RU2719418C2 - Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептидам и способ присоединения радиоизотопа к полипептидам - Google Patents
Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептидам и способ присоединения радиоизотопа к полипептидам Download PDFInfo
- Publication number
- RU2719418C2 RU2719418C2 RU2016123920A RU2016123920A RU2719418C2 RU 2719418 C2 RU2719418 C2 RU 2719418C2 RU 2016123920 A RU2016123920 A RU 2016123920A RU 2016123920 A RU2016123920 A RU 2016123920A RU 2719418 C2 RU2719418 C2 RU 2719418C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- radioisotope
- attaching
- composition
- chelator
- Prior art date
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 188
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 186
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 184
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims abstract description 79
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 30
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 23
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 12
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims abstract description 11
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- JHALWMSZGCVVEM-UHFFFAOYSA-N 2-[4,7-bis(carboxymethyl)-1,4,7-triazonan-1-yl]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 JHALWMSZGCVVEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 16
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 6
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 abstract description 15
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 72
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 66
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 16
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 16
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 16
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 15
- 229910052733 gallium Inorganic materials 0.000 description 15
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 15
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 15
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 15
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 14
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 14
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 14
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 13
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 9
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 9
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 8
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 7
- VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N yttrium atom Chemical compound [Y] VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 6
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 5
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 5
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000000021 endosomolytic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 5
- -1 pH 4.5 Substances 0.000 description 5
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- 101710187052 Flavohemoprotein Proteins 0.000 description 4
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 4
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 4
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 230000003439 radiotherapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 3
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 3
- 229910052765 Lutetium Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- OHSVLFRHMCKCQY-UHFFFAOYSA-N lutetium atom Chemical compound [Lu] OHSVLFRHMCKCQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- ABEIJMWLNYUWMD-KRWDZBQOSA-N 2-[(5s)-4,7-bis(carboxymethyl)-5-[(4-isothiocyanatophenyl)methyl]-1,4,7-triazonan-1-yl]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)C[C@@H]1CC1=CC=C(N=C=S)C=C1 ABEIJMWLNYUWMD-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 229940051173 recombinant immunotoxin Drugs 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229910052713 technetium Inorganic materials 0.000 description 2
- GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N technetium atom Chemical compound [Tc] GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQXIMYREBUZLPM-UHFFFAOYSA-N 1-aminoethanethiol Chemical compound CC(N)S ZQXIMYREBUZLPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDOPJKHABYSVIX-UHFFFAOYSA-N 2-[4,7,10-tris(carboxymethyl)-6-[(4-isothiocyanatophenyl)methyl]-1,4,7,10-tetrazacyclododec-1-yl]acetic acid Chemical compound C1N(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)C1CC1=CC=C(N=C=S)C=C1 UDOPJKHABYSVIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STNZNCWQNMGRIM-UHFFFAOYSA-N 2-benzyl-1,4,7,10-tetrakis-(4-methylphenyl)sulfonyl-1,4,7,10-tetrazacyclododecane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N1CCN(S(=O)(=O)C=2C=CC(C)=CC=2)CC(CC=2C=CC=CC=2)N(S(=O)(=O)C=2C=CC(C)=CC=2)CCN(S(=O)(=O)C=2C=CC(C)=CC=2)CC1 STNZNCWQNMGRIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 229940123804 Bombesin antagonist Drugs 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 101000944380 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000635854 Homo sapiens Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000004378 Melanocortin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000950 Melanocortin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101800001751 Melanocyte-stimulating hormone alpha Proteins 0.000 description 1
- 101100118551 Mus musculus Egfr gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102100027467 Pro-opiomelanocortin Human genes 0.000 description 1
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101150049278 US20 gene Proteins 0.000 description 1
- VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N Yttrium-90 Chemical compound [90Y] VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- LBDSXVIYZYSRII-IGMARMGPSA-N alpha-particle Chemical compound [4He+2] LBDSXVIYZYSRII-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000002790 bombesin antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000192 extended X-ray absorption fine structure spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000049765 human CDKN1A Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- RJMMFJHMVBOLGY-UHFFFAOYSA-N indium(3+) Chemical compound [In+3] RJMMFJHMVBOLGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008606 intracellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- OHSVLFRHMCKCQY-NJFSPNSNSA-N lutetium-177 Chemical compound [177Lu] OHSVLFRHMCKCQY-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000639 membranetropic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000004776 molecular orbital Methods 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002603 single-photon emission computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 1
- WHNFPRLDDSXQCL-UAZQEYIDSA-N α-msh Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(C)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WHNFPRLDDSXQCL-UAZQEYIDSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C01—INORGANIC CHEMISTRY
- C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
- C01G15/00—Compounds of gallium, indium or thallium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области фармации, в частности к композиции для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором и к способу присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором. Композиция состоит из полипептида и присоединяемого радиоизотопа, цитрата натрия, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоты (HEPES), хлорида натрия, додецилсульфата натрия (SDS) с подобранным для присоединения радиоизотопа значением pH среды, находящимся в диапазоне 4-7,5 единиц. В способе радиоизотоп добавляют к полипептиду с присоединенным хелатором и инкубируют в среде, содержащей цитрат натрия в диапазоне концентраций 1-20 мМ, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновую кислоту (HEPES) в концентрации 80 мМ, хлорид натрия, додецилсульфат натрия (SDS) в концентрации 0,02%, при температуре 37°С, при рН, находящемся в диапазоне 4-7,5 единиц, после чего добавляют хлорид натрия до физиологической концентрации ионов в смеси и гидроксид натрия до рН 7,5. Группа изобретений обеспечивает создание композиции, позволяющей присоединять радиоизотопы, легко образующие нерастворимые гидроксиды при pH больше 3-3,5, к полипептидам, которые плохо растворимы в слабокислой среде (pH 3-6). 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 17 ил., 19 пр.
Description
Введение
Изобретение направлено на решение задачи возможно более простого и эффективного получения широкого круга радиофармацевтических препаратов, прежде всего полипептидных радиофармпрепаратов, которые могут быть использованы для терапии и диагностики, в частности для терапии и диагностики онкологических заболеваний. Эффективность радиофармацевтических препаратов, в особенности в случае применения их для терапии, во многом зависит от возможности получать их с высокой удельной радиоактивностью. Потребность в новых эффективных средствах диагностики и терапии рака велика, что обусловлено медленным прогрессом в развитии методов лечения многих онкологических заболеваний, смертность от которых практически не снижается на протяжении десятилетий.
Область техники
Изобретение относится к области фармацевтики и касается радиофармацевтических препаратов (РФП) на основе полипептидных носителей, может быть использовано в биотехнологии в экспериментальной медицине, клеточной и молекулярной биологии.
Уровень техники
Получение ряда готовых к употреблению РФП осуществляется путем смешивания в специально подобранном буферном растворе соответствующих радиоизотопов, например, 99mTc, 111In, 67Ga, 90Y и других, с определенным компонентом, обеспечивающим заданные диагностические или терапевтические характеристики. В настоящее время уже используется в практике ряд РФП на основе полипептидных носителей и разрабатывается намного большее количество подобных РФП (Reilly, 2010). Эффективность такого рода РФП зависит от полипептидного носителя, применяемого изотопа и эффективности присоединения одного к другому, что определяет удельную радиоактивность получаемых РФП. В наибольшей мере высокая удельная радиоактивность необходима для радиотерапевтических РФП на основе полипептидов, взаимодействующих со специфическими мишенями в организме. Полипептиды в составе РФП, не несущие радиоизотоп, конкурируют с полипептидами, несущими реальное действующее начало, снижая за счет этого эффект. Предпочтительными для РФП являются радиоизотопы с относительно небольшим, но достаточным для удобного практического применения периодом полураспада. К этим изотопам, с периодом полураспада в несколько дней, относятся, например, 111In, 67Ga и 90Y, с теоретически достижимой при присоединении одного атома радиоизотопа к одному носителю удельной радиоактивностью 40-49 мКи на нмоль пептидного носителя (Breeman et al., 2003). Для такого рода изотопов, известен, например, используемый для присоединения радиоизотопов буферный раствор ацетата натрия в концентрации 10 мМ - 1 М с pH 3-6 (патент RU 2251110, см. также аналогичный европейский патент EP 2112512). Подобные слабокислые ацетатные буферные растворы в большинстве случаев используют для присоединения изотопов индия, галлия, иттрия, лютеция к диагностическим и терапевтическим агентам при помощи ковалентно присоединенных к этим агентам хелаторов, таких как 1,4,7,10-тетраазоциклододекан-N,N'N'',N'''-тетрауксусная кислота (ДОТА), 1,4,7-триазоциклононан-1,4,7-триуксусная кислота (НОТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА) и многих других (патенты US 7230085, US 7541018; US 8815211; US 8268781; US 7011816; US 7259249; US 8603435; EP 1156835; EP 1603598; заявки EP0264333A2; EP2962699A2; заявки US20140328754A1, US20050249671A9; см. также непатентные источники, например: Breeman et al., 2003; Wadas et al. 2010; Malmberg et al. 2012; Nayak & Brechbiel, 2009; Price & Orvig, 2013; Mukai et al., 2002; Varasteh et al., 2013; Lee et al., 1997; Andersson et al. 2015; Ju et al., 2010; Gao et al. 2016 и др.). В более щелочных условиях многие удобные для диагностики и радиотерапии изотопы, например, таких элементов, как In, Ga, Y, образуют плохо растворимые гидроксиды. Так, галлий легко образует нерастворимые гидроксиды при pH > 3, а индий - при pH > 3,4 (Anderson & Welch, 1999). Отмечается, что, хотя в некоторых случаях присоединение вышеупомянутых радиоизотопов проводили при pH 7-8 (Kukis et al. 1998), проблемы с их растворимостью в нейтральной и слабощелочной среде мешают добиваться получения препаратов с высокой удельной радиоактивностью (Breeman et al., 2003). Считается, что ацетат препятствует образованию гидроксидов за счет образования слабых комплексов с металлами (Clausen et al., 2002), что способствует более эффективному встраиванию в хелаторы, обладающие высоким сродством к ионам металлов. Несмотря на широкое применение ацетата в качестве средства для образования промежуточных комплексов с ионами для последующего встраивания в координационный центр высокоаффинного хелатора, этот подход обладает рядом недостатков, поскольку не всегда обеспечивает достаточно полное встраивание радиоизотопа и требует кислых условий, что создает проблемы для веществ, которые плохо растворимы в кислой среде.
