KR920002165B1 - 개선된 백신 및 제조방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
[발명의 명칭]
개선된 백신 및 제조방법
[도면의 간단한 설명]
제1도는 살모낼라로부터 얻은 편모 단백질에 접합되어 있는 트리니트로 페놀(TNP)로써 면역된 쥐에 있어서의 항체 역치를 설명하는 그래프이다.
제2도는 살모낼라로부터 얻은 편모 단백질에 접합되어 있는 TNP로써 면역된 쥐의 적용량 반응을 설명하는 그래프이다.
제3도는 계란 알부민(hEA)에 접합되어 있는 TNP와 살모낼라로부터 얻은 편모 단백질에 접합되어 있는 TNP로써 면역된 쥐의 면역 반응을 비교하는 그래프이다. 또 이 그래프는 보조제 폴리포트 32 : 5(CytRx코포레이션, 아틀란타, 죠오지아)가 있는 것과 없는 두 화합물을 사용하여 비교한 것이다.
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 백신, 보다 특별하게는 항원과 접합될 때 항원에 대한 면역반응을 확대하는 박테리아 편모를 포함하는 백신에 관한 것이다.
[배경분야]
백신은 일반적으로 신체내로 주사되어 자동면역을 제공하는 병원체(infectious agent), 또는 병원체의 약간의 부분으로 이루어지는 항원부분의 현탁액으로 정의된다. 백신을 만드는 항원 부분은 미생물로부터 정제된 천연 생선물, 합성생성물 또는 유전 공학화된 단백질 팹티드 또는 유사한 생성물일 수 있다. 보조제는 주입된 면역원과의 혼합물이 면역반응을 증가시키는 어떤 물질로서 이곳에서 정의된다. 합텐은 적절한 항체와는 선택적으로 반응하나 합텐 그 자체는 일반적으로 면역원이 아닌 물질로서 이곳에서 정의된다. 대부분의 합텐은 작은 분자이지만 약간의 거대분자들이 또한 합텐으로 작용할 수 있다. 접합은 둘이상의 분자의 공유결합이나 다른 결합 형태로서 이곳에 정의된다.
60년전에 화농성 박테리아 또는 다양한 부가적인 화합물과의 혼합물로서 백신을 투여함으로써 디프테리아 또는 파상풍에 대한 항독소 반응을 증가시키는 것이 가능하다는 것이 증명되었다. 그때 이후로, 임상학자 및 면역학자들은 종종 존재하는 부작용(side effect)들을 최소화하는 것을 꾀하면서 보조제로 면역 반응을 증가시키기 위해 노력해왔다.
생합성 및 재조합 DNK기술은 종래에는 생산하기 불가능했던 항원 에피토프(Epitope)를 갖는 백신의 개발을 가능케하고 있다. 예를 들어 근간의 백신 지원체는 연쇄상 구균상, 임균성, 발(hoof) 및 구강 질환, AIDS(HIV-1 바이러스) 및 말라리아 항원을 면역학적으로 묘사한 합성 팹티드류를 포함한다.
기생성 질환 말라리아에 대한 연구는 특히 중요하다. 이 질환은 세계적으로 매년 200,000,000명보다 많은 사람들에게 감염되어 사망률 및 무기력(loss of work)의 관점에서 세계에서 가장 중요한 질환이다. 유전공학의 기술은 말라리아 기생체의 여러 단백질을 확인하고 현재 상당량을 생산하는데 사용되어 왔다. 특히 포자체 단계(sporozoite stage)에서 나온 12아미노산 팹티드는 중요한 항원 부위를 운반하는 것으로 확정되었다. 이 특별한 팹티드에 대한 항체는 그것이 주사된 후에 즉시 기생체를 죽일 수 있다. 불행하게도 이 팹티드는 그 자체가 적절한 면역 반응을 낼 수 없다.
기생체 팹티드에 대한 효과적인 면역반응을 유도하기 위한 노력으로, 팹티드를 보조제와 투여하였다. 그러나 현재까지 팹티드와 함께 사용된 보조제들은 만족스러운 결과를 생성하지 못했다. 그리하여, 합텐 에피토프의 면역성을 향상시킬 효능있는 비독성 보조제의 개발에 관심이 기울어져 왔다. 이외에, 보조제는 보다 빠른, 보다 효능있거나 보다 연장된 반응을 유도해낼 통상적인 백신과 사용을 위해 필요하다. 또한 그러한보조제는 항원 공급이 제한적 이거나 생산에 비용이 많이드는 경우에 유용하다.
최근까지 보조제의 개발은 실험적인 것이었다. 많은 화합물들이 면역반응을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 이 화합물들은 물질 및 기능면에서 현저하게 다양하며, 보조제 작용의 통합된 메카니즘(mechanism)을 발견하고자 하는 복잡한 시도를 갖는 것이 사실이다. 이러한 메카니즘 설명은 면역계의 이해에서 최근의 진보에 뒤떨어져 있다.
다양한 보조제는 그들의 분류시 어려움이 존재한다. 보조제는 미네랄, 박테리아, 식물, 합성 또는 숙주 생성물인 그들의 원천에 따라 이따금 분류된다. 이런 분류하에서 제1군은 알루미늄 화합물과 같은 비박테리아성 보조제이다.
보조제로 알루미늄 화합물의 최초 사용은 1926년에 기술되어 있다. 그 이래로, 알루미늄염으로 침전된 항원 또는 알루미늄 염과 혼합된 항원 또는 기능성 알루미늄 화합물에 흡수된 항원은 동물 및 인간에서 면역반응을 향상시키기 위해 광범위하게 사용됐다. 알루미늄 화합물 및 유사한 보조제는 하기 메카니즘을 통해 작용하는 것으로 나타났다. 항원의 분비는 느려서 항원 및 대식세로 또는 여포-수지상 세포와 같은 항원-존재세포사이의 상호 반응시간을 연장한다. 이외에, 면역적응성 세포들은 주사의 영역에 흡인된다. 알루미늄입자들은 면역화 시킨지 7일후에 토끼의 임포절에서 나타나며, 또 다른 중요한 기능은 항원을 그들의 결절에서 T세포 함유 영역으로 향하게 할 수 있다는 것이다.
