KR930003312B1 - 메탈로티오네인과 생물학적 활성 분자의 추적-표지 결합체의 제조방법 - Google Patents

메탈로티오네인과 생물학적 활성 분자의 추적-표지 결합체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

메탈로티오네인과 생물학적 활성 분자의 추적-표지 결합체의 제조방법
본 발명은 추적 금속-함유 메탈로티오네인과 생물학적 활성분자를 결합(conjugate)시키는 향상된 방법에 관한 것이다.
진단 및 치료를 목적으로 방사표지된 표적-탐비용 생물학적 활성 분자(이하 BAM으로 기술한다), 특히 항체 및 그밖의 단백질을 사용하는 것은 매우 활기있는 분야이다. 이러한 방사표지법에 대해서는 하기 문헌을 참조하라 : 액켈만(Eckelman)등의 Radiolabeling of Antibodies, Cancer Research, 40 : 3036-3042(1980) 및 스파키아나키스(Sfakianakis)등의 Radioimmunodiagnosis and Radioimmunotherapy, J. Nuci. Med 23 : 840-850(1982). 대부분 광범위하게 사용되는 방사표지 항체법은 I-131, I-125 또는 I-123을 사용하는 직접 요오드화법이다. 그러나, 이러한 방사성 핵종은 방사량적인 단점 및 방사영상(imaging)단점을 갖는다. 특정 금속 방사성 핵종, 예를들어 Tc-99m 및 In-111은 신티그래픽 영상에 보다 적절하다. 그러나 지금까지는, 방사성 핵종과 BAM 사이의 친화력이 충분하지 못하기 때문에, 대개의 BAM에 금속 방사성핵종을 직접 결합시키는 것은 어려운 일이었다. 더우기, 이러한 결합이 가능한 몇몇 경우에, 방사성 핵종의 결합은 때때로 BAM의 생물학적 활성이 부분적으로 또는 완전히 상실되는 결과를 초래한다.
상기의 이유로 인해, 본 기술분야에 금속 킬레이트제를 사용하는 공유 콘쥬게이트 결합에 의해 금속 방사성 핵종으로 BAM을 방사 표지하는 방법이 제안되었다. 예를들어, 카우(khaw)등은 Science 209 ; 295-297(1980)에 In-111 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA)로 방사표지된 심장미오신에 대한 항체 및 심근 경색증을 영상화하기 위한 상기 표지된 항체의 용도에 대해 발표하였다.
크레카렉(krejcarek)등은 Biochem, Biophys, Res. Commun. 77 : 585-585(1977)에 인체 혈청 알부민(HSA) 같은 단백질을 금속 방사성 핵종으로 표시하기 위한 DTPA의 용도에 대해 발표하였다.
프리챠드(pritchard)등은 Proc, Soc, Exp, Biol, Med. 151 : 297-302(1976)에 In-111를 킬레이트시킬 수 있는 여러가지 시약, 예를들어, 트랜스페린, D-페니실라민 및 데페록사민에 항체를 컨쥬게이트시키는 방법을 발표하였다. 요꼬야마(Yokoyama)등은 1981년에 공고된 유럽 특허원 제 35, 765호에 단백질(예를들어, HSA, 유로키나제, 피브리노겐), 항생물질(예를들어, "블레오마이신", "카나아이신")호르몬, 사카라이드 및 지방산을 포함하는 여러가지 BAM을 방사표지하기 위한 이작용성 킬레이트제로서 데페록사민을 기술하고 있다. 하버(Harber)등은 1981년에 공고된 유럽 특허원 제 38, 546호에 항체, 항원 및 항체단편을 포함하는 단백질을 방사표지하기 위한 이 작용성 킬레이트제로서 DTPA, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 에틸렌디아민을 기술하고 있다. 요꼬야마 등은 1981년 특허된 미합중국 특허 제4, 287, 362호에 단백질을 방사 표지하기 위한 이 작용성 킬레이트제로서 3-카복시-2-옥소프로피온 알데히드 비스(N-메틸-티오세미카바존) (OPBMT) 및 이의 유사체를 기술하고 있다. 선드버그(Sundberg) 등의 1976년 특허된 미합중국 특허 제3, 994, 966호, 미어레스(Meares)등의 미합중국 특허 제4,043,998호 및 륭(Leung)등의 Int. J. App. Radiation and Isotopes 29 : 687-692(1978)에는 단백질을 표지하기 위한 1-(p-벤젠디아조늄)-EDTA 및 1-p-아미노페닐-EDTA 등의 이작용성 EDTA 유사체가 기재되어 있다. 팩(paik)등은 J. Radioanal. Chem. 57 : 553-564(1980)에 이 작용성 킬레이트제로서 DTTA-아조-이미데이트로 불리우는 DTPA의 아조유도체 및 HSA를 In-111로 표지하기 위한 이의 용도를 기술하고 있다.
그러나, 지금까지 알려진 각각의 이 작용성 킬레이트제는 일반적으로 특정의 금속 방사성 핵종을 배위하는 것으로 밝혀졌다. 그러므로 여러가지 금속이온을 배위할 수 있고, BAM과 결합할 수 있으면서 BAM의 생물학적 활성을 유지할 수 있는 킬레이트제의 개발이 필요하게 되었다.