Исследования, в которых присоединение радиоизотопов таких элементов, как галлий, проводили в нейтральной или слабощелочной среде позволяли получать препараты с невысокой удельной радиоактивностью. Так, например, присоединение 68Ga к маннозилированному альбумину происходило и при pH 7,4 в фосфатном буфере, однако полученная при этом удельная радиоактивность была даже менее 5 мКи/мг белка (Choi et al., 2011).
Другим вариантом буферного раствора для создания радиофармпрепаратов с помощью встраивания ионов используемых в медицине радиоизотопов в соответствующий хелатор является использование цитратного буфера (заявка EP 0264333A2; заявка WO1999036105A2; патенты US 5130118; US 5217704; EP 0315188; EP 0649857; EP 0495878). Как показали проведенные кинетические исследования, в результате взаимодействия галлия с хелатором НОТА, сначала быстро образуется промежуточный комплекс галлия с цитратом и хелатором, после чего этот комплекс в результате следующего скорость-лимитирующего шага переходит в комплекс галлий(III)-НОТА (Morfin & Tóth, 2011). Авторы отмечают также, что наибольшая скорость образования комплекса наблюдается при этом в достаточно кислой среде (pH~4). Недостатками цитратных буферных растворов или смесей на их основе для присоединения радиоактивных изотопов являются достаточно узкий диапазон значений pH, находящийся в кислой области, и невысокие удельные активности, которых достигали в упомянутых источниках в результате использования цитратного буфера или его смесей с ацетатом. Так, например, патент US 6024938 предлагает смесь, в которой кроме целевого белка (иммуноглобулин с присоединенным хелатором ДТПА) присутствует цитратный буфер, pH 4,5, хлорид натрия, мальтоза, полисорбат-80. На 1 мг белка в этом случае предлагается добавлять 1,25 мКи 111In, что при выходе присоединения 90% дает получаемую в итоге удельную радиоактивность немногим более 1 мКи/мг белка. Аналогичные удельные активности получаются и в результате применения вариантов, описанных для 111In в патентах US 5130118, несколько большие (4,5 мКи/мг белка) – для патента US 5217704. В заявке WO1999036105A2 для 111In описана удельная радиоактивность 2 мКи/мг белка (10 мКи/мг для 90Y). Кроме того, отмечают, что цитрат в определенных условиях может мешать образованию комплексов радиоизотопов с хелаторами (Lewis et al., 1994).
Еще одним вариантом буферного раствора для присоединения радиоизотопов с использованием хелаторов является использование 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоты (HEPES) (патент US 5225181; заявка US 20150231285A1). Использование этого буферного раствора в той области, в которой он обладает выраженными буферными свойствами (6,8 – 8,2) для присоединения таких радиоизотопов, как индий, требует последующей очистки (US 5225181). В то же время, мечение полипептидов индием в присутствии HEPES или другого подобного соединения 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) в более кислой среде (pH 5,5) позволяет добиваться высокой удельной радиоактивности (Brom et al., 2012). Недостатком этого подхода является трудности, которые возникают при попытке присоединить полипептиды, которые плохо растворимы в слабокислой области.
Для решения этой проблемы предложен также метод гетерогенного присоединения радиоизотопов к полипептидам, плохо растворимым в слабокислой среде. В этом случае полипептид, плохо растворимый в кислой среде, с присоединенным хелатором НОТА в процессе получения конъюгата с 67Ga выпадал в осадок, после чего полученный конъюгат отделяли центрифугированием от несвязанного галлия, перерастворяли в фосфатном буфере с ДМСО при pH 8 и доочищали при помощи повторного центрифугирования и гель-фильтрации (Koumarianou et al., 2014). Такой вариант присоединения радиоизотопа требует проведения нескольких стадий очистки и плохо приспособлен для широкого применения при рутинном приготовлении РФП.
Задача изобретения.
Задачей настоящего изобретения является создание композиции, позволяющей присоединять радиоизотопы, легко образующие нерастворимые гидроксиды при pH больше 3-3,5, к полипептидам, которые плохо растворимы в слабокислой среде (pH 3-6). Композиция должна обеспечивать высокоэффективное присоединение такого рода изотопа при высокой степени радиохимической чистоты получаемого продукта. Кроме этого, метод применения, основанный на использовании такой композиции должен быть достаточно простым, без применений стадий очистки с тем, чтобы его можно было бы впоследствии использовать в широкой практике.
В качестве примера такого рода полипептидов можно привести модульные транспортные полипептиды, описанные в патенте US 9095624, которые плохо растворимы в диапазоне pH от 3,5 до 7.
Сущность изобретения.
Сущность изобретения состоит в получении композиции из нескольких соединений, способствующих как растворимости ионов радиоизотопов таких элементов, как индий, галлий, иттрий и им подобных, в области значений pH, в которой они образуют нерастворимые гидроксиды, так и растворимости полипептидов, которые плохо растворимы в той же области значений pH. В результате применения композиции создаются условия для хелатирования этих радиоизотопов хелаторами, присоединенными к вышеупомянутым полипептидам. Для этой цели на основании соображений о том, что несколько веществ, способных образовывать слабые комплексы с ионами вышеупомянутых радиоизотопов, будут способствовать более полному образованию комплексов с хелаторами, присоединенными к вышеупомянутым полипептидам, а додецилсульфат в концентрациях ниже критической концентрации мицеллообразования будет способствовать тому, что полипептиды с присоединенными хелаторами будут оставаться в растворе в процессе присоединения, был разработан соответствующий состав композиции.
Эта композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором, включает помимо полипептида и присоединяемого радиоизотопа цитрат натрия, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновую кислоту (HEPES), хлорид натрия, додецилсульфат натрия (SDS). Эта композиция способна обеспечивать присоединение радиоизотопа при значениях pH, находящихся в диапазоне 4-7 единиц.
В качестве одного из компонентов композиции, а именно, в качестве вещества, способного образовывать слабые комплексы с радиоизотопом, используется цитрат натрия. Данная композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором обеспечивает присоединение радиоизотопа при концентрациях цитрата натрия в диапазоне 1-20 мМ и наилучшим образом работает при концентрации цитрата натрия 6 мМ.
В качестве другого компонента композиции, а именно, в качестве вещества, способного образовывать комплексы с радиоизотопом, используется HEPES, комплексы которого с радиоизотопом слабее, чем цитратные. Проведенная в процессе создания композиции работа показала, что композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором обеспечивает присоединение изотопа в присутствии 80 мМ HEPES.
В качестве компонента композиции для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором, способствующего тому, что полипептиды с присоединенными хелаторами будут оставаться в растворе в процессе присоединения, используется додецилсульфат натрия в концентрации ниже критической концентрации мицеллообразования. Такие концентрации додецилсульфата должны обеспечивать экранирование гидрофобных участков образующихся на молекулах полипептидов, имеющих изоэлектрическую точку в области pH, в которой происходит эффективное присоединение радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором, без образования мицелл. В качестве предпочтительной в композиции используется концентрация додецилсульфата натрия 0,02%.
Проведенные исследования по подбору состава композиции для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором выявили, что pH 4,5 является предпочтительным для присоединения, хотя достаточно эффективное присоединение происходит и в области pH от 3 до 7,5.
Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором предназначена для искусственных химерных полипептидов, которые создаются для направленного транспорта различных активных веществ в клетки-мишени. Такие искусственные транспортные конструкции рассматриваются как перспективное средство для создания нового поколения лекарственных препаратов (Sobolev, 2008; Costantini et al., 2008; Lorberboum-Galski, 2011; Weldon & Pastan, 2011; Rosenkranz et al., 2014). Поскольку во многих случаях для создания таких конструкций используются амфифильные последовательности для взаимодействия с липидным бислоем, гидрофильность которых уменьшается в слабокислой среде, заявляемая композиция является средством решения проблемы присоединения ионов таких радиоактивных изотопов таких элементов, как индий, галлий, иттрий к необходимым полипептидам. В качестве примера таких химерных полипептидов можно назвать модульные транспортные полипептиды (модульные нанотранспортеры), состоящие из интернализуемого лигандного модуля для взаимодействия с клеткой-мишенью, эндосомолитического модуля, модуля для транспорта в ядро и модуля носителя (Rosenkranz et al., 2000, 2003, 2008, 2014; Gilyazova et al., 2005, 2006; Sobolev 2008, 2009, 2013; Slastnikova et al., 2012a,b, 2015; Koumarianou E. et al., 2014; патент US 9095624). Кроме таких искусственных полипептидов с присоединенными хелаторами, композиция может быть использована для присоединения соответствующих радиоизотопов к полипептидам, модифицированным дополнительными ковалентно присоединенными активными компонентами, обеспечивающими, например, взаимодействие с клетками-мишенями. Иными словами, композиция обеспечивает также присоединение радиоизотопов к конъюгатам полипептидов с активными в отношении клеток компонентами, для обеспечения чего к этим полипептидам присоединены также и хелаторы, способные взаимодействовать с необходимыми радиоизотопами.
Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором может быть использована для присоединения соответствующих радиоизотопов к природным полипептидам (белкам).
Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором может быть использована для присоединения ионов радиоизотопов таких элементов, как индий, галлий, иттрий, технеций, лютеций и других подобных элементов, способных образовывать комплексы с соответствующими присоединенными к полипептидам хелаторами.
Заявляемая композиция может быть использована для присоединения вышеупомянутых радиоизотопов к полипептидам при помощи таких ковалентно присоединенных к полипептидам хелаторов, как 1,4,7-триазоциклононан-1,4,7-триуксусная кислота (НОТА), 1,4,7,10-тетраазоциклододекан-N,N'N'',N'''-тетрауксусная кислота (ДОТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА), а также других хелаторов.
Процесс присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором, состоит в том, что радиоизотоп добавляют к полипептиду с присоединенным хелатором и инкубируют в среде, содержащей цитрат натрия, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновую кислоту (HEPES), хлорид натрия, додецилсульфат натрия (SDS), с подобранными концентрациями вышеуказанных компонентов, при подобранной температуре в течение подобранного времени с подобранным значением pH, находящимся в диапазоне 4-7,5 единиц, после чего добавляют хлорид натрия до физиологической концентрации ионов в смеси и гидроксид натрия до pH 7,5. Инкубацию можно производить при разной температуре, в зависимости от устойчивости полпептида и удобства работы, в частности, инкубацию можно производить при температуре 37°С, а также при комнатной температуре. Инкубацию проводят в течение необходимого времени, которое зависит от используемых температуры, радиоизотопа и хелатора, который присоединен к полипептиду.
Технический результат.
Достигаемый технический результат заключается в том, что при использовании простого метода смешения радиоизотопа и плохо растворимого в слабокислой среде полипептида в буферном растворе заявляемой композиции можно получить РФП с высокой радиохимической чистотой и высокой удельной радиоактивностью, не требующий в процессе получения отдельной стадии очистки. Для полипептидов с присоединенным радиоизотопом 111In достигается 95 – 99% радиохимическая чистота при удельной радиоактивности не менее 70 мКи/мг полипептида. Метод работает также и для полипептидов, которые хорошо растворимы в слабокислой среде. Метод может быть применен для изотопов таких элементов, как индий, галлий, иттрий, лютеций и других.
Предполагается, что специалист в данной области техники может, применяя предыдущее описание, использовать настоящее изобретение в его полном объеме. Последующие предпочтительные специфические варианты осуществления интерпретируются исключительно как иллюстративные и не могут рассматриваться в качестве материала, ограничивающего объем настоящего изобретения.
Краткое описание иллюстраций к примерам, описывающим композицию для присоединения радиоизотопа к полипептидам.
Фиг. 1. Анализ распределения в полиакриламидном геле (ПААГ) радиоактивности образца 111In-НОТА-полипептид-1 (111In-НОТА-ПП1), полученного с помощью композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам. 111In-НОТА-ПП1 был получен, как описано в примере 10, после чего аликвота препарата была разделена электрофорезом в ПААГ (Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gel, Biorad, Россия) по Лэммли (Laemmli, 1970) с последующей детекцией радиоактивного излучения при помощи фосфоримеджера Storm 865 (GE Healthcare, Швеция). Слева – отметки, соответствующие расположению цветных маркеров молекулярной массы на геле (ColorBurst™ Electrophoresis Marker, Sigma, США). Содержание свободного, не присоединенного к полипептиду 111In составило 0,95%. Количественный анализ распределения радиоактивности выполнен с использованием программы ImageQuant TL 5.0 (Bio-Rad, США).
Фиг. 2. Анализ распределения в ПААГ радиоактивности образца 111In-НОТА-полипептид-2 (111In-НОТА-ПП2), полученного с помощью композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам. 111In-НОТА-ПП2 был получен, как описано в примере 10, после чего аликвота препарата была разделена электрофорезом в ПААГ (Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gel) по Лэммли (Laemmli, 1970) с последующей детекцией радиоактивного излучения при помощи фосфоримеджера Storm 865. Слева – отметки, соответствующие расположению цветных маркеров молекулярной массы на геле (ColorBurst™ Electrophoresis Marker). Содержание свободного, не присоединенного к полипептиду 111In составило 3,7%. Количественный анализ распределения радиоактивности выполнен с использованием программы ImageQuant TL 5.0.
Фиг. 3. Анализ распределения в ПААГ радиоактивности образца 111In-НОТА-полипептид-3 (111In-НОТА-ПП3), полученного с помощью композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам. 111In-НОТА-ПП3 был получен, как описано в примере 10, после чего аликвота препарата была разделена электрофорезом в ПААГ (Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gel) по Лэммли (Laemmli, 1970) с последующей детекцией радиоактивного излучения при помощи фосфоримеджера Storm 865. Слева – отметки, соответствующие расположению цветных маркеров молекулярной массы на геле (ColorBurst™ Electrophoresis Marker). Содержание свободного, не присоединенного к полипептиду 111In составило 2,1%. Количественный анализ распределения радиоактивности выполнен с использованием программы ImageQuant TL 5.0.
Фиг. 4. Анализ распределения в ПААГ радиоактивности образца 111In-НОТА-(полипептид-4)-(фолиевая кислота) (111In-НОТА-ПП4-ФК), полученного с помощью композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам. 111In-НОТА-ПП4-ФК был получен, как описано в примере 10, после чего аликвота препарата была разделена электрофорезом в ПААГ (Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gel) по Лэммли (Laemmli, 1970) с последующей детекцией радиоактивного излучения при помощи фосфоримеджера Storm 865. Слева – отметки, соответствующие расположению старта, флуоресцентно-меченного полипептида с молекулярной массой 75 кД и бромфенолового синего. Содержание свободного, не присоединенного к полипептиду 111In составило 3,3%. Количественный анализ распределения радиоактивности выполнен с использованием программы ImageQuant TL 5.0.
Фиг. 5. Анализ распределения в ПААГ радиоактивности образца 111In-НОТА-(полипептид-4)-(полиэтиленгликоль-фолиевая кислота) (111In-НОТА-ПП4-ПЭГ-ФК), полученного с помощью композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам. 111In-НОТА-ПП4-ПЭГ-ФК был получен, как описано в примере 10, после чего аликвота препарата была разделена электрофорезом в ПААГ (Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gel) по Лэммли (Laemmli, 1970) с последующей детекцией радиоактивного излучения при помощи фосфоримеджера Storm 865. Слева – отметки, соответствующие расположению цветных маркеров молекулярной массы на геле (ColorBurst™ Electrophoresis Marker). Содержание свободного, не присоединенного к полипептиду 111In составило 1,4%. Количественный анализ распределения радиоактивности выполнен с использованием программы ImageQuant TL 5.0.
Фиг. 6. Анализ распределения в ПААГ радиоактивности образца 111In-НОТА-полипептид-5 (111In-НОТА-ПП5), полученного с помощью композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам. 111In-НОТА-ПП5 был получен, как описано в примере 10, после чего аликвота препарата была разделена электрофорезом в ПААГ (Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gel) по Лэммли (Laemmli, 1970) с последующей детекцией радиоактивного излучения при помощи фосфоримеджера Storm 865. Слева – отметки, соответствующие расположению старта, флуоресцентно-меченного полипептида с молекулярной массой 70 кД и бромфенолового синего. Содержание свободного, не присоединенного к полипептиду 111In составило 2,5%. Количественный анализ распределения радиоактивности выполнен с использованием программы ImageQuant TL 5.0.
Фиг. 7. Анализ распределения в ПААГ радиоактивности образца 111In-НОТА-полипептид-6 (111In-НОТА-ПП6), полученного с помощью композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам. 111In-НОТА-ПП6 был получен, как описано в примере 10, после чего аликвота препарата была разделена электрофорезом в ПААГ (Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gel, Biorad, Россия) по Лэммли (Laemmli, 1970) с последующей детекцией радиоактивного излучения при помощи фосфоримеджера Storm 865 (GE Healthcare, Швеция). Слева – отметки, соответствующие расположению цветных маркеров молекулярной массы на геле (ColorBurst™ Electrophoresis Marker, Sigma, США). Содержание свободного, не присоединенного к полипептиду 111In составило 4,8%. Количественный анализ распределения радиоактивности выполнен с использованием программы ImageQuant TL 5.0 (Bio-Rad, США).
Фиг. 8. Кинетика присоединения 111In к НОТА-полипептид-2 (НОТА-ПП2). 111In-НОТА-ПП2 был получен, как описано в примере 10, за исключением времени инкубации радиоизотопа с НОТА-ПП2, которое указано на графике. После окончания инкубации к образцам был добавлен ЭДТА, после чего аликвоты препаратов были разделены электрофорезом в ПААГ (Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gel, Biorad, Россия) по Лэммли (Laemmli, 1970) с последующей детекцией радиоактивного излучения при помощи фосфоримеджера Storm 865 (GE Healthcare, Швеция). Количественный анализ распределения радиоактивности выполнен с использованием программы ImageQuant TL 5.0 (Bio-Rad, США).
Фиг. 9. Анализ распределения в ПААГ радиоактивности образца 111In-ДОТА-полипептид-2 (111In-ДОТА-ПП2), полученного с помощью композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам. 111In-ДОТА-ПП2 был получен, как описано в примере 11, после чего аликвота препарата была разделена электрофорезом в ПААГ (Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gel) по Лэммли (Laemmli, 1970) с последующей детекцией радиоактивного излучения при помощи фосфоримеджера Storm 865. Слева – отметки, соответствующие расположению цветных маркеров молекулярной массы на геле (ColorBurst™ Electrophoresis Marker). Содержание свободного, не присоединенного к полипептиду 111In составило 1,5%. Количественный анализ распределения радиоактивности по гелю выполнен с использованием программы ImageQuant TL 5.0.