보조제 효능은 배수 임포절의 염증과 관련있는 것으로 나타났다. 많은 연구들이 알루미늄 염과 함께 투여된 항원이 증가된 체액면역으로 이끄는 것으로 확인되었지만, 연기된-형태의 과감작에 의해 측정되었을 때 세포 매체 면역은 단지 약간 증가한 것으로 나타난다. 또한 수산화 알루미늄은 보조경로(complementpathway)를 활성화시키는 것으로 기재되었다. 이 메카니즘은 면역글로불린 생산 및 B세포 복제뿐아니라 국소적인 염증 반응에서 역할을 담당할 수 있다.
우선, 이들의 뛰어난 안정성의 기록 때문에, 현재 알루미늄 화합물이 인간에게 보조제로 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 이들에게 문제가 없는 것은 아니다. 알루미늄 함유 백신은 때때로 국부적 반응을 일으킨다. 알레르기 발현은 임상적 문제는 아니지만 알루미늄 화합물은 T세포 종속 메카니즘을 통해 주사영역으로 호산성을 유도하고 항원 프리밍(priming)후 주사한다면, IgE반응을 유도하며 IgE반응에 대한 헬퍼(helper)기능을 갖는 담체-특히 세포 집단을 유도하는 것으로도 말해진다. 게다가 알루미늄-함유 백신은 동결건조할 수 없어서, 오염의 위험을 초래하는 냉동된 수송과 저장이 필요불가결하다.
결국, 그리고 가장 중요하게, 알루미늄 화합물은 질병으로부터 지속된 보호를 유도하는데 항상 성공적인 것은 아니다. 따라서 알루미늄 염은 보호를 유도하기 위해서만 항체 반응을 요구하는 강력한 면역항원에 대해 충분한 보조제인 반면, 많은 감염에서 요구되는 형태의 세포-매체 면역 반응을 도입하기 위해 말라리아의 약한 면역원과 같은 합성 팹티드와 함께 사용될 때 이들은 효과적이지 않다.
또 다른 많은 군의 보조제는 박테리아 원(bacterialorigin)의 것이다. 최근, 박테리아원을 갖는 보조제는 정제 및 합성되고 있으며(예컨대, 무라밀 디팹티드(muramyldipeptides), 지질 A), 숙주 조정자는 무성 생식을 하여(인터루이킨(Interleukin 1과 2) 연구용의 화학적으로 특성화된 생성물을 제공하였다. 최근 10년간에 세균 유래 활성성분의 다음 세가지 보조제의 화학적 정제에 있어서 현저한 진보가 있었다 : 보르데렐라페르투시스(Bordetella pertussis), 지질다당류(lipopolysaccharide)와 Freund의 완전보조제.
T-임파구(T-lymphocyte)집단 상의 작용을 통하여 세포-매체 면역성에 대해 조절하는 능력 때문에 B. 페르투시스가 흥미있는 것이다. 지방다당류와 Freund의 완전보조제에 있어서는, 보조 활성부분이 확인되고 합성되어, 구조-기능관계와 더 유리한 독성 치료비율을 생산하는 원(original)보조제의 개질 가능성에 대한 연구를 가능하게 했다.
지질 A를 비롯한 지질다당류와 그의 다양한 유도체들은 리포좀 또는 다른 지질 에멀션과 조합한 강력한 보조제가 되는 것으로 발견되었다. 지금까지 인간에게 사용하기 위한 충분히 낮은 독성을 갖는 유도체를 생산할 수 있는 여부는 확실하지 않다. Freund의 완전 보조제는 대부분의 실험 연구에서 포준이다. 그러나, 이것은 숙주를 죽이거나 불구가 되게 하도록 충분히 심각할 수 있는 국부적 및 심각한 전신적 염증 반응을 일으킨다. 인간에게는 이것을 사용할 수 없다.
보조제는 또한 이들의 의도된 작용 메카니즘에 의해 분류된다. 이런 형태의 분류는 대부분의 보조제가 하나이상의 메카니즘에 의해 기능을 나타내기 때문에 필수적으로 다소 임의적이다. 보조제는 항원의 국부화 및 방출을 통하여 또는 대식세포와 임파구와 같은 면역계를 만드는 세포 상에 직접 영향을 미침으로써 작용할 수 있다. 보조제가 면역반응을 향상시키는 또 다른 메타니즘은 항원데포우(depot)의 생성에 의한 것이다. 이것은 알루미늄 화합물, 오일 에멀션, 리포좀 및 합성 중합체의 보조활성에 기여하는 것으로 나타난다. 지질 다당류와 뮤라밀 디팹티드의 보조활성은 주로 대식세포의 활성화를 통해 매체되는 것으로 나타난 반면에, B. 페르투시스(B. pertussis)는 대식세포 및 임파구 모두에 영향을 준다.
모노카인스(monokines) 및 림포카인(lymphokines)의 이용과 같은 면역잠재성(immunopotentiotion)에의 최근 추측하는 접근들 및 면역반응을 향상시키는 항원, 담체 및 보조제의 조작은 통상적으로 많이 쓰인다.
말리리아의 합성 팹티드와 같은 작은 면역원들은 면역반응을 증가시키기 위해 보다 큰 단백질이나 담체들에 부착될 수 있다. 면역원성(immunogenicity)에 대한 항원의 복합성 및 분자크기사이의 관계는 분자상에 항원 결정인자의 유효성을 반영한다. 이 관계는 면역 반응을 자극시키기 위해 보다 큰(담체)분자와 작은 라디칼을 복합시키는 요건을 기술하였던 랜드스테이너(landsteiner)에 의해 처음 주목되었다. 그러나, 요건에 대한 기구론적 토대는 면역원성(immunogenicity)을 표현하기 위해 분자상에 2개의 항원 결정인자의 최소에 대한 요구 및 담체 효과를 증명한 실험들을 기다려야 했다.
이 결정인자들은 각각 T 및 B 임파구와 상호 작용하는 담체 및 합텐 결정인자들을 나타낸다. 그러나, 담체 부분의 작용은 T-의존 체액반응에서 T세포의 활성화를 통해 단순한 항원성 이상으로 확장한다.
