KR870001148B1 - 고착글루코오스 이성화 효소의 제조방법 - Google Patents

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고착글루코오스 이성화 효소의 제조방법

제1도는 실시예 2의 글루코오스 이성화 효소 및 다당류에 대한 용리(溶離) 양상을 예시한 도면.

근래에 와서 고착 효소를 사용하는 공정을 공업적으로 응용 및 개발하고자 하는데에 큰 역점을 두고 있다. 고착 효소는 일반적으로 정제 또는 미정제된 상태의 효소 조제물을 흡착성 담체와 접촉시켜 제조하고 있다. 이들 고착 효소는 특히 회분식 공정과는 반대로 연속작업이 가능하다는 점에서 활용성이 있다. 그러나 각종 효소를 사용하여 고착 효소를 제조함에 있어서 담체에 대한 흡착정도가 낮다는 등의 여러가지 문제점이 대두되고 있다. 이러한 문제는 작업 효율이 낮은 고착 효소조성물을 초래하기 때문에 특히 바람직한 것이 되지 못한다.

본 발명은 이러한 문제점들을 야기하는 주요원인 및 이를 해결할 수 있는 방법에 관한 것으로서 현재까지 고착된 형태로 성공적이거나 실용성 있게 사용할 수 없었던 여러가지 효소를 사용할 수 있도록 한다.

현재까지 특정 효소의 고착 과정에서 제기되어온 난점은 효소 조제물에 통상 존재하는 고분자량의 어떤 다당류의 존재가 그 원인이라는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 이들 다당류도 역시 담체에 흡착되는데 통상 효소를 끌어서 보유하는 담체의 활성부의(活性部位)를 봉쇄함으로써 효소의 흡착을 방해하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 다음과 같은 단계를 거쳐 고착 효소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 즉 (가) 흡착억제성 다당류을 함유하는 효소 제조물을 만들고, (나) 다당류를 효소 조제물로부터 분리한 후, (다) 그 결과로서 생긴 효소용액과 흡착성 담체를 접촉시켜 효소를 고착시키는 단계로 되어 있다.

본 발명은 용이하게 고활성의 고착 효소를 얻게 하는 방법을 제공하여 높은 효율로 연속반응이 수행될 수 있게 하는 것이다.

모든 효소 조제물이 반드시 담체에 대한 효소 흡착과 고착작용을 실질적으로 방해할만치 충분한 다당류를 함유하고 있지는 않다고 하더라도 많은 경우에 해당된다. 특히 실질적으로 세포 내에서 효소를 생성시켜 유지하는 미생물들은 이것이 문제로 되고 있다. 이들 미생물로부터 효소 조제물을 얻을려면 세포를 파괴하여 효소를 방출시키도록 해야 한다. 본 발명에서는 이렇게 세포를 파괴시켜 주면 생성된 효소 조제물에 존재하게 되는 흡착억제성 다당류의 량에 상당한 기여를 하게 됨을 판명했다. 또한 어떤 종류의 효소 조제물은 고농도의 흡착억제성 다당류가 있다는 것도 확인되었다. 특히 글루코오스 이성과 효소 조제물 중에는 보통 상당량의 흡착억제성 다당류가 함유되어 있다. 따라서 본 발명은 특히 글루코오스 이성화 효소를 고착시키는데 적용되며, 특히 세포 내에서 효소를 생성하는 스트렙토마이세스(Streptomyces)과의 방선균(放線菌)이나 유산균(Lactobacillus)과의 세균 ; 특히 유산단한균을 포함하는 세균 같은 미생물로부터 글루코오스 이성화효소가 제조될 때 유용하다.

본 분야에 알려진 방법에 따라 세포외로 효소를 제조하는 미생물로부터 효소제조물을 쉽게 얻을 수 있다. 이들 미생물에 대해서는 효소를 함유하는 매체로부터 여과, 원심분리 등의 방법으로 세포를 분리하는 것이 보통이다. 잔류하는 매체는 적절한 효소 조제물이다. 세포 내에서의 미생물 생성에 있어서는 우선 미생물의 세포로부터 효소를 분리해야 한다. 이런 분리를 수행하기 위한 실시방법은 미특허번호 3,708,397호, 3,850,751호, 3,868,304호에 묘사되어 있다. 따라서 자기분해(또는 초음파처리), 분쇄, 산분해 등의 방법을 사용하여 세포를 파괴시킨 후 여과하여 세포세편(細片)을 분리하면 흡착억제성 다당류를 함유하는 효소를 얻게 된다. 필요에 따라서 배지(培地) 또는 미생물 자체로부터 직접 얻은 미정제 효소 조제물을 통상의 방법으로 정제할 수 있다. 예를들면 미정제물을 프로타민(Protamine)과 같은 것으로 처리하여 핵산(核酸)을 침전 제거시키는 것이다. 조제물은 또한 흔히 농축 처리되기도 한다. 이렇게 한면 단위 활성도가 훨씬 큰 추출물을 얻을 수 있고 또한 오염물질도 감소된다. 그러나 미정제물을 종래의 정제 방법으로 처리함에 따라서 흡착억제성 다당류는 효소 조제물에 잔류하게 되는데 그 정도는 보통 효소의 단백질 중량에 대하여 수퍼센트 이상이다. 이 다당류는 그 존재 및 영향에 대해서는 종래 알려지지 않는 것으로 믿어지는데 반드시 완전히 제거하여 최대효소 흡착이 되게 해야 한다. 이들 다당류의 정확한 성질은 생성원에 따라 다르다. 따라서 종래의 효소 담체에 흡착될 수 있는 능력과 효소의 흡착저지(또는 억제) 능력만을 가지고 그 성질을 가장 적절하게 나타낼 수 있다. 그러나 그 위에 고분자량이면 비투석성(非透析性)이라는 점에서도 일반적으로 특성으로 볼 수 있다.

미정제 또는 정제된 조제물로부터 다당류를 분리시키자면 여러가지 방법을 적용할 수 있다. 예를들자면 다당류를 선택적으로 흡착하지만 효소에 대해서는 불활성인 이온교환수지와 접촉시켜 효소조제물로부터 다당류를 분리제거할 수 있다. 또 다른 방법으로는 유기용매를 효소조제물에 가하는데, 이때 효소를 선택적으로 침전시킬 수 있을 정도의 농도로 해서 가한다. 침전된 효소를 물같은 용매에 용해시켜 흡착억제성 다당류가 없는 재구성된 효소액을 생성시킨다. 마찬가지로 효소를 선택적으로 침전시킬 수 있을 정도의 농도에서 염을 효소조제물에 가한 후 재차 용해시켜 필요로 하는, 다당류가 함유되지 않는 용액을 만드는 방법도 있다. 다당류를 선택적으로 제거(이 경우 효소를 거의 흡착하지 않아야 함)하며 효소 용액으로부터 다당류를 분리시킬 목적으로서도 사용할 수 있는 흡착제로서는 강염기성 음이온 교환수지(type Ⅰ), 강염기성 음이온 교환수지(typeⅡ), 중간 정도의 염기성 음이온교환수지 및 약염기성 음이온교환수지가 있다. 전형적인 수지는 알 쿠닌(R. Kunin), 알 제이 마이어스(R.J. Myers), 존 윌리 엔드 썬즈(John Wiley & Sons)의 이온교환수지(1952)와, 미쯔비시 화학공업주식회사의 소책자 다이아이온(DIAION)-이온교환수지편람에 기재되어 있다. 그러나 효소를 전혀 또는 거의 흡착하지 않고 효소용액 중에 있는 다당류를 선택적으로 흡착 제거할 수 있는 물질이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 기타 적절한 흡착제 확인방법으로는 다음에 나오는 실시예에 열거되는 방법으로 통상적인 시험을 하면 된다.