Фиг. 10. Хроматография растворов радиоизотопов после их инкубации в растворе для мечения полипептидов. 111In или 67Ga были проинкубированы при 37ºС в течение 2 часов в растворе для мечения полипептидов, после чего к ним был добавлен ЭДТА до концентрации 1,5 мМ и проведена гель-фильтрация на готовых колонках с Сефадексом G-25 (PD-10, GE-HeallthCare, США) при сборе фракций по 10 капель (около 400 мкл). 1 – хроматография раствора 111In без цитрата, 2 – хроматография раствора 111In с 6 мМ цитратом, 3 – хроматография раствора 67Ga с 6 мМ цитратом. Заштрихована область элюции полипептидов, описанных в примерах 1-6.
Фиг. 11. Влияние концентрации цитрата на эффективность присоединения радиоизотопа к полипептиду. Полипептид 2 был проинкубирован с 111In, в условиях, описанных в примере 10, с различными концентрациями цитрата, после чего аликвоты растворов были подвергнуты электрофорезу в полиакриламидном геле (Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gel) по Лэммли (Laemmli, 1970) с последующей детекцией радиоактивного излучения при помощи фосфоримеджера Storm 865. Количественный анализ распределения радиоактивности выполнен с использованием программы ImageQuant TL 5.0. Данные на графике представляют собой средние значения 2-4 независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего.
Фиг. 12. Влияние добавления в состав композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам SDS на эффективность присоединения 111In к НОТА-полипептид 2 (НОТА-ПП2). Присоединение 111In к НОТА-ПП2 было проведено, как описано в примере 10 за исключением концентрации SDS, концентрации которого была различной. Вертикальной прерывистой линией отмечена критическая концентрация мицеллообразования для SDS.
Фиг. 13. Зависимость эффективности присоединения 111In к полипептиду при помощи композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам от pH. Полипептид 2 был проинкубирован 111In, в условиях, описанных в примере 10, за исключением добавляемого количества 0,25 М HCl для обеспечения различных pH, после чего аликвоты растворов были подвергнуты электрофорезу в ПААГ (Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gel) по Лэммли (Laemmli, 1970) с последующей детекцией радиоактивного излучения при помощи фосфоримеджера Storm 865. Количественный анализ распределения радиоактивности выполнен с использованием программы ImageQuant TL 5.0.
Фиг. 14. Усиление цитотоксического действия 111In в результате его присоединения при помощи композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам. 111In был присоединен к полипептиду 1 (ПП1), модифицированному хелатором НОТА. 111In-полипептид и 111In в различных концентрациях был добавлен к клеткам рака мочевого пузыря человека линии EJ, и после инкубации в течение 48 часов выживаемость была определена методом колониеобразования. Результаты типичного эксперимента приведены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (3-6 повторов), значение которой не выходит за пределы символа, обозначающего среднее значение. Прерывистыми линиями обозначены границы 95% доверительного интервала. Данные были оценены по одноэкспоненциальному уравнению y=A⋅e-k·x, для обоих наборов данных. Соотношение A37 (1/k) = 32,6, достоверность различия констант p<0,0001 по f-критерию Фишера.
Фиг. 15. Усиление цитотоксического действия 111In в результате его присоединения при помощи композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам. 111In был присоединен к полипептиду 2 (ПП2), модифицированному хелатором НОТА. 111In-полипептид и 111In в различных концентрациях был добавлен к клеткам меланомы мыши B16-F1, и после инкубации в течение 48 часов выживаемость была определена методом колониеобразования. Результаты типичного эксперимента приведены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего, прерывистыми линиями обозначены границы 95% доверительного интервала. Данные были оценены по одноэкспоненциальному уравнению y=A⋅e-k·x, для обоих наборов данных. Соотношение A37 (1/k) = 3,7, достоверность различия констант p<0,0001 по f-критерию Фишера.
Фиг. 16. Усиление цитотоксического действия 111In в результате его присоединения при помощи композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам. 111In был присоединен к полипептиду 3 (ПП3), модифицированному хелатором НОТА. 111In-полипептид и 111In в различных концентрациях был добавлен к клеткам эпидермоидной карциномы человека линии А431, и после инкубации в течение 48 часов выживаемость была определена методом колониеобразования. Результаты типичного эксперимента приведены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего, прерывистыми линиями обозначены границы 95% доверительного интервала. Данные были оценены по одноэкспоненциальному уравнению y=A⋅e-k·x, для обоих наборов данных. Соотношение A37 (1/k) = 36,6, достоверность различия констант p<0,0001 по f-критерию Фишера.
Фиг. 17. Усиление цитотоксического действия 111In в результате его присоединения при помощи композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам. 111In был присоединен к полипептиду 4, модифицированному малеимдным производным ПЭГ-фолата, который был также модифицирован хелатором НОТА. 111In-полипептид и 111In в различных концентрациях был добавлен к клеткам эпидермоидной карциномы человека линии А431, и после инкубации в течение 48 часов выживаемость была определена методом колониеобразования. Результаты типичного эксперимента приведены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего, прерывистыми линиями обозначены границы 95% доверительного интервала. Данные были оценены по одноэкспоненциальному уравнению y=A⋅e-k·x, для обоих наборов данных. Соотношение A37 (1/k) = 2,2, достоверность различия констант p<0,0001 по f-критерию Фишера.
Примеры осуществления изобретения.
Пример 1
Полипептид 1.
Полипептид 1 (ПП1) – модульный нанотранспортер для доставки терапевтических агентов в опухолевые клетки с повышенной экспрессией рецептора эпидермального фактора роста человека, состоящий из лигандного модуля, в качестве которого был использована последовательность эпидермального фактора роста человека; эндосомолитического модуля, в качестве которого была использована последовательность транслокационного домена дифтерийного токсина; модуля ядерной локализации, в качестве которого была использована оптимизированная последовательность сигнала ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-40; и модуля-носителя, в качестве которого была использована последовательность гемоглобиноподобного белка Escherichia coli, нарабатывали биосинтетически в E. coli и очищали при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе, как описано Гилязовой с соавт. (Gilyazova et al., 2006).
Пример 2
Полипептид 2.
Полипептид 2 (ПП2) – модульный нанотранспортер для доставки терапевтических агентов в клетки меланомы состоящий из лигандного модуля, в качестве которого был использована последовательность α-меланоцит-стимулирующего гормона человека; эндосомолитического модуля, в качестве которого была использована последовательность транслокационного домена дифтерийного токсина; модуля ядерной локализации, в качестве которого была использована оптимизированная последовательность сигнала ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-40; и модуля-носителя, в качестве которого была использована последовательность гемоглобиноподобного белка, нарабатывали в E. coli и очищали при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе, как описано в примере 1.
Пример 3
Полипептид 3.
Полипептид 3 (ПП3) – модульный нанотранспортер для доставки терапевтических агентов в опухолевые клетки с повышенной экспрессией рецептора эпидермального фактора роста человека состоящий из лигандного модуля, в качестве которого был использована последовательность эпидермального фактора роста человека; эндосомолитического модуля, в качестве которого была использована последовательность транслокационного домена дифтерийного токсина; модуля ядерной локализации, в качестве которого была использована оптимизированная последовательность сигнала ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-40; и модуля-носителя, в качестве которого была использована последовательность миоглобина человека, нарабатывали в E. coli, штамм C3029 (New England Biolabs, США), и очищали при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе следующим образом: индукцию синтеза полипептида проводили при помощи добавления изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида до концентрации 200 мкМ и температуре 22°С в течение 15-18 часов. Выделение полипептида проводили из телец включения в денатурирующих условиях. Тельца включения солюбилизировали раствором 50 мМ NaHPO4, 300 мМ NaCl, 8М мочевина, pH 8,0. После аффинной очистки на Ni-NTA-сефарозе белок элюировали раствором 50 мМ NaHPO4, 300 мМ NaCl, 8М мочевина, 250 мМ имидазола, pH 8,0. Элюат, содержащий очищенный ПП3, диализовали против изотонического буферного раствора.
Пример 4
Конъюгат полипептида с ковалентно присоединенным дополнительным функциональным компонентом.
Полипептид 4 (ПП 4) состоит из последовательности транслокационного домена дифтерийного токсина; оптимизированной последовательности сигнала ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-40 и последовательности гемоглобиноподобного белка. Полипептид нарабатывали в E. coli и очищали при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе (Gilyazova et al., 2006). Полипептид был модифицирован при помощи ковалентного присоединения по аминогруппам полипептида дополнительного компонента, обеспечивающего клеточную специфичность. В качестве компонента, обеспечивающего клеточную специфичность, использовали фолиевую кислоту, рецепторы к которой сверх-экспрессированы при ряде заболеваний, в том числе онкологических (Sudimack & Lee, 2000; Lu & Low, 2012; Slastnikova et al., 2015). Присоединение фолата осуществляли при помощи 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно опубликованной ранее методике (Leamon et al., 1992). Для этого к 0,1 М раствору фолиевой кислоты (ФК) в диметилсульфоксиде добавляли раствор EDC в ДМСО в 1,2-молярном избытке по отношению к ФК. Спустя час инкубации при комнатной температуре к полученной смеси добавляли раствор NHS в ДМСО в молярном избытке 2,4 по отношению к фолиевой кислоте и продолжали инкубацию в течение 4 часов, после чего в реакционную смесь добавляли раствор полипептида 5 в соотношении фолат : МНТ=15:1. Реакцию синтеза проводили в течение 12 часов при комнатной температуре в отсутствии доступа света. Очистку полученного конъюгата (ПП4-ФК) проводили при помощи ультрафильтрации. Присоединение ФК к полипептиду определяли спектрофотометрически при длине волны 367 нм.
Пример 5
Конъюгат полипептида с ковалентно присоединенным по уникальному месту присоединения дополнительным функциональным компонентом.
