KR920008374B1

KR920008374B1 - 항종양 면역증강효과가 있는 단백다당체(G 009)를 생성하는 가노데르마루시덤(Ganoderma lucidum) IY 009

Info

Publication number: KR920008374B1
Application number: KR1019900019877A
Authority: KR
Inventors: 이권행; 정훈; 이준우; 정천희
Original assignee: 일양약품 주식회사; 정형식
Priority date: 1990-12-04
Filing date: 1990-12-04
Publication date: 1992-09-26
Also published as: CA2097821A1; RU2082755C1; JPH084494B1; EP0563383A4; CA2097821C; KR920012420A; AU1223897A; WO1992010562A1; EP0563383A1; AU8951591A

Abstract

내용 없음.

Description

항종양 면역증강효과가 있는 단백다당체(G 009)를 생성하는 가노데르마루시덤(Ganoderma lucidum) IY 009

제1도는 본 발명 단백다당류 G 009의 당류분석 크로마토그람.

제2도는 본 발명 단백다당류 G 009의 아미노산 크로마토그람.

제3도는 본 발명 단백다당류 G 009의 I.R 분석도.

제4도는 본 발명 균주 IY 909 균사체의 현미경 사진이며.

제5도는 본 발명 균주 IY 909 특이성 비교도이다.

본 발명은 항종양 면역증강효과가 있는 단백다당체를 생성하는 균주에 관한 것이다.

본 발명자들은 새로운 항종양, 면역증강효과가 있는 단백다당체의 탐색을 목적으로 다수의 담자균류를 각 지역별로 채집하여, 그 담자균류가 생성하는 단백다당체의 분리를 시도하였다. 그 결과 전라남도 해남군 두륜산 일대에서 채집한 가노데르마(Ganoderma)속에 속하는 담자균류를 적당한 배지에서 배양하면, 항종양 및 면역증강 효과가 있는 단백다당체를 생성하는 것을 발견하였다. 생성된 단백다당체를 분리하고 그 이화학적 성질 및 생물학적 성질을 검토하였던 바, 이것을 항종양, 면역증강효과가 있는 단백다당체 G 009로 명명하였으며 이를 생성하는 균주를 가노데르 마루시덤(Ganoderma lucidum) IY 009(한국 종균 협회 기탁번호 KFCC-10709호; 1990년 10월 5일자 기탁)로 명명하였다.

본 발명은 G 009를 생성하는 균주 IY 009에 관한 것이다. 고등균에 속하는 담자균류로부터 약효 성분인 항균성분, 환각성분, 독성분, 콜레스테롤 강하 성분등에 관하여 연구되어 왔으나 최근에 와서 항암성분과 면역기능 증강작용의 연구가 활발히 진행되고 있어 담자균류의 중요성이 높아지고 있다.

이에 본 발명자들은 항암성분 및 면역기능 증강작용이 있는 물질을 분비하는 균주를 분리 액내 배양하여 그 약리효과를 연구하던 중 지금까지 분리 동정된 코르디셉스속의 종(species)보다는 탁월한 항암효과 및 면역 증강 작용을 갖는 변종의 균주를 분리하였으며 균사체의 액내 배양 방법을 확립하고 그 배양된 균사체로부터 추출한 성분의 항암효과 및 면역 증강 효과를 확인 하였다. 이에 대하여 본 발명자들은 다음의 실시예 및 실험예로 본 발명을 설명한다.

[실시예]

[단백다당체의 분리]

1) 균주 : 가노데르마 루시덤균주는 전남 해남군 두륜산 일대에서 채집하여 분리, 동정하였다.

2) 보존 배지 : 감자 텍스트로스 한천(Potato dextrose ager : PDA) 경사 배지; 감자 텍스트로스 배지(Difce. U.S.A.) 39g을 증류수에 녹여 1L로 하고, 121℃에서 20분간 고압멸균 후 경사배지로 만들었다.

액내배양용 매지 : 포도당 50g, 펩톤 20g, KH₂PO₄0.87g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, FeCl₂·6H₂O 10㎎, MnCl₂·4H₂O 7㎎, CuSO₄5H₂O 10㎎, ZnCl₂, 4㎎에 증류수를 가해 1L로 하였다. 이의 pH를 5.5으로 조정하여 121℃, 20분간 고압증기 멸균하였다.

