KR930002830B1 - 항종양 면역증강효과가 있는 단백다당체(s 818) - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

항종양 면역증강효과가 있는 단백다당체(S 818)

제 1 도는 본 발명 단백다당류 S 818의 당류 분석 크로마토그람.

제 2 도는 본 발명 단백다당류 S 818의 아미노산 크로마토그람.

제 3 도는 본 발명 단백다당류 S 818의 I.R 분석도.

제 4 도는 본 발명 균주 IY 818 균사체의 현미경 사진이다.

본 발명은 항종양 면역증강효과가 있는 단백다당체에 관한 것이다.

본 발명자들은 새로운 항종양, 면역중강효과가 있는 단백다당체의 탐색을 목적으로 다수의 담자균류를 각 지역별로 채집하여, 그 담자균류가 생성하는 단백다당체의 분리를 시도하였다. 그 결과 전라남도 해남군 두륜산 일대에서 채집한 쉬조필럼(Schizophyllum)속에 속하는 담자균류를 적당한 배지에서 배양하면, 항종양 및 면역증강 효과가 있는 단백다당체를 생성하는 것을 발견하였다. 생성된 단백다당체를 분리하고 그 이화학적 성질 및 생물학적 성질을 검토하였던 바, 이것을 항종양, 면역증강효과가 있는 단백다당체 S 818로 명명하였으며, 이를 생성하는 균주를 쉬조필럼 콤순(Schizophyllum commune) IY 818(한국 종균 헙회 기탁번호 KFCC-10710호; 1990년 10월 5일자 기탁)로 명명하였다. 고등균에 속하는 담자균류로 부터 약효 성분인 항균성분, 환각성분, 독성분, 콜레스테롤 강하성분 등에 의하여 연구되어 왔으나 최근에 와서 항암 성분과 면역기능 증강작용의 연구가 활발히 진행되고 있어 담자균류의 중요성이 높아 지고 있다. 이에 본 발명자들은 항암 성분 및 면역기능 증강작용이 있는 물질을 분비하는 균주를 분리 액내배양하여 그 약리효 과를 연구하던 중 지금까지 분리 동정된 쉬조필럼 속의 종(species)보다는 탁월한 항암효과 및 면역증강 작용을 갖는 변종의 균주를 분리하였으며 균사체의 액내배양방법을 확립하고 이 배양된 균사체로 부터 추출한 성분의 항암효과 및 면역증강 효과를 확인하였다. 이에 대하여 본 발명자들은 다음의 실시예 및 실험예로 본 발명을 설명한다.

[실시예]

단백다당체의 분리

1) 균주 : 쉬조필럼 콤순 균주는 전남 해남군 두륜산 일대에서 채집하여 분리, 동정하였다.

2) 보존배지 : 감자 덱스트로스 한천(Potato dextrose agar , PDA) 경사 배지 , 감자 덱스트로스 배지 (Difco, U.S.A.) 39g을 증류수에 녹여 1L로 하고, 12℃에서 20분간 고압멸균 후 경사 배지로 만들었다.

액내배양용 배지 ; 포도당 50%, 펩톤 20g, KH₂PO₄, 0.878, MgSO₄, 7H₂O 0.5g, FeCl₂,, 6H₂O 10mg, MnCl₂, 4H₂O, 7mg, CuSO₄. 5H₂O 10mg, ZnCl₂4mg, CuSO₄. 5H₂O 1mg에 증류수를 가해 1L로 하였다. 이의 pH를 5.5으로 조정하여 12℃, 20분간 고압증기 멸균하였다.

3) 배양 : 보관중인 균주를 PDA 경사배지에서 이식하여 25±1℃에 7일간 성장시킨 후 발육된 균사를 무균적으로 분리하여 액내배양용 배지 100ml에 넣고 15초간 미세분쇄기(Microblender)로 분쇄하였다. 이를 500ml용 삼각플라스크에 옮기고 25±1℃에서 180rpm으로 균사체가 직경 5mm 정도의 성숙한 균괴를 이룰 때까지 10일간 진탕배양 하였다. 얻어진 균괴를 미세분쇄기로 10초간 분쇄한 후, 액내배양용 배지 100ml가 든 500ml용 삼각플라스크에 5%(v/v)씩 접종하고 상기 조건과 동일한 조건으로 10일간 진탕 배양하였다. 얻어진 균사 배양물을 다시 10초간 분쇄하여 종균으로 하고 액내배양용 배지 100ml을 500ml용 삼각플라스크에 넣고 종균을 5%(v/v)의 농도로 접종하였다. 25±1℃의 온도에서 오비탈진탕배양기(회전반경 1인치 비전과학 Co.)에서 170회전/분으로 7일간 진탕배양 하였다.