항원 분자상 결정인자의 조합은 헬퍼(helper) 및 억압인자 T세포의 차별적인 활성화에 의한 면역 반응에 영향을 줄 수 있다. 이 효과를 설명하는 모델계는 합성 삼원공중합체 1-글루타민산60-L-알라닌30-L-티토신10(GAT)에 대한 반응계(C 57 B 1/6) 및 비반응계(DBA/1)쥐의 유전학적으로 조절된 체액반응이다. C 57 B 1/6쥐는 이 폴리팹티드에 대해 반응하지만 DBA/1 쥐는 GAT가 메틸화된 소혈청 알부민(MBSA)과 결합될때에만 반응할 것이다. 그러나, 쥐가 GAT-MSBA로 면역화되기전에 GAT로 주사된다면, GAT에 대한 검출가능한 항체 반응은 일어날 수 없다. 이러한 관찰에 대한 설명은 GAT가 반응기 쥐에서 헬퍼 T세포를 자극하나 지배적으로는 비반응기 쥐에서 억압인자 T세포를 활성화시킨다는 것이다. 억압인자 세포의 이러한 우세는 MBSA에 결합될 때라도 GAT에 대한 반응을 방지한다. 그러나, 1차 면역이 GAT-MBSA로 이루어진다면, 담체부분에 의한 헬퍼 T세포의 활성화는 GAT에 의해 활성화된 어떤 억압인자 세포의 효과를 무효로 하는 헬프를 제공한다.
또한 생단백질 분자와 결합된 결정인자는 헬프 및 억압에 다르게 기여하는 것으로 증명되었다. 항원의 면역원 담체의 결합은 그 항원에 대한 반응으로 생산된 항체의 동기준 표본을 변화시킬 수 있다. 다양한 캡슐로 쌓인 박테리아로부터 정제된 다당류들은 다 반복 항원 결정인자와 그들의 중합특성으로 인해 흉선-비종속 항원이다. 그들은 이러한 박테리아의 보호 항원을 나타내는 한편, 생산된 IgM항체들은 질환을 방지하는데 제한된 효력을 갖는다. 그리하여, 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 및 헤모필러스 인플루엔자형 b로부터 나온 다당류는 파상 풍톡소이드와 같은 단백질에 결합된다. 이렇게 결합된 제제들은 흉선-종속 항원이며 면역학적 복원뿐아니라 다당류 부분에 대한 IgG반응을 유발한다.
마찬가지로, 흉선-비종속 다당류 담체들은 흉선-종속 IgG면역반응들을 요구하는 말라리아와 관련된 것과 같은 작은 팹티드들의 면역원성들을 향상시키는데 거의 효능을 갖지 않는다.
팰드만 및 리에 의한 문헌에서는 살모넬라 유기체의 편모 항원들이 강한 IgM항체 반응들을 자극시키는 전형적인 흉선-비종속 항원들이라고 주장하고 있다. (펠드만 M. 일동의 ＂면역 반응에서 흉선-유도세포에 대한 요건 및 항원 구조사이의 관계 ＂J.E.p.Med. 제 134권, pp.103-119,1971; 및 리 일동의 ＂반복된 면역화 동안에 포스포릴클린에 대한 모노클로날 반응의 약화 및 자발적인 회복 ＂J.Inonun., 제 113권, pp.1644-1646, 1974년을 참조).
이 공개된 자료는 말라리아 팹티드를 또는 흉선-종속 IgG항체반응을 요구하는 다른 작은 항원들에 대한 보조제나 담체로서 거의 효능을 갖지 않는다.
아마도 담체와 보조제를 구분하는 정확한 전이점은 없다. 명백하게, 담체 부분은 고유 보조성(adjuvanticity)으로 언급된 항원의 성질에 기여한다. 톨레로겐(tolerogen)을 면역원으로 전환시키는 특정물질들의 능력은 비고유 보조성으로 언급된다. 보조성은 단백질의 응집이나 면역원 또는 비활성 담체에의 흡착을 통해 항원의 크기를 증가시킴으로써 향상될 수 있다. 그리하여 항원을 흡수하고 면역 반응을 향상시키는 수산화 알루미늄, 라텍스 입자, 벤토나이트 또는 리포좀과 같은 물질들을 보조제라 부른다. 그러나 관찰된 항원의 응집의 효과는 극도로 복잡한 것으로 인식된 보조제 작용의 제한된 측면에서만 나타난다.
작은 팹티드들 및 다른 합텐들은 보조제를 사용하지 않고 강한 면역반응을 일으킬 수 없다.
현재 구입가능한 대부분의 보조제는 병원체에 의한 전염에 대해 동물이나 인간을 보호하는데 효과적인 면역반응을 유발하지 않는다. 그리하여 필요한 것은 동물 및 인간에게 투여될 수 있고 면역계가 전염에 대해 동물이나 인간을 보호할 수 있는, 팹티드 또는 다른 합텐에 대해 연장되고 효능있는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신이다.
[발명의 요약]
본 발명에 따라서, 팹티드 또는 기타 작은 합텐에 대하여 인간이나 동물에게 예방접종 하는데 특별히 유효한 백신이 제공된다. 개선된 백신은 팹티드 또는 기타 작은 합텐에 대한 장기적이고도 효능이 있는 면역 반응을 제공한다.
본 발명은 팹티드 또는 기타 작은 합텐과 같은 작은 항원 결정인자에 접합되어 있는 박테리아 단백질을 포함한다.
본 발명에 사용된 박테리아 단백질은 박테리아 편모이다. 이 편모는 어떤 편모화된 미생물로부터 유도될 수 있다. 그러나, 살모낼라(Salmonella)종으로부터 유도된 것이 바람직하다. 그러나, 편모가 어떤 특별한 적용을 위해 유도된 바람직한 박테리아 종은 그 적용의 특별한 항원 요구성에 좌우되며 본 발명에서 중요한게 아니다. 박테리아 편모는 자연 중합된 형태일 수 있거나 재중합 플라젤린 일 수 있다.
