KR920009502B1 - 인간 초산화물 불균화 효소(Cu, Zn-SOD) 발현운반체 (pYLBC-A/G-SOD) 및 그의 제조방법 - Google Patents

인간 초산화물 불균화 효소(Cu, Zn-SOD) 발현운반체 (pYLBC-A/G-SOD) 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

인간 초산화물 불균화 효소(Cu, Zn-SOD) 발현운반체 (pYLBC-A/G-SOD) 및 그의 제조방법
제 1도는 변형된 초산화물 불균화 효소 유전자의 염기 서열 및 아미노산서열을 나타낸 것이고,
제 2도는 본 발명에 따른 효모 발현 운반체로의 클로닝 과정을 도시한 것이고,
제 3도는 본 발명의 초산화물 불균화 효소 유전자를 함유한 발현 운반체(pYLBC-A/G-SOD)로 형질전환시킨 효모를 발효시킨 후 추출물을 소듐도데실 설페이트-롤리아크릴아마이드겔 전기 영동한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 인간 초산화물 불균화 효소 발현 운반체(pYLBC-A/G-SOD) 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 유전 공학적인 방법으로 효모를 발현체로 하여 초산화물 불균화 효소(SOD)를 대량 생산하는데 사용될 수 있는 초산화물 불균화 효소 발현 운반체(pYLBC-A/G-SOD)와 그 운반체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
생체내에서 생물학적 반응에 의해 생성되는 초산화물은 그 강한 방응성으로 인해 핵산의 변이를 일으켜 암을 유발하거나 조직의 파괴를 가져오기도 한다. 초산화물 불균화 효소(SOD)는 이러한 초산화물을 산소와 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉진시켜 생체를 보호하는 작용을 한다.
진핵 세포류에는 세가지 종류의 초산화물 불균화 효소(SOD)가 있는데 본 발명에 의해 클로닝된 것은 세포질내에 있는 Cu, Zn-SOD의 cDNA이다. 인간의 Cu, Zn-SOD는 153개의 아미노산으로 구성되는 분자량 19,000달톤의 단백질로 2개가 동일하게 비공유결합(Lieman-Hurwitz, J. et al., Biochem. Int. 3, 107 (1981))하여 만들어진 단백질로서 류마티스를 비롯한 여러가지 인체의 질병 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
종래에는 소에서 추출 정제한 초산화물 불균화 효소(SOD)를 치료제로 사용함으로써 항체가 생성되거나 또는 활성도가 낮은 문제점이 있었으며, 유전 공학 기술에 의해서 대장균에서 생산(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 7142 (1986))하였으나, 이는 대장균 독소 추출 정제에 단점이 있었다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 연구 노력한 결과 유전 공학기술을 응용하여 효모에서 사용될 수 있는 발현 운반체를 완성하게 되었다.
본 발명은 동일자에 출원한 본 출원인의 특허출원인 초산화물 불균화 효소(SOD) 유전자를 함유하는 파아지 핵산인 M13mp18-SOD(Escherichia coli LUCK-SOD-1E : KFCC-10699)를 제한 효소 Nco I, Sal I으로 동시 절단하여 얻어진 470 염기쌍의 초산화물 불균화 효소(SOD)의 핵산 절편과 Saccharomyces cerevisiae pYLBC-A/G-HGH(KFCC-10669, 선출원 번호인 특허출원 제88-18192호에 상세히 기재되어 있음)로부터 제한효소 Pst I, Nco I 으로 절단해서 얻은 A/G 작동 유전자를 포함하는 4,400염기쌍의 절편 및 제한효소 Pst I, Sal I으로 절단하여 얻은 GAP 종료 유전자를 포함하는 9,500염기쌍의 절편을 접합 반응시켜서 초산화물 불균화 효소 발현 운반체 (pYLBC-A/G-SOD)를 제조함을 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
제1도에 나타낸 바와 같은 염기서열의 초산화물 불균화 효소(SOD)유전자(본 출원인의 동일자로 출원함)에서 얻은 M13mp18-SOD(Escherichia coli LUCK-SOD-1E : KFCC-10699)의 핵산을 10mM의 Tris-HCI(pH 8.0), 7mM의 MgCI2, 150mM의 NaCl, 7mM의 2-메캅토에탄올, 100 ㎍/ml의 BSA의 반응조건하에서 제한효소 Sal I, Nco I으로 동시 절단한 후, 초산화물 불균화 효소 유전자(470염기쌍)의 핵산 절편을 전기 영동에 의한 젤 추출 방법으로 정제하였다.