Конъюгат ПП4 с дополнительным компонентом, обеспечивающим взаимодействие с клетками-мишенями, в качестве которого использовали фолиевую кислоту. ПП4 имеет 3 сульфгидрильных группы, из которых только одна реакционноспособна. Для проведения реакции присоединения сначала доступную для модификации сульфгидрильную группу ПП4 (2,5 мг/мл) восстанавливали в натрий-фосфатном буфере (pH 7,5) при помощи добавления трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP, Thermo Fisher Scientific, США) до конечной концентрации 2 мМ в течение 40 минут при температуре 37°С. Полученный раствор диализовали от избытка TCEP против натрий-фосфатного буфера (pH 7,3) с 1 мМ ЭДТА до соотношения TCEP:полипептид=2,5:1. Затем к диализованному восстановленному раствору ПП4 добавляли 50-кратный мольный избыток раствора N-этилмалеимид-полиэтиленгликоль-фолата (Мал-ПЭГ-ФК, Nanocs, США, мол. масса ПЭГ – 3,4 кД) в натрий-фосфатном буфере, pH 7,3 с 1 мМ ЭДТА. pH реакционной смеси поддерживали на уровне 7,2-7,4, чтобы избежать с одной стороны преципитации МНТ (pH<7,0), а с другой стороны – конкурирующей реакции малеимида со свободными аминогруппами (pH>8,5). Реакционную смесь инкубировали при постоянном мягком перемешивании при +4°С в течение ночи.
Очистку модифицированного МНТ (Mw более 72000 Да) от неприсоединенного производного фолата проводили при помощи ультрафильтрации (5 циклов ультрафильтрации) в натрий-фосфатном буферном растворе через мембрану, пропускающую соединения с молекулярной массой до 30 кД.
Присоединение ФК к полипептиду определяли при помощи электрофореза в ПААГ по Лэммли (Laemmli, 1970).
Пример 6
Полипептид 5.
Полипептид 5 (ПП5) – модульный нанотранспортер для доставки терапевтических агентов в опухолевые клетки с повышенной экспрессией рецептора эпидермального фактора роста человека, состоящий из лигандного модуля, в качестве которого был использована последовательность эпидермального фактора роста человека; эндосомолитического модуля, в качестве которого была использована последовательность транслокационного домена дифтерийного токсина; модуля ядерной локализации, в качестве которого была использована оптимизированная последовательность сигнала ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-40; модуля внутриклеточного взаимодействия для связывания с ядерным антигеном пролиферирующих клеток (PCNA), в качестве которого был использован С-концевой фрагмент (аминокислоты 87-164) белка р21 человека; и модуля-носителя, в качестве которого была использована последовательность гемоглобиноподобного белка Escherichia coli (HMP), нарабатывали в E. coli и очищали при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе как описано в примере 3.
Пример 7
Полипептид 6.
В качестве полипептида 6 использовали природный бычий сывороточный альбумин (Amresco, США).
Пример 8
Присоединение хелатора НОТА к полипептидам.
Для присоединения НОТА к полипептидам использовали бифункциональный хелатор, - S-2-(4-изотиоцианатобензил)-1,4,7-триазоциклононан-1,4,7-триуксусную кислоту (p-SCN-Bn-NOTA, Macrocyclics, США), - способный к специфическому ковалентному присоединению к аминогруппам полипептидов. Все использованные растворы были очищены от ионов, способных связываться с высоким сродством с хелатором, при помощи ионообменной смолы Chelex-100 (BioRad, США) и стерилизованы при помощи фильтрации под вакуумом через фильтры с размером пор 0,22 мкм. Полипептиды перед реакцией были диализованы против раствора содержащего 50 мМ NaHCO3, 150 мМ NaCl и 5 мМ ЭДТА, pH 8,6. p-SCN-Bn-NOTA в том же растворе был добавлен к одному из полипептидов из примеров 1-7 (2-4 мг/мл) в 10-кратном молярном избытке. Реакцию проводили течение 18-20 часов при комнатной температуре, после чего полученный конъюгат очищали при помощи ультрафильтрации через мембрану с размером пор 30 кД в буфере, содержащем 15 мМ NaCl и 10 мМ HEPES, pH 7,5. Полученные конъюгаты НОТА-полипептид лиофилизовали в необходимых порциях и хранили при -20°С.
Пример 9
Присоединение хелатора ДОТА к полипептидам.
Для присоединения ДОТА к полипептидам использовали S-2-(4-изотиоцианатобензил)-1,4,7-10-тетраазоциклододекан-1,4,7-тетрауксусную кислоту (p-SCN-Bn-DOTA, Macrocyclics). Присоединение проводили, как описано в примере 7.
Пример 10
Присоединение 111In к НОТА-полипептидам.
Присоединение 111In проводили при помощи специально разработанной одностадийной методики с последующим определением доли неприсоединенного изотопа при помощи электрофореза по Лэммли (Laemmli, 1970). Типичное присоединение 111In к НОТА-полипептиду осуществляли следующим образом: 0,12 мг лиофилизованного НОТА-полипептида растворяли в стерильных условиях в 0,04 мл стерильной деионизированной воды. К восстановленному НОТА-полипептиду добавляли 108,3 мкл буферного раствора, содержащего 10 мМ HEPES и 15 мМ хлорид натрия, pH 7,5; 28,7 мкл буферного раствора 1 М HEPES, pH 7,5; 21,2 мкл буферного раствора 0,1 М цитрата, pH 6,7, 8,1 мкл раствора 1% додецилсульфата натрия (SDS) и 42,3 мкл 0,25 M соляной кислоты (Ultrapure Grade, Merck, Germany), после чего добавляли к полученной смеси 101,6 мкл (8,7 мКи на момент готовности полученного меченого полипептида для применения) 111In в 0,048 M соляной кислоте. Пробирку с реакционной смесью инкубировали при температуре +37 С в течение 1 часа. По окончании инкубации в пробирку с реакционной смесью добавляли 3 мкл раствора 0,05 М ЭДТА, pH 8,0 для остановки реакции, мягко перемешивали и инкубировали при 37°С ещё в течение 10 минут. Затем в пробирку добавляли 24 мкл 1 М гидроксида натрия для достижения физиологических значений pH смеси. Для анализа результата мечения аликвоту полученного 111In-НОТА-полипептид подвергали денатурирующему электрофорезу с SDS в готовом ПААГ (Mini-Protean TGX Any kD, BioRad) по Лэммли (Laemmli, 1970) с последующим детектированием радиоактивного излучения геля при помощи специального экрана и фосфоримеджера Storm 865 (GE HealthCare, Швеция) при времени экспозиции геля 15 минут и последующим анализом полученного изображения при помощи программы ImageQuant TL 5.0 (Bio-Rad, США). Результаты проведенных работ по присоединению 111In к МНТ-НОТА показывают, что применяемый метод обеспечивает одностадийное присоединение, не требующее дальнейшей очистки, и доля неприсоединенного изотопа составляет около 5% или менее. Типичные примеры результатов присоединения 111In к различным полипептидам приведены на фигурах 1-7. При использовании данного метода удельная радиоактивность полипептидов с присоединенным 111In составляла 72 мкКи/мкг полипептида (2,7 МБк/мкг) на момент окончания анализа полученного продукта. Кинетика присоединения 111In к НОТА-полипептиду представлена на фигуре 8.
Пример 11
Присоединение 111In к ДОТА-полипептидам.
Присоединение 111In к ДОТА-полипептидам проводили, как описано в примере 10, за исключением времени инкубации, которое составило 3 часа 40 минут (фиг. 9).
Пример 12
Влияние цитрата на присоединение радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором.
Добавление таких изотопов, как 111In или 67Ga, в растворы, подходящие для мечения полипептидов, приводит к образованию плохо растворимых гидроксидов, которые в низких концентрациях формируют агрегаты небольшого размера, которые плохо разделяются с полипептидами при использовании гель-фильтрации даже при последующем добавлении избытка свободного хелатора (например, ЭДТА до 1,5 мМ, фиг. 10), имеющего высокое сродство к этим ионам – lg(константы комплексообразования) для комплекса In3+-ЭДТА – 24,9, а для комплекса Ga3+-ЭДТА – 21,0 (Sun et al., 1996). Это указывает на необходимость разработки одностадийного метода, обеспечивающего присоединение таких радиоизотопов к полипептидам с хелатором, не требующего дальнейшей очистки. Добавление в состав композиции для присоединения радиоизотопов к полипептидам цитрата приводит к исчезновению агрегатов, сопоставимых по гидродинамическому размеру с используемыми пептидами.
На фигуре 11 представлена зависимость эффективности присоединения радиоизотопа 111In к полипептиду 2 от концентрации цитрата в композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам, полученная при помощи анализа получаемых продуктов электрофорезом в полиакриламидном геле. При добавлении цитрата до конечной концентрации 6-9 мМ эффективность присоединения радиоизотопа к полипептиду с хелатором увеличивается, при больших концентрациях цитрата эффективность присоединения начинает снижаться.
Пример 13
Влияние SDS на присоединение радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором.
Ряд искусственных полипептидов, в первую очередь, полипептиды богатые амфифильными мембранотропными последовательностями, обладает ограниченной растворимостью в слабокислой среде, в условиях, при которых образуются комплексы ионов таких элементов как галлий, индий, иттрий. Для обеспечения лучшей растворимости таких полипептидов в состав композиции для присоединения радиоизотопа к полипептидам был добавлен SDS в концентрации ниже критической концентрации мицеллообразования (ККМ). Данная добавка позволяет плохорастворимым в этих условиях полипептидам оставаться в растворе в течение времени, необходимого для присоединения радиоизотопа к полипептиду с хелатором. SDS мало влиял на эффективность присоединения индия к ПП2-НОТА (фиг. 12), как в концентрациях ниже ККМ, так и в концентрациях выше ККМ.