본 발명은 또한 블록 공중합체와 같은 보조제와 함께 팹티드 및 접합되어 있는 편모의 투여를 포함한다. 본 발명의 백신과 함께 사용될 수 있는 바람직한 보조제는 에틸렌 디아민 개시제상에 있는 친수성 폴리옥시에틸렌(POE)의 중합체를 포함하는 블록 공중합체로부터 유도되는 것이다. 이어 소수성 폴리옥시 프로필렌(POP)의 중합체가 친수성 폴리옥시에틸렌(POE)의 블록에 첨가된다. 이는 하기 일반식을 갖는 옥타 블록 공중합체를 생성한다.
상기 식에서, a는 폴리옥시에틸렌(C2H4O)a(POE)으로 표시되는 친수성 부분이 화합물의 총 분자량의 약 10%-40%를 차지하도록 하는 수이고; 폴리옥시프로필렌(C3H6O)b(POP)으로 구성되는 옥타블록 공중합체의 소수성 부분의 평균 응집 분자량은 약 4000-8000돌턴이며; b는 옥타블록 공중합체의 총 분자량중 폴리옥시프로필렌 (C3H6O)b(POP)부분이 화합물의 약 60%-90%를 차지하도록 하는 수이다.
편모는 작은 항원 결정인자, 예컨대, 합텐, 약제, 팹티드에 대하여 오래-지속되고, 높은 역치 및 높은 결합성을 갖는 항체 반응을 유발시키는데 아주 유효한 보조제 및 담체로서 사용될 수 있다. 팹티드는 합성되거나 유전공학적으로 제조될 수 있다. 유전공학적으로 제조되는 팹티드의 예들은 현재 말라리아에 대해 이용가능하다. 작은 항원 결정인자와 편모의 접합물을 포함하는 개선된 백신은 강하고 장기적인 흉선-종속 IgG항체 반응을 유도하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 작은 면역원 결정인자에 대한 장기적이고 효능이 있는 면역 반응을 제공하는데 특히 유효한 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 말라리아 기생체에 의한 감염에서 개체를 보호할 수 있는 유지된 면역 반응을 생성하기 위해, 말라리아와 같은 합성 팹티드를 이용할 수 있는 유효한 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 질병을 예방하는데 유효한 면역 반응을 생성하기 위해 AIDS바이러스의 합성팹티드를 이용할 수 있는 유효한 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 작은 면역원 결정인자, 예컨대 팹티드 또는 합텐에 대해 효능이 있고 장기적인 IgG 반응을 생성하기 위해 인간이나 동물의 면역 계를 자극할수 있는 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간이나 동물에 대해 낮은 독성을 갖는 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 국소적인 알레르기 반응이 거의 없거나 전혀 없는 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동결 건조될 수 있는 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 백신제제와 함께 사용할 수 있는 보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 이러한 장점, 특징, 및 목적은 청구된 청구범위와 공개된 실시양태의 상세한 설명을 검토하면 명백해질 것이다.
본 발명은 작은 팹티드 또는 다른 합텐에 대해 동물 또는 인간을 면역시키는데 특히 유용한 백신을 포함한다. 본 발명에 따라, 작은 팹티드 또는 합텐을 미생물로부터 유도된 편모에 접합시킨다. 편모는 임의의 편모 미생물로부터 유도된다 : 그러나 살모넬라 종으로부터 유도된 것들이 좋다. 특정한 적용을 위해 편도를 유도하기에 바람직한 박테라아 종들은 적용의 특정 항원 요건에 의존하나 이것이 본 발명에 중요하지는 않다.
몇몇 박테리아는 편모 하나를 갖는 한편 다른 것들은 편모 한타래를 가지며 또 다른 것들은 세포 표면 전체에 분산되어 있는 편모들을 갖는다. 박테리아 편모는 직경이 10-35nm이고 간혹길이가 10-15㎛를 초과하거나 세포직경의 여러배일 수 있다. 대부분의 박테리아 편모는 파장이 약 2.5㎛인 규칙적이고 균일한곡선을 나타낸다.
천연 단백질인 박테리아 편모를 pH3으로 산성화시키면, 이들은 분자량이 대부분의 종에서 거의 40,000인 플라젤린(flagellin)으로 불리는 동일한 단량체 부단위들로 해리된다. pH 및 염농도의 적절한 조건하에서, 플라젤린 단량체들을 자동적으로 다시 연합하여 자연 편모와 동일한 파장의 규칙적 곡선을 갖는 온전한 편모와 동일하게 보이는 구조를 형성한다.
자연 형태 또는 다수의 고정시약으로 고정된 온전한 박테리아 편모가 본 발명 실시에 사용될 수 있다. 더욱이, 다시 합쳐진 플라젤린은 본 발명을 실시하는데 만족스럽다. 본 발명의 필수적 요소는 제조물이 특정미생물의 전형적인 길쭉한 편모 구조를 생산하기 위해 기하학적 패턴으로 규칙적인 간격으로 놓여진 플라젤린 분자로 이루어진 중합체로 구성되는 것이라고 믿어진다.
항원은, 포유동물에 투입될 때 항체의 형성을 초래하는 화합물들이다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 대표적인 항원들에는 단백질, 당단백질 및 핵단백질, 예컨대 팹티드, 호르몬, 혈청 단백질, 상보단백질, 응집인자 및 바이러스 또는 박테리아 생성물들이 있다. 바이러스 또는 박테리아 생성물들은 효소 절단에 의해 생산된 유기체 성분이거나 당업자에 잘알려진 DNA 재조합 기술에 의해 생산된 유기체의 성분일 수 있다.
다음은 대표적인 항원들이 부분적 열거표이다.
합텐은 면역원 담체에 결합되어 척색동물에 투입될 때 합텐에 대해 특이적인 항체를 형성시키는 화합물이다. 대표적인 합텐에는 에스트로겐 및 콜티손과 같은 스테로이드, 저분자량 팹티드, 다른 저분자량의 생물학적 화합물, 항생제 및 화학치료 화합물과 같은 의약, 공업 오염물, 향미제, 식품첨가물, 및 식품오염물 및/또는 그의 대사물 또는 유도체들이 있다.