3) 배양 : 보관중인 균주를 PDA경사배지에 이식하여 25±1℃에 7일간 성장시킨 후 발육된 균사를 무균적으로 분리하여 액내배양용 배지 100ml에 넣고 15초간 미세분쇄기(Microblender)로 분쇄하였다. 이를 500ml용 삼각플라스크에 옮기고 25±1℃에서 180rpm으로 균사체가 직경 5mm정도의 성숙한 균괴를 이룰 때까지 10일간 진탕배양하였다. 얻어진 균괴를 미세분쇄기로 10초간 분쇄한 후, 액내배양용 배지 100ml가 든 500ml용 삼각플라스크에 5%(V/V)씩 접종하고 상기 조건과 동일한 조건으로 10일간 진탕 배양하였다. 얻어진 균사 배양물을 다시 10초간 분쇄하여 종균으로 하고 액내배양용 배지 100ml을 500ml용 삼각플라스크에 넣고 종균을 5%(V/V)의 농도로 접종하였다. 25±1℃의 온도에서 오비탈진탕배양기(회전반경 1인치 비전과학 Co.)에서 170회전/분으로 7일간 진탕배양하였다.

4) 단백다당류의 추출 및 분리

배양이 끝난 배양액 전체를 6000rpm에서 15분간 원심분리한 후 균사체만을 취하여 2배의 2.5N NaOH용액에 침윤시킨 다음 실온에서 24시간 방치하여 6000rpm에서 15분간 원심분리하였으며, 상등액을 취하여 빙초산으로 pH 7.4로 증화시킨 후, 비스킹 튜브(Visking tube; Sigma, U.S.A)를 이용하여 3일 동안 투석시켰다. 투석이 끝난 후 농축하여 3배의 에탄올을 가해 4℃에서 24시간 방치 후 6000 회전에서 15분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 탈이온에 용해시켜 6000 회전에서 15분간 원심분리하여 상등액을 농축하고, 동결건조시켜 단백다당류를 분리하여T다.

5) 단백다당류의 정제

상기의 시료를 물에 용해시켜 과량의 에탄올을 가한 후 얻어진 침전물 12.5g을 취하여 물에 다시 용해시켰다. 이 시료용액을 디이에이-셀룰로스(DEAE-Cellulose, Cl^-form) Column(3㎝×60cm)에 적용시킨 후 물로 용출시켜 얻어진 용출분획 200ml에 동량의 메탄올을 가해 원심분리하여 침전물을 에탄올로 세척한 후 감압건조하여 G1(2.1g)을 얻었다. 상등액(400ml)에 에탄올 400ml을 가해 원심분리한 후 얻어진 침전물을 감압건조하여 G2(0.42)을 얻었으며, G2를 제거하고 남은 상등액 800ml에 다시 에탄올 800ml를 가해 얻어진 침전물을 감압건조하여 G3(1.1g)를 얻었다. G1(2.1g)을 물에 용해시켜 세파덱스 지-100(Sephadex G-100)에 적용시켜 물로 용출하였다. 튜브 No.5-33의 분획물을 동결건조하여 G4(1.5g)을 얻었으며 튜브 No.34-44의 분획물을 합한 G5(0.3g)를 감압건조하여 분리하였다. G4를 물에 다시 용해시켜 0.15M 세타브론(Catavelon; Cethyl-trimethyl ammonium bromide)과 0.1M 보레이트 완충액(Borate buffer pH 8.0)이 동량으로 혼합된 용액을 동량 가한후, 0.5M NaOH로 pH를 9.0로 조정하여 침전물(G7)과 상동액(G6)을 취하였다. G7에 2M의 빙초산을 가해 용해시킨 후 3배의 메탄올을 가하여 침전물을 얻었다. 여기에서 얻어진 침전물을 메탄올과 아세톤으로 세척한 후 감압건조하였다 (G8). G8를 소량의 물에 용해하여 세파로스 씨엘-4B(Sepharose CL-4B)에 적용시킨 후 물로 용출하여 튜브 N0. 25-30에서 C9을 얻었으며, 튜브 No. 31-46에서 G10을 얻었다.