Пример 14
Влияние pH на присоединение 111In к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором.
Композицию для присоединения радиоизотопов к полипептидам можно использовать для присоединения радиоизотопов в слабокислой или нейтральной среде. Так эффективность присоединения 111In к НОТА-полипептиду 2 слабо изменялось в диапазоне pH от 4 до 7,5, с несколько большей эффективностью при pH около 4,5 (фиг. 13). Средняя эффективность присоединения оцененная при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в этих условиях для этого полипептида составила 96,2±0,5% (n=9). Для другого полипептида (ПП1) средняя эффективность была близкой – 96,5±0,7% (n=7).
Пример 15
Цитотоксическая активность индия, присоединенного к полипептиду-1 с ковалентно присоединенным хелатором.
Для определения увеличения цитотоксической активности 111In в результате его присоединения при помощи хелатора НОТА к полипептиду-1 (ПП1), способному доставлять действующее начало в ядра клеток с повышенной экспрессией рецептора эпидермального фактора роста использовали клетки рака мочевого пузыря человека линии EJ, обладающими 1,6×105 рецепторов на клетку. Клетки культивировали в среде ДМЕМ/F12 с 10% фетальной телячьей сывороткой при 37°С и 5% углекислого газа. Для определения цитотоксичности клетки рассевали в 24-луночные плашки по 25 000 клеток на лунку и на следующий день добавляли 111In-НОТА-ПП1, приготовленный как описано в примере 10, или 111In без ПП1, но со всеми компонентами заявляемой композиции, приготовленный таким же образом, с указанной активностью препаратов в 1 мл свежей среды. Через 48 часов лунки отмывали от среды с препаратами, клетки снимали с подложки и рассевали на определение выживаемости по тесту колониеобразования по 2000 клеток в 25 см2 культуральные флаконы. Через 7-9 дней клетки фиксировали 0,3% раствором кристаллического фиолетового в этаноле, после чего просчитывали количество колоний. Результаты обрабатывали при помощи нелинейной регрессии с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software, США), согласно одноэкспоненциальному уравнению y=A⋅e-k·x, где y – выживаемость в процентах от контроля, х – добавленная активность в беккерелях на мл среды, A и k – оцениваемые параметры (количество клеток в контроле, не подвергнувшемуся воздействию, и константа уменьшения выживаемости клеток, соответственно). Соотношение констант, характеризующих цитотоксичность радиоизотопа (k), составило 32,6 раза для присоединенного к ПП1 111In по отношению к неприсоединенному, что свидетельствует об увеличении его цитотоксичности (фиг. 14) в результате присоединения к ПП1.
Пример 16
Цитотоксическая активность индия, присоединенного к полипептиду-2 с ковалентно присоединенным хелатором.
Для определения увеличения цитотоксической активности 111In в результате его присоединения при помощи хелатора НОТА к полипептиду-2 (ПП2), способному доставлять действующее начало в ядра клеток с повышенной экспрессией меланокортинового рецептора первого типа (прежде всего, клетки меланомы), использовали клетки меланомы мыши линии B16-F1, обладающими 104 рецепторов на клетку (Siegrist et al., 1989). Клетки культивировали в среде ДМЕМ с фетальной телячьей сывороткой при 37°С и 5% углекислого газа. Клетки рассевали в 24-луночные плашки по 12 000 клеток на лунку и на следующий день добавляли 111In-НОТА-ПП1, приготовленный как описано в примере 10, или 111In без ПП1, но со всеми компонентами заявляемой композиции, приготовленный таким же образом, с указанной активностью препаратов в 1 мл свежей среды. Через 48 часов лунки отмывали от среды с препаратами, клетки снимали с подложки и рассевали на определение выживаемости по тесту колониеобразования по 500 клеток в 25 см2 культуральные флаконы. Через 7 дней клетки фиксировали 0,3% раствором кристаллического фиолетового в этаноле, после чего просчитывали количество колоний. Результаты обрабатывали нелинейной регрессией при помощи GraphPad Prism, согласно одноэкспоненциальному уравнению y=A⋅e-k·x, где y – выживаемость в процентах от контроля, х – добавленная активность в беккерелях на мл среды, A и k – оцениваемые параметры (количество клеток в контроле, не подвергнувшемуся воздействию, и константа уменьшения выживаемости клеток, соответственно). Результаты свидетельствуют об увеличении цитотоксичности 111In в результате его доставки в ядра клеток меланомы, в результате чего начинает сказываться токсическое действие электронов Оже, образующихся в результате распада 111In (фиг. 15). Соотношение констант, характеризующих цитотоксичность радиоизотопа (k), составило 3,7 раза для присоединенного к ПП2 111In по отношению к неприсоединенному изотопу, что свидетельствует об увеличении его цитотоксичности в результате присоединения к ПП2.
Пример 18
Цитотоксическая активность индия, присоединенного к полипептиду-3
Для определения увеличения цитотоксической активности 111In в результате его присоединения при помощи хелатора НОТА к полипептиду-3 (ПП3), способному доставлять действующее начало в ядра клеток с повышенной экспрессией рецептора эпидермального фактора роста, использовали клетки меланомы мыши линии A431, обладающими 2-3×106 рецепторов на клетку (Rosenkranz et al., 1989). Клетки культивировали в среде ДМЕМ с фетальной телячьей сывороткой при 37°С и 5% углекислого газа. Для эксперимента клетки рассевали в 24-луночные плашки по 25 000 клеток на лунку и через двое суток добавляли 111In-НОТА-ПП1, приготовленный как описано в примере 10, или 111In без ПП1, но со всеми компонентами заявляемой композиции, приготовленный таким же образом, с указанной активностью препаратов в 1 мл свежей среды. Через 48 часов лунки отмывали от среды с препаратами, клетки снимали с подложки и рассевали на определение выживаемости по тесту колониеобразования по 500 клеток в 25 см2 культуральные флаконы в среде “Improved MEM zink option medium” (Life Technology, США) с добавлением 1 мг/л инсулина и 8 мМ (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульоната (HEPES) (среда ZO). Через 7 дней клетки фиксировали 0,3% раствором кристаллического фиолетового в этаноле, после чего просчитывали количество колоний. Результаты обрабатывали нелинейной регрессией при помощи GraphPad Prism, согласно одноэкспоненциальному уравнению y=A⋅e-k·x, где y – выживаемость в процентах от контроля, х – добавленная активность в беккерелях на мл среды, A и k – оцениваемые параметры (количество клеток в контроле, не подвергнувшемуся воздействию, и константа уменьшения выживаемости клеток, соответственно). Результаты свидетельствуют об увеличении цитотоксичности 111In в результате его доставки в ядра клеток меланомы, в результате чего начинает сказываться токсическое действие электронов Оже, образующихся в результате распада 111In (фиг. 16). Соотношение констант, характеризующих цитотоксичность радиоизотопа (k), составило 36,6 раза для присоединенного к ПП3 111In по отношению к неприсоединенному изотопу, что свидетельствует об увеличении его цитотоксичности в результате присоединения к ПП3.
Пример 19
Цитотоксическая активность индия, присоединенного к полипептиду-4, модифицированному ПЭГ-ФК
Для определения увеличения цитотоксической активности 111In в результате его присоединения при помощи хелатора НОТА к полипептиду-4, с присоединенным ПЭГ-фолатом (ПП4-ПЭГ-ФК), способному доставлять действующее начало в ядра клеток с повышенной экспрессией рецептора фолиевой кислоты, использовали клетки глиомы человека линии U-87 MG. Клетки культивировали в дефицитной по фолату среде с 10% фетальной телячьей сывороткой при 37°С и 5% углекислого газа. Для эксперимента клетки рассевали в 24-луночные плашки по 30 000 клеток на лунку и через двое суток добавляли 111In-НОТА-ПП1, приготовленный как описано в примере 10, или 111In без ПП1, но со всеми компонентами заявляемой композиции, приготовленный таким же образом, с указанной активностью препаратов в 1 мл свежей среды. Через 48 часов лунки отмывали от среды с препаратами, клетки снимали с подложки и рассевали на определение выживаемости по тесту колониеобразования по 5000 клеток в 25 см2 культуральные флаконы в среде ZO. Через 7 дней клетки фиксировали 0,3% раствором кристаллического фиолетового в этаноле, после чего просчитывали количество колоний. Результаты обрабатывали нелинейной регрессией при помощи GraphPad Prism, согласно одноэкспоненциальному уравнению y=A⋅e-k·x, где y – выживаемость в процентах от контроля, х – добавленная активность в беккерелях на мл среды, A и k – оцениваемые параметры (количество клеток в контроле, не подвергнувшемуся воздействию, и константа уменьшения выживаемости клеток, соответственно). Результаты свидетельствуют об увеличении цитотоксичности 111In в результате его доставки в ядра клеток меланомы, в результате чего начинает сказываться токсическое действие электронов Оже, образующихся в результате распада 111In (фиг. 17). Соотношение констант, характеризующих цитотоксичность радиоизотопа (k), составило 2,2 раза для присоединенного к ПП3 111In по отношению к неприсоединенному изотопу, что свидетельствует об увеличении его цитотоксичности в результате присоединения к ПП4-ПЭГ-ФК.
Цитируемые патентные документы
RU 2251110 (29.02.2000). Чинн П. и др. Набор для радиоактивного мечения и анализ связывания.
EP 2112512 (29.02.2000). Chinn P., et al. Radiolabeling kit and binding assay. (US 6994840)
US 7230085 (27.11.2002). Griffiths G.L. et al. Anti-DOTA antibody.
US 7259249 (01.12.2004). Griffiths G.L. & Govindan S.V. Method for preparing conjugates of proteins and chelating agents.