더우기, 통상의 맥관내 방사 그래피 대비제는 요오드화 방향족 화합물을 기본으로 한다. 그러나, 이 화합물은 사용농도에서 생리학적으로 내성이 있음은 밝혀지지 않았다. 그러므로, 상기의 요오드화 화합물 대신의 생리학적으로 혼용가능한 화합물의 개발이 필요하다.
또한, NMR 영상법의 빠른 발전으로 인해 특히 BAM과 콘쥬게이트시킬 수 있는 유용한 대비제가 필요하게 되었다. 브라쉬(Brasch)는 NMR 영상에 대한 대비증강법에 관한 그의 논문[Radiology 147 : 781-788(1983)]에서 대비제 화합물은 저농도에서 강한 NMR 활성을 가져야하며 생체내에서 비-반응성이며 진단용량으로는 비독성을 나타내야 한다는 "이상적"대비 증강제로서의 기준을 설정하였다.
톨만(Tolman)의 1983년 10월 6일자 미합중국 특허원 제 539, 733호에는 추적-표지된 메탈로티오네인과 생물학적 활성분자(BAM)의 결합체를 제조하기 위한 여러가지 방법이 기재되어 있다. 이 방법으로 유용한 추적-표지된 결합제를 수득하기는 하나 그 수율이 매우 낮았다. 그러므로 BAM에 추적-표지된 메탈로티오네인을 결합시키는 방법의 개발이 요구된다.
본 발명은 ( i ) BAM을 헤테로 이작용성 가교결합제에 결합시키고 ; ( Ⅱ ) ( i ) 의 생성물을 적어도 1부위의 금속이 추적자 금속인 메탈로티오네인과 결합시키거나, ( i ) 의 생성물을 모든 금속 부위가 비-추적자인 메탈로티오네인과 결합시킨 다음 비-추적자의 적어도 1부위에 추적자 금속으로 교환 표지하는 연속단계로 구성되는 메탈로티오네인과 BAM의 추적-표지된 결합체를 생성시키는 향상된 방법에 관한 것이다. 메탈로티오네인(Metallothioneins) 메탈로티오네인은 1978년 7월 17 - 22일에 쮜리히에서 열린 Proceedings of the First International Meeting on Metallothionein and Other Low Molecular Weight Metal-Binding Protein[ed, by kogi and Nordberg, Birkhauser Verlag Basel, 1979(kag 및 Nordberg로 후술함)]에서 메탈로티오네인으로 명명하였다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재된 kagi 및 Nordberg의 제46 내지 92면을 하기와 같이 요약하였다. 메탈로티오네인은 1957년에 발견되었으며 : 칼슘 및 아연을 함유하는 단백질은 말의 신장에서 단리 하였다. 연속적으로 그 후 몇가지 단백질이 토끼, 인체, 원숭이, 소, 양, 돼지, 개, 햄스터, 래트, 마우스 및 바다표범에서 발견되었다. 말의 메탈로티오네인은 분자량이 6000 내지 7000이며 ; 금속함량이 높고 ; 시스테인 함량이 높으며 ; 일반적으로 방향족 아미노산은 함유하지 않고 ; 금속 티올레이트(머캅타이드)의 광학성 특성이 고정되어 있는 특성을 갖는다. 상기의 여러가지 특성을 갖는 말 신장의 메탈로티오네인과 유사한 단백질을 "메탈로티오네인(kagi 및 Nordbert, p48)으로 명명할 수 있음을 상기의 First International Meeting on Metallothioneins에서 동의하였고, 이에 따라 본 명세서에서 이 용어를 사용하였다. 물론 메탈로티오네인 단편은 적어도 약 6개의 아미노산잔기를 갖는 작용적으로 유사한 폴리펩티드로서 본 발명에 사용될 수도 있다.
일반적으로, 메탈로티오네인은 생체내에서 생성되며 광범위한 여러가지 금속이온을 킬레이트시키는 친화력이 매우 좋은 저분자량이 단백질이다. 메탈로티오네인의 생리학적 기능은 잘 알려져 있지 않으나, 일반적으로, 필수 금속의 항상성(homeostasis) 기능 및 중금속의 해독작용을 하는 것으로 이해된다. 메탈로티오네인은 고등척추동물, 무척추동물, 및 진핵 및 원핵 미생성물에 편재한다. 예를들어, Cd, Hg, Zn, 또는 Cu등의 금속이온에 유기체를 노출시키면 아포단백질 티오네인에 대한 mRNA의 생성이 증가하여 메탈로티오네인의 합성이 새롭고 빠르게 유발된다. 그러므로, Cd 주입에 감응하는 특정 미생물에 의해 생성된 카디스틴등의 분자도 본 발명에 사용하려고 한다.
모든 표유동물의 티오네인은 60 내지 61개의 아미노산 잔기를 함유하며 분자당 7g-원자의 이가 금속이온 또는 20g-원자이하의 일가 금속이온과 결합할 수 있다. 일반적으로 티오네인은 방향족 또는 히스티딘 잔기를 함유하지 않으며, 포유동물 티오네인중 20개의 아미노산 잔기는 시스테인이다. 분광학적 현상에 의하면, 티오네인에 의한 금속 결합은 오로지 시스테인의 술프히드릴 잔기에 의한다.
여러 메탈로티오네인의 완전한 아미노산 서열은 이미 결정되어 kagi 및 Nordberg 60페이지에 보고되어 있으며, 그중 하나를 다음에 나타내었다.
