상기의 각 반응에 의한 방출 광량 사이의 관계를 나타낸다.
제 2 도에 나타난 바와 같이, A 용액을 과산화수소 수용액에 첨가한 후 예정된 시간이 경과했을 때 실시예 I과 유사한 결과가 얻어졌다. 그러므로, 본 발명의 시약과 시료를 자동 피펫 장치 뿐만 아니라 손으로 피펫하는 경우에도 본 발명의 시약을 사용할 수 있는데, 그 이유는 시약과 시료를 셀에 주입시킨 후 셀을 측정 장치의 측정 위치에 장착하는데 약 10초가 소요되기 때문이다.
[실시예 Ⅲ]
카탈라제의 최적 농도를 결정하기 위해서 다음과 같은 실험을 행하였다.
카탈라제를 2×10-7몰/ι 루미놀 및 5×10-6몰/ι 마이크로퍼옥시다제를 함유하는 수용액에 첨가하여 각각 500U/ml, 100U/mι및 1U/ml의 카탈라제를 함유하는 용액을 얻고, 이들을 1시간 동안 방치하였다. 이어서, 각각의 용액 0.5ml를 10-3내지 10-9몰/ι의 과산화수소를 함유하는 수용액 0.1ml에 첨가하였다. 각 시료에서 마이크로퍼옥시다제 존재하에 루미놀과 과산화수소 사이의 반응에 의한 방출 광량을 광도계 UPD-8000으로 측정하였다.
대조예로서, 2×10-7몰/ι루미놀을 함유하는 수용액 0.5mι및 5×10-6몰/ι의 마이크로퍼옥시다제를 함유하는 수용액 0.5ml를 10-3내지 10-9몰/ι의 과산화수소를 함유하는 수용액 0.1ml에 첨가하였다. 각 반응에 의한 방출 광량을 실시예 Ⅲ과 유사한 방법으로 측정하였다(대조예 Ⅲ).
제 3 도는 과산화수소 농도와 각 반응에 의한 방출 광량 사이의 관계를 나타낸다. 카탈라제 농도가 500U/ml일 경우, 시료중에 과산화수소가 함유되지 않았을 때의 방출 광량인 블랭크치는 감소될 수 있다. 그러나, 용액중에 카탈라제가 과량으로 존재하기 때문에, 시험하고자 하는 과산화수소가 또한 분해되고, 과산화수소를 함유하는 시료의 방출 광량이 또한 감소된다. 한편, 카탈라제 농도가 1U/ml일 경우, 카탈라제 농도가 너무 작기 때문에 루미놀중의 과산화수소가 충분히 분해되지 않아 블랭크치가 효과적으로 감소되지 않는다. 이러한 경우, 카탈라제의 최적 농도는 100U/ml임이 발견되었다.
[실시예 Ⅳ]
시료에 첨가하는 카탈라제의 최적 농도를 구하기 위해서, 카탈라제를 2×10-7몰/ι 루미놀 및 5 : 10-6몰/ι의 마이크로퍼옥시다제를 함유하는 용액에 첨가하여 200U/ml, 100U/mι및 10U/mι카탈라제를 함유하는 용액을 얻고, 이들을 1시간 동안 방치하였다. 이어서, 각각의 용액 0.5ml를 여러가지 농도(10-3내지 10-9몰/ι)의 과산화수소를 함유하는 수용액 0.1ml에 첨가하고, 각 반응에 의한 방출 광량을 광도계 UPD-8000으로 측정하였다.
실시예 Ⅲ과 비교하기 위해서, 카탈라제를 2×10-7몰/ι의 루미놀 및 5×10-6몰/l의 마이크로퍼옥시다제를 함유하는 용액에 첨가하여 카탈라제 250U/ml(대조예 Ⅳ-I) 및 5U/ml(대조예 Ⅳ-Ⅱ)를 함유하는 용액을 얻고, 이들을 1시간 동안 방치하였다. 이어서, 이들 용액 0.5ml를 10-3내지 10-9몰/ι의 과산화수소를 함유하는 각각의 시료 0.1ml와 혼합하고, 각각의 반응에 의한 방출 광량을 동일한 방법으로 측정하였다.