바람직한 특정수지로서는 Lewatit MP-500, Lewatit M-504, Lewatit CA-9268HL(이상의 것들은 모두가 서독 바이엘사제품 상표명임), IMAC A-27, IMAC S5-40, IMAC S5-50(이상의 것들은 일본 시내쯔화학주식회사 제품 상표명임) 등이 있다. 전술한 이온교환수지 중에서 교환기들은 OH,Cl,SO₄등과 같은 것이지만 NaCl 또는 HCl로부터 오는 Cl을 이용함이 특히 바람직하다.

이온교환수지를 사용하여 효소로부터 당류를 분리할 경우 효소 조제물의 농도를 보통 100-5,000IGIU/mι로 하는데 500IGIU/mι로 하는 것이 특히 좋다. 그러한 농도는 필요에 따라 희석시키거나 농축시켜 얻을 수 있다. 이어서 칼럼(Column) 또는 기타 적당한 용기 중에서 전술한 이온교환수지와 단순히 접촉시킨다.

효소의 활성도를 “IGIU”로 나타냄에 있어서 이것은 국제 글루코오스 이성화 효소단위(International Glucose Isomerase unit)의 약자이다. 효소 1IGIU는(예로서 글루코오스 이성화 효소의 경우) MgCl₂0.01몰과 COCl₂0.001몰 존재하에 pH 7.5 및 60℃로 조절한 글루코오스 0.1몰 용액 중에서 1분당 프룩토오스 1마이크로몰을 생성할 수 있는 량을 나타낸 것인데, 다음 분석과정을 이용하여 표준상태하에서 글루코오스 용액으로 생성된 케토오스를 분광광도 측정법에 의해 측정한다.

모액(母液)을 다음과 같은 방법으로 만든다.

분석용 모액

성 분 량

0.01 M MgCl₂1mι

0.001 M CoCl₂1mι

1.0 M 인산완충액, pH7.5 0.5mι

무수 D-글루코오스 1.44g

증류수 전체용적이 7.5mι가 되게가 함.

분석용 효소를 먼저 희석시켜 1-6IGIU/mι가 되게 한다. 효소의 이성화 반응은 효소 1mι를 모액 3mι에 가하고 60℃에서 30분간 배양시키면 된다. 배양종료시에 가서 1mι를 취하여 0.5N과 염소산 9mι중에 넣어 급냉시킨 후 전체용적이 250mι가 되게 희석시킨다.

비교시험을 해보기 위하여 용액상태의 효소 1mι 대신에 물 1mι를 사용하여 배양 초기에 글루코오스 공시험을 행하고 시스테인(Cysteine)-황산법을 사용하여 개토오스를 측정한다. 이 분석을 함에 있어서 전술한 바와같은 이성화조건하에서 매분당 프룩토오스 1마이크로몰을 생성하는데 필요한 효소활성도의 량을 1IGIU라고 한다.

예를들자면 칼럼 중에서의 다당류의 흡착은 칼럼중으로 효소 조제물을 0.5-10BVH의 유속으로 통과시켜 흡착시켜야 하는데 일반적으로 1.0BVH로 하는 것이 좋다.

또는 칼럼중으로 효소 조제물을 3-24시간, 일반적으로 10-15시간 동안 순환시켜도 된다.

BVH란 SV, 즉 공간속도(space velocity)라고도 하는데 1시간 당흡착제부피 (bedvolumes per hour)중을 통과하는 칼럼유속이다.

용기중에서 회분식(回分式) 방법으로 흡착을 시킬 때는 효소조제물을 전술한 흡착제와 접촉시키는데, 이때 30분-24시간, 대체로 2-5시간 동안 교반하여 준다. 이와같이 하여 다당류를 흡착시켜 효소 조제물로부터 분리한다.

다당류가 흡착될 때의 효소조제물의 pH는 4-11, 대체로 5부근으로 하여 주어야 한다. 더욱이 온도는 실온으로 하여 주는 것이 특히 바람직하며 대체로 46-60℃의 범위로 해야 한다.

유기용매를 사용하여 다당류를 분리시키는 전술한 방법을 실시함에 있어서 공존하고 있는 다당류를 침전시키지 않고 효소를 침전시킬 수 있는 용매라면 어떤 것이라도 좋다.

대표적인 용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, t-부탄올, 아세톤, p-디옥산 또는 이들의 혼합물 등이 있다.

다당류를 침전시키지 않고 효소를 침전시킬 수 있을 정도로 유기용매를 충분한 량으로 효소조제물에 가한다. 예를들자면 이소프로판올을 사용할 경우에 있어서 용적으로 30-38%, 대체로 약 36% 정도의 농도로 할 수 있을 정도의 량을 가한다.

아세톤을 사용할 경우에는 농도가 용적으로 27-36%(30-33%가 좋음)가 되게끔 가해야 하고, 에탄올의 경우는 36-45%(38-42%가 좋음), 메탄올의 경우는 44-55%, 프로판올에 대해서는 30-38%, t-부탄올의 경우는 28-36%, 그리고 p-디옥산의 경우는 28-36%으로 해야 한다.

이들 유기용매를 사용할 때 일반적으로 먼저 효소 조제물의 pH를 5-8(대체로 약 7 정도가 좋음)의 범위로 조절하여 두고 유기용매(10°-20℃까지 사전 냉각시킨 것)를 가하는데 이때 목적농도에 도달할 때까지 계속해서 완만하게 교반을 한다.

용매의 농도가 적정수준이 되면 교반을 다시 30분-2시간 정도 더 계속한 후 침전된 효소를 원심분리법 또는 경사분리법을 사용하여 수집하고, 이것을 물과 같은 용매에 용해시킨다.

선택적인 침전이 되도록 효소액에 가하는 염으로서는 황산암모늄, 황산나트륨 및 황산 마그네슘이 있다. 그러나 이러한 작용을 할 수 있는 염이면 동등하게 모두 사용할 수 있다.

이들 염을 효소 조제물에 가하여 효소를 소요의 선택적인 침전이 될 수 있는 농도가 되게 해야 한다.

예를들자면 황산 암모늄의 경우에 있어서는 전체 중량으로 45% 이상의 수준, 대체로 50-60% 포화가 되게끔 가해줘야 한다.