[표 1 ]
메탈로티오네인(MT)의 아미노산 서열
Figure kpo00001
약호 : A=알라닌, C=시스테인, D=아스파르트산, E=글루탐산, G=글리신, I=이소로이신, K=리신, L=로이신, M=메티오닌, N=아스파라긴, P=프롤린, Q=글루타민, R=아르기닌, S=세린, T=트레오닌, V=발린, Ac=아세틸, H=유리아미노말단, OH=유리카복시말단.
상기식에서 시스테인 잔기는 쇄를 따라 분포하여 다수의 -C-X-C-잔기(여기서, X는 시스테인 이외의 아미노산이다)가 존재함을 알 수 있다. 상기 표에는 포유류의 메탈로티오네인 보다 분자량이 적은 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 메탈로티오네인이 포함된다. kagi 및 Nordberg 55면에 보고된 바와 같이 고분자량의 메탈로티오네인(9,500 내지 10,000)은 다른 유기체로부터 단리된다. 상기의 모든 메탈로티오네인이 본 발명에 포함되나 포유류의 메탈로티오네인이 바람직하다. 생체내 진단 및 치료목적으로, 치료할 포유류와 같은 종류에서 단리한 메탈로티오네인을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
하기 문헌에 기재된 금속을 결합하는 티오네인 단편이 본 발명에 사용될 수 있다[참조, Yoshida등 Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 76 : 486-490, kondo 등의 Tetrahedron Letters, 24 : 925-928 : 및 콘도등의 Tetrahedron Letters, 25 : 3869(1984) : 및 Wing등의 J. Biol. Chem., 257 : 3471(1982) : 및 본 명세서에 삽입된 참고문헌]. 요시다등에 의해 합성된 마우스 티오네인의 단편은 다음의 서열을 갖는다 : 약호는 표 1에서와 같다.
1. H2N-K-C-T-C-C-A-OH
2. H2N-A-C-K-D-C-K-C-T-OH
3. H2N-S-C-T-C-T-S-S-C-A-OH
4. H2N-G-C-S-K-C-A-Q-G-C-V-OH
5. H2N-G-C-V-K-G-A-A-D-K-C-T-C-A-OH
요시다등에 의해 합성된 것 같은 금속-결합된 티오네인 단편(즉, 메탈로티오네인 단편)이 본 발명에 사용하기에 적절하나 완전한 메탈로티오네인이 바람직하다.
물론, 메탈로티오네인과 유사한 기능을 갖는 폴피-펩티드 뿐만아니라 메탈로티오네인/메탈로티오네인 단편과 통상의 합성법으로 제조한 통상의 단량체의 공중합체도 이들의 상기에 기재 한 메탈로티오네인의 일반적 특성을 갖는한 본 발명의 실시에 사용될 수 있음은 본 분야의 숙련가에 의해 자명할 것이다.
[금속추적-표지]
현재까지 알려진 진단 및 치료용 방사성 핵종중 하기의 것이 본 발명의 실시에 유용하다(반감기 d=일, h=시간)
[표 Ⅱ]
Figure kpo00002
진단용 방사성 핵종은 30kev 내지 1Mev의 에너지를 방출하여 약 1분 내지 8일의 반감기를 갖는 감마선 방출제 및/또는 양전자 방출제 이다. 이러한 방사성 핵종은 예를들어 평면, 단일양자 또는 양전자 단층 사진 촬영법에 기초한 통상의 방사 신티그래픽 방법에 유용하다. 치료용 방사성 핵종은 100ev 내지 2Mev의 에너지를 갖는 α-, β-, γ- 전환 전자 또는 오제(Auger) 전자를 방출하며 생체내에서 세포를 죽일 수 있다.
물론, 본 분야의 숙련가는 상기의 여러가지 방사성 핵종을 진단 및 치료용으로 사용하는 경우 그 사용 용량이 여러가지로 변환될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 영상화 하기 위해 방사성 핵종을 사용하는 경우, 사용되는 특정용량은 단지 진단용으로 유용한 영상을 수득하기에 충분한 양, 일반적으로 체중 70㎏당 0.1 내지 200mCi범위이다. 한편, 치료용으로는 더 많은 용량 일반적으로 체중 70㎏당 0.1 내지 500mCi의 범위가 사용될 수 있다. 또한, 바람직한 용량은 근본적으로 반감기, 방사능형태 및 방사능에너지등의 방사성 핵종의 물리적 성질 및 방사표시제의 약동학적 특성에 따른다.
NMR 영상용으로 현재까지 알려진 대비제중 코발트, 니켈, 구리 및 루테늄이 본 발명의 실시예 유용하다.
방사그래피 영상용으로 현재까지 알려진 대비제중 주기율표 72 내지 83번의 금속원소가 본 발명의 실시예 유용하며, 비스무스, 납, 수은, 금, 백금, 레늄 및 텅스텐이 바람직하다.