4) 단백다당류의 추출 및 분리

배양이 끝난 배양액 전체를 6000rpm에서 15분간 원심분리한 후 균사체만을 취하여 2배의 2.5N NaOH 용액에 침윤시킨 다음 실온에서 24시간 방치하여 6000rpm에서 15분간 원심분리하였으며, 상등액을 취하여 빙초산으로 pH 7.4로 중화시킨 후, 비스킹 튜브(Visking tube . Sigma, U.S.A.)를 이용하여 3일 동안 투석시켰다. 투석이 끝난 후 농축하여 3배의 에탄올을 가해 4℃에서 24시간 방치한 후 6000회전에서 15분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 탈이온수에 용해시켜 6000회전에서 15분간 원심분리하여 상등액을 농축하고, 동결건조시켜 단백다당류를 분리하였다.

5) 단백다당류의 정제

상기의 시료를 물에 용해시켜 과량의 에탄올을 가한 후 얻어진 침전물 15.5g을 취하여 물에 다시 용해시켰다. 이 시료용액을 디이에이-셀루로스(DEAE-Cellulose, Cl-form) Column(3cm×60cm)에 적용시킨 후 물로 용출시켜 얻어진 용출분획 200ml에 동량의 메탄올을 가해 원심분리하여 침전물을 에탄올로 세척한 후 감압건조하여 S1(4.1g)을 얻었다. 상등액(400ml)은 에탄올 400ml를 가해 원심분리한 후 얻어진 침전물을 감압건조하여 S2(0.82g)를 얻었으며 S2를 제거하고 남은 상등액 800ml에 다시 에탄올 800ml를 가해 얻어진 침전물을 감압건조하여 S3(3.2g)를 얻었다. S1(4.1g)을 물에 용해시켜 세파덱스 지-100(Sephadex G-100)에 적용시켜 물로 용출하였다. 튜브 No. 30-38의 분획물을 동결건조하여 S4(2.6g)를 얻었으며 튜브 No.39-49의 분획물을 합한 S5(7.8g)를 감압건조하여 분리하였다. S4를 물에 다시 용해시켜 0.15M 세타브론(Cetavelon , Cethyltrimethyl ammonium brumide)과 0.1 M 보레이트 완충액(Borate buffer pH 8.0)이 동량으로 혼합된 용액을 동량 가한 후, 0.5M NaOH로 pH를 9.0로 조정하여 침전물(S7)과 상등액 (S6)을 취하였다. S7에 2M의 빙초산을 가해 용해시킨 후 3배의 메탄올를 가하여 침전물을 얻었다. 여기에서 얻어진 침전물을 메탄올과 아세톤으로 세척한 후 감압건조하였다(S8). S8를 소량의 물에 용해하여 세파로스 씨엘-4B(Sepharose CL-48)에 적용시킨 후 물로 용출하여 튜브 No. 27-32에수 S8을 얻었으며, 튜브 No. 32-49에서 S10을 얻었다.

[실험예 1]

항암실험

위에서 얻은 분획물의 육종-180에 대한 활성실험은 아래와 같이 행하였다. 20-25g ICR 웅성 마우스의 복강내에서 일주일 간격으로 이식하며 계대한 육종-180(Sarcoma-180)세포를 실험용 종양세포를 사용하였다. 마우스 복강에서 7일간 배양된 육종-180 세포를 복수와 함께 취하여 빙냉, 멸균한 식염수를 가하여 4000rpm에서 5분간 원심분리하여 세포침전물을 분리하였다. 분리된 세포를 생리식염수로 3회 세척한 후 1×107 세포/ml가 되도록 희석하였다.