박테리아 배양물로부터 편모를 제조하기 위한 다수의 방법들이 개발되었고 당업자에 잘알려져 있다. 바람직한 방법은 여기에 기술된 바와 같이 코바야시, 린커 및 코플러 Arch.Biochem.Biophys.84, 342-362(1959)의 방법을 변경시킨 것이다. TY2균주의 살모낼라티피 유기체들을 유동성 한천에서 배양한다. 고유동성 유기체들은 대부분 편모를 생성하기 때문에 선택되어야 한다. 이후에 유기체들을 트립티카제 대두육즙 20ι에 접종하고 대수 성장기의 끝까지 거의 30시간동안 37℃에서 배양한다. 이때 0.3%현탁액을 생산하도록 포름 알데히드를 첨가하여 유기체들을 죽인다. 유기체들은 바람직하게 원심분리하여 수집한다. 그러나 지나친 전단력의 생성을 피하도록 조심하여야 한다. 이후에 진탕기에서 20분간 세게 흔들어줌으로 유기체로부터 편모를 제거한다. 유기체를 분쇄시키지 않고 편모를 떼어내기 위한 전단력을 생산하는 다른 혼합기 및 장치도 동일하게 만족스럽다.
이후에 분별 원심분리시켜 세포 몸체로부터 편모를 분리한다. 거의 2000rpm에서 원심분리시켜서 표준실험실 원심분리기에서 세포 몸체를 제거한다. 이후에 30,000rpm에서 초원심분리시켜서 편모를 수집한다. 편모를 다시 현탁시키고 초원심분리기에서 다시 원심분리시켜서 용해성의 오염물질을 쏟아버린다. 거대한 오염물질은 투명한 편모 펠릿 바닥에 검은 반점을 형성할 것이다. 이 물질은 물리적으로 제거하고 기우려 따른다. 박테리아 배양물 20ι로부터 유도된 최종 생성물에는 정제된 편모 약 100mg이 있다.
고정되지 않은 편모를 약 pH2에서 밤새 산성화시킴으로 플라젤린을 생성할 수 있다. 이러한 처리로 편모 단백질을 해리시켜서 분자량이 약 30,000인 플라젤린 단량체들을 생산한다. 단량체들을 적어도 24시간 동안 중성 pH에서 정지시켜 놓으면 합체된 편모로 다시 연합된다. 다시 합체된 플라젤린은 작은 항원 성분들을 위한 보조제 및 담체로서, 자연 편모와 거의 동일하게 효과적이다. 단량체 플라젤린 또는 플라젤린 단백질의 단백질 분해성 절단단편들은 효과가 극히 낮다.
항원 합텐 또는 팹티드 성분들은 당업자에 잘 알려진 표준수단 중 어느 하나로 편모에 화합적으로 접합시킬 수 있다. 가장 단순하고 가장 효과적인 수단중 하나는 글루테르알데히드를 사용하는 것이다. 글루테르알데히드는 편모에 팹티드를 공유 결합시키고 더나아가 편모제조물을 고정하는 2가 가교결합성 화합물이다.
디니트로플루오로벤젠과 같은 다른 화학적 가교 결합 시약 또는 화학적 항원 유도체들이 효과적이다.
편모에 부착된 항원의 양은 특정 적용에 따라 변하며 본 발명의 중요한 요소가 아니다. 바람직하게는 편모 제조물내의 플라젤린 단량체당 2-10의 팹티드 또는 합텐단위로 충분하다.
접합된 편모 제조물을 투석, 원심분리 또는 임의의 다른 표준 방법으로 정제한다. 이후에 이 물질을 약 100㎍/ml의 농도로 염수에 재현탁시킨다. 이 제조물은 주사시마다 1-100㎍의 낮은 투여량으로 효과적이다. 10㎍의 투여량으로 여러 상황에서 만족할 만한 반응이 생성된다. 이 물질을 임의의 통상적인 경로, 정맥내, 피하, 근육내, 또는 복강내 주사할 수 있다. 피하 또는 근육내 경로는 여러 백신을 위해 보통 가장 편리하다.
한예로서, 디니트로페놀로 접합된 살모낼라 티피 편모 20㎍의 주사물은 주사후 첫 번째 1주일이 끝에 발생하고 수개월간에 지속되는, 합텐 DNP에 대해 특이적인 IgG항체 적정물을 형성한다.
편모에 접합된 항원 성분 및 편모에 대한 면역 반응의 지속은 예외적이고 보통과 다르다. 이 물질은 주사자리에 항원이 국부적 축적물을 형성하지 않는다. 편모에 주사된 투여량중 거의 90-95%는 분해되어 24시간이내에 배출된다. 물질중 일부는 국부 림프절내의 베아센타내에서 장시간 동안 유지된다. 베아센타내의 이 항원의 존재는 항체 생산을 연장시키는 것에 기여하는 것으로 믿어진다.
본 발명은 다른 유용한 보조제조물보다 다수의 이점들을 갖는다. 이것은 주사자리에 거의 염증을 일으키지 않으며 전적으로 생체내 분해될 수 있다. 이는 오일 에멀션 또는 알루미늄과 같은 무기염과 현저히 대조된다. 면역반응을 연장시키는데 매우 작은 투여량의 항원이 필요하다. 항체의 중요 부분은 말라리아, 포자체 및 다른 중요한 감염에 대한 보호에 필요한 유형인 상보-고정 IgG이다. 이 생성물은 글루테르알데히드와 같은 고착제와 함께 제조될 때 특히 안정하다. 이를 동결건조시키고 실온에서 무한히 저장할 수 있다. 염수로 복원시킬 경우 냉동에서 수주간 안정하고 실온에서는 수일간 안정하다.
감염성 숙주내에서 감염을 유발할 수 살아있는 희석 백신과는 달리, 이러한 백신제제는 극소량의 다당류와 함께 중합단백질만으로 구성된다.
본 발명에 따라 제조된 백신의 바람직한 투여량은 5㎍-500㎍이다. 어떠한 백신의 최적 투여량은 백신접종을 맞는 동물이나 인간의 면역학적 상태 및 편모 단백질과 접합된 항원에 따라 좌우될 것이다.
또한 면역 반응을 더 향상시키기 위하여 본 발명의 백신을 보조제와 함께 투여할 수도 있다. 본 발명의 백신과 함께 사용될 수 있는 바람직한 보조제는 에틸렌 디아미노 개시제상에 조합된 친수성 폴리옥시에틸렌(POE)의 중합체를 포함하는 블록 공중합체(Polyphore 32:5, 조지아주 아틀란타시소재 CytRx 회사)에서 유도되는 것이다. 이후 소수성 폴리옥시프로필렌(POP)의 중합체가 친수성 폴리옥시에틸렌(POE)의 블록에 첨가된다. 이로써 하기 일반식을 갖는 옥타블록 공중합체가 생성된다.