염을 효소에 가할 때는 효소의 pH를 5-8, 대체로 약 7 정도가 되게 하여야 좋고 이때 완만하게 교반시키면서 가한다. 염의 농도가 적절하게 되면 30분-2시간 정도 더 교반을 해주고 원심분리법 또는 경사분리법으로 침전이 된 효소를 수집한후 재용해시킨다.

전술한 방법으로 얻은 효소액 중에는 흡착억제성 다당류가 완전히 함유되지 않은 것으로 이것을 흡착성 담체와 접촉시켜 효소를 고착시킨다.

적절한 흡착성 담체로는 공지의 문질들이 있는데, 즉 이온교환수지, DEAE-셀룰로오스, 염기성 탄산마그네슘, 콜로이드실리커, 활성탄 및 다공성 알루미나 등이 있다.

흡착성 이온교환수지의 예를들자면

Amberlite IRA-904, Amberlite IRA-938, Amberlite IRA-93, Diaion PA-302, Diaion PA-304, Diaion PA-308, Diaion WA-20, Duolite A-2, Duolite A-7, Duolite S-3, Duolite ES-561 및 Duolite ES-562 등이 있다.

담체로서 이온교환수지를 사용할 경우 교환기로는 OH형, Cl형, SO₄형 등이 있으며 이중 어느 것이라도 좋은데 가장 바람직한 것으로는 NaCl 또는 HCl로 재생시켜 만든 Cl형이다.

DEAE-셀룰로우스 담체는 효소를 고착시키는데 사용되며 여기에 속하는 것으로는 공지의 물질들인 Selectacel-20이 있다. 콜로이드 실리커로서는 LUDOX HS-30, LUDOX HS-40, LUDOX, AM LUDOX TM, Snowtex 20, Snowtex 30, Snowtex N 등이 있다. 다공성 알루미나의 예로는 미국 코오닝사(Corning Co.)의 것이 있고 활성탄으로는 Darco S-51과 Darco G-60이 있다.

다당류를 함유하지 않은 효소액을 전술한 담체와 접촉시켜 효소를 흡착 또는 고착시킴에 있어서 칼럼내에서나 기타 적절한 용기 내에서 담체와 용액을 접촉시키는데, 이때 농축 또는 희석을 시켜 용액을 소요의 농도(예로서 글루코오스 이성화 효소 농도로서50-1,000mι U/mι, 대체로 약 300U/mι로 함이 좋음)로 조절한 후 사용하든지 용액 그대로의 농도로 해서 사용한다.

고착시킬 때에 효소액의 pH를 4-11, 특히 pH 7-8 부근으로 하여 주는 것이 좋다.

더욱이 온도는 4℃-60℃ 특히 실온 정도로 해줘야 한다.

칼럼 중에서 고착시킬 경우는 효소액을 0.5-10BVH(대체로 1.0BVH가 좋음)의 유속으로 칼럼 중에 도입해야 된다. 또 다른 방법으로서도 3-24시간(대체로 10-15시간이 좋음) 동안 칼럼 중에서 순환시켜 흡착을 시킬 수도 있다.

회분식 흡착 처리에 있어서 적절한 용기 내에서 고착시킬 때에는 효소액과 담체를 30분-24시간(대체로 2-5시간이 좋음)동안 교반하면서 접촉시켜야 한다.

본 발명을 실험 실시예에 따라 상술하기로 한다.

[실험실시예 1]

Streptomyces olivochromogenes(FERM 1640, ATCC 21114)를 30℃에서 약 50시간동안 액체 배지중에서 진동 배양(振動培養) 시킨 후 10,000rpm에서 20분간 원심 분리시켜 세포를 수집한다. 습한 세포의 중량을 달은 후 10mM MgCl₂를 함유한 이온교환수(3용적) 중에 현탁시키고, 이어서 습한 세포 중량에 대해 리소자임(lysozy me) 0.02%와 톨루엔 1%를 가하고 30℃에서 24시간동안 완만하게 교반하면서 용균작용(lysis)을 시킨다.

최종적으로 생성된 분해물을 10,000rpm에서 20분간 원심 분리시키고 세포세편(細片)을 제거한다.

다음에 동일 용적의 이소프로필 알코올을 상청액(上淸液)에 가하는데 이때 완만하게 교반을 하여 준다. 혼합액을 다시 원심 분리하여 침전물을 수집한다. 침전물을 소량의 탈염수(脫鹽水)(10mM MgCl₂함유) 중에 용해시킨다. 이와 같은 일련의 작업을 하면 세포 내의 초기 글루코오스 이성화효소 중의 70% 이상을 가용성 형태로 하여 회수하게 된다. 공일 미생물 균주(菌株)를 사용하여 전술한 방법에 따라 19회나 반복하여 19가지의 각기 다른 글루코오스 이성화 효소액을 제조한다. 이들 19가지의 글루코오스 이성화 효소액을 다음과 같은 방법을 사용하여 실험을 행한다.

크기가 1.6×20cm인 19개의 칼럼 중에 강염기성 이온교환수지인 Amberlite IRA-904 10mι를 충전시킨 후 탈염수를 사용하여 칼럼을 세척한다. 전술한 19가지의 글루코오스 이성화 효소를 희석시켜 각 농도가 500u/mι가 되게 하고 다시 각 칼럼에 1.0BVH의 유속으로 10mι를 가한다. 이들 글루코오스 이성화 효소액을 각 칼럼을 통하여 하루밤 동안 동일 유속으로 순환시켜 효소를 흡착 및 고착시킨다.

이어서 이들 각 칼럼을 탈염수 100mι를 사용하여 세척하여 미흡착물질을 칼럼에서 분리제거하고 세척액중의 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 측정한다.

아래에 나오는 식들을 사용하여 이온교환수지 1mι당 흡착된 글루코오스 이성화 효소의 활성도의 량과 19개의 각 칼럼에 대한 흡착 효율을 계산한다.

칼럼에 공급된 글루코오스 이성화 효소의 총 활성도를 (A)로 표시하고 세척액 중에 있는 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 (B)로 표시하여 이온교환수지의 용적(mι)을 (C)로 나타내기로 한다.

이온교환수지 1mι당 흡착된 글루코오스 이성화 효소의 활성도=

흡착효율=

다음에 전술한 19가지의 글루코오스 이성화 효소 각각에 대해 5mι씩을 취하여 10mM MgCl₂와 1mM CoCl₂를 함유한 탈염수에 대해 하루밤 동안 투석시켜 글루코오스 이성화 효소액 중에 함유된 저분자량의 단당류와 프로판올을 제거하는데 이때 비투석정의 다당류는 잔류하게 된다. 이들 투석이 된 글루코오스 이성화 효소용액의 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 측정하고 페놀-황산법에 의해 단당류의 함량을 측정한다.

글루코오스 이성화 효소 1단위당 다당류의 량을 계산한다. 19가지의 글루코오스 이성화 효소액을 Amberlite IRA-904에 대한 흡착효율이 높은 순서로 배열하여 표 1에 나타내었다.