이 세포부유액 0.1ml를 마우스 한군을 10마리로 하여 왼쪽 서혜부에 피하이식하였다. 종양세포 이식 후 72시간이 지난 후 연속 10일간 정제된 분획물들인 단백다당류를 투여하였다. 대조군에는 생리식염수를, 처치군에는 생리식염수에 용해시킨 단백다당류를 20m/kg의 농도로 0.1ml씩 투여하였다. 종양세포를 이식한 지 30일째 되는 날 마우스를 치사시키고, 유발된 고형암을 적출한 후 그 중량을 측정하여 평균 종양중량을 구하고 아래 식에 의하여 종양저지 백분율을 계산하였다.

저지백분율 (I. R ％) ="" ×100

I. R : Percent Inhibtion Ratio

Cw : 대조군의 평균종양무게

Tw : 처치군의 평균종양무게

이러한 육종-180을 이용한 항암실험결과는 표 1에 나타난 바와 같이 대조군에 비하여 처치군에서 가장 우수한 효과가 있는 S9을 선택하여 S 818로 칭하였으며 이에 대한 분석은 아래 실험 예에서 행하였다.

[표 1]

S 818의 화학적 분석을 위해 총당은 안트론 발색법, 단백질 함량은 로우리(Lowry) 등의 방법으로 측정한 후 아미노산, 구성 당류를 분석하였고 결과를 표 2,3,4에 나타내었으며 당류 분석 크로마토그람은 제 1 도에. 아미노산 크로마토그람은 제 2도에, I.R의 분석은 제 3도에 나타내었다.

당류 분석을 위한 G.L.C(Shimadzu GC 9A. Japan)사용의 조건 :

Culunln 3% OV-17(80-100) (Mesh shimalite)

3mmø×1 Boronsilicate glass column

Temperature Clumn 150-l8O℃ Gradient, Detector 190℃

Flow rate N2 : 50ml/min

H2 : 60ml/min. (0.6kg/㎠)

Air : 60m1/min. (0,6kg/㎠)

Attenuation 10²×2¹a.f.s(ampere full scale)

[표 2]

[표 3]

아미노산 자동분석기(Beokman Sys. 6300, U.S.A.)사용의 분석조건 :

Column 2.6×200mm

Ion exchange resin #338076(Beokman)

Flow rate Buffer solution 0.33ml/min

Ninhydrin 0.17ml/min

Analysis cycle time 60min

Column pressure 2100psi(147kg/㎠)

Ninhydrin pressure 100psi(7kg/㎠)

Column temperature 50-70℃ Grdient

N₂gas pressure 40psi(2.8kg/㎠)

Reaction bath temperature 130℃

Wave length 570nm,440nm

[표 4]

[실험예 2]

S 818의 투여경로에 따른 항암효과의 변화

ICR 웅성 마우스 20-25g의 복강내에서 일주일 간격으로 이식하며 계대한 육종-180 세포를 실험용 종양 세포로 사용하였다. 마우스복강에서 7일간 배양된 육종-180 세포를 복수와 함께 취하여 빙냉, 멸균한 식염수를 가하여 3000rpm에서 5분간 원심분리하여 세포침전물을 분리하였다. 분리된 세포를 생리식염수로 3회 세칙한 후 1×10⁷세포/ml가 되도록 희석 하였다. 이 세포현탁액을 마우스 한군을 10마리로 하여 I×10⁶세포/0.1ml을 이식한 후 24시간이 지난 뒤 격일제로 10회, 근육, 피하 및 복강 주사는 20mg/kg를, 정맥주사는 격일제로 5회를 10mg/kg로 투여하였으며 대조군도 같은 방법으로 생리식염수 0.1ml씩 투여하여 30일 경과 후 고형암 무게를 측정하여 비교하였다.

표 5에 나타난 바와 같이 모든 투여방법에서 차이가 거의 없이 고형암의 성장을 억제시켰다.

[표 5]

[실험예 3]

S 818의 투여에 의한 수명연장효과

마우스 생체내에서 S 818의 항암활성을 측정하기위해 에르리히카시노마 세포(Ehrlich ascite tumors : EAT)를 사용하였다. EAT 세포를 1×10⁸, 5×10⁷세포/ml를 마우스에 복강 주사하여 이식하고 24시간이 경과한 후 S 818를 인산완충염용액에 용해시켜 100mg/kg의 투여량으로 12일간 연속하여 복강, 경구투여하였으며 20일, 25일, 30일, 40일, 50일의 평균수명을 측정하였다. 대조군은 생리식염수를 동량, 동시 투여하였다. 표 6에서 나타난 바와 같이 S 818의 복강투여와 정맥투여가 비슷한 수준의 항암효과를 나타냈으며 대조군 보다 현저한 수명연장효과를 가져왔다.