[표적-탐지용 생물학적 활성 분자]
본 명세서에서 사용된 용어, 표적-탐지용 생물학적 활성분자(BAM)은 항체(특히, 모노클로날 항체), 항체의 Fab, Fab', 및 Fcab')2단편, 및 포유류 신체의 특정기관, 조직 또는 세포의 그밖의 분자를 뜻한다. 상기의 그밖의 분자는 예를들어, 인슐린, 글루카곤, 프로스타 글라딘, 스테로이드성 호르몬등의 호르몬, 및 펩티드, 및 난소에서 수용체에 결합하는 황체화(leuteinizing)호르몬 같이 특정 세포형태에 결합하는 다른 단백질이다. 단백질 등의 거대분자는 일반적으로 메탈로티오네인 결합을 통해 방사표지하기에 바람직하나, 여러 작은 분자의 결합은 적절하지 못하다. 예를들어, 심장의 무스카린 콜린성 수용체에 결합하는 퀴누클리디닐, 벤질레이트 여러 분자와 방사능표지된 메탈로티오에인과의 결합은 다음과 같이 생체내 심장 세포의 방사능 약제학적 생존능을 제공한다. 방사능 표지된 메탈로티오네인에 결합된 에스트로겐 및 뉴로펩티드는 각각 유방암 및 뇌관류제를 제공할 수 있을 것이다.
[메탈로티오네인에 BAM의 결합]
본 발명 방법의 개선점은 BAM이 메탈로티오네인에 결합되도록 가교결합체를 사용하는 것이다. 이러한 가교 결합제는 사실상 헤테로 이작용성이다. 즉, BAM을 결합시키기 위해 사용된 반응성기는 메탈로티오네인을 결합시키기 위해 사용된 반응성기와 작용상 서로 별개이다. 더욱 자세히 설명하자면, 메탈로티오네인과 반응할 가교결합제의 반응성기는 메탈로티오네인의 티올(-SH)기와 반응할 수 있는 것이어야 하며, BAM과 반응할 가교 결합제의 반응성기는 티올기와 반응할 수 없고, BAM상의 다른 작용기와 반응할 수 있는 것이어야 한다. BAM이 모노클로날 항체 또는 다른 글리코프로테인인 경우, 가능한 반응성기는 -NS2, -OH, -CO2H 및 NHC(=NH) NH2이다. 상기의 기를 함유하지 않는 보다 작은 약제 또는 호르몬의 경우, 상기기중 하나를 작은 분자에 합성적으로 혼입시켜 메탈로티오네인의 결합이 일어나도록 할 수 있다. 상기의 약제 또는 호르몬 내지 다른 것들은 사용하는 방법이 매우 광범위하게 본 기술분야에 알려져 있으며 생물학적 특이성 및 친화력의 보존을 우선적으로 고려한다. 상기의 합성 변법에 대하여는 문헌에 기재되어 있다[참조, Means and Feeney, "Chemical Modification of Proteins, "Holden-Day, Inc. (1971)].
더우기, 본 발명의 방법은 메탈로티오네인의 결합체에 가해지기 전에 BAM을 가교결합제에 결합시켜야 한다. 이러한 반응 순서가 역전된다면, 즉, BAM을 도입시키기 전에 메탈로티오네인을 가교결합제에 결합시키는 경우, 바람직하지못한 분자내 및/또는 분자간 가교결합이 활발해져서 BAM-메탈로티오네인 결합체의 수율을 감소시킨다. 하기 실시예에 나타나있듯이, 본 발명의 순차적 공정은 BAM과 메탈로티오네인의 추적-표지된 결합체의 수율을 기대 이상으로 향상시킨다.
그러므로, 헤테로 이작용성 가교결합제를 통해 BAM을 메탈로티오네인에 콘쥬게이트 시키는 것은 하기 일반식으로 나타낼 수 있다.
BAM＋X-Z-Y → BAM-Z-Y
BAM-Z-Y＋MT(-SH) → BAM-Z-MT
상기식에서, MT(-SH)는 Yer와 반응하는 기로서 -SH기를 갖는 메탈로티오네인이고, X는 Y와 상이하며, Z는 탄소(또는 N, S 또는 p원자)수 O (바람직하게는 1) 내지 20의 알킬, 아릴, 시클로알킬, 알케닐, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 포스포알킬, 카복시알킬, 또는 케토알킬이고, 단, X 또는 Y의 바람직한 결합 특성을 방해하는 잔기는 제외하며(X 및 Y가 서로 직접 결합되는 경우 Z는 존재하지 않는다) ; Y는 티올과 반응하는 잔기로서 α-할로산, α-할로에스테르, α-할로아미드, 아릴할라이드 및 여러가지 미카엘 수용체(예를들어, 말레이미드 비닐 술파이드 및 비닐술폰)이고 ; X는 BAM 상의 비-티올 작용기와 반응하는 잔기로서, -NH2-OH, -CO2H 및 -NHC(=NH) NH2이다.
X에 대한 바람직한 아실화제는 염화물 및 무수물등의 활성화 카복실 작용성 이미도 에스테르, 티올에스테르 및 N-히드록시숙신이미드 에스테르이다. 일반적으로, 아민은 생체내에서 에스테르보다 더 안정하므로 히드록실보다 아민을 아실화시킴이 바람직하다. 이런점에서, BAM상의 알데히드 또는 케톤기에 의한 헤테로 이작용성 시약의 NH2기의 환원적 알킬화도 유용하다.
-NHC(=NH) NH2기와 공유결합을 형성함에 있어서, X선에 대한 바람직한 잔기는 말론디알데히드와 유사한 1, 2- 및 1, 3-디카보닐 화합물, 시클로헥산-1, 2-디온 및 캄포르퀴논이다. 상기 시약과 아르기닌 잔기와의 반응은 매우 선택적이며 가역적이다.
가교결합을 시키기 위해 BAM의 카복시기를 사용함에 있어서 X에 대한 바람직한 잔기는 아미노기이다.