[실험예 1]

[항암실험]

위에서 얻은 분획물의 육종 -180에 대한 활성실험은 아래와 같이 행하였다. 20-25g ICR 웅성 마우스의 복강내에서 일주일 간격으로 이식하며 육종 -180(Sarcoma-180)세포를 실험용 종양세포를 사용하였다. 마우스 복강에서 7일간 배양된 육종 -180 세포를 복수와 함께 취하여 빙냉, 멸균한 식염수를 가하여 4000rpm에서 5분간 원심분리하여 세포침전물을 분리하였다. 분리된 세포를 생리식염수로 3회 세척한 후 1×10⁷세포/ml가 되도록 희석하였다. 이 세포부유액 0.1ml를 마우스 한군을 10마리로 하여 왼쪽 서혜부에 피하이식하였다. 종양세포 이식 후 72시간이 지난 후 연속 10일간 정제된 분획물들인 단백다당류를 투여하였다. 대조군에는 생리식염수를, 처치군에는 생리식염수에 용해시킨 단백다당류를 20㎎/㎏의 농도로 0.1ml씩 투여하였다. 종양세포를 이식한 지 30일째 되는 날 마우스를 치사시키고, 유발된 고형암을 적출한 후 그 중량을 측정하여 평균 종양중량을 구하고 아래식에 의하여 종양저지 백분율을 계산하였다.

이러한 육종 -180을 이용한 항암실험결과는 표 1에 나타난 바와 같이 대조군에 비하여 처치군에서 가장 우수한 효과가 있는 G9를 선택하여 G 009로 칭하였으며 이에 대한 분석은 아래 실험예에서 행하였다.

[표 1]

G 009의 화학적 분석을 위해 총당은 안트론 발색법, 단백질 함량은 로우리(Lowry)등의 방법으로 측정한 후 아미노산, 구성당류를 분석하였고 결과를 표 2,3,4에 나타내었으며 당류분석 크로마토그람은 제1도예, 아미노산 크로마토그람은 제2도에 I.R의 분석은 제3도에 나타냈다. 당류분석을 위한 G.L.C(Shimadzu GC 9A, Japan)사용의 조건 :

[표 2]

[표 3]

아미노산 자동분석(Beckman Sys. 6300, U.S.A) 사용의 분석조건 :

[표 4]

[실험예 2]

[G 009의 투여경로에 따른 항암효과의 변화]

ICR 웅성 마우스 20-25g의 복강내에서 일주일 간격으로 이식하며 계대한 육종 -180 세포를 실험용 종양세포로 사용하였다. 마우스복강내에서 7일간 배양된 육종 -180 세포를 복수와 함께 취하여 빙냉, 멸균한 식염수를 가하여 3000rpm에서 5분간 원심분리하여 세포침전물을 분리하였다. 분리된 세포를 생리식염수로 3회세척한 후 1×10⁷세포/ml가 되도록 희석하였다. 이 세포현탁액을 마우스 한군을 10마리로 하여 1×10⁷세포/0.1m을 이식한 후 24시간이 지난 뒤 격일제로 10회, 근육, 피하 및 복강주사는 20㎎/㎏를, 정맥주사는 격일제로 5회를 10㎎/㎏로 투여하였으며 대조군도 같은 방법으로 생리식염수 0.1ml씩 투여하여 30일 경과 후 고형암 무게를 측정하여 비교하였다. 표 5에 나타난 바와 같이 모든 투여방법에서 차이가 거의 없이 고형암의 성장을 억제시켰다.

[표 5]

[실험예 3]

[G 009의 투여에 의산 수명연장 효과]

마우스 생체내에서 G 009의 항암활성을 측정하기 위해 에르리히 카시노마 세포(Ehrlich ascite tumors : EAT)를 사용하였다. EAT세포를 1×10⁶, 5×10⁷세포/ml를 마우스 복강주사하여 이식하고 24시간이 경과한 후 G 009를 인산완충염 용액에 용해시켜 100㎎/㎏의 투여량으로 12일간 연속하여 복강, 경구투여 하였으며, 20일, 25일, 30일 40일 50일의 평균수명을 측정하였다. 대조군은 생리식염수를 동량, 동시 투여하여였다. 표6에 나타난 바와 같이 G 009의 복강투여와 정맥투여가 비슷한 수준의 항암 효과를 나타냈으며 대조군 보다 현저한 수명연장효과를 가져왔다.