[표 6]

[실험예 4]

[트립판 블루(Trypan Blue) 처리한 마우스에서 S 818의 항암효과]

ICR 웅성 마우스 20-25g의 복강내에서 일주일 간격으로 이식하며 계대한 육종-180 세포를 실험용 종양 세포로 사용하였다.

마우스복강에서 7일간 배양된 육종-180 세포를 복수와 함께 취하여 빙냉, 멸균한 식염수를 가하여 4000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포침전물을 분리하였다. 분리된 세포를 생리식염수로 3회 세척한 후 1×10⁷세포/ml이 되도록 희석하여 0.1ml씩 마우스 서혜부에 피하주사하였다.

1일 경과한 후 4mg/mouse(0.4ml)의 트립판 블루를 복강투여하였다. 다시 1일 경과 후 1회에 1mg/ mouse(0.1ml)으로 3일간 간격으로 총 13mg/마우스가 되도록 트립판 블루를 피하주사하며, 트립판 블루의 투여 직후 S 818 10mg/kg을 정맥주사하였다. 대조군은 S 818 투여대신 생리식염수로 주사하며 처치군과 대조군의 마우스 수는 각각 10마리로 하였다.

종양이식 30일 경과 후 마우스를 치사시키고 종양의 무게를 측정하였다. S 818에 대한 트립판 블루처리 효과에 대한 위의 실험결과는 표 7과 같으며 이러 실험결과는 대식세포 불활성화 인자인 트립판 블루를 처리하므로서 본 발명의 추출 성분인 S 818이 항암효과와 관련이 있는 대식세포를 활성화 시켜줌을 알 수 있으며 또한 S 818가 T-임파구의 항암활성과 더불어 대식세포의 기능을 활성화 시켜주므로서 항암효과를 나타내는 것으로서 보인다.

[표 7]

[실험예 5]

[신생 마우스의 흉선절제 후 S 818 투여와 항흉선 글로블린 처리시 효과]

2일령 ICR 마우스의 흉선젤제는 스조된(Sjodin)의 방법으로서 시행하였으며 흉선절제 6주후에 마우스 서 혜부에 육종-180를 1×10⁷세포/ml의 세포현탁액을 0,1ml씩 이식하였다. 이식 24시간 후 격일 간격으로 10회 20mg/kg의 투여량으로 S 818를 근육주사 하였다. 흉선절제된 마우스의 감염방지를 위해 실험기간중 태트라사이크린-HCl(Tetracycline-HCl) 포함된 급수를 하여주었다.

항흉선혈청의 분리는 Tadakuma 방법을 사용하였는 바 2-3주령의 마우스에서 흉선을 절제하여 흉선세포를 분리한 다음 인산완충염용액에 희석하여 세포현탁액으로 만든 다음 1×10³세포/ml 흉선세포를 3주 간격으로 3회 토끼에 정맥주사 하여 면역화시켰다. 최종 주사 후 1주일이 지난 뒤 항흉선혈청을 취하여 56℃에서 30분 불활성화 시켰다. 이 불활성화된 항흉선혈청에서 IgG(면역 글로블린 G)분획을 암모니움 설 페이트로 침전시켜 분리한 후 1×10⁷세포/ml의 육종-180이 접종된 지 1일이 지난 마우스에 10일동안 0.1 ml의 투여량으로 복강 주사하였으며, S 818는 육종-180 이식 1일 후 격일 간격으로 20mg/kg의 투여량으로 5회 근육주사하였다.

위의 실험결과가 표 8에 나타난 바와 같이 S 818의 항암효과는 T-세포의 기능과 관련되어 흉선절제된 마우스가 대조군보다 항암효과가 현저히 낮았으며 항흉선글로블린 처리군에서도 정상토끼 글로블린의 슈도 (pseudo)-처리군인 대조군 보다 항암효과가 감소됨을 볼 수 있다. 그러므로 이러한 실험결과는 S 818가 T-세포의 기능을 활성화 시키므로서 항암효과를 나타내는 것으로 간주된다.