표 1에 나타난 결과를 보면 상당량의 고분자량의 다당류(하루밤 동안 투석시켜도 제거되지 않는 것임)가 존재하므로 해서 이온교환수지에 의한 글루코오스 이성화 효소의 흡착을 방해하고 있다는 것을 알 수 있다.

[표 1]

[실험실시예 2]

실험실시예 1에 나온 19가지의 글루코오스 이성화 효소 조제물 전체 중에서 Amberlite IRA-904에 가장 불량하게 결합되는 글루코오스 이성화 효소액 S를 사용하여 다음과 같은 실험을 한다. 용액 S(40,000 단위의 글루코오스 이성화 효소함유) 20mι를 0.05M 3-HCl완충액(pH 7.0 ; 10mM MgCl₂와 1mM CoCl₂함유)에 대하여 하루밤 동안 투석시킨 것을 DEAE-셀룰로오스 칼럼(크기 : 2.2×50cm, DEAE-셀룰로오스 150mι함유) 중에 공급한다. 이때 동일 완충액을 사용하여 38.5mι/hr의 유속으로 미리 칼럼을 평형화시켜 둔다. 글루코오스 이성화 효소 및 다당류는 담체상에 흡착된다.

NaCl농도 범위를 0-0.5M로 하여 농도 기울기법에 따라 용리(熔離)시킨 용리물을 분활 수집기를 사용하여 7mι를 수집하고 각 분별물을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도와 280mu에서의 흡착도 및 다당류의 함량을 측정한다.

제1도에서 명확히 알 수 있는 바와 같이 글루코오스 이성화 효소는 NaCl농도 0.05M에서 용리되지만 다당류는 NaCl농도 0.1M에서 용리된다. 이러한 결과는 글루코오스 이성화 효소액 중에서 공존하고 있는 글루코오스 이성화 효소 및 다당류를 성공적으로 분리했다는 것을 뜻한다. 이러한 방법으로 얻을 글루코오스 이성화 효소를 60% 이소프로판올을 사용하여 농축시키는 한편 다당류를 증발기에서 농축시킨다. 글루코오스 이성화 효소액(S)으로부터 분리시켜 정제한 다당류는 평균 분자량이 약34,000정도이다.

실험실시예 1에서의 글루코오스 이성화용액 H 및 B에 대해서도 동일실험방법을 적용하여 유사한 결과를 얻었다.

[실험실시예 3]

실험실시예 2에서와 같은 방법을 따라 글루코오스 이성화 효소액(S)으로부터 다당류를 분리하여 농축시키고 정제된 글루코오스 이성화 효소 조제물도 또한 만든다. 이들 두 가지 물질과 용액(S)를 사용하여 다음과 같은 실험을 한다.

크기가 1.6×20cm인 세 가지 칼럼에다 Amberlite IRA-904 10mι를 각각 충전시킨 후 탈염수로 잘 세척한다. 다음에 용액(S)를 칼럼(1)에 공급하고 정제된 글루코오스 이성화 효소 조제물은 칼럼 (2)로 공급하고 칼럼(3)에는 다당류를 정제된 글루코오스 이성화 효소조제물에 다시 첨가하여 만든 용액을 가한다.

각 경우에 있어서 글루코오스 이성화 효소 농도를 약 500U/mι정도가 되게 희석한 용액을 1.0BVH의 유속으로 칼럼 중에 가한다. 동일 유속으로 하루밤 동안 칼럼을 통하여 용액을 순환시켜 수지가 흡착을 하도록 한다.

이들 세 가지 각 칼럼 중에 공급된 효소액 중에는 글루코오스 이성화 효소의 활성도가 5,000단위가 되며 칼럼 (1)과 (3)에 공급된 효소액 각각에는 다당류를 8mg 함유한다. 흡착과정이 끝나면 각 칼럼을 탈염수 100mι를 사용하여 세척하므로서 미흡착물질을 수지층에서부터 제거한다.

각 세척액 중에 함유된 다당류 및 글루코오스 이성화 효소의 량을 측정하며 Amberlite IRA-904 수지에 흡착된 글루코오스 이성화 효소 및 다당류의 흡착정도를 계산한 결과는 다음 표와 같다.

[표 2]

다음에는 실시예 2의 방법에 따라 정제된 글루코오스 이성화 효소 및 다당류의 글루코오스 이성화 효소액 (H) 및 (B)로부터 제조한다. 이들 물질은 방금 나온 방법에 따라 사용하여 실험한 결과는 다음 두가지 표에 나타난 바와 같다.

[표 3]

[표 4]

상기 표에서 글루코오스 이성화 효소액 중의 다당류는 글루코오스 이성화 효소 흡착성 담체, 예를들자면 이온 교환수지 같은 것에 의해 글루코오스 이성화효소 그 자체보다 더욱 선택적으로 흡착됨을 알 수 있다. 따라서 글루코오스 이성화 효소의 흡착을 억제하는 데 큰 영향을 주고 있는 것이다. 또한 분명한 사실로서는 글로코오스 이성화 효소액 중의 다당류의 량이 감소되거나 없어지게 되면 글루코오스 이성화 효소에 대한 흡착지 증가된다는 것이다.

[실험실시예 4]

실험실시예 1에서 제조된 글루코오스 이성화 효소액(S)를 10mM MgCl₂및 1mM CoCl₂를 함유하는 탈염수에 대해 4℃에서 하루밤 동안 투석시킨다. 탈염수의 외부 투석 용액을 투석과정 도중 자주 갈아준다.

투석된 용액을 각각 16mι씩 분취하고(각각에는 글루코오스 이성화 효소 9,683단위와 다당류 189.79mg을 함유함) 열 개의 50mι들이 비이커에 각각 옮겨 넣는다. 차거운 이소프로판올을 교반하면서 각 비이커에 서서히 가하는데 각각 6,7…14 및 15mι가 되게 한다. 4℃에서 30분간 교반을 계속한 후 각 혼합물을 원심 분리판으로 옮겨 15,000rpm에서 15분간 원심 분리시킨다.

상청액을 경사분리하여 제거하고 침전물을 약 30mι 정도의 탈염수에 용해시킨다. 이렇게 해서 만든 10가지 용액 각각을 50mι들이 메스플라스크에 옮기고 탈염수를 가하여 용적이 50mι가 되게 한다. 글루코오스 이성화 효소 전활성도 및 다당류의 함량을 각 용액에 대해 측정한다.

초기에 사용한 글루코오스 이성화 효소액 16mι중에 함유된 글루코오스 이성화 효소의 전 활성도를 E₁, 여기에 함유된 다당류의 함량을 P₁, 회수한 물질 중에 함유된 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 E₂, 여기에 함유된 다당류의 량을 P₂이라고 하여, 다음 식에 이들을 대입하면 이소프로판올로 처리한 10가지 조제물 각각에 대해 글루코오스 이성화 효소 및 다당류에 대한 회수율을 계산한다. 각 용액에 대해서도 글루코오스 이성화 효소 1단위당 다당류의 량을 계산한다.