[표 6]

[실험예 4]

[트립판 블루(Trypan Blue) 처리한 마우스에서 G 009의 항암효과]

ICR 웅성 마우스 20-25g의 복강내에서 일주일 간격으로 이식하며 계대한 육종 -180 세포를 종양세포로 사용하였다. 마우스복강내에서 7일간 배양된 육종 -180 세포를 복수와 함께 취하여 빙냉, 멸균한 식염수를 가하여 4000rpm에서 5분간 원심분리하여 세포침전물을 분리하였다. 분리된 세포를 생리식염수로 3회세척한 후 1×10⁷세포/ml가 되도록 희석하여 0.1ml씩 마우스 서혜부에 피하주사하였다. 1일이 경과한 후 4㎎/mouse(0.4ml)의 trypan blue를 복강투여하였다. 다시 1일 경과 후 1회에 1㎎/mouse(0.1ml)으로 3일 간격으로 총 13㎎/mouse가 되도록 트립판 블루를 피하주사하며, 트립판 블루의 투여직 후 G 009 10㎎/㎏을 정맥주사하였다. 대조군은 G 009 투여대신 생리식염수로 주사하며 처치군과 대조군의 마우스 수는 각각 10마리로 하였다. 종양이식 30일 경과 후 마우스를 치사시키고 종양의 무게를 측정하였다. G 009에 대한 트립판 블루처리 효과에 대한 위의 실험결과는 표 7과 같으며 이러한 실험결과는 대식세포 불활성화인자인 트립판 블루를 처리하므로서 본 발명의 추출 성분인 G 009가 항암효과와 관련이 있는 대식세포를 활성화시켜줌을 알 수 있으며 또한 G 009가 T-임파구의 항암활성과 더불어 대식세포의 기능을 활성화 시켜주무로서 항암효과를 나타내는 것으로서 보인다.

[표 5]

[실험예 5]

[신생 마우스의 흉선절제 후 G 009 투여와 항흉선 글로블린 처리시 효과]

2일령 ICR 마우스의 흉선절제는 스조딘(Sjodin)의 방법으로 시행하였으며 흉선절제 6주후에 마우스 서혜부에 육종-180를 1×10⁷세포/ml의 세포현탁액을 0.1ml씩 이식하였다. 이식 24시간 후 격일 간격으로 10회 20㎎/㎏의 투여량으로 G 009를 근육주사하였다. 흉선절제된 마우스의 감염방지를 위해 실험 기간중 테트라사이크린-HCl(Tetracycline-HCl) 포함된 급수를 하여주었다. 항흉선혈청의 분리는 Tadakuma 방법을 사용하였는 바 2-3주령의 마우스에서 흉선을 절제하여 흉선세포를 분리한 다음 인산완충염용액에 희석하여 세포현탁액으로 만든 다음 1×10⁶세포/ml 흉선세포를 3주 간격으로 3회 토끼에 정맥주사하여 면역화 시켰다. 최종 주사 후 1주일이 지난 뒤 항융선혈청을 취하여 56℃에서 30분 불활성화 시켰다. 이 불활성화된 항흉선혈청에서 1gG(면역 글로블린 G)분획을 암모니움 설페이트로 침전시켜 분리한 후 1×10⁷세포/ml의 육종-180이 접종된 지 1일이 지난 마우스에 10일동안 0.1ml의 투여량으로 복강주사하였으며, G 009는 육종-180이식 1일 후 격일 간격으로 20㎎/㎏의 투여량으로 5회 근육주사하였다. 위의 실험결과가 표 8에 나타난 바와 같이 G 009의 항암효과는 T-세포의 기능과 관련되어 흉선절제된 마우스가 대조군보다 항암효과가 현저히 낮았으며 항흉선글로블린 처리군에서도 정상토끼 글로블린의 슈도(pseudo)-처리군인 대조군 보다 항암효과가 감소됨을 볼 수 있다. 그러므로 이러한 실험결과는 G 009가 T-세포의 기능을 활성화 시키므로서 항암효과를 나타내는 것으로 간주된다.

[표 8]

[실험예 6]

[G 009가 보체계에 미치는 영향]

보체는 기니어 피그(Guinea pig)혈청과 사람의 신선한 혈청을 사용하였으며, 적혈구는 면양적혈구를 사용하였으며 항체는 항 면양 용혈소(Anti Sheep-hemolysin)를 사용하였다. 보체계 활성실험은 아래와 같이 행하였다.