[표 8]

N.M : 정상 마우스 171

T.M : 흉선절제 마우스

A.T.M. : 항흉선 글로블린처리 마우스

N.R.G.M : 정상토끼 글로블린처리 마우스

[실험예 6]

[S 818가 보체계에 미치는 영향]

보체는 기니어 피그(Guinea pig)혈청과 사람의 신선한 혈청을 사용하였으며, 적혈구는 면양적혈구를 사용하였으며 항체는 항 면양 용혈소(Antisheep-hemolysin)를 사용하였다. 보체계 활성시험은 아래와 행하였다.

시험관에 150㎕의 젤라틴 베로날 완충액 (GVB²⁺)과 시료 50㎕를 가한 다음 여기에 50㎕의 보체(100 units/ml)를 첨가하고, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, GVB²⁺를 가하여 보체 농도를 1 unit/ml로 조정하였다. 이들 혼합물을 용혈소(Hemolysin , 2MHU/ml)에 감작한 면양적혈구세포(5×10⁶) 2ml씩 첨가하고 GVB²⁺용액으로 조정된 보체혼합물을 1.0, 1.2, 1.6unit를 각각 가한 후, GVB²⁺용액으로 총량이 5ml 되게 조정하였다. 37℃에서 60분간 반응시킨 후 2500rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상등액의 흡광도를 541nm에서 측정하였다.

활성도는 대조군과 S 818의 보체소비량(%)이며 표 9에 나타난 바와 같이 S 818의 농도에 비례하여 보체 소비량이 증가하였으며, 이러한 결과는 S 818가 면역계의 중요방어기능중의 하나인 보체계 기능을 활성화 시켜주므로서 면역증강작용을 나타내는 것으로 생각할 수 있다.

[표 9]

[실험예 7]

면역에 관련된 장기중량에 대한 S 818의 효과

S 818를 10mg/kg의 투여량으로 마우스에 정맥주사 한 후 5일 후 폐, 간, 비장을 적출하여 이들의 중량을 측정하였으며, 라이소자임(Lysozyme)은 인산염완충용액(pH 6.2)에서 용해시킨 스트렙토코커스 리소데이쿠스(Streptococcus lysodeicus)를 기질로 하여 반응시킨 후 그 활성은 660nm에서 흡광도로 측정하였다.

표 10에서 나타난 바와 같이 S 818의 처리군에서 비장의 중량과 라이소자임의 활성도가 증가한 이유는 S 818가 대식세포를 활성화 시켜 라이소자임의 활성치가 중가한 것이며, 면역기능에 관련된 비장의 중량이 증가한 것으로 보인다.

[표 10]

[실험예 8]

마우스의 용혈반 형성세포수에 S 818이 미치는 영향

1) 실험동물로서 20-25g의 웅성 ICR계 마우스 1군을 5마리로 하여, 시료를 20mg/kg의 농도로 연속 5 일간 복강 주사하였다. 마지막 투여 7일 후 면양적혈구를 1×108 세포/ml 농도를 복강 주사하여 면역시킨 후, 면양적혈구 투여 4일 후 비장을 적출하였다.

브렌더(blender)로 빙냉의 평형 염용액과 함께 분쇄하여 비장세포를 유리시켰다. 이를 2000rpm에서 5분 간 원심분리하여, 상등액을 제거하고, 적혈구를 제거하기위해 0.83% 염화암모늄용액에 부유시켜 37℃에서 3분간 방치하였다. 다시 원심분리하여 빙냉의 평형염용액에 부유시킨 후, 적혈구 제거 비장 세포수를 혈구 계로 측정하였다.

2) 알세르용액[포도당 20.5g. 염화나트륨 4.2g, 구연산나트륨 8.Og을 1L의 증류수에 용해시킨 후 밀리포 아여과기(0.45㎛)로 여과하여 사용]에 현탁된 면양 적혈구를 평형염용액으로 2000rpm에서 5분동안 4회 반복하여 세척하고, 최종농도가 10% 되게 평형염용액에 부유시켰다.