그후 Saccharomyces cerevisiae pYLBC-A/G-HGH(KFCC-10669)에서 얻어진 운반체를 Pst I, Nco I 제한 효소로 절단하여 A/G작동유전자를 포함하는 4,400 염기쌍의 절편을 얻고, 또한 Pst I, Sal I 제한 효소로 절단하여 GAP 종료유전자를 포함하는 9,500 염기쌍의 절편을 얻었다. 이 두 개의 절편을 각각 첨가하고 앞에서 얻은 초산화물 불균화 효소(SOD) 유전자 핵산의 Nco I, Sal I 절단 절편을 넣고 접합반응시켜서 초산화물 불균화 효소 발현 운반체(pYLBC-A/G-SOD)를 제조함을 특징으로 한다.
이상과 같은 초산 화합물 불균화 효소(SOD) 유전자를 함유하는 효모 발현 운반체(pYLBC-A/G-SOD)의 제조과정을 제2도에서 도시하였다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1]
초산화물 불균화 효소(SOD) 유전자의 효모 발현 운반체로의 클로닝
동일자에 출원한 초산화물 불균화 효소(SOD) 유전자가 삽입된 M13mp18-SOD의 핵산을 10Mm의 Tris-HCl(pH 8.0), 7mM의 MgCl2, 150mM의 NaCl, 7mM의 2-메르캅토에탄올, 100㎍/ml의 BSA의 반응 조건하에서 제한효소 Sal I, Nco I으로 동시 절단한 후, 초산화물 불균화 효소 유전자(470 염기쌍)의 핵산 절편을 전기 영동에 의한 젤 추출 방법으로 정제하였다.
pYLBC-A/G-HGH에서 얻어진 운반체를 Pst I, Nco I 제한효소로 절단하여 A/G 작동유전자를 포함하는 4,400 염기쌍의 절편을 얻고, 또한 Pst I, Sal I 제한효소로 절단하여 GAP 종료 유전자를 포함하는 9,500 염기쌍의 절편을 얻었다. 이 두 개의 절편(20㎍/㎕)을 각각 1㎕씩 첨가하고 앞에서 얻은 초산화물 불균화 효소(SOD) 유전자 핵산의 Nco I, Sal I 절단 절편 (10㎍/㎕) 4㎕, 2㎕의 10 × 리가아제 완충용액(500mM Tris-HCl pH7.6, 100mM MgCl2, 200mM DTT, 10mM ATP, 500㎍/ml BSA), 2㎕의 10mM ATP, 1㎕(μ/㎕)의 T4DNA Ligase(New England Biolabs., U.S.A.), 9㎕의 증류수를 넣고 14℃에서 2시간이상 접합 반응시킨 후 대장균 HB101(ATCC 33698)에 형질전환시키고 엠피실린 플레이트에서 선별하였다. Allkaline lysis 방법(Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, U.S.A.(1982))으로 플라스미드 DNA를 추출한 후 Nco I, Sal I 제한 효소로 절단하여 초산화물 불균화 효소(SOD) 유전자가 A/G 작동 유전자와 GAP 종료유전자 사이에 클로닝된 초산화물 불균화 효소 발현 운반체(pYLBC-A/G-SOD)를 확인하였다. 그리고, 이 핵산은 다시 이중 나선핵산 염기서열 확인방법(Biotechniques, Vol. 6, No. 9,839 (1988))으로 재확인하였다 (제2도 참조).
이 SOD를 포함하는 재조합 플라스미드를 발현체인 효모 Saccharomyces cerecisiae DC04(Yeast Genetic Stock Center, University of California. Berkeley, CA, U.S.A.)에 형질 전환시켜서 SOD를 생산하는 균주를 얻었다.
[실시예 2]
효모에서 초산화물 불균화 효소(SOD)를 대량 발현 및 SOD-폴리아크릴아마이드젤 전기 영동에 의한 확인
실시예 1에서 얻어진 초산화물 불균화 효소 발현 운반체(pYLBC-A/G-SOD)로 형질 전환된 효모균주를 3ml의 루이신(leucine)이 결핍된 포도당 결핍 배양액(배양액 1리터당 아미노산이 없는 효모질 염기 6.7g과 루이신 결핍 영양공급제 0.25g 및 6% 포도당)에서 24시간 동안 30℃에서 진탕 배양시킨 후, 이를 100ml의 YEPD배양액(2% 펩톤, 1% 효모추출물, 2% 포도당)에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다.
이때, 최종 흡광도는 O.D. 650mm에서 25정도였으며, 여기서 흡광도 650mm에서 10에 해당하는 양을 원심분리시켜(Eppendorf microfuge, 5분, U.S.A.), 그 침전을 400㎕ 완충용액 (10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA, 2mM PMSF, 8M Urea)에 용존시키고, 직경 0,4mm의 유리구슬을 같은 부피로 첨가하고 강하게 10분간 진탕시켜 세포벽을 파괴한 후 상기와 같이 원심 분리하여 상층액인 효모 추출물을 얻었다. 10㎕의 효모 추출물을 15% SPS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동시키고, 그 결과를 제3도에 나타내었다.