글루코오스 이성화 효소 회수율=

다당류 회수율=

글루코오스 이성화 효소 1단위당 다당류 량(r/u)=

이들 식을 사용하여 계산한 결과는 표 5와 같다.

[표 5]

이소프로판올 농도가 글루코오스 이성화 효소 및 다당류의 분리에 미치는 영향

표 5를 볼 것 같으면 이소프로판올의 농도가 용적으로 36.0% 이하에서는 다당류가 거의 침전이 되지 않지만 이소프로판올 농도가 점차 커지게 됨에 따라 효소와 더불어 계속하여 침전된다는 것을 알 수 있다. 한편으로 글루코오스 이성화 효소의 회수율은 이소프로판올 농도가 용적으로 33%일 때 극히 크다는 것을 분명히 알 수 있다. 이소프로판올의 농도를 용적으로 30-38%(대체로 36% 정도가 좋음)로 하며 회수율이 저하되지 않고서도 글루코오스 이성화 효소를 우선적으로 침전시킬 수 있다. 동시에 수지 담체에 글루코오스 이성화 효소가 흡착되는 것을 억제하는 다당류는 액상에 그대로 잔존하게 된다.

다음에 크기가 1.6×20cm인 9개의 칼럼 중에 각각 습한 Amberlite IRA-904 수지 10mι를 충전하고 탈염수로 잘 세척한다. 전술한 방법과 같이하여 글루코오스 이성화 효소액(S)을 사용하여 분취한 후 9가지의 각기 농도가 다른 이소프로판올(용적으로 30.4%인 것과 그 이상인 것)을 사용하여 처리한다.

생성된 글루코오스 이성화 효소 침전물을 탈염수에 용해시킨다. 이와같이 하여 만든 효소 조제물 중에 글루코오스 이성화 효소 3,000단위가 함유되도록(효소액 15.6-22mι중에) 조절한 후 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤동안 전술한 바 있는 칼럼을 통하여 순환시킨다.

순환 및 흡착이 완전히 끝나면 각 칼럼을 탈염수 50mι로 세척하여 미흡착물을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소 활성도를 측정한 결과는 표 6에 있는 바와 같다.

[표 6]

표 6에 나타난 결과를 보면 이소프로판올을 사용하여 다당류를 액상 중에 잔존시키면서 글루코오스 이성화 효소를 우선적으로 침전시킬 경우 농도를 30-38용적%로 해주는 것이 가장 바람직하다는 것을 명확히 알 수 있다.

[실험실시예 5]

실험실시예 4에서 나온 투석시킨 글루코오스 이성화 효소를 사용하여 효소액 16mι씩을 분취하여(이때 글루코오스 이성화 효소 9.683단위와 다당류 189.79mg을 함유함) 50mι들이 비이커 7개중으로 옮겨 넣은 후 용액을 고반하면서 차거운 아세톤을 서서히 가하는데 이때 용적을 6.7…11 및 12mι로 하여 비이커에 가한다. 4℃에서 30분간 교반한 혼합물을 각각 원심분리기에서 15,000rpm으로 15분간 처리하여 분리한다.

상청액을 경사분리제거하고 침전물을 각각 탈염수 30mι정도에 용해시킨 것을 50mι들이 메스플라스크로 옮겨 넣고 탈염수를 가하여 50mι가 되게 한다. 이들 각 효소액을 분석하여 글루코오스 이성화효소 총 활성도와 총 다당류 함량을 구한다. 본 실시예에 대한 결과는 표 7에 있는 바와 같다.

아세톤의 농도가 33.3용적% 이하가 되면 글루코오스 이성화 효소에 함유된 다당류는 침전되기가 어렵다는 것을 알 수 있다.

아세톤의 농도가 36용적% 이상이 되면 침전 및 회수속도가 크게 된다. 한편으로 아세톤의 농도가 30.4용적 %가 되면 글루코오스 이성화 효소의 회수율이 크게 된다.

[표 7]

아세톤 농도가 글루코오스 이성화 효소 및 다당류의 분리에 미치는 영향

아세톤의 농도를 30-33용적%로 하여 주게되면 회수율이 저하됨이 없이 글루코오스 이성화 효소를 우선적으로 침전시킬 수 있음과 동시에 수지 담체에 대한 글루코오스 이성화 효소의 흡착을 억제하는 다당류가 액상중에 잔류하게 된다.

다음에 크기가 1.6×20cm인 7개의 칼럼 각각에 습기가 있는 Amberlite IRA-904 수지 10mι를 충전한 후 탈염수로 잘 세척한다. 전술한 방법으로 글루코오스 이성화 효소액(S)을 처리하여 7가지로 분취한 후 각기 다른 농도를 가진 7가지 아세톤으로 처리하여 얻은 글루코오스 이성화 효소 침전물을 탈염수에 용해시킨다. 이와같이 조제한 효소액 중에 글루코오스 이성화 효소 활성도가 3,000단위(효소액 16-19mι중)로 되게 조절한 후 전술한 칼럼을 통하여 실온에서 공간속도 1의 유속으로 하루밤 동안 순환시킨다.

순환과 흡착이 끝나면 각 칼럼을 탈염수 50mι로 세척하여 미흡착물을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 구한다. 그 결과는 표 8에 있는 바와 같다.

[표 8]

표 8에 나타난 결과에서 분명히 할 수 있는 바와 같이 아세톤을 사용하여 글루코오스 이성화 효소를 선택적으로 흡착시킬 경우 그 농도를 27-36%로 함이 가장 바람직하다.

[실험실시예 6]

실험실시예 4에서 조제한 투석시킨 글루코오스 이성화 효소액을 사용하여 각각 11mι씩 분취하고(이때 글루코오스 이성화 효소 6.657단위와 다당류 130.48mg을 함유) 50mι들이 비이커 6개에 옮겨 넣는다. 용액을 완만히 교반하면서 차거운 에탄올을 서서히 비이커 중에 가하여 각각 용적이 6,7,8,9,10 및 11mι가 되게 한다. 4℃에서 30분간 교반을 계속한 후 혼합물을 각각 원심 분리기에 넣고 15,000rpm에서 15분간 분리시킨다.

상청액을 경사분리 제거하고 침전물을 각각 15mι 정도의 탈염수 중에 용해시킨 후 이들 각 용액을 25mι들이 메스플라스크에 옮기고 탈염수를 사용하여 용적 25mι가 되게 한다. 이들 각 효소액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 총 활성도 및 다당류 함량을 구한 결과는 표 9와 같다.

[표 9]

에탄올 농도가 글루코오스 이성화 효소 및 다당류의 분리에 미치는 영향

표 9에서 나타난 결과에서 알 수 있다싶이 에탄올의 농도가 용적으로 42.1% 이하가 되면 글루코오스 이성화액에 함유된 다당류는 침전이 되기가 어렵다는 것이다. 에탄올의 농도가 계속해서 45.0용적% 이상이 되면 침전 및 회수가 가능하다. 한편 에탄올 농도가 38.9용적%일 때 글루코오스 이성화 효소는 완전히 회수된다.