상기식에서, a는 폴리옥시에틸렌(C2H4O)a(POE)으로 표시되는 친수성 부분이 화합물의 총 분자량의 약 10%-40%를 차지하도록 하는 수이고; 폴리옥시프로필렌(C3H6O)b(POP)으로 구성되는 옥타블록 공중합체의 소수성 부분의 평균 응집 분자량은 약 4000-8000돌턴이며; b는 옥타블록 공중합체의 총 분자량중 폴리옥시프로필렌(C3H6O)b(POP)부분이 화합물의 약 60%-90%를 차지하도록 하는 수이다.
바람직한 보조제는 하기 일반식을 갖는다.
상기 식에서, a는 약 5이고 b는 약 32이다.
본 발명을 구성하는 백신과 함께 사용될 수 있는 또 다른 공중합체는 하기 일반식을 갖는다 : HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bH
상기 식에서, 소수부분(C3H6O)의 분자량은 약 2000-5000이고 화합물의 총 분자량은 약 2300-6000이다(조지아주아틀란 타시 소재 CytRx회사).
바람직한 보조제는 하기 일반식을 갖는다 : HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bH
상기 식에서 소수성 부분(C3H6O)의 분자량은 약 4300이고 친수성부분(C2H4O)의 백분율은 약 10중량%이다.(조지아주아틀란타시 소재 CytRx 회사).
중합체 블록은 염기성 촉매 존재하에 상승된 온도 및 압력하에서 4관능성 에틸렌디아민 개시제상에 에틸렌옥사이드와 프로필렌옥사이드를 축합 시킴으로써 형성된다. 결합되어 각 공중합체내에 중합체를 형성하는 단량제 단위의 수에 있어 약간의 동계상의 변화가 있다. 주어진 분자량은 각각의 제조시 공중합체 분자의 평균 중량의 근사값이다. 이들 블록 공중합체의 제조에 관한 더 상세한 기재는 본 발명에 참고로 한 미합중국 특허 제2,674,619호 및 미합중국 특허 제2,979,528호에서 볼 수 있다[아울러, 본 발명에 참고로한 ＂블록 중합체 계면활성제의 검토＂(슈몰카, I.R., J.Am. Oil Chemists, Soc., 54:110-116(1977)) 및 블록 및 그래프트 공중합, 제2권(R.J. 세레사 편집, 존월리 ＆amp; 선즈, 뉴옥(1976))를 참고할 것].
본 발명을 구성하는 백신을 옥타블럭 공중합체와 혼합하여 인간이나 동물에게 투여한다. 본 발명의 백신과 함께 투여되는 보조제의 바람직한 양은 약 0.1mg-5.0mg이며, 가장 바람직한 양은 약 0.5mg-2mg이다.
하기 특정 실시예들은 소량의 합텐에 대한 유기체의 면역 반응을 향상시키기 위해 제공되는 본 발명을 설명하는 것이다. 다른 실시예들도 이 분야의 통상의 숙련인에게 명백할 것이며 본발명이 하기 구체적인 실시예들에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
균주 TY2의 삼모넬라 티피 유기체를 유동성 한천에서 성장시켰다. 그후 유기체를 트립티케이스 콩 육즙배지 20ml에 접종하고, 성장의 대수기 끝까지 37℃에서 30시간 동안 배양한 다음, 포름알데히드를 첨가함으로써 유기체를 죽이고, 0.3%현탁액을 생성하였다. 유기체를 원심분리하여 수집하였다. 지나친 전단력의 생성을 피하기 위해 주의해야 한다. 그후 진탕기 내에서 20분간 활발하게 흔들어 주므로써 유기체로부터 편모를 제거하였다. 유기체를 붕괴하지않고 편모를 없앨 수 있는 전단력을 생성하는 다른 혼합기 및 기기들도 똑같이 만족스럽다.
그후 차동 원심분리에 의해 세포체로부터 편모를 분리하였다. 세포체를 표준 실험 원심분리기로 2000rpm에서 원심분리하여 제거한 후, 30,000rpm에서 초 원심분리하여 편모를 수집하였다. 초원심분리후에, 편모를 재현탁시키고 초원심 분리기로 재원심분리하고 용해된 오염물질을 부어 버렸다. 다량의 오염물질이 투명한 편모 펠릿 바닥에 검은 점을 형성하는데, 이 물질들을 물리적으로 분리제거하였다. 20ι의 박테리아 배지로부터 유도된 최종 생성물은 대략 100mg의 정제된 편모이었다.
[실시예 2]
약 pH 2에서 12시간 동안 편모를 산성화하여 플라젤린(Flagellin)을 생성하였다. 이 처리는 편모 단백질을 분리하여 분자량 대략 30,000을 갖는 플라젤린의 세 개의 단량체를 생성하였다. 중성 pH에서 최소한 24시간 동안 방치했을 때 단량체들이 중합된 편모 형태로 재집합하였다.
[실시예 3]
글루테르알데히드는 팹티드를 편모에 공유적으로 부착시키는 2가가교-결합 화합물이고 편모 재제를 더 고착시킨다. 단백질에 관능기를 접합시키는 방법들은 이 분야에서 통상의 기술의 하나로서 잘 알려져있다. 디니트로플루오로 벤젠과 같은 다른 화학적 가교-결합 반응물 또는 화학적 항원 유도체가 효과적이다.
[실시예 4]
집합된 편모 재제를 투석, 원심분리, 또는 어떤 다른 표준 방법에 의해 정제하였다. 그후 약 100㎍/ml농도의 염수에서 물질을 재현탁시켰다. 이 제조물은 주사당 1-100㎍의 낮은 투여량으로 효과적이다. 투여량 10㎍이 많은 상태에서 만족한 반응을 생성한다. 물질은 어떤 통상적인 경로, 정맥내, 피하, 근육내 또는 복강내로 주사할 수 있다. 피하 또는 근육내 경로는 많은 많은 백신 목적에서 가장 통상적인 것이다.