1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸)-카보디이미드 또는 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드 등의 수용성 카보디이미드에 의해 활성화시키는 경우, BAM의 활성화된 카복실기는 가교 결합제의 X=NH2와 반응하여 아미드 결합을 형성할 것이다.
본 발명에 유용한 시판되는 가교결합제는 숙신 이미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 숙신이미딜 4-(요오도 아세틸)아미노 벤조에이트(SIAB) 및 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트이다.
일반적으로, X 및 Y 사이의 쇄 길이는 결합될 BAM의 특성에 따른다. BAM이 거대한 경우, 메탈로티오네인에 결합된 가교결합제와 거대 단백질의 표적 작용성기 사이에 최적의 공유결합이 형성되는데 필요한 쇄의 길이보다 길 수도 있다. 반면에 BAM이 작은 경우, BAM을 그의 세포표면 수용체와 반응하기 위한 메탈로티오네인에 결합시키기 위해 매우 긴 쇄가 필요할 수도 있다. 결과적으로 쇄의 길이는 가교결합 과정에 적합하도록 또는 메탈로티오네인-BAM 결합체의 생물학적 활성을 최대로 유지시키도록 변화시킬 수 있다.
일반적으로, 메탈로티오네인에 단백질을 결합시킴에 있어, 메탈로티오네인 및 BAM의 변성과 생물학적 활성의 손실을 피하기 위해서는 순한 조건이 필요하다. 반응의 pH는 약 3 내지 11, 바람직하게는 5 내지 9, 온도는 0 내지 60℃, BAM 및 메탈로티오네인의 농도는 10-2내지 10-6M, 바람직하게는 약 10-4M 이어야 한다. 바람직한 용매는 일반적으로 물이며, 디메틸 술폭시드류의 용매를 여러 양으로 가하여 비극성 결합제를 용해시킬 수도 있다. 메탈로티오네인에 비-단백질류 BAM을 결합시키는 경우, 다소 강한 조건이 메탈로티오네인에 의해 내성이 될수 있고, 이 반응은 디메틸 술폭시드류의 유기용매중에서 수행될 수 있다.
[추적-표지 메탈로티오네인]
본 발명을 위해, 상기 반응식에 삽입된 메탈로티오네인을 "냉각(cold)"(즉, 추적금속을 함유하지 않는다) 시키거나 미리 추적-표지할 수 (즉, 추적 금속에 의해 점유된 메탈로티오네인의 금속 결합부위의 일부 또는 전부) 있다.
상기 반응식에서 추적-표지된 메탈로티오네인이 사용되는 경우에, 일반적으로 두가지 방법으로 추적-표지된 메탈로티오네인을 생성시킬 수 있다. 그 한 방법은 티오네인을 직접 표지하는 것이다. 다른 방법은 바람직한 금속추적-표지를 사용하여 Zm-메탈로티오네인 같은 메탈로 티오네인을 교환표지하는 것이다.
첫번째 방법, 즉 추적-표지로 티오네인을 직접 표지하는 방법은 엠 바삭(M, Vasak) 및 제이, 카기(J, kagi)에 의해 보고된 방법과 유사하다[참조. Proc. Notl. Acad, Sci, U.S.A, : 78 : 6709(1981)], 일반적으로 포유류 티오네인을 pHR에서 용해시키고, 모든 불용성 생성물질은 여과에 의해 제거한다. 이러한 티오네인 용액에 금속 추적-표지 및 바람직한 비-추적-표지 금속양이온을 가한다. 추적-표지 및 비-추적-표지 금속 양이온의 총 농도는 티오네인 당 적어도 7개의 이가 또는 20개의 일가금속 양이온이 결합될 수 있거나, 메탈로 티오네인의 모든 금속 결합부위가 채워지도록 이가 및 일가 양이온이 적절히 혼합될 수 있도록 충분히 해야 한다. 티오네인의 독특한 특성 때문에, 하나 이상의 금속 양이온을 함유하는 메탈로티오네인이 제조될 수 있다.
그러므로, 티오네인의 모든 금속-결합 부위가 금속 추적-표지로 채워질 수 있으므로 매우 고농도로 추적-표지된 메탈로티오네인이 수득될 수 있다.
금속 추적-표지로서 방사성 핵종을 사용하는 경우, 가하는 방사성 핵종의 농도는 해당되는 임상적인 적용에 필요한 특이활성에 따른다. 진단용으로는 티오네인 1몰당 방사성 핵종의 몰비가 1 이하일 수 있다. 치료용으로는 이보다 클 수 있다. 비-방사성 금속 양이온은 방사성 양이온에 의해 채워지지 않는 금속 결합부위를 채우기에 충분한 양으로 가할 수 있다. 방사성 핵종 및 임의로 비방사성 금속양이온을 가한다음 생성되는 용액을 탈가스화하여 산소를 제거하고, pH가 7.0 이상이될 때까지 불활성 대기중에서 중화시킬 수 있다. 이렇게 중화시키는 동안 티오네인이 방사성 핵종 및 비-방사성 금속양이온 주위를 둘러싸게되어 바람직한 방사표지된 메탈로티오네인이 형성된다. 그 다음 방사표지된 메탈로티오네인을 투석, 사이즈 익스클루젼 또는 이온 교환 크로마토그래피등의 통상의 방법으로 정제할 수 있다. 방사표지된 메탈로티오네인의 비-방사성 금속 함량은 원자 흡광법에 의해 측정 가능하며 방사성 핵종 함량은 방사능 붕괴를 계수하여 분석한다. 이렇게 정제된 방사성 핵종-표지된 메탈로티오네인은 전술한 가교결합제를 사용하여 BAM에 직접 결합시킬 수 있다.