3) 평판접시에 1.5% 아가(Noble agar, Difco.) 10㎖을 부어 기저층평판을 만들었다. 다시 0 7% 아가 2㎖에 1)의 비장세포 100㎕와 2)의 면양적혈구 100㎕를 혼합한 후, 평판접시에 붓고 균일하게 퍼지도록 하 였다. 이것을 37℃에서 60분간 감작화 시킨 후, 보체로서 흡습된 기니아피그 혈청을 평형염용액에 10배 희석하여 2.5㎖씩 가하여 37℃에서 30분간 배양 후, 형성된 용혈반 형성 세포술 및 비장세포 전체중의 용혈 반 형성 세포수(PEC/비장)를 계산하여 표시하였다. 표 11에 나타난 결과로 보아 S 818이 전체 비장세포수 및 용혈반 형성세포수의 현저한 증가원인을 가져오므로 면역증강작용에 관련되어 있음을 알 수 있다.

[표 11]

[실험예 9]

[면역 자극작용]

매 그룹당 10마리로 하여 생후 6주된 20-25g의 웅성 ICR계 마우스를 사용하였다. S 818를 생리식염수에 용해시키고 각 농도별 용액 0.2㎖를 마우스에 복강내 투여한다. 투여후 24시간에 1㎖의 페리칸 드로잉 잉크 17블랙(Perikan Drawing Ink 17 Blak, Gunther-Wagner Co., Ltd.에서 제조)과 3％(v/v)의 젤라틴을 함유하는 생리식염수 2㎖를 혼합하여 제조한 탄소현탁액 0.2㎖를 마우스꼬리에 정맥주사한 후 1, 5, 10 및 15분에 헤파린으로 피복된 헤마토크리트 모세관을 사용하여 안와에서 혈액 0.02㎖를 채취하여 즉시 0.1%(v/v)의 탄산나트륨 수용액 1.6㎖로 희석 및 용혈시긴다. 이 용액을 675nm에서 비색시키고 식작용 지수(K치)를 할페른 등(Halpern et al)의 등식에 의해 측정하다.

대조군은 마우스에 생리식염수로 0.2㎖를 투여한다.

상기식에서

C0=t0 시간에서의 혈액중의 탄소분말함량이고

C =t 시간에서 혈액중의 탄소분말함량이다.

위 실험에 대한 결과를 표 12에 나타내며 S 818의 농도에 비례하여 면역 식작용 지수(K)가 높게 나타났으며 이러한 결과로 보아 S 818이 면역반응에 관여하여 면역 증강작용을 나타내는 것으로 보인다.

[표 12]

[실험예 10]

[S 818에 대한 독성시험]

S 818에 대한 급성독성시험은 마우스, 렛, 토끼에 대해 행하였으며 S 818 투여 후 14일째 측정을 하였다.

표 11에 나타난 바와 같이 투여경로나 종(species)에 대해서도 치사는 없었으므로 S 818은 독성이 매우 낮은 안전한 물질이다.

[표 11]

[실험예 11]

[균종간 특성 비교]

본 발명자들은 전국 각지역에서 채집된 쉬조필럼 콤순(Schizophyllum commune) 균주의 항암효과를 검색하여 본 결과 항암효과가 우수하다고 판단되는 4종과 표준 균주(농촌진흥청 농업기술연구소 균이과 보유) 의 계통간 분류 및 생리 유전적 차이를 규명하고자 아래와 같은 실험을 하였다.

[실험재료 및 방법]

[사용균주, 배지 및 배양]

본 실험에 사용한 균주는 국내에서 자생하는 채집된 쉬조필럼 콤순중 항암효과가 우수하다고 판단되는 4 균주를 사용하였으며 수집원은 표 12와 같다.

[시료의 추출]

액내배양한 배양물을 원심분리 하여 얻어진 균사체를 인산염 완충 용액(pH 7.5)에 3회 세척한 후 균사체를 빙냉하에 30초간 초음파 처리하였다. 이것을 12000xg에서 원심분리한 후, 상등액을 전기영동 시료로 사용하였다.

[단백질 정량]

시료중의 단백질은 소의 실험 알부민(BSA)를 표준 물질로 사용하여 BCA 단백질 검정 시약(Pierce Co.)를 사용하여 정량하였다.

[전기영동]

전기영동은 불연속 완충 시스템을 이용하였다. 분리 겔은 240mM Tris-Cl 완충용액(pH 8.48)에 10% T, 10% C 농도로 하였고, 스택 겔은 Tris 완충용액(39.5mM Tris, 0.064N H₃P₄, pH 6.9)에 3.125% T, 20% C 농도로 겔을 조제 하였다. 겔을 굳히기 위해 TEMED와 암모니움 퍼설페이트를 사용하였다. 런닝 완충(running buffer)으로 양극에는 40mM 트리스-글리신 완충액(pH 8.8)을, 음극에는 60mM 트리 스-Cl 완충액(pH 7.47)을 사용하였으며, 시료는 70㎍씩을 겔에 loading하여 4℃에서 100볼트로 2시간 동안 전개하였다.