이 결과를 제 4 도에 나타내었다. 제 4 도에 나타난 바와 같이, 카탈라제 농도가 200U/ml, 100U/mι및 10U/ml인 경우, 블랭크치가 충분히 감소되어 측정 감도를 개선할 수 있고, 또한 피검 시료중의 과산화수소가 과량의 카탈라제에 의해 분해되지 않았다. 카탈라제 농도가 200U/ml보다 클 경우, 즉 250U/ml인 경우, 블랭크치가 감소될 수 있지만, 용액중에 과량의 카탈라제가 존재하기 때문에, 실험하고자하는 과산화수소도 과량의 과산화수소에 의해 분해되어 모든 측정치가 감소한다. 한편, 카탈라제 농도가 5U/ml인 경우, 카탈라제 농도가 너무 작기 때문에, 루미놀중의 과산화수소가 충분히 분해되지 않아 블랭크치를 효과적으로 감소시킬 수 없다. 그러므로, 카탈라제의 최적 농도는 10U/mι내지 200U/ml였다.
[실시예 Ⅴ]
상기 시약을 자동 피펫 장치로 사용하는데 소요되는 최적 측정 시간을 다음과 같은 실험으로 결정하였다.
카탈라제 농도가 100U/ml가 되도록 카탈라제를 2×10-7몰/ι의 루미놀 및 5×10-6몰/ι의 마이크로퍼옥시다제를 함유하는 용액에 첨가하고, 1시간 동안 방치하였다. 이어서, 이 용액 0.5ml와 과산화수소 수용액 0.1ml를 자동 피펫 장치를 사용하여 셀에 주입하고, 이들 반응에 의한 방출 광량을 광도계 UPD-8000으로 측정하여 혼합 후 15초 동안 적분치를 얻었다.
대조예로서, 상기 반응에 의한 방출 광량을 상기와 동일한 방법으로 혼합하고 15초후에 개시하여 15초 동안 측정하여, 그 적분치를 얻었다(대조예 Ⅴ).
상기 측정 결과를 제 5 도에 나타내었다. 또한, 비교용으로 대조예Ⅲ의 결과를 제 5 도에 나타내었다. 대조예 Ⅴ의 경우, 블랭크치는 감소되었으나, 다른 측정치는 모두 마찬가지 이었다. 그 이유는 과산화수소로 인한 전형적인 발광 현상에 있어서, 시약을 시료에 첨가한 2 내지 3초후에 방출 광량이 그 피크에 도달하기 때문이다.(제6도 참조). 그러므로, 본 발명의 을 사용하는 경우, 방출 광량은 자동 피펫 장치로 혼합한 후 15초 동안 측정하는 것이 적합함을 알 수 있다.
본 발명에 의한 시약의 안정성을 시험하기 위해서 다음과 같은 실험을 행하였다.
카탈라제를 2×10-7몰/ι의 루미놀 및 6×10-3몰/ι 페리시안화칼륨을 함유하는 용액에 첨가하고, 혼합한 후 즉시, 1/2시간, 1시간, 5시간, 10시간, 15시간, 20시간 및 24시간 후에 광도계 UPD-8000으로 방출 광량(15초 동안의 적분치로서)을 측정하였다.
그 결과를 제 7 도에 나타내었다. 제 7 도에 나타난 바와 같이, 본 발명의 시약은 방치 시간에 관계없이 안정한 것으로 나타냈다.
또한, 동일한 혼합물에 의한 방출 광량을 카탈라제를 첨가하고 1주일 및 1개월 후에 측정하였다. 제 8 도에 나타난 바와 같이, 본 발명의 시약은 1개월 후에도 안정한 것으로 나타났다.
[실시예 Ⅶ]
다기능성 시약을 수불용성 담체와 반응시킨 후, 이어서 여기에 카탈라제가 고정되도록 카탈라제를 부착시켰다. 아미노프로필-CPG[다공성 유리, 공극 직경 : 120-200메쉬, 일렉트로-뉴클레오닉스 인크. (ELECTRO-NUCLEONICS INC.) 제품]와 글루타르알데히드를 각각 수불용성 담체와 다기능성 시약으로서 사용하였다. 아미노프로필-CPG 1g을 2.5% 글루타르알데히드 및 0.01% 인산을 함유하는 완충 용액 25ml중에 실온에서 3시간 동안 침지시켜서 알데히드 CPS를 형성시켰다. 이어서, 알데히드 CPG를 100, 000U/mι카탈라제 및 0.01% 인산을 함유하는 완충 용액 2ml와 실온에서 3시간 동안 반응시켜서 고정 카탈라제를 제조하였다.
이어서, 발광 시약으로서 작용하는 루미놀을 상기 고정 카탈라제가 충전된 컬럼을 통해 통과시켰다. 이 용액 0.5ml와 마이크로퍼옥시다제 0.5ml를 여러가지 농도(10-3내지 10-9몰/ι)의 과산화수소를 함유하는 수용액 0.1ml에 첨가하였다. 각 반응에 의한 방출 광량을 광도계를 사용하여 15초 동안 적분치로서 측정하였다.