[실시예 5]
ELISA 분석은 트리니트로페놀 합텐에 대해 영향을 주는 항체의 결정에 사용된다. 이것은 사운더스에 의해 본래 발표된 방법을 변형한 것이다(사운더스, G.C., ＂선택된 프로토클을 포함하는 고체상 효소 면역 분석 기술＂, 임상 실험의 면역 분석, 알란 R. 리스, 뉴욕 pp 111-112, 1979 참조).
플라스틱 지지체에 부착되는 단백질의 변성 및, 백그라운드(back ground)를 증가시키고 민감성을 감소시키는 경향이 있는 단백질의 비특이적 흡수를 감소시키도록 계면활성제 및 단백질의 이용을 감소시키기 위해 단백질, 소 혈청 알부민, 히드로 겔을 사용하였다. 글루타르알데히드는 항원을 BSA-피막된 96-웰 마이크로타이터(microtiter)판에 부착시키기 위해 사용되었다. 결합되지 않은 글루타르알데히드는 씻어버렸다. 판에 첨가된 항원을 글루타르알데히드의 유리 알데히드기를 통해 공유적으로 판에 부착하였다.
남은 알데히드기를 리신으로 블록킹함으로써 판은 사용할 준비가 되었다. 판을, 다양한 항 혈청의 희석물과 함께 배양하고, 세척하면 그후 과산화 효소-접합 염고 항-쥐 IgG 또는 부 부류(subclass)중의 하나 같은 2차 항체가 생긴다. 판을 세척하고 기질(예를 들어, 과산화물을 갖는 오르쏘페닐렌 디아민)을 첨가하였다. 티터텍 물티스칸(Titertek Multiscan)광도계에 의해 492nm에서의 결과적인 흡광도가 읽혀졌다. 항체의 역치는 백 그라운드의 최대 O.D 1/3-1/2를 생산하도록 요구되는 항 혈청의 희석에 의해 측정되었다.
이것은 참조 항 혈청을 견본과 동시 비교함에 의하여 표준화된다. 이것은 다른 날 수행 되는 역치의 비교를 용이하게 한다. 또 다른 것과의 관계에 있어서 항체의 상대적인 결합성은 혈청 희석에 대한 O.D. 곡선의 기울기 분석에 의해 평가된다.
[실시예 6]
하기 실험에 있어서 편모당 평균 4TNP 분자가 접합된 편모 25㎍을 쥐에 후부 푸우트 패드(Footpad)를 통해 투여하였다. TNP-접합된 편모는 염수 0.5ml의 부피로 투여된다. TNP에 대해 특이한 항체는 TNP-접합 편모의 투여 후에 하기 시간에 따라 측정되었다 : 8일, 19일, 30일, 50일, 및 90일. 이 실험의 결과를 제1도에 표기하였다. 제1도에서 보듯이, TNP-접합 편모에 대한 면역 반응은 90일 후에도 여전히 상당히 높다. TNP-접합 달걀 알부민과 같은 통상적인 TNP접합체에 대한 반응은 지속기간 중에 매우 짧고 항제 역치가 매우 낮다. 동물들은 단일 주사후 용해가능한 단백질 캐리어 상의 합텐에 대해 감지되는 항체를 갖는 모든 것에서 빈번하게 반응하지 않는다.
[실시예 7]
투여량에 대한 쥐의 반응을 TNP-접합 편모를 다양한 주입량으로 투여하여 측정하였다. 플라젤린 분자(분자량 대략 40,000)당 평균 4TNP 분자와 접합된 편모를 쥐에 후부의 푸우트패드를 통해 투여하였다.
TNT-접합 편모를 명수의 0.5ml 부피로 투여하였다. 하기 농도의 TNP-접합 편모를 쥐에 투여하였다 : 4㎍, 10㎍, 25㎍ 및 50㎍. TNP-접합 편모에 대한 반응에서 생성된 항체를 TNP-접합 편모의 투여 8일 및 19일 후에 측정하였다. 이 실험의 결과는 제2도에 표기하였다.
[실시예 8]
달걀 혈청(hEA)에 접합된 TNP 및 박테리아 편모 단백질에 접합된 TNP에 대한 쥐의 면역성 반응의 비교가 제3도에 표기되어 있다. 이 실험에서, 편모와 같은 유형으로 반응성 유도체 트리니트로 벤젠 술폰산(TNBS)을 사용하여 TNP를 hEA에 접합시켰다. TNP-접합 hEA 100㎍ 또는 TNP-접합 편모 25㎍을 쥐에 후부의 푸우트 패드를 통해 투여했다. TNP-접합 단백질 투여 10후에 항체 역치가 실시예 Ⅴ에 따라서 측정되었다. 제3도에서 나타나는 바와 같이, 항체 역치에 의해 측정된 것처럼, TNP-접합 편모는 TNP-접합 hEA보다 상당히 큰 면역 반응을 유도하였다. 이 실험에서 투여된 TNP-hEA의 양이 TNP-접합 편모의 양의 4배(TNP-hEA 100㎍ 대 TNP-접합 편모 25㎍)인 것을 주의해야 한다.
[실시예 9]
실시예 8에서 사용된 같은 제제를 폴리포어
32 : 5보조제(cytRX Corporation, Atlanta GA) 1.0mg의 첨가와 함께 쥐에 투여하였다. TNP-접합 hEA 100㎍ 또는 TNP-접합 편모 25㎍을 쥐에다 후부의 푸우트 패드를 통해 투여하였다. 보조제와 함께 TNP-접합 단백질의 투여 10일후에 항체 역치를 실시예 5에 따라서 측정하였다. 이 실험의 결과를 제3도에서 요약했다. 나타나는 바와 같이, 보조제는 TNP-접합 hEA 및 TNP-접합 편모 모두에 면역 반응을 나타낸다. 그렇지만, TNP-접합 편모는 TNP-접합 hEA보다 상당히 큰 면역 반응을 유도한다.
Claims (38)
- 항원에 접합되어 있는 유효량의 박테리아 편모로 구성된 백신.
- 제1항에 있어서, 박테리아 편모가 살모넬라 종으로부터 분리된 것인 백신.