제3도에서 레인 1은 단백질 표준 분자량(Bio-Rad사 제품, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547, U.S.A.)으로서 위로 부터 43000, 29000, 18400, 14300, 6200 및 2300 달톤이며, 레인 2는 초산화물 불균화 효소(SOD) 유전자를 함유하지 않는 효모의 추출물이고, 레인 3은 본 실시예에서 얻어진 초산화물 불균화 효소 발현 운반체(pYLBC-A/G-SOD)를 함유하는 효모 추출물의 20㎕시료이며, 제4레인은 초산화물 불균화 효소(SOD)의 표준시료이다.
제3도에 나타난 바와 같이, 제 3레인의 초산화물 불균화 효소 발현 운반체(pYLBC-A/G-SOD)를 함유하는 효소추출물을 전기 영동한 결과, 제2레인의 초산화물 불균화 효소(SOD) 유전자를 함유하지 않는 통상의 효모의 경우와는 달리, 초산화물 불균화 효소(SOD) 표준시료의 분자량 19,000 달톤에 상응하는 위치에 진한 단백질 벤드를 나타냄으로써 초산화물 불균화 효소(SOD)가 발현되었음을 확인할 수 있었다.
이상에서 설명한 바와 같은 본 발명의 초산화물 불균화 효소 발현 운반체(pYLBC-A/G-SOD)는 유전공학적인 방법에 의해 초산화물 불균화 효소(SOD)를 대량생산하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (7)

  1. 인간 초산화물 불균화 효소 유전자를 함유하는 파아지핵산인 M13mp18-SOD(Escherichia coli LUCK-SOD-1E : KFCC-10699)를 제한효소 Nco I, Sal I 으로 동시 절단하여, 얻어진 초산화물 불균화 효소의 핵산 절편과 Saccharomyces cerevisiae pYLBC-A/G-HGH(KFCC-10669)로부터 제한 효소 Pst I, Nco I 으로 절단해서 얻은 A/G 작동유전자를 포함하는 절편 및 제한효소 Pst I, Sal I 으로 절단하여 얻은 GAP 종료 유전자를 포함하는 절편을 접합 반응시켜서 제조된 것임을 특징으로 하는 초산화물 불균화 효소 발현운반체 pYLBC-A/G-SOD.
  2. 제1항에 있어서, 초산화물 불균화 효소 유전자는 다음의 염기서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 초산화물 불균화 효소 발현 운반체 pYLBC-A/G-SOD.
    Figure kpo00001
  3. 제1항에 있어서, 초산화물 불균화 효소 핵산 절편은 470 염기쌍으로 구성됨을 특징으로 하는 초산화물 불균화 효소 발현 운반체 pYLBC-A/G-SOD.
  4. 제1항에 있어서, A/G 작동 유전자를 포함하는 절편은 4,400 염기쌍으로 구성됨을 특징으로 하는 초산화물 불균화 효소 발현 운반체 pYLBC-A/G-SOD.
  5. 제1항에 있어서, GAP 종료 유전자를 포함하는 절편은 9,500 염기쌍으로 구성됨을 특징으로 하는 초산화물 불균화 효소 발현 운반체 pYLBC-A/G-SOD.
  6. 인간 초산화물 불균화 효소 유전자를 함유하는 파아지 핵산인 M13mp18-SOD(Escherichia coli LUCK-SOD-1E : KFCC-10699)을 10mM의 Tris-HCl(pH 8.0), 7mM의 MgCl2, 150mM의 NaCl, 7mM의 2-메르캅토에탄올, 100ug/ml의 BSA의 반응 조건하에서 제한효소 Sal I, Nco I으로 동시 절단하고, 초산화물 불균화 효소 470 염기쌍의 핵산 절편을 전기 영동에 의한 젤 추출방법으로 정제한 후 Saccharomyces cerevisiae pYLBC-A/G-HGH(KFCC-10669)를 Pst I, Nco I 제한 효소로 절단하여 A/G 작동유전자를 포함하는 4,400 염기쌍의 절편을 얻고, 또한 PstI, Sa1I 제한 효소로 절단하여 GAP 종료유전자를 포함하는 9,500 염기쌍의 절편을 얻은 다음, 이 두 개의 절편을 각각 첨가하고 앞에서 얻은 초산화물 불균화 효소 유전자 핵산인 Nco I, Sal I 인지 부위를 갖고 있는 핵산 절단 절편을 넣고 접합 반응시키는 것을 특징으로 하는 초산화물 불균화 효소 발현 운반체 pYLBC-A/G-SOD의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 초산화물 불균화 효소는 다음의 염기서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 초산화물 불균화 효소 발현 운반체 pYLBC-A/G-SOD의 제조방법.
    Figure kpo00002
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