에탄올의 농도를 38-42용적%가 되게 하면 회수율이 저하되지 않고서도 글루코오스 이성화 효소를 선택적으로 침전시킬 수 있다. 동시에 수지 담체에 대한 글루코오스 이성화 효소의 흡착을 억제하는 다당류는 액상 중에 잔류하게 된다.

다음에 크기가 1.6×20cm인 6개의 칼럼 중에 각각 습한 Amberlite IRA-904 수지를 충전하고 탈염수로 잘 세척한다. 전과 같은 방법으로 글루코오스 이성화 효소액(S)을 사용하여 분취한 것을 6가지의 농도가 각기 다른 에탄올로 처리한다. 이와같이 하여 얻은 글루코오스 이성화 효소 침전물을 탈염수에 용해시키고 글루코오스 이성화 효소의 활성도가 3,000단위(효소액 11.3-16.7mι중에)가 되게 조절한 후 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 전술한 칼럼을 통하여 순환시킨다.

순환과 흡착이 끝나면 각 칼럼을 탈염수 50mι로 세척하여 수지층에 있는 미흡착물질을 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 구하는데 그 결과는 표 10과 같다.

[표 10]

표 10의 결과를 보면 에탄올을 사용하여 글루코오스 이성화 효소의 선택적인 침전을 하도록 할 경우 그 농도는 30-45용적%가 되어야 가장 바람직한 결과를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.

[실험실시예 7]

실험실시예 4에서 나온 바와같이 투석처리를 하여 얻은 효소액을 16mι씩 분취(이때 글루코오스 이성질화 효소 9,683단위 및 다당류 189.79mg 함유)한 것을 50mι들이 비이커 6개에 각각 옮겨 넣은 후 용액을 4℃에서 완만히 교반하면서 황산암모늄을 가하여 각각 포화도가 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 및 70%가 되게 한다. 다시 30분간 더 교반을 한 후 혼합물을 각각 원실분리기에 넣고 15,000rpm에서 15분간 처리하여 분리시킨다.

상청액을 경사분리제거하고 각 침전물을 별도로 약 30mι 정도의 탈염수중에 용해시킨 액들을 50mι들이 메스플라스크에 옮기고 탈염수를 사용하여 전체 용적이 각각 50mι가 되게 한다.

이들 각 효소액을 분석하여 글루코오스 이성화효소 총 활성도 및 다당류 함량을 구한 결과는 표11과 같다.

표 11에 나타난 결과를 보면 글루코오스 이성화 효소액 중에 함유된 다당류는 황산 암모늄의 포화도가 45-70%, 또는 본 실시예에서 사용한 포화도의 전체범위 이상으로 되면 침전이 잘 되지 않음을 알 수 있다. 한편으로 글루코오스 이성화 효소는 황산 암모늄의 포화도가 50% 이상이 되면 거의 완전히 침전되어 회수된다.

황산 암모늄을 사용하므로서 다당류를 함유하는 글루코오스 이성화 효소액으로부터 글루코오스 이성화 효소를 선택적으로 침전시킬 수 있다.

[표 11]

황산 암모늄의 농도가 글루코오스 이성화 효소 및 다당류의 분리에 미치는 영향

다음에 크기가 1.6×20cm인 칼럼 6개 중에 습한 Amberlite IRA-904 수지 10mι씩을 각 칼럼 중에 충전하고 탈염수로 잘 세척한다. 전과 같은 방법으로 글루코오스 이성화 효소액(S)을 사용하여 일정량을 각각 분취하고 6가지의 농도가 각기 다른 황산 암모늄으로 처리한다. 생성된 글루코오스 이성화 효소 침전물을 탈염수에 용해한 효소액 중에 글루코오스 이성화 효소의 활성도가 3,000단위(효소액 15.5-33.3mι중)가 되게 조절한 후 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 전술한 칼럼을 통하여 순화시킨다.

순환과 흡착이 끝나면 각 칼럼을 탈염수 50mι로 세척하여 미흡착물을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 구하는데 그 결과는 표 12에 있는 바와 같다.

표 12에 나타난 결과를 보면 황산 암모늄을 사용하여 글루코오스 이성화 효소의 선택적인 침전이 일어나게 하자면 황산 암모늄의 농도가 포화도가 45% 이상이 되어야 한다는 것이다.

[표 12]

전술한 방법으로 얻은 글루코오스 이성화 효소를 함유한 용액은 다당류가 거의 완전히 제거된 것으로서 글루코오스 이성화 효소 흡착성 담체와 접촉시켜 글루코오스 이성화 효소를 여기에 흡착시킨다.

다음에는 본 발명을 응용 실시예에 따라 상술하기로 한다.

[실시예 1]

강염기성 음이온 교환수지(sype Ⅰ)인 습기가 있는 Lewatit M-500 10mι를 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 충전시킨 후 2M NaCl 용액 50mι를 사용하여 1BVH의 유속으로 먼저 처리하고 이어서 물로 철저히 세척한다.

다음에는 실험실시예 1에서 조제한 글루코오스 이성화 효소액(S) 3ml(글루코오스 이성화 효소 5,000단위와 총당류 함량 112mg 중에서 다당류 98mg 함유)을 사용하여 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 전술한 칼럼을 통하여 순환시킨다.

칼럼을 20mι의 탈염수로 세척하여 미흡착물을 수지층에 분리제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도 및 글루코오스 이성화 효소 및 총당류에 대한 흡착율을 계산한다.

나타난 결과를 보면 Lewatit M-500은 글루코오스 이성화 효소를 거의 흡착하지 않지만 총당류중 80.1%를 흡착하고 있다.

다음에 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 습기가 있는 Amberlite IRA-904 수지 10mι를 충전시키고 탈염수로 철저히 세척한 후 전술한 바 있는 Lewatit M-500으로 된 칼럼에서 처리하여 글루코오스 이성화 효소액(S)으로부터 대부분의 다당류를 제거한 글루코오스 이성화 효소액을 15mι(글루코오스 이성화 효소 3,000단위 함유)를 취하여 Amberlite IRA-904 칼럼에 공급하고 실온에서 공간속도 1의 유속으로 하루밤 동안 칼럼을 통하여 순환시킨다.

탈염수 50mι를 사용하여 칼럽을 세척하여 미흡작물을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소 함량을 구한다. 확인된 결과에 의하면 공급한 글루코오스 이성화 효소의 99.4%가 Amberlite IRA-904 수지에 흡착되며 글루코오스 이성화 효소를 흡착한 Amberilte IRA-904 수지는 고착 글루코오스 이성화 효소로 사용할 수 있다는 것이다.