- 제2항에 있어서, 살모넬라 종이 살모넬라 티피인 백신.
- 제1항에 있어서, 항원이 합텐, 약제, 팹티드, 단백질, 다당류, 지질, 당지질 및 당팹티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 백신.
- 제1항에 있어서, 항원이 말라리아 기생체로부터 유래된 것인 백신.
- 제1항에 있어서, 항원이 인간 면역결핍 바이러스로부터 유래된 것인 백신.
- 제1항에 있어서, 편모가 재중합 플라젤린으로 구성된 것인 백신.
- 제1항에 있어서, 보조제와 함께 투여되는 백신.
- 제8항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 것인 백신 :
상기식에서, a는 폴리옥시에틸렌(C2H40)a(POE)으로 표시되는 친수성 부분이 화합물의 총 분자량의 약 10%-40%를 차지하도록 하는 수이고; 폴리옥시프로필렌(C3H6O)b(POP)으로 구성되는 옥타블록 공중합체의 소수성 부분의 평균 응집 분자량은 약 5000-7000돌턴이며; b는 옥타블록 공중합체의 총 분자량중 폴리옥시프로필렌(C3H6O)b(POP)부분이 화합물의 약 60%-90%를 차지하도록 하는 수이다. - 제8항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 것인 백신 :
상기 식에서, a는 약 5이고, b는 약 32이다. - 제8항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 것인 백신 : HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bH 상기식에서, 소수성 부분(C3H6O)의 분자량은 약 2000-5000이고 화합물의 총 분자량은 약 2300-6000이다.
- 제8항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 것인 백신 : HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bH 상기 식에서, 소수성 부분(C3H6O)의 분자량은 약 4300이고, 친수성 부분(C2H4O)a백분율은 약 10중량%이다.
- 항원에 접합되어 있는 유효량의 박테리아 편모의 투여 단계로 구성되는, 인간을 제외한 동물을 면역시키는 방법.
- 제13항에 있어서, 박테리아 편모가 살모넬라 종으로부터 분리된 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 살모넬라 종이 살모넬라 티피인 방법.
- 제13항에 있어서, 항원이, 합텐, 약제, 팹티드, 단백질, 다당류, 지질, 당지질 및 당팹티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 항원이 말리리아 기생체로부터 유래된 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 항원이 인간 면역결핍 바이러스로터 유래된 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 편모가 재중합 플라젤린으로 구성된 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 백신이 보조제와 함께 투여되는 방법.
- 제20항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 것인 방법 :
상기식에서, a는 폴리옥시에틸렌(C2H4O)a(POE)으로 표시되는 친수성 부분이 화합물의 총 분자량의 약10%-40%를 차지하도록 하는 수이고; 폴리옥시프로필렌(C3H6O)b(POP)으로 구성되는 옥타블럭 공중합체의 소수성 부분의 평균 응집 분자량은 약 5000-7000돌턴이며; b는 옥타블럭 공중합체의 총 분자량중 폴리옥시프로필렌(C3H6O)b(POP) 부분이 화합물의 약 60-90%를 차지하도록 하는 수이다. - 제20항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 것인 방법 :
상기식에서, a는 약 5이고, b는 약 32이다. - 제20항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 것인 방법 : HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bH상기 식에서, 소수성 부분(C3H6O)의 분자량은 약 2000-5000이고, 화합물의 총 분자량은 약 2300-6000이다.
- 제20항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 것인 방법 : HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bH상기 식에서, 소수성 부분(C3H6O)의 분자량은 약 4300이고 친수성 부분(C2H4O)a의 백분율은 약 10중량%이다.
- (a) 박테리아로부터 편모를 분리하고; (b) 상기 편모를 항원에 접합시키는 것으로 구성되는 개선되는 백신의 제조 방법.
- 제25항에 있어서, 박테리아 편모가 살모넬라 종으로부터 분리된 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 살모넬라종이 살모넬라 티피인 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 항원이, 합텐, 약제, 팹티드, 단백질, 다당류, 지질, 당지질 및 당팹티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 항원이 말라리아 기생체로부터 유래된 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 항원이 인간 면역결핍 바이러스로부터 유래된 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 편모가 재중합 플라젤린으로 구성된 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 백신이 보조제와 함께 투여되는 방법.
- 제32항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 것인 방법.
상기식에서, a는 폴리옥시에틸렌(C2H4O)a(POE)으로 표시되는 친수성 부부이 화합물의 총 분자량의 약 10%-40%를 차지하도록 하는 수이고; 폴리옥시프로필렌(C3H6)b(POP)으로 구성되는 옥타블록 공중합체의 소수성 부분의 평균 응집 분자량은 약 5000-7000돌턴이며; b는 옥타블록 공중합체의 총 분자량중 폴리옥시프로필렌(C3H6O)b(POP)부분이 화합물의 약 60%-90%를 차지하도록 하는 수이다. - 제32항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 것인 방법 :
상기 식에서, a는 약 5이고, b는 약 32이다. - 제32항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 것인 방법 : HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bH상기 식에서, 소수성 부분(C3H6O)의 분자량은 약 2000-5000이고, 화합물의 총분자량은 약 2300-6000이다.
- 제32항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 것인 방법 : HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bH상기 식에서, 소수성 부분(C3H6O)의 분자량은 약 4300이고, 친수성 부분(C2H4O)a의 백분율은 약 10중량%이다.
- 하기 일반식의 공중합체로 이루어진 백신보조제 :
상기 식에서, a는 폴리옥시에틸렌(C2H4O)a(POE)으로 표시되는 친수성 부분이 화합물의 총 분자량의 약 10%-40%를 차지하도록 하는 수이고; 폴리옥시프로필렌(C3H6O)b(POP)으로 구성되는 옥타블록 공중합체의 소수성 부분의 평균 응집 분자량은 약 5000-7000돌턴이며; b는 옥타블록 공중합체의 총 분자량중 폴리옥시프로필렌(C3H6O)b(POP)부분이 화합물의 약 60%-90%를 차지하도록 하는 수이다. - 제37항에 있어서, 보조제가 하기 일반식을 갖는 백신보조제 :
상기 식에서, a는 약 5이고, b는 약 32이다.
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