대조예로서, 고정 카탈라제로 처리하지 않은 루미놀을 각각의 동일한 과산화수소 수용액 0.1ml에 첨가하고, 방출 광량을 측정하였다(대조예 Ⅶ).
이들 결과를 제 9 도에 나타내었다. 대조예 Ⅶ의 경우, 시료중의 과산화수소의 농도가 비교적 낮을 경우, 예를 들면 10-7몰/ι 미만일 경우, 피검 시료중의 과산화수소에 대한 루미놀중의 과산화수소의 비는 비교적 크다. 그 결과, 반응액중에 이미 함유되어 있는 과산화수소에 의한 방출 광량은 시료중의 과산화수소에 의한 방출 광량보다 훨신 더 크다. 즉, 시료중의 카탈라제 농도가 10-7U/mι미만인 경우, 백그라운드 광이 측정치에 상당한 영향을 미치기 때문에 이와 같은 낮은 농도의 과산화수소의 함량을 정확히 측정하기는 어렵다, 한편, 실시예 Ⅶ의 경우, 과산화수소의 농도가 약 10-8몰/ι 일 경우에도 백그라운드 광은 측정치에 거의 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명의 시약을 사용함으로써 약 10-8몰/ι 정도의 낮은 과산화수소 농도에서도 과산화수소 함량을 측정할 수 있음을 발견하였다.
본 발명에 의하면, 본 발명에 의한 방법은 제10도에 나타낸 장치를 사용함으로써 행할 수 있다. 루미놀과 같은 발광 시약 및 마이크로퍼옥시다제와 같은 촉매를 각각 탱크(1) 및 (2)에 저장하였다. 발광 시약 및 촉매를 펌프(3)을 사용하여 흡입시켜서 고정 카탈라제가 충전된 컬럼(6)을 통하여 흑색 상자(5)내의 셀(4)에 주입시켯다. 발광 시약 및 촉매를 함유하는 시료(7)로부터 방출되는 광을 광전자 증배관(8)로 검출하였다.
[실시예 Ⅷ]
실시예 Ⅶ과 유사한 방법으로 제조한 고정 카탈라제를 나일론 네트 백에 넣었다. 여기서, 나일론 네트 백은 수불용성 담체로서 사용한 유리 비드가 배관으로 사용한 실리콘 튜브의 내경보다 작아 고정 카탈라제가 발광 시약 밖으로 유출되는 것을 막기 위해 사용하는 것으로서, 메쉬 100 이하의 크기의 그물눈을 갖는, 나일론으로 제조된 그물이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 나일론 네트 백 중의 고정 카탈라제를 루미놀 용액 100ml와 마이크로퍼옥시다제 용액 100ml중에 각각 침지시켰다. 이어서, 루미놀 용액 0.5ml와 마이크로퍼옥시다제 용액 0.5ml를 여러가지 농도(10-4내지 10-9몰/ι)의 과산화수소 용액 0.1ml에 첨가했다. 각 반응에 의한 방출 광량을 광도계 UPD-8000을 사용하여 측정하였다.
대조예로서, 고정 카탈라제로 처리하지 않은 루미놀 및 마이크로퍼옥시다제를 사용함으로써 각 반응에 의한 방출 광량을 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과를 제11도에 나타내었다. 제11도에 나타낸 바와 같이, 실시예 Ⅶ과 동일한 결과가 이 실시예에서도 얻어짐을 알 수 있다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 의한 방법은 제12도에 나타낸 장치를 사용함으로써 행할 수 있다. 발광 시약 및 촉매를 각각 탱크(11)과 (12)에 저장하였다. 나일론 네트 백 중의 고정 카탈라제(13)을 각각 탱크(11) 및 (12)에 넣었다. 발광 시약 및 촉매를 펌프(14)로 흡입하여 흑생 상자(16)내의 셀(15)에 도입시켰다. 발광 시약 및 촉매를 함유하는 시료(17)로부터 방출광량을 광전자 증배관(18)을 사용하여 검출하였다.

Claims (15)

  1. 과산화수소를 함유하는 시약을 카탈라제와 혼합하여 시약중의 과산화수소를 분해하는 단계, 카탈라제와 과산화수소 사이의 반응을 중단시키는 억제제를 카탈라제와 시약의 혼합물에 첨가하는 단계, 시료에 상기 시약을 첨가하는 단계, 및 촉매 존재하에 상기 시약과 시료중의 과산화수소 사이의 반응에 의해 발생되는 광량을 측정하여 시료중의 과산화수소의 함량을 측정하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 시료중의 과산화수소의 함량 측정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제는 아지드화나트륨인 것이 방법.