시험관에 150㎕의 젤라틴 베로날 완충액(GVB²⁺)과 시료 50㎕를 가한 다음 여기에 50㎕의 보체(100units/ml)를 첨가하고, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, GVB²⁺를 가하여 보체 농도를 1unit/ml로 조정하였다. 이들 혼합물을 용혈소(Hemolysin; 2MHU/ml)에 감작한 면양적혈구세포(5×10⁶) 2ml씩 첨가하고 GVB²⁺용액으로 조정된 보체혼합물을 1.0, 1,2. 1.6 unit를 각각 가한 후, GVB³⁺용액으로 총량이 5ml의 되게 조정하였다. 37℃에서 60분간 반응시킨 후 2500rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상등액의 흡광도를 541nm에서 측정하였다. 활성도는 대조군과 G 009의 보체소비량(%)이며 표 9에 나타나 바와 같이 G 009의 농도에 비례하여 보체소비량이 증가하였으며, 이러한 결과는 G 009가 면역계의 중요방어기능중의 하나인 보체계 기능을 활성화 시켜주므로서 면역증강작용을 나타내는 것으로 생각할 수 있다.

[표 9]

[실험예 7]

[면역에 관련된 장기중량에 대한 G 009의 효과]

G 009를 10㎎/㎏의 투여량으로 마우스에 정맥주사 한 후 5일 후 폐, 간, 비장을 적출하여 이들의 중량을 측정하였으며, 라이소자임(Lysozyme)인 인삼염 완충용액(pH 6.2)에서 용해시킨 스트렙토코커스 리소데이쿠스(Streptococcus lysodcicus)를 기질로 하여 반응시킨 후 그 활성은 660nm에서 흡광도를 측정하였다.

표10에 나타난 바와 같이 G 009의 처리군에서 비장의 중량과 라이소장임의 활성도가 증가한 이유는 G 009가 대식세포를 활성화 시켜 라이소자임의 활성치가 증가한 것이며, 면역기능에 관련된 비장의 중량이 증가한 것으로 보인다.

[표 10]

[실험 예 8]

[마우스의 용혈반 형성 세포수에 G 009가 미치는 영향]

1) 실험동물로서 20-25g의 웅성 ICR계 마우스 1군을 5마리로 하여, 시료를 20㎎/㎏의 농도로 연속 5일간 복강 주사하였다.

마지막 투여 7일후 면양적혈구를 1×10²세포/ml 농도를 복강 주사하여 면역시킨 후, 면양적혈구 투여 4일 후 비장을 적출하였다.

브렌더(Blender)로 빙냉의 평형 염용액과 함께 분쇄하여 비장 세포를 유리시켰다. 이를 2000rpm에서 5분간 원심분리하여, 상등액을 제거하고, 적혈구를 제거하기 위해 0.83% 염화암모늄용액에 부유시켜 37℃에서 3분간 방치하였다. 다시 원심분리하여 빙냉의 평형염용액에 부유시킨 후, 적혈구 제거 비장 세포수를 혈구계로 측정하였다.

2) 알세르용액(포도당 20.5g, 염화나트륨 4.2g, 구연산나트륨 8.0g을 1L의 증류수에 용해시킨 후 밀리포아여과기(0.45㎛)로 여과하여 사용에 현탁된 면양적혈구를 평형염용액으로 2600rpm에서 5분동안 4회 반복하여 세척하고, 최종 농도가 10%되게 평형염용액에 부유시켰다.

3) 평판접시에 1.5%아가(noble agar, Difco) 10ml을 부어 기저층평판을 만들었다. 다시 0.7% 아가 2ml에 1)의 비장세포 100㎕와 2)의 면양적혈구 10㎕를 혼합한 후, 평판접시에 붓고 균일하게 펴지도록 하였다.

이것을 37℃에서 60분간 감작화 시킨후, 보체로서 흡습된 기니아피그 혈청을 평형염용액에 10배 희석하여 2.5ml씩 가하여 37℃에서 30분간 배양 후, 형성된 용혈반 형성 세포수 및 비장세포 전체중의 용혈반 형성 세포수(PEC/비장)를 계산하여 표시하였다. 표 11에 나타난 결과로 보아 G 009가 전체 비장 세포수 및 용혈반 형성세포수의 현저한 증가원인을 가져오므로 면역증강작용에 관련되어 있음을 알 수 있다.