[겔의 염색]

(1) 에스테라제(E.C.3, 1, 1, 1)

전개된 겔을 0.2M 인산염 완충액(pH 6.5)에 30분간 침지하였다. 침지되는 동안 새 완충액으로 3회 교반하여 주었다. 침지가 끝난 겔의 산도를 조정한 후, 발색액(α-naphthylacetate 20mg, ethylene glycol monomethyl ether 2㎖, fast blue RR salt 20mg, 0.2M phophate buffer 120㎖)을 가하여 어두운 곳에서 35℃로 30분간 서서히 흔들어 주면서 발색시켰다.

(2) 아시드 포스파라제(E.C. 3,1,3,2)

겔을 0.1M 초산염 완충액(pH 5.2)에 침지하여 겔내의 산도를 조정한 후, 발색액(10% MgCl, 용액 6 ㎖, fast garnet GBC salt 70㎎, α-naphthy1-phosphate 80㎎. β-naphthy1phosphate 40㎎, 0.1M acetate buffer 100㎖)을 가해 37℃에서 30분간 발색 시켰다.

(3) 루신 아미노 펩티다제(E.C.3,4,11,1)

겔에 발색액[L-leucy1-β-naphthylamide HCl 20mg, fast black K salt 20mg, distilling water 50 ㎖, 0.2M Tris-malate buffer(pH 5.4) 120㎖]을 가해 어두운 곳에서 30분간 발색 시켰다.

(4) 퍼옥시다아제(e.C.1,11,1,7)

겔을 수세한 후, 발색액(benzidine 1g, acetic acid 9㎖, mixed solution of 1 part of benzidine solution mixed with 40㎖ of distilled water, 1 part of 0.03% H₂O₂and 4 parts of distilled water)을 가해 어두운 곳에서 발색 시켰다.

이러한 실험결과를 설명하면 아래와 같다.

[에스테라제의 동위 효소 패턴]

제 5도에 나타난 바와 같이 쉬조필럼 콤순 균종들의 에스테라제 밴드는 모두 11개로, 2번째 및 8번째 밴드가 공통적으로 나타났음을 알 수 있었다.

[아시드 포스포타제의 동위효소 패턴]

또한 아시드 포스파타제 패턴의 경우는 총 2개의 밴드중 1번째 밴드가 공통적으로 나타나 높은 유사성을 보였다. (제 5 도)

[퍼옥시다아제의 동위효소 패턴]

퍼옥시다아제의 경우는 3개의 밴드가 보였으며, IY 805, IY 806, 및 IY 818간에는 서로 비슷한 양상을 나타냈다. (제 5 도)

[쉬조필럼속 균종간의 유연관계]

표준균주인 Fr 3009와 IY 805가 63.6% 정도의 유연관계를 나타냈으며, IY 805, IY 806 및 IY 818 사이 에는 40%의 유연관계를 보였다. 다른 균주간의 유연관계도 대부분 40% 정도로 낮은 유연관계를 나타냈다. (제 5 도)

이상과 같은 결과들로 부터 동일종내의 등위효소 패턴의 차이는 지리적인 환경차이에 따른 유전적 변이에 의해 생화학적 변화를 유발시킴으로서 나타남을 알 수 있었으며, 이러한 차이가 균주마다 항암활성이 다른 단백다당체를 생성하는 것과 관련이 있는 것으로 보인다.

[표 12]

[표 13]

Claims (1)

1. 쉬조필럼 콤순 IY 818(KFCC-10710)을 배양하고 이로부터 분리된, 당성분으로 알파-글루코스, 베타- 글로코스, 프록토오스, 크실로오스를 함유하고 단백성분으로서 글라이신, 라이신, 알라닌, 히스티닌, 아르기닌, 바린, 아스파르틱 애시드, 트레오닌, 이소로이신, 세린, 로이신, 글루타믹 애시드, 타이로신, 프롤린, 페닐알라닌, 메치오닌을 함유하고, 항종양 면역 중강효과를 가지는 단백다당체(S 818).