두번째 표지 방법은 메탈로티오네인의 비-추적-표지 금속 양이온의 전부 또는 일부를 추적-표지 금속 양이온으로 교환시키는 방법이다. 이러한 교환반응을 성공시키려면 추적-표지 양이온은 형성된 메탈로티오네인중의 비-추적 표지 양이온보다 메탈로티오네인의 머캅타이드에 대한 친화력이 좋아야 한다.
예를들어, 금속 추적-표지 같은 방사성 핵종을 사용하는 경우, 아연 양이온은 테크네튬, 수은 또는 은의 양이온 보다 메탈로티오네인의 머캅타이드에 대한 친화력이 좋지 못하다. 그러므로 테크네튬-99m, 수은-197 도는 은-111의 존재하에 Zn-메탈로티오네인(MTH)의 Zn(Ⅱ) 양이온은 각각 99m Tc Zn-MTH,197Hg, Zn-MTh 또는111Ag, Zn-MTh로 쉽게 치환된다. 즉, Zn-MTh는 전술한 바삭(Vasak)등의 방법에 의해 쉽게 제조되므로, Zn-MTh 또는 Zn-MTh-BAM 결합체의 교환표지 반응은 Zn-MTh 또는 Zn-MTh-BAM 결합체를 가용성 교환 가능한 방사성 핵종, 예를들어99mTc-글루코헵토네이트,197HgCl2또는111Ag(NH3)2 ＋"와 혼합시켜 수행할 수 있다. 교반반응 후, 방사표지된 메탈로 티오네인을 예를들어, 투석, 사이즈 익스클루젼 또는 이온교환 크로마토그래피등의 통상의 방법으로 정제할 수 있다. 교환 표지의 수율은 방사능 붕괴를 계수하여 측정할 수 있으며 메탈로티오네인에 혼입된 총 방사능의 퍼센트로서 나타낸다. 코발트(Ⅱ), 니켈(Ⅱ) 및 아연(Ⅱ) 양이온은 표 2에 수록된 방사성 핵종을 포함하는 교환표지 반응에 사용가능한 메탈로 티오네인을 형성한다 :
아연(Ⅱ)양이온이 상기 교환 표지반응의 비-방사능 양이온으로 바람직하다.
한편, "냉각된" 메탈로티오네인을 본 발명의 과정에 사용하여, BAM-메탈로티오네인 결합체의 형성후 교환-표지시킬 수 있다. 이러한 교환 표지법은 전술한 바와 같이 수행한다. 이러한 교환 표지방법은 교환 표지반응이 한정 부위에서 수행될 수 있으므로 24시간 이내의 반감기를 갖는 방사성 핵종을 사용하는 경우 유용하게 사용된다.
후술하는 바와 같이 반감기가 짧은 방사성 핵종을 사용하는 Zn-MTh-BAM의 교환 표지반응은 사용직전 방사성 핵종을 도입시켜 붕괴에 의한 방사능의 필연적 손실을 피할 수 있다. 언급한 방사성 핵종중 99m Tc은 Mo-99/Tc-99m 생성기에서 쉽게 수득할 수 있고 바람직한 물리적 특성을 갖는 방사성 핵종 이므로 비교적 짧은 반감기를 가져 본 발명에 가장 바람직하다.
메탈로티오네인을 방사표지하기 위한 상기의 방법들은 비-방사능 금속 추적-표지의 혼입에 사용할 수 있다.
방사그래피 대비에 유용한 금속, 즉 Bi, Rh, Hg, Au, Pt, Re 및 W 중DPTJ, 수은 및 금 은 교환 표지하거나 아포 단백질에 직접 접합시킴으로 메탈로 티오네인에 혼입시킬 수 있으며, 나머지 원소의 혼입은 직접 표지법에 의해 성취된다. NMR 영상용으로 유용한 금속, 즉, Co, Ni Cu(Ⅱ) 및 Ru 중에서 구리(Ⅱ) 및 루테늄은 교환 표지에 의해 메탈로티오네인에 가장 잘 혼입되는 반면 코발트 및 니켈은 직접 표지법에 의해 혼입된다.
본 발명의 추적-표지된 결합체는 선행 기술의 추적-표지된 BAM과 같은 방법으로 사용한다. 이들은 저장(Storage 및 Shipment)하기 위하여 동결건조시키고, 정상 생리식염수 같은 약리학적으로 허용 가능한 매질에서 환원(reconstitution)시키며, 진단 영상 또는 치료할 목적으로 정맥내 주사할 수 있고, 또는 이들은 교환 표지에 의해 사용직전에 제조할 수 있다.
본 발명의 결합체는 생체분석 및 선행기술의 추적-표시된 화합물과 같은 방법으로 임상적 진단법에 사용될 수도 있다.