[실시예 2]

강염기성 음이온 교환수지(type Ⅰ)인 습기가 있는 Lewatit M-504 수지 10mι을 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 충전시키고 2M NaCl 50mι를 사용하여 1BVH의 유속으로 처리한 후 물로 철저히 세척한다.

실험실시예 1에서 조제한 글루코오스 이성화 효소액(S) 3mι(글루코오스 이성화 효소 5,000단위와 총당류 함량 112mg 중 다당류 98mg 함유)를 취하여 실온에서 공간속도 1의 유속으로 하루밤 동안 전술한 칼럼을 통하여 순환시킨다.

탈염수 20mι를 사용하여 칼럼을 세척하여 미흡착물을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도, 총당류의 활성도 및 글루코오스 이성화 효소와 전체 탄화수소물에 대한 흡착효율을 계산한다.

결과에 의할 것 같으면 Lewatit M-504는 글루코오스 이성화 효소를 거의 흡착하지 않는 반면 총당류 중 81.0%를 흡착하고 있다.

다음에 1.6×20cm 크기의 칼럼 중에 습기가 있는 Amberlite IRA-904 수지 10mι를 충전하고 탈염수로 철저히 세척한 후 전술한 방법으로 Lewatit M-504로 된 칼럼에서 처리하여 글루코오스 이성화 효소액(S)으로부터 다당류를 전부 제거한 글루코오스 이성화 효소액 15mι(글루코오스 이성화 효소 3,000단위 함유)를 취하여 Amberlite IRA-904 칼럼 중에 공급하고 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 칼럼을 통하여 순환시킨다.

탈염수 50mι를 사용하여 칼럼을 세척하여 미흡착물을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 구한다. 확인된 결과에 의할 것 같으면 공급한 글루코오스 이성화 효소의 99.5%가 Amberlite IRA-904 수지에 흡착된다는 것이다.

[실시예 3]

강염기성음 이온교환수지(tyhe Ⅱ)인 습기가 있는 Lewatit CA-9268HL 10mι을 크기 1.6×20cm인 칼럼 중에 충전하고 2M NaCl 용액 50mι을 사용하여 공간속도 1에서 처리한 후 물로 철저히 세척한다. 다음에 실험실시예 1에서 조제한 글루코오스 이성화 효소액 (S) 3mι(글루코오스 이성화 효소 5,000단위와 총당류 함량 112mg중 다당류 98mg 함유)을 취하여 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 전술한 칼럼을 통하여 순환시킨다.

탈염수 20mι를 사용하여 칼럼을 세척하여 미흡착물을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도, 총당류의 함량 및 글루코오스 이성화 효소와 총당류에 대한 흡착효율을 계산한다. 결과에 의하면 Lewatit CA-9268HL을 글루코오스 이성화 효소를 거의 흡착하지 못하지만 총당류중 87.9%를 흡착하고 있다.

다음에 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 습기가 있는 Amberlite IRA-904 10mι를 충전한 후 전술한 방법으로 Lewatit CA-9268 HL로 된 칼럼에서 처리하여 글루코오스 이성화 효소액(S)으로부터 다당류의 대부분을 제거한 글루코오스 이성화 효소액 15mι(글루코오스 이성화 효소 3,000단위)를 취하여 Amberlite IRA-904로 된 칼럼 중에 공급하고 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 칼럼을 통하여 순환시킨다.

탈염수 5mι를 사용하여 칼럼을 세척하여 미흡착물을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 구한다.

결과에 의하면 Amberlite IRA-904 수지는 공급한 글루코오스 이성화 효소를 100% 흡착하고 있다.

[실시예 4]

강염기성 음이온 교환수지인 습기가 찬 IMAC S5-40 10mι를 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 충전하고 2M NaCl용액 50mι를 사용하여 1BVH의 유속으로 칼럼을 처리한 후 물로 철저히 세척한다. 다음에 실험실시예 1에서 조제한 글루코오스 이성화 효소액(S) 3mι(글루코오스 이성화 효소 5,000단위와 총당류 함량 112mg 중에서 다당류 98mg 함유)를 취하여 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 전술한 칼럼을 통하여 순환시킨다.

탈염수 20mι를 사용하여 칼럼을 세척하여 미흡착물을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도, 총당류 함량 및 글루코오스 이성화 효소 및 총당류에 대한 흡착효율을 계산한다.

결과에 의할 것 같으면 IMAC S5-40은 글루코오스 이성화 효소를 거의 흡착하지 않으나 총당류 함량 중 88.2%를 흡착하고 있다.

다음에 습기가 있는 Amberlite IRA-904 수지 10mι을 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 충전하고 탈염수로 철저히 세척한 후 전술한 방법으로 IMAC S5-40으로 된 칼럼에서 처리하여 글루코오스 이성화 효소액(S)으로부터 다당류 대부분을 제거한 글루코오스 이성화 효소액 15mι(글루코오스 이성화 효소 3,000 단위 함유)을 취하여 Amberlite IRA-904로 된 칼럼 중에 공급하고 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 칼럼을 통하여 순환시킨다.

칼럼을 탈염수 50mι로 세척하여 미흡착물을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 구한다. 확인된 글루코오스 이성화 효소를 100% 흡착하고 있다.

[실시예 5]

강염기성 음이온 교환수지인 습기가 있는 IMAC S5-50 10mι를 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 충전하고 2M NaCl 용액 50mι 를 사용하여 공간속도 1에서 칼럼을 처리한 후 물로 철저히 세척한다.

다음에 실험실시예 1에서 조제한 글루코오스 이성화 효소액(S) 3mι(글루코오스 이성화 효소 5,000단위 및 총당류 함량 112mg 중 다당류 98mg 함유)을 취하여 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 전술한 칼럼을 통하여 순환시킨다.

칼럼을 탈염수 20mι로 세척하여 미흡착물질을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도, 총당류 함량 및 글루코오스 이성화 효소 및 총당류에 대한 흡착효율을 계산한다. 결과에 의하면 IMAC S5-50은 글루코오스 이성화 효소를 거의 흡착하지 않지만 총당류 함량중 66.9%를 흡착하고 있다.

다음에는 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 습기가 있는 Amberlite IRA-904 10mι를 충전하고 탈염수로 철저히 세척한다. 이어서 전술한 방법에 따라 IMAC S5-50으로 된 칼럼에서 처리하여 글루코오스 이성화 효소 중에서 다당류를 대부분 제거한 글루코오스 이성화 효소액 15mι(글루코오스 이성화 효소 3,000단위 함유)를 취하여 Amberlite IRA-904로 된 칼럼 중에 공급하고 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 칼럼을 통하여 순환시킨다.

탈염수 50mι를 사용하여 칼럼을 세척하여 미흡착물을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하여 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 구한다. 확인된 결과에 의하면 Amberlite IRA-904 수지는 공급된 글루코오스 이성화 효소를 100% 흡착하고 있다.

[비교실시예 1]

습기가 있는 Amberlite IRA-904 수지 10mι를 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 충전하고 탈염수로 철저히 세척한 후 실험실시예 1에서 조제한 글루코오스 이성화 효소액(S)를 농도 200u/mι까지 희석시키고 이중 15mι를 취하여 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 전술한 칼럼을 통하여 순환시킨다.