[표 11]

[실험예 9]

[면역자극작용]

매 그룹당 10마리로 하여 생후 6주된 20-25g의 웅성 ICR계 마우스를 사용하였다. G 009를 생리식염수에 용해시키고 각 농도별 용액 0.2ml를 마우스에 복강내 투여한다. 투여후 24시간에 1ml의 페리칸 드로잉잉크 17블랙(Perikan Drawing Ink 17 Blak, Gunther-Wagner Co.,Ltd에서 제조)과 3%(V/V)의 젤라틴을 함유하는 생리식염수 2ml를 혼합하여 제조한 탄소현탁액 0.2ml를 마우스꼬리에 정맥주사한 후 1, 5, 10 및 15분에 헤파린으로 피복된 헤마토크리트 모세관을 사용하여 안와에서 혈액 0.02ml를 채취하여 즉시 0.1%(V/V)의 탄산나트륨 수용액 1.6ml로 희석 및 용혈시킨다. 이 용액을 675nm에서 비색시키고 식작용지수(K치)를 할페른 등(Halperan et al)의 등식에 의해 측정한다.

대조군은 마우스에 생리식염수 0.2ml를 투여한다.

위 실험에 대한 결과를 표12에 나타내며 G 009의 농도에 비례하여 면역 식작용 지수(K)가 높게 나타났으며 이러한 결과로 보아 G 009가 면역반응에 관여하여 면역 증강작용을 나타내는 것으로 보인다.

[표 12]

[실험예 10]

[G 009에 대한 독성 시험]

G 009에 대한 급성독성시험은 마우스, 렛, 토끼에 대해 행하였으며 G 009 투여 후 14일째 측정을 하였다.

표 11에 나타난 바와같이 투여경로나 종(species)에 대해서도 치사는 없었으므로 G 009는 독성이 매우 낮은 안전한 물질이다.

[표 13]

[실험예 11]

[균종간 특성 비교]

본 발명자들은 전국 각지역에서 채집된 가노데르마 루시덤(Ganoderma lucidum) 균주의 항암 효과를 검색하여 본 결과 항암효과가 우수하다고 판단되는 4종과 표준균주(농촌진흥청 농업기술연구소 균이과 보유)의 계통간 분류 및 생리 유전적 차이를 규명하고자 아래와 같이 실험을 하였다.

[실험 재료 및 방법]

[사용균주, 배지 및 배양]

본 실험에 사용한 균주는 국내에서 자생하는 영지(Ganoderma lueidum) 중 항암효과가 우수하다고 판단된 4균주를 사용하였으며 수집원은 표12와 같다.

[시료의 추출]

액내배양한 배양물을 원심분리 하여 얻어진 균사체를 인산염 완충염류액(phosphate buffered saline : pH 7.5)에 3회세척한 후 균사체를 빙냉하에 30초간 초음파 처리하였다. 이것을 1200xg에서 원심분리한 후, 상등액을 전기영동 시료로 사용하였다.

[단백질 정량]

시료중의 단백질은 소혈청 알부민(bovin serum alvumin : BSA)를 표준물질로 사용하여 BCA 단백 분석시약(protein assay reagent)(Pierce Co.)를 사용하여 정량하였다.

[전기영동]

전기영동은 불연속 완충계(discontinuous buffer system)을 이용하였다. 분리 겔(separating gel)은 240mM Tris-Cl 완충액(pH 8.48)에 10% T, 10% C농도로 하였고, 스택 겔(stacking gel)은 Tris 완충용액(39.5mM Tris, 0.064N H₃PO₄, pH 6.9)에 3.125%, T, 20% C농도로 겔을 조제하였다. 겔을 굳히기 위해 TEMED와 암모니움 퍼셀페이트를 사용하였다. 런닝 완충(running buffer)으로 양극에서는 40mM 트리스-글리신 완충액(pH 8.8)을, 음극에서 60nM 트리스-Cl완충액(pH 7.47)을 사용하였으며, 시료는 70㎍씩을 겔에 장전(loading)하여 4℃에서 100V로 2시간 동안 전개하였다.

[겔의 염색]

(1)에스테라제(E.C, 3,1,1,1)

전개된 겔을 0.2M 인산염 완충액(pH6.5)에 30분간 침지하였다. 침지되는 동안 새 완충액으로 3회 교환하여 주었다. 침지가 끝난 겔의 산도를 조정한 후 발색액(α-naphthylacetate 20㎎, ethylene glycolmonomethyl ether 2ml. fast blue RR salt 20㎎, 0.2M phosphate buffer 120ml)을 가하여 어두운 곳에서 35℃로 30분간 서서히 흔들어 주면서 발색 시켰다.