[실시예 1]
SIAB-가교 결합된99mTc, Zn-메탈로티오네인/항-인체 유방암 B6.2의 제조 및 평가
A. STAB-가교결합된99mTc, Zn-MTh-B6.2결합체의 제조
0.020M Hepes pH 7.5중의 모노클로날 항체 B 6.2(1.2㎎, 0.7㎖, 8×10-6몰) [D Colcher, et al, proc. Natl Acad, Sci, USA, 78, 3199(1981)]에 100배 몰과량의 술포숙신이미딜 4-(요오드아세틸)-아미노벤조에이트(Sulfo-SIAB, Pierce Chemical Co.,(10㎎/㎖ 증류수용액 0.033㎖)를 가한다. B6.2 및 술포-SIAB를 37℃에서 15분간 인큐베이트한다. 과량의 SIAB를 세파덱스 G-25미세크로마토그래피(1.0×40.0㎝)에 의해 0.05M TRIS-HCl pH 9.0으로 용출시켜 제거한다. SIAB 변형 B6.2(1.6㎖중 6.0×10-6몰)을 상기 용출액으로부터 회수한다. (약 75% 단백질 회수율)이 변형 B 6.2에 0.050MTRIS-HCl pH 9.0중의 D.Winge 및 K.Miklossy의 방법[참조. Arch, Biochem. Biophy., 214 80(1982)]에 의해 제조된 Zn-Mhr 25배 몰과량을 가하여 1.5×10-4몰(1㎎/㎖ 용액 0.89㎖, 1.639×10-4M 스토크)이 되도록 한다. 2시간동안 4℃에서 인큐베이트하면 Zn-MTh-SIAB-B 6.2결합제가 완전히 형성된다. 미반응 Zn-MTh 및 다른 불필요한 성분을 0.1M 인산나트륨 pH 7.0으로 용출시키는 세파덱스 G-150크로마토그래피(1.0×40.0㎝)로 제거한다. 정제된 결합체 1㎖에 0.25㎖의 0.4M일염기성 인산나트륨 및 약 0.4㎖의99mTc-GLUCOSCANTM(120mc)을 가한다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이트 시킨 다음 교환표지된99mTc, Zn-메탈로티오네인-B6.2 콘쥬게이트를 0.1M 인산염 완충액 pH7.0을 1㎖/min의 속도로 용출시키는 BioRad TSK-250 겔 여과 컬럼을 사용하여 HPLC로 정제한다.
정제 후 생성되는99mTc 방사능 39%는 STAB 가교결합된 결합체와 결합된다.
B. SIAB-가교결합된 99mTc, Zn-MTh-B6.2-결합체의 시험관내 평가 SIAB를 사용하는 MT의 결합으로 생성되는 B6.2의 표적 항원에 대한 결합능의 효과는 고체상 방사 면역 분석으로 분석한다(D. Colcher, M. Zalutsky, W. Kaplan, D. Kufe, F. Austin, F Shlom, Cancer Restarch 43 : 736(1983)]. 이러한 분석법은 인체 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma) LS 174T를 치매 마우스에 이종이식시켜 성장시켜 추출한 암세포를 사용한다.[B. H. Tom, et al., In vitro, 12: 180(1973)] LS 174T 암세포는 B 6.2를 결합하는 항원을 가지며, 방사표지된 B 6.2의 비특이성 결합에 대한 대조물로서 A 375세포는 상기 항원을 가지지 못한다.
LS 174T 암세포 추출물을 고체상 분석함에 있어서99mTc-MTh-SIAB-B 6.2의 최대 결합은 가한 99m Tc 활성 63%이며, 항원-음성에 결합하는 대조물 A 375암 추출물은 6%이다. 이것은 SIAB를 사용하여 B6.2에 MTh를 결합시키면 항원에 대한 특이성이 일반적으로 유지되는 결합체가 수득됨을 나타낸다.
[실시예 2]
SMCC-가교경결합된 99Tc, Zn-MTh-B 6.2 결합체의 제조
A. Zn-MTh에서 출발하는 제법(비교방법)109Cd, Zn-MTh는 실시예 1 에서와 같이 제조한다.
0.02M Hepes pH 7.5중의109Cd, Zn-MTh(0.366㎎, 0.75㎖, 6×10-5mM)에 100배몰 과량의 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸 시클로헥산 1-카복실레이트(Sulfo-SMCC, Chemical Co.,) (2.618㎎)을 가한다.109Cd, Zn-MTh 및 Sulfo-SMCC를 37℃에서 15분간 인큐베이트시킨다. 0.05M 인산나트륨 pH 7.0으로 용출시키는 세파덱스 G-25미세크로마토그래피(1.0×40㎝)에 의해 과량의 Sulfo-SMCC를 제거한다. SMCC변형된 MTh를 0.05M 인산이나트륨 pH 7.5중의 0.07몰당량의 B 6.2(0.5㎖중 0.5㎎ 3.3×10-6)에 가한다. 2시간 인큐베이트 시키면 결합체 형성이 완결된다. 미반응 MTh를 실시예 1 에서와 같이 세파덱스 G-150 크로마토그래피에 의해 제거한다. 정제된 B 6.2와 결합한109Cd 활성은 존재하지 않는다. MTh-B 6.2 결합체 분획물을 실시예 1 에서와 같이 교환 표지한다. 이 물질과 결합한 방사능은 존재하지 않는다.