EP 2962699 A2 (01.12.2004). Griffiths G.L. & Govindan S.V. Improved method for preparing conjugates of proteins and chelating agents.
US 8815211 (09.02.2011). Hino A. Radioactive metal-labeled anti-cadherin antibody.
US 8268781 (02.03.2007). Gotthardt M., et al. Peptide derivatives of exendin-4.
EP 1156835 (29.02.2000). Chinn P. Method for radiolabeling proteins with yttrium-90.
EP 1603598 (18.03.2004). Merlo A., et al. Radiolabeled conjugates based on Substance P and the use thereof.
US 7541018 (08.03.2007). Maecke H.R., et al. Treatment process using somatostatin analogues.
US 20140328754 A1 (18.06.2014). Hino A. et al. Radioactive metal-labeled anti-cadherin antibody
US 8603435 (12.01.2009). Miao Y. & Guo H. Compounds and methods for use in diagnosing and treating melanoma, including metastatic melanoma and methods relating to same.
US 7011816 (13.12.2002). Griffiths G. & Mcbride W. Labeling targeting agents with gallium-68 and gallium-67.
US 20050249671 A9 (22.12.2003). Parmelee D. et al. Neutrokine-alpha conjugate, neutrokine-alpha complex, and uses thereof.
EP 0264333 A2 (15.10.1987). Siegel R.C. & Alvarez V.L. Method for preparation of protein-chelator-metal ion compositions suitable for injection.
EP 0315188 (04.11.1988). Johnson, D.K. & Rogers, P.E. Methods and materials for the preparation of metal labelled antibody solutions.
US 5217704 (27.12.1991). Johnson, D.K. & Rogers P.E. Methods and materials for the preparation of metal labelled antibody solutions.
EP 0495878 (10.10.1990). Akzo N.N.V & Subramanian, R. Method for purifying chelator conjugated compounds.
WO 1999036105 A2 (15.01.1999). Borchardt P.E. et al. Use of radiolabeled monoclonal IgM in therapy for cancer and autoimmune disease.
US 9095624 (10.02.2012). Sobolev et al. Modular transport platform for targeted delivery of therapeutic agents.
Цитируемые непатентные документы
1. Anderson C.J., Welch M.J. Radiometal-labeled agents (non-technetium) for diagnostic imaging // Chem. Rev. – 1999. – Т. 99. – №. 9. – С. 2219-2234.
2. Andersson K.G. et al. Comparative evaluation of 111In-labeled NOTA-conjugated affibody molecules for visualization of HER3 expression in malignant tumors // Oncol. Rep. – 2015. – Т. 34. – №. 2. – С. 1042-1048.
3. Breeman W.A.P. et al. Optimising conditions for radiolabelling of DOTA-peptides with 90Y, 111In and 177Lu at high specific activities // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. – 2003. – Т. 30. – №. 6. – С. 917-920.
4. Brom M. et al. Improved labelling of DTPA-and DOTA-conjugated peptides and antibodies with 111In in HEPES and MES buffer // EJNMMI Res. – 2012. – Т. 2. – №. 1. – С. 1-11.
5. Choi J.Y. et al. Development of 68 Ga-labeled mannosylated human serum albumin (MSA) as a lymph node imaging agent for positron emission tomography // Nucl. Med. Biol. – 2011. – Т. 38. – №. 3. – С. 371-379.
6. Clausén M. et al. Characterisation of gallium (III)-acetate complexes in aqueous solution: A potentiometric, EXAFS, IR and molecular orbital modelling study // Dalton Trans. – 2002. – №. 12. – С. 2559-2564.
7. Costantini D.L., Hu M., Reilly R.M. Update: peptide motifs for insertion of radiolabeled biomolecules into cells and routing to the nucleus for cancer imaging or radiotherapeutic applications // Cancer biotherapy & radiopharmaceuticals. – 2008. – Т. 23. – №. 1. – С. 3-24.
8. Gao C. et al. Auger electron-emitting 111 In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123+/CD131− phenotype of leukemia stem cells // Appl. Radiat. Isot. – 2016. – Т. 110. – С. 1-7.
9. Gilyazova D.G. et al. Recombinant modular transporters on the basis of epidermal growth factor for targeted intracellular delivery of photosensitizers // Current Research on Laser Use in Oncology: 2000-2004. – International Society for Optics and Photonics, 2005. – С. 59730E-59730E-10.
10. Gilyazova D.G. et al. Targeting cancer cells by novel engineered modular transporters // Cancer Res. – 2006. – Т. 66. – №. 21. – С. 10534-10540.
11. Ju C.H. et al. Development of a 177Lu-labeled RGD derivative for targeting angiogenesis // Cancer Biother. Radiopharm. – 2010. – Т. 25. – №6. – С. 687-691.
12. Kukis D.L. et al. Optimized conditions for chelation of yttrium-90-DOTA immunoconjugates // J. Nucl. Med. – 1998. – Т. 39. – №. 12. – С. 2105.
13. Koumarianou E. et al. Radiolabeling and in vitro evaluation of 67 Ga-NOTA-modular nanotransporter–A potential Auger electron emitting EGFR-targeted radiotherapeutic // Nucl. Med. Biol. – 2014. – Т. 41. – №. 6. – С. 441-449.
14. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – Т. 227. – С. 680-685.
15. Leamon C.P., Low P.S. Cytotoxicity of momordin-folate conjugates in cultured human cells //J. Biol. Chem. – 1992. – Т. 267. – №. 35. – С. 24966-24971.
16. Lee J. et al. In vitro and in vivo evaluation of structure-stability relationship of 111 In-and 67 Ga-labeled antibody via 1B4M or C-NOTA chelates // Nucl. Med. Biol. – 1997. – Т. 24. – №. 3. – С. 225-230.
17. Lewis M.R., Raubitschek A., Shively J.E. A facile, water-soluble method for modification of proteins with DOTA. Use of elevated temperature and optimized pH to achieve high specific activity and high chelate stability in radiolabeled immunoconjugates // Bioconjug. Chem. – 1994. – Т. 5. – №. 6. – С. 565-576.
18. Lorberboum-Galski H. Human toxin-based recombinant immunotoxins/chimeric proteins as a drug delivery system for targeted treatment of human diseases //Expert opinion on drug delivery. – 2011. – Т. 8. – №. 5. – С. 605-621.
19. Lu Y., Low P.S. Folate-mediated delivery of macromolecular anticancer therapeutic agents // Adv. Drug Deliv. Rev. – 2012. – Т. 64. – С. 342-352.
20. Malmberg J. et al. Comparative evaluation of synthetic anti-HER2 Affibody molecules site-specifically labelled with 111In using N-terminal DOTA, NOTA and NODAGA chelators in mice bearing prostate cancer xenografts // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. – 2012. – Т. 39. – №. 3. – С. 481-492.
21. Morfin J.F., Tóth É. Kinetics of Ga (NOTA) formation from weak Ga-citrate complexes // Inorg. Chem. – 2011. – Т. 50. – №. 20. – С. 10371-10378.
22. Mukai T. et al. Synthesis and evaluation of a monoreactive DOTA derivative for indium-111-based residualizing label to estimate protein pharmacokinetics //J. Pharm. Pharmacol. – 2002. – Т. 54. – №. 8. – С. 1073-1081.
23. Nayak T.K., Brechbiel M.W. Radioimmunoimaging with longer-lived positron-emitting radionuclides: potentials and challenges // Bioconjug. Chem. – 2009. – Т. 20. – №. 5. – С. 825-841.
24. Reilly R.M. (ed.). Monoclonal antibody and peptide-targeted radiotherapy of cancer. – John Wiley & Sons, Singapore, 2010, 632 p.
25. Rosenkranz A.A., Jans D.A., Sobolev A.S. Targeted intracellular delivery of photosensitizers to enhance photodynamic efficiency // Immunol. Cell Biol. – 2000. – Т. 78. – №. 4. – С. 452-464.
26. Rosenkranz A.A. et al. Recombinant modular transporters for cell-specific nuclear delivery of locally acting drugs enhance photosensitizer activity // FASEB J. – 2003. – Т. 17. – №. 9. – С. 1121-1123.
27. Rosenkranz A.A. et al. Engineered modular recombinant transporters: application of new platform for targeted radiotherapeutic agents to α-particle emitting 211 At // Int. J. Radiat. Oncology* Biology* Physics. – 2008. – Т. 72. – №. 1. – С. 193-200.
28. Rosenkranz A.A. et al. Use of intracellular transport processes for targeted drug delivery into a specified cellular compartment // Biochemistry (Moscow). – 2014. – Т. 79. – №. 9. – С. 928-946.
29. Siegrist W. et al. Characterization of receptors for α-melanocyte-stimulating hormone on human melanoma cells // Cancer Res. – 1989. – Т. 49. – №. 22. – С. 6352-6358.
30. Slastnikova T.A. et al. Modular nanotransporters: a multipurpose in vivo working platform for targeted drug delivery // Int. J. Nanomed. – 2012a. – Т. 7. – С. 467-482.
31. Slastnikova T.A. et al. Modular nanotransporters: a versatile approach for enhancing nuclear delivery and cytotoxicity of Auger electron-emitting 125I // EJNMMI Res. – 2012b. – Т. 2. – С. 59.
32. Slastnikova T.A. et al. Modular nanotransporters for targeted intracellular delivery of drugs: folate receptors as potential targets // Curr. Pharm. Design. – 2015. – Т. 21. – №. 9. – С. 1227-1238.
33. Sobolev A.S. Modular transporters for subcellular cell-specific targeting of anti-tumor drugs // BioEssays. – 2008. – Т. 30. – №. 3. – С. 278-287.
34. Sobolev A.S. Modular nanotransporters of anticancer drugs conferring cell specificity and higher efficiency // Biochemistry (Moscow). – 2009. – Т. 74. – №. 13. – С. 1567-1574.