(2)아시드 포스파라제(E.C. 3,1,3,2)

겔을 0.1M초산염 완충액(pH 5.2)에 침지하여 겔내의 산도를 조정한 후, 발색액(10% MgCl₂용액 6ml, fast garnet GBC salt 70㎎, α-naphthlphosphate 80㎎, β-naphthylphosphate 40㎎. 0.1M acetate buffer 100ml)을 가해 37℃에서 30분간 발색 시켰다.

(3) 루신 아미노 펩티다제(E.C.3,4,11,1)

겔에 발색액(L-leycy-β-napthylamide BCl 20㎎, fast black K salt 20㎎, distilling Water 50ml, 0.2M Tris-malate buffer(pH 5.4)120ml)을 가해 어두운 곳에서 30분간 발색 시켰다.

(4) 퍼옥시다아제(E.C.1,11,1,7)

겔을 수세한 후, 발색액(Benzidine 1g, acetic 9ml, mixed solution of 1 part of benzidine solution mized with 40ml of distilled water, 1 part of 0.03%H₂O₂. and parts of distilled water)을 가해 어두운 곳에서 발색시켰다.

이러한 실험결과를 설명하면 아래와 같다.

[에스테라제의 동위 효소 패턴(pattern)]

영지의 에스테라제 밴드(esterase band)는 제1도에서와 같이 모두 17개가 나타났는데, 5와 15번째 밴드는 모든 규주에서 거의 공통적으로 보였다. 표준균주인 Fr 07004와 Fr 07008 및 IY 005균주의 에스테라제 패턴은 매우 유사하였으나, IY 009와 IY 010균주의 에스테라에 패턴은 다른 균주와 많은 차이가 있음을 알 수 있었다.

[아시드 포스포타제의 동위효소 패턴]

제5도에 나타난 바와 같이 표준균주 Fr 07004, Fr07008 및 IY 005 균주의 아시드 포스포타제 패턴간에는 매우 유사한 양상을 나타내었으나, IY 009와 IY 010의 경우는 다른 균주와는 상이한 밴드 패턴을 보였다.

[루신 아미노 펩티디아제 동위효소 패턴]

영지에서는 모두 3개의 루신 아미노 팹티디아제 밴드가 나타났으며, 이중표준균주인 Fr 07004, Fr 07008 및 IY 005는 대부분 동일한 양상을 나타냈으나, IY 009는 이들과는 전혀 다른 양상을 나타내었다(제5도).

[퍼옥시디아제의 동위효소 패턴]

영지균주에서는 2개의 퍼옥시디아제 밴드가 나타났으며, 표준균주인 Fr 07004, Fr 07008 및 IY 005 사이에는 유연관계가 많았다(제5도).

[균종간의 유연관계]

표 14에 나타난 바와 같이 영지의 표준균주인 Fr 07008과 IY 005 사이에는 93.8%, Fr 07004와 IY 005는 82.4%의 높은 유연관계를 보이고 있으나, Fr 07004와 IY 010 및 Fr 07004와 IY 009는 각각 30.45와 31.8%의 비교적 낮은 유연관계를 보였다.

이상과 같은 결과들로부터 동일종내의 동위효소 패턴의 차이는 지리적인 환경차이에 따른 유전적 변이에 의해 생화학적 변화를 유발시킴로서 나타남을 알 수 있었으며, 이러한 차이가 균주마다 항암활성이 다른 단백다당제를 생성하는 것과 관련이 있는 것으로 보인다.

[표 14]

[표 15]

Claims

가노데르마 루시덤을 배양하고 이로부터 분리된, 당성분으로 베타-글루코스, 알파-글루코스, 갈락토오스, 알파-만노오스, 프룩토오스를 함유하고 단백성분으로서 글라이신, 라이신, 알라닌, 히스티딘, 아르기닌, 바린, 아스파르틱애시드, 트레오닌, 이소로이신, 세린, 로이신, 글루타믹 애시드, 타이로신, 프롤린, 페닐알라닌, 메치오닌, 함유하고, 항종양 면역 증강효과를 가지는 단백 다당체(G 009)를 생성하는 균주, 가노데르마루시덤(Ganodermer lucidum)IY 009.