  3. 과산화수소를 함유하는 시약을 전체 용적에 기초해서 10 내지 200U/㎖ 농도의 카탈라제와 혼합하여 시약중의 과산화수소를 분해하는 단계, 시료에 상기 시약을 첨가하는 단계, 및 촉매 존재하에 상기 시약과 시료중의 과산화수소 사이의 반응에 의해 발생되는 광량을 측정하여 시료중의 과산화수소의 함량을 측정하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 시료중의 과산화수소의 함량 측정 방법.
  4. 과산화수소를 함유하는 시약을 고정 카탈라제와 접촉시켜 시약중의 과산화수소를 분해하는 단계, 시료에 상기 시약을 첨가하는 단계, 및 촉매 존재하에 상기 시약과 시료중의 과산화수소 사이의 반응에 의해 발생되는 광량을 측정하여 시료중의 과산화수소의 함량을 측정하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 시료중의 과산화수소의 함량 측정 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 시약은 상기 고정 카탈라제가 충전되어 있는 컬럼을 통해 통과시킴으로써 상기 고정 카탈라제와 접촉시키는 것인 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 고정 카탈라제는 수불용성 담체와 다기능성 시약 사이의 반응에 의해 형성되는 담체상에 고정된 카탈라제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 시약과 시료를 마이크로퍼옥시다제 존재하에 반응시켜 과산화수소 함량을 측정하기 위한 시약으로서, 발광 시약 및 전체 용적에 기초해서 10 내지 200U/㎖ 농도의 카탈라제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 시료중의 과산화수소 측정용 시약.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 발광 시약이 루미놀인 시약.
  9. 시약과 시료를 마이크로퍼옥시다제 존재하에 반응시켜 과산화수소 함량을 측정하기 위한 시약으로서, 발광 시약 및 고정 카탈라제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 시료중의 과산화수소 측정용 시약.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 고정 카탈라제는 수불용성 담체와 다기능성 시약 사이의 반응에 의해 형성되는 담체 상에 고정된 카탈라제로 이루어지는 것인 시약.
  11. 제10항에 있어서, 상기 수불용성 담체는 아미노프로필-CPG(조절된 다공성 유리 ; Controlled Porous Glass)인 것인 시약.
  12. 제10항에 있어서, 상기 다기능성 시약은 글루타르알데히드인 시약.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 발광 시약은 루미놀인 시약.
  14. 발광 시약이 저장된 제 1 용기, 촉매가 저장된 제 2 용기, 셀이 위치하고, 광학적으로 밀폐가능한 중공실을 형성하는 하우징 수단, 상기 촉매 및 상기 발광 시약중의 과산화수소의 분해에 대해 활성인 고정 카탈라제가 충전되어 있는 컬럼, 상기 발광 시약 및 상기 촉매를 상기 제 1 용기 및 제 2 용기로부터 상기 컬럼을 통해 상기 하우징실중의 상기 셀 중으로 주입시키기 위한 제 1 수단, 및 상기 촉매 존재하에서 상기 발광 시약과 상기 시료중의 상기 과산화수소 사이의 반응에 의해 방출되는 광량을 측정하기 위한 제 2 수단으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 상기 시료중의 과산화수소 함량을 측정하기 위하여 촉매 존재하에 발광 시약과 시료중의 과산화수소 사이의 반응에 의해 방출되는 광을 검출하는 장치.
  15. 발광 시약 및 이 발광 시약중의 과산화수소 분해에 대해 활성인 고정 카탈라제가 저장된 제 1 용기, 촉매 및 이 촉매의 과산화수소 분해에 대해 활성인 고정 카탈라제가 저장된 제 2 용기, 셀이 위치하고, 광학적으로 밀폐가능한 중공실을 형성하는 하우징 수단, 상기 발광 시약 및 상기 촉매를 상기 제 1 용기 및 제 2 용기로부터 상기 하우징실중의 상기 셀중으로 주입시키기 위한 제 1 수단, 및 상기 촉매 존재하에 상기 발광 시약과 시료중의 상기 과산화수소의 반응에 의해 방출되는 광량을 측정하기 위한 제 2 수단으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 상기 시료중의 과산화수소 함량을 측정하기 위하여 촉매 존재하에 상기 발광 시약과 상기 시료중의 과산화수소 사이의 반응에 의해 방출되는 광을 검출하는 장치.
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