35. Sobolev A.S. Modular nanotransporters: A multitarget platform for anticancer drug delivery // Herald Rus. Acad. Sci. – 2013. – Т. 83. – №. 4. – С. 324-335.
36. Sudimack J., Lee R.J. Targeted drug delivery via the folate receptor // Adv. Drug Deliv. Rev. – 2000. – Т. 41. – №. 2. – С. 147-162.
37. Sun Y. et al. Indium (III) and gallium (III) complexes of bis (aminoethanethiol) ligands with different denticities: stabilities, molecular modeling, and in vivo behavior // J. Med. Chem. – 1996. – Т. 39. – №. 2. – С. 458-470.
38. Varasteh Z. et al. Synthesis and characterization of a high-affinity NOTA-conjugated bombesin antagonist for GRPR-targeted tumor imaging // Bioconjug. Chem. – 2013. – Т. 24. – №. 7. – С. 1144-1153.
39. Wadas T.J. et al. Coordinating radiometals of copper, gallium, indium, yttrium, and zirconium for PET and SPECT imaging of disease // Chem. Rev. – 2010. – Т. 110. – №. 5. – С. 2858-2902.
40. Weldon J.E., Pastan I. A guide to taming a toxin–recombinant immunotoxins constructed from Pseudomonas exotoxin A for the treatment of cancer // FEBS J. – 2011. – Т. 278. – №. 23. – С. 4683-4700.
Claims (18)
1. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором, характеризующаяся тем, что в ее состав помимо полипептида и присоединяемого радиоизотопа входят цитрат натрия, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота (HEPES), хлорид натрия, додецилсульфат натрия (SDS) с подобранным для присоединения радиоизотопа значением pH среды, находящимся в диапазоне 4-7,5 единиц.
2. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 1, отличающаяся тем, что концентрация цитрата натрия находится в диапазоне 1-20 мМ.
3. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 2, отличающаяся тем, что в качестве предпочтительной используется концентрация цитрата натрия 6 мМ.
4. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве предпочтительной используется концентрация HEPES 80 мМ.
5. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 1, отличающаяся тем, что используется концентрация додецилсульфата натрия ниже критической концентрации мицеллообразования.
6. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 5, отличающаяся тем, что в качестве предпочтительной используется концентрация додецилсульфата натрия 0,02%.
7. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве предпочтительного используется pH 4,5.
8. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве полипептида используется искусственный химерный полипептид.
9. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве полипептида используется искусственный химерный полипептид, ковалентно модифицированный компонентами, обеспечивающими взаимодействие с клетками.
10. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве полипептида используется искусственный химерный полипептид, ковалентно модифицированный компонентами, обеспечивающими взаимодействие с клетками, по уникальному месту присоединения на молекуле.
11. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве полипептида используется природный полипептид.
12. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве радиоизотопа используется 111In.
13. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве радиоизотопа используется 67Ga.
14. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве хелатора используется 1,4,7-триазоциклононан-1,4,7-триуксусная кислота (НОТА).
15. Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве хелатора используется 1,4,7,10-тетраазоциклододекан-N,N'N'',N'''-тетрауксусная кислота (ДОТА).
16. Способ присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором, характеризующийся тем, что радиоизотоп добавляют к полипептиду с присоединенным хелатором и инкубируют в среде, содержащей цитрат натрия в диапазоне концентраций 1-20 мМ, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновую кислоту (HEPES) в концентрации 80 мМ, хлорид натрия, додецилсульфат натрия (SDS) в концентрации 0,02%, при температуре 37°С, при рН, находящемся в диапазоне 4-7,5 единиц, после чего добавляют хлорид натрия до физиологической концентрации ионов в смеси и гидроксид натрия до рН 7,5.
17. Способ присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 16, отличающийся тем, что в качестве хелатора используют 1,4,7-триазоциклононан-1,4,7-триуксусную кислоту (НОТА), в качестве радиоизотопа используют 111In и инкубацию проводят в течение 1 часа.
18. Способ присоединения радиоизотопа к полипептиду с ковалентно присоединенным хелатором по п. 16, отличающийся тем, что в качестве хелатора используют 1,4,7,10-тетраазоциклододекан-N,N'N",N'"-тетрауксусную кислоту (ДОТА), в качестве радиоизотопа используют 111In и инкубацию проводят в течение 3 часов 40 минут.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016123920A RU2719418C2 (ru) | 2016-06-16 | 2016-06-16 | Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептидам и способ присоединения радиоизотопа к полипептидам |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016123920A RU2719418C2 (ru) | 2016-06-16 | 2016-06-16 | Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептидам и способ присоединения радиоизотопа к полипептидам |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016123920A RU2016123920A (ru) | 2017-12-21 |
| RU2719418C2 true RU2719418C2 (ru) | 2020-04-17 |
Family
ID=63851938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016123920A RU2719418C2 (ru) | 2016-06-16 | 2016-06-16 | Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептидам и способ присоединения радиоизотопа к полипептидам |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2719418C2 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5248764A (en) * | 1989-06-16 | 1993-09-28 | Merck Frosst Canada, Inc. | Chelate derivatives of atrial natriuretic factor (ANF) |
| US6024938A (en) * | 1994-07-07 | 2000-02-15 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Lyophilized imaging agent formulation comprising a chemotactic peptide |
| RU2537175C2 (ru) * | 2013-03-26 | 2014-12-27 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации | Способ получения радиоиммунного препарата для диагностики и терапии онкологических заболеваний |
-
2016
- 2016-06-16 RU RU2016123920A patent/RU2719418C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5248764A (en) * | 1989-06-16 | 1993-09-28 | Merck Frosst Canada, Inc. | Chelate derivatives of atrial natriuretic factor (ANF) |
| US6024938A (en) * | 1994-07-07 | 2000-02-15 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Lyophilized imaging agent formulation comprising a chemotactic peptide |
| RU2537175C2 (ru) * | 2013-03-26 | 2014-12-27 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации | Способ получения радиоиммунного препарата для диагностики и терапии онкологических заболеваний |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Brom M. et al. Improved labelling of DTPA-and DOTA-conjugated peptides and antibodies with 111In in HEPES and MES buffer // EJNMMI Res. - 2012. - Т. 2. - N 1. - С. 1-11. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016123920A (ru) | 2017-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fichna et al. | Synthesis of target-specific radiolabeled peptides for diagnostic imaging | |
| CA2873144C (en) | Radio-pharmaceutical complexes | |
| Bullok et al. | Characterization of novel histidine-tagged Tat-peptide complexes dual-labeled with 99mTc-tricarbonyl and fluorescein for scintigraphy and fluorescence microscopy | |
| JP3036602B2 (ja) | 撮像用テクネチウム−９９ｍ標識ペプチド | |
| Sarko et al. | Bifunctional chelators in the design and application of radiopharmaceuticals for oncological diseases | |
| Li et al. | Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. Site-specific conjugation of DOTA-peptides to a Cys-diabody | |
| Brandt et al. | Mini-review: Targeted radiopharmaceuticals incorporating reversible, low molecular weight albumin binders | |
| Tolmachev et al. | Targeted nuclear medicine. Seek and destroy | |
| JP7109627B2 (ja) | 放射性核種錯体を調製するための方法およびキット | |
| CA3066240C (en) | Improved pharmacokinetics and cholecystokinin-2 receptor (cck2r) targeting for diagnosis and therapy | |
| JPWO2017150549A1 (ja) | 放射性標識薬剤 | |
| Satpati et al. | 68 Ga-Chelation and comparative evaluation of N, N′-bis-[2-hydroxy-5-(carboxyethyl) benzyl] ethylenediamine-N, N′-diacetic acid (HBED-CC) conjugated NGR and RGD peptides as tumor targeted molecular imaging probes | |
| JP2022133357A (ja) | がんイメージング及びがん放射線治療のための組成物及び方法 | |
| KR930003312B1 (ko) | 메탈로티오네인과 생물학적 활성 분자의 추적-표지 결합체의 제조방법 | |
| Vats et al. | 99m T c‐labeled NGR‐chlorambucil conjugate, 99m T c‐HYNIC‐CLB‐c (NGR) for targeted chemotherapy and molecular imaging | |
| JP2008538204A (ja) | 安定化側鎖を含む放射性標識複合体キレート剤 | |
| CA3171753A1 (en) | Stable formulations for radionuclide complexes | |
| Ballard et al. | In vitro and in vivo evaluation of melanin-binding decapeptide 4B4 radiolabeled with 177Lu, 166Ho, and 153Sm radiolanthanides for the purpose of targeted radionuclide therapy of melanoma | |
| Obata et al. | Development of novel 191Pt-labeled Hoechst33258: 191Pt is more suitable than 111In for targeting DNA | |
| RU2719418C2 (ru) | Композиция для присоединения радиоизотопа к полипептидам и способ присоединения радиоизотопа к полипептидам | |
| Pruszynski et al. | D-amino acid peptide residualizing agents bearing N-hydroxysuccinimido-and maleimido-functional groups and their application for trastuzumab radioiodination | |
| Vats et al. | Preparation and comparative evaluation of 99mTc‐HYNIC‐cNGR and 99mTc‐HYNIC‐PEG2‐cNGR as tumor‐targeting molecular imaging probes | |
| Pratesi et al. | Biotin derivatives carrying two chelating DOTA units. Synthesis, in vitro evaluation of biotinidases resistance, avidin binding, and radiolabeling tests | |
| Sadri et al. | Synthesis and biodistribution studies of iodine‐131 D‐amino acid YYK peptide as a potential therapeutic agent for labeling an anti‐CD20 antibody | |
| Deberle | Development of radiolabeled small molecules and peptides towards targeted radionuclide therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200419 |