B. 모노클로날 항체 B 6.2에서 출발하는 제법(본 발명의 방법).
0.020M Hepes pH 7.5중의 모노클로날 항체 B 6.2(2.5㎎, 1㎖ 1.67×10-5몰)에 100배몰 과량의 술포-숙신이미딜 4-(N-말레이드도메틸)시클로헥산 1-카복실레이트(Sulfo-SMCC, Pierce Chemical Co.) (0.0729㎖ 10㎎/㎖ 증류수 스토크용액)을 가한다. B 6.2 및 Sulfo-SMCC를 37℃에서 15분간 인큐베이트한다. 과량의 Sulfo-SMCC를 0.050M TRIS-HCl pH 9.0으로 용출시키는 세파덱스 G-25 미세크로마토그래피(1.0×40.0㎝)로 제거한다. SMCC-변형된 B 6.2(3㎖중 1.25×10-5㎖)을 회수한다(단백질 회수율 75%). 이 변형된 B 6.2를 0.050M TRIS-HCl pH 9.0중의 실시예 1 에서 제조한 Zn-MTh 20배 몰 과량을 가하여 3.13×10-4몰(1㎎/㎖ 용액 1.85㎖, 1.639×10-4M 스토크)이 되도록 한다. 2시간 동안 4℃에 인큐베이트시키면 Zn-MTh-SMCC-B 6.2 콘쥬게이트 형성이 완결된다. 미반응 Zn-MTh 및 다른 불필요한 성분을 0.020M Hepes 0.150 M NaCl pH 7.5로 용출시키는 Sephacryl S-300크로마토그래피(1.0×40.0㎝)로 제거한다. 회수 되어 정제된 Ab 결합체는 Centricom-30(Amicon)로 사용하여 2.1×10-5mM Ab로 농축시킨다.
0.0646㎖의 결합체에 0.02㎖의 0.4M 일염기성 인산염 및 0.025㎖99mTc-GLUCOSCANTM(5mCi)를 가한다. 실온에서 4시간동안 인큐베이트시킨 다음 교환 표지된99mTc-MTh B 6.2 결합체를 pH 7.0의 0.1M 인산염 완충액을 1㎖/min의 속도로 용출시키는 Bio-Red TSK-250겔 여과 컬럼을 사용하여 HPLC로 정제한다. 정제하여 생성된99mTC의 76%가 SMCC-가교결합된 결합체와 결합된다.

Claims (11)

  1. 생물학적 활성 분자(BAM)를 헤테로 이작용성 가교결합제에 결합시키고 ; 이 생성물을 적어도 한 부위의 금속이 추적자 금속인 메탈로티오네인과 결합시키는 연속단계를 포함함을 특징으로 하는, 메탈로티오네인과 생물학적 활성분자의 추적-표지된 결합체의 제조방법.
  2. BAM을 헤테로 이작용성 가교결합체에 결합시키고 ; 이의 생성물을 모든 금속이 비-추적자인 메탈로티오네인과 결합시키는 연속단계를 포함함을 특징으로 하는 메탈로티오네인과 생물학적 활성분자의 결합체의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 추가로, 적어도 한 부위의 비-추적자 금속을 추적자 금속으로 교환 표지하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, BAM 이 항체인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 추적자 금속이 테크네튬-99m, 루테늄-97, 수은-197, 납-203, 팔라듐-103, 은-111, 금-198, 구리-67, 레늄-188, 비스무트-212 및 코발트, 니켈, 구리, 루테늄, 비스무트, 납, 수은, 금, 백금, 레늄 및 텅스텐 원소로부터 선택되는 방법.
  6. 제1, 4또는 5항에 있어서, 헤테로 이작용성 가교 결합체가 하기 일반식을 갖는 방법.
    X-Z-Y
    상기식에서, Z는 0 내지 20개의 탄소, 질소, 황 또는 인원자를 갖는 알킬, 아릴, 시클로알킬, 알케닐, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 포스포알킬, 카복시알킬 또는 케토알킬이며, Y는 티올과 반응성인 잔기이고, X는 -NH2, -OH, -CO2H 또는 NHC (=NH) NH2기, 또는 산화된 카보히드레이트 잔기로부터 유도된 알데히드와 반응성인 잔기이다.
  7. 제1, 4 또는 5항에 있어서, 헤테로 이작용성 가교결합체가 숙신이미딜 4-(N-말레이미도 메틸) 시클로헥산-1-카복실레이트 ; 숙신이미딜 4-(요오도아세틸)아미노벤조에이트 ; 및 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐) 부티레이트에서 선택된 방법.
  8. 제 3 항에 있어서, BAM이 항체인 방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 추적자 금속이 테크네튬-99m, 루테늄-97, 수은-197, 납-203, 팔라듐-103, 은-111, 금-198, 구리-67, 레늄-188, 비스무트-212 및 코발트, 니켈, 구리, 루테늄, 비스무트, 납, 수은, 금, 백금, 레늄 및 텅스텐 원소로부터 선택되는 방법.
  10. 제2, 3, 8 또는 9항에 있어서, 헤테로 이작용성 가교결합제가 하기 일반식을 갖는 방법.
    X-Z-Y
    상기식에서, Z는 0 내지 20개의 탄소, 질소, 황 또는 인원자를 갖는 알킬, 아릴, 시클로알킬, 알케닐, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 포스포알킬, 카복시알킬, 또는 케토알킬이며, Y는 티올과 반응성인 잔기이고, X는 -NH2, -OH, -CO2H 또는 NHC (=NH) NH2기, 또는 산화된 카보히드레이트 잔기로부터 유도된 알데히드와 반응성인 잔기이다.
  11. 제2, 3, 8 또는 9항에 있어서, 헤테로 이작용성 가교결합제가 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카복실레이트 ; 숙신이미딜 4-(요오도아세틸) 아미노벤조에이트 ; 및 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐) 부티레이트에서 선택되는 방법.
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