KR890002418B1 - 고수율 발현용 풀라스미드 벡터 pHK-3의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 pHK-3의 제한 효소지도.
제2도는 pHK-3의 제조공정 개략도.
제3도는 pIN III A3와 pHK-3의 DNA농도를 비교한 전기영동 사진이다.
본 발명은 유용한 폴리펩타이드의 생산에 적합하도록 개량된 플라스미드의 제조방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 유용한 폴리펩타이드를 암호하는 유전자를 용이하고 단순한 방식으로 삽입시킬 수 있으며, 또한 이 유용한 폴리펩타이드를 고수율로 생산할 수 있도록 개량시킨 플라스미드 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다.
현재의 유전자 조작기술은 미생물 또는 고등동물의 세포를 사용하여 각종의 유용한 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 정도까지 발달하였으며, 트핍토판 프로모터, lac-프로모터 및 람다파지 PL-프로모터등의 사용이 알려져 있다(P.W.그레이등 "Nature"295,503,1982 ; D.괴델등, Nature.287,411,1980 ; T.타니구치등, Proc. Nat'l Acad.Sci.77,5230, 1980 ; R.데린크등, Nature,287,193,1980).
대장균의 지방 단백질은 대장균의 외막을 구성하는 단백질로서 세포당 4.8×105분자로 구성되어 있는 것으로(미사요리 이노우에 저 : 세균외막의 발생성 및 그 작용, p8, 윌레이 인터사이언스사, 토론토, 1979) 이는 단일물질로서는 대장균 세포내에 가장 많이 존재하는 성분중의 하나로, 이에 상응하는 지방 단백질의 유전자는 전사활동이 강력한 프로모터를 갖고 있다는 것이 밝혀지게 되었다. 또한 이러한 지방 단백질 유전자의 프로모터 부위(5'-말단 미해독부위) 및 이 단백질의 구조 유전자 부위를 포함하는 유전자의 pBR 322 내로의 서브 클로닝과 삽입된 외인성 유전자의 발현이 가능하도록 변형시킨 일련의 플라스미드의 조성도 알려진 바 있다.(카가쿠 투 사이브츠, 20 No.1,47-58, 1982 : 켄조 나카무라와 미사요리 이노우에, EMBO 1 ; 771, 1982 : 존 그라예브등, EMBO 3,2437,1984 : 요시히로 마수이등, Bio/Technology, 1984,1,31.).
따라서 본 발명은 유용한 폴리펩타이드를 실질적으로 거의 완전한 형태로 직접 생산할 수 있도록 개량된 재조합 벡터에 관한 것으로, 대장균 지방 단백질 유전자의 5'-말단 미해독 부위(프로모터부위, 샤인-달가르노 배열 및 lac-프로모터. 오퍼레이터 부위 포함) 및 lac-리프레서(repressor)부위를 포함하되 플라스미드 DNA를 고수율로 생산할 수 있도록 개량한 재조합 벡터를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
한편, 대장균 지방 단백질 유전자의 프로모터 부위를 이용하여 이종성 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로 한국 특허출원 제84-4220호(공개번호 제85-1286호)가 있으나, 여기에서 사용하는 벡터는 외부 유전자의 발현을 조절할 수 없어 외부 유전자에 의한 발현이 조절되지 않으므로 해서 무절제하게 발현된 외부 폴리펩타이드는 자체분해되든가 또는 숙주의 생리적 활동에 무리를 주게되어 숙주세포에 해를 줄 가능성이 큰 것이다.
본 발명에 의한 재조합 벡터 pHK-3(KFCC-10237)은 플라스미드 벡터 pIN III A3(유전자 발현을 위한 실험실적 조작 : 1983, 아카데믹출판사 : p15-24)을 기원으로하여 제조한 재조합 벡터로서, pIN III A3 벡터는 대장균 지방 단백질의 프로모터부위에 lac-프로모터·오퍼레이터가 삽입되고, 또한 이 lac-프로모터·오퍼레이터를 조절하여 외부 폴리펩타이드의 생산을 조절할 수 있도록 lac-리프레서 유전자가 삽입된 것이고, 플라스미드 벡터 pHK-3는 pBR 322 플라스미드 DMA상에서 플라스미드 DNA의 복제수(copy number)를 조절하는 RNA 1 유전자상에 돌연변이가 일어나 대장균 내에서 많은수의 플라스미드 DNA를 합성할 수 있게된 플라스미드 벡터 pHK 314(Imre등, Gene 30,257,1984)를 제한 효소 NdeI과 PstI를 사용하여 절단하고, 돌연변이가 일어난 RNA 1 유전자를 포함하는 부위를 분리한 다음, 이를 pIN III A3 플라스미드 DNA의 NdeI-PstI절편과 교환함으로써 얻어진 pIN III A3 플라스미드 DNA를 고수율로 생산할 수 있는 플라스미드 벡터이다.
[실시예 1]
pHK-3(KFCC-10237), (제1도 참조)의 제조
pIN III A3플라스미드 DNA를 제한효소 PstI 및 NdeI를 사용하여 절단시킨 후, 3.5% 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동하여 6.1Kb의 DNA절편을 분리하였다. 플라스미드 DNA의 복제수(copy number)를 조절하는 RNA 1 유전자 상에 돌연변이가일어나 대장균내에서 플라스미드DNA를 다량으로 합성할 수 있게된 pHC314 플라스미드 DNA를 제한효소 PstI 및 NdeI를 사용하여 절단시킨 후, 전기영동하여 1.3Kb의 DNA를 분리하였다.
상기와 같이 분리시킨 6.1Kb와 1.3Kb의 DNA단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시켜 플라스미드 벡터 pHK-3(KFCC-10237)을 제조하였다(제2도 참조).
[실시예 2]
형질전환된 균주의 선별
1) 형질전환균주는 형질 전환후 암피실린을 50㎍/ml로 첨가한 LB고체 배지에서 하룻밤 배양한 후, 내 암피실린 유전자의 발현에 의하여 군락을 형성하는 균주를 선별함으로써 1차 선별하였다.
2) 1차 선별된 균주를 암피실린을 50μ/ml로 첨가한 액체 LB배지(LB broth)에서 하룻밤 배양한 후, 매니아티스 실험서(p368-369)에 따라서 소량의 플라스미드 DNA를 분리한 후 아가로스 겔 전기영동하여 DNA의 크기와 양을 비교판정하여 2차 확인하였다(제3도 참조).
Claims (2)
- 대장균 지방 단백질 유전자의 프로모터 부위와 lac-프로모터.오퍼레이터 부위 및 lac-리프레서 부위를 포함하는 pIN III A3 벡터내에 돌연변이된 RNA 1 유전자를 포함하는 DNA단편을 삽입함을 특징으로하는 대장균 세포내에서 고수율로 전사 및 해독될 수 있는 재조합 벡터 pHK-3(KFCC-10237)을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 돌연변이된 RNA 1 유전자를 포함하는 DNA단편은 pHC 314 DNA로 부터 제한효소 NdeI-PstI을 사용하여 분리한 것임을 특징으로 하는 방법.
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