이 칼럼을 탈염수 50mι로 세척하여 미흡착물을 수지층으로부터 제거하고 세척액을 분석하고 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 구한다.

결과에 의하면 글루코오스 이성화 효소중 44.4%라는 낮은 정도로 Amberlite IRA-904 수지가 흡착하고 있다.

[실시예 9]

글루코오스 이성화 효소를 함유하는 미생물인 Streptomyces olivochromogenes(FERM 1640, ATCC 21, 114)를 액체 배지 50mι를 각각 함유하는 50-mι들이 삼각플레스크 100개에 도입하여 30℃에서 48시간 동안 진동 배양시킨다.

이들 배양액 모두를 모아서 균사(

)를 10000rpm에서 20분간 원심분리하여 수집한다. 습세포의 총중량, 수분함량, 건조중량 및 글루코오스 이성화 효소의 활성도 등에 대하여 초음파 처리한 후 측정을 한다. 각 측정치는 표 13에 나타난 바와 같다.

[표 13]

습세포 250g을 1ι들이 삼각 플라스크 중에 넣고 탈염수 750mι를 가하여 현탁시킨 후 리소자임 50mι(습세포에 대해 0.02%)과 톨루엔 10mι을 가하고 30℃에서 24시간 동안 완만히 교반하여 자가분해가 일어나도록 한다.

분해물을 15,000rpm에서 20분간 원심분리시켜 침전된 세포세편을 제거한다. 상청액을 글루코오스 이성화 효소액(T)라 하고 글루코오스 이성화 효소의 활성도, 총당류 함량, 용액을 하루밤 투석시킨 후의 다당류 함량을 구한 결과는 표 14에 있는 바와 같다.

[표 14]

글루코오스 이성화 효소액(T)의 분석 결과

다음에 글루코오스 이성화 효소액(T) 200mι(글루코오스 이성화 효소 13,754단위 및 총당류 337.76mg 함유)를 취하여 400mι들이 비이커에 넣고 차거운 이소프로판올 112.5mι 교반하면서 서서히 가한다(이소프로판올의 최종 농도는 36용적%) 4℃에서 1시간 동안 교반을 한 후 혼합물을 15,000rpm에서 15분간 원심분리한다. 상청액을 경사분리제거하고 침전물을 약 30mι 정도의 탈염수중에 용해시켜 50mι들이 메스플라스크에 옮긴다.

이것을 탈염수를 가하여 전체 용적이 50mι가 되게 한 후 이용액의 글루코오스 이성화 효소 활성도 및 총당류 함량을 구한다. 글루코오스 이성화 효소의 회수율은 95.67%인 반면 총당류의 회수율은 8.24%이었다. 글루코오스 이성화 효소 활성도에 대한 총당류 함량의 비는 2.12(r/u)이었다.

다음에 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 습기가 있는 Amberlite IRA-904 수지 10mι을 충전한 후 글루코오스 이성화 효소액(T)를 농도가 36용적%인 이소프로판올을 사용하여 처리하여 전술한 방법으로 조제한 효소액 12mι(글루코오스 이성화 효소 3,158단위 함유)을 이 칼럼 중에 도입하고 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 칼럼을 통하여 순환시킨다. Amberlite IRA-904로 된 칼럼에서 공급된 글루코오스 이성화 효소를 100% 흡착하였다.

[실시예 7]

실시예 6에서 조제한 글루코오스 이성화 효소액(T) 200mι(글루코오스 이성화 효소 13,754 단위와 당류 337.76mg 함유)를 취하여 400mι들이 비이커에 넣고 차거운 아세톤 100mι(최종 아세톤 농도 : 33.3%)를 교반하면서 서서히 가한다.

4℃에서 1시간 동안 교반한 혼합물을 15,000rpm에서 15분간 원심 분리시키고 상청액을 경사분리제거하고 침전물을 약 30mι 정도의 탈염수에 용해시킨 후 50mι들이 메스플라스크에 옮긴다.

이 용액을 탈염수에 가하여 용적이 50mι가 되게 한 후 이 용액의 글루코오스 이성화 효소 활성도 및 총 당류 함량을 구한다.

글루코오스 이성화 효소의 회수율은 97.59%인 반면 총당류의 회수율은 11.63%이었다. 글루코오스 이성화 효소의 활성도 1단위당 총 당류의 량은 2.93(r/u)이었다.

다음에 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 습기가 있는 Amberlite IRA-904 수지 10mι을 충전시킨 후 글루코오스 이성화 효소액(T)를 농도가 33.3용적%인 아세톤으로 처리하여 전술한 방법으로 조제한 효소액 12mι(글루코오스 이성화 효소 3,221단위 함유)을 이 칼럼 중에 가하고 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 순환시킨다.

Amberlite IRA-904로 된 칼럼에서의 공급된 글루코오스 이성화 효소가 100% 흡착되었다.

[실시예 8]

실시예 6에서 조제한 글루코오스 이성화 효소액(T) 200mι(글루코오스 이성화 효소 13,754단위 및 당류 337.76mg 함유)을 400mι들이 비이커에 넣고 차거운 에탄올 135mι(최종에탄올 농도 40.3%)을 교반하면서 서서히 가한다. 4℃에서 1시간 교반한 혼합물을 15,000rpm에서 15분간 원심분리시킨다. 상청액을 경사분리 제거하고, 침전물을 약 30mι 정도의 탈염수에 용해시킨 후 50mι들이 메스플라스크에 옮기고 탈염수를 가하여 전체 용적이 50mι가 되게 한다. 이 용액의 총당류 함량과 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 구한다. 글루코오스 이성화 효소의 회수율은 98.52%인 반면 총당류의 회수율은 12.03%이었다. 글루코오스 이성화 효소의 활성도 1단위당 총당류의 량은 3.00(r/u)이었다.

다음에 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 습기가 있는 Amberlite IRA-904 수지 10mι을 충전시키고 글루코오스 이성화 효소액(T)을 농도가 40.3용적%인 에탄올로 처리하여 전술한 방법으로 조제한 효소액 12mι(글루코오스 이성화 효소 3,252단위 함유)을 1칼럼에 도입하고 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 칼럼을 통하여 순환시킨다. Amberlite IRA-904로 된 칼럼 중에서의 공급된 글루코오스 이성화 효소의 흡착율은 100%이었다.

[실시예 9]

실시예 6에서 조제한 글루코오스 이성화 효소액(T) 200mι(글루코오스 이성화 효소 13,754 단위와 당류 337.76mg 함유)을 400mι들이 비이커에 넣고 이 효소액에 교반을 하면서 황산암모늄 70.2g(최종 황산암모늄 농도 ; 55% 포화도)을 가한다. 4℃에서 1시간 교반시킨 혼합물을 15000rpm에서 15분간 원심분리시키고 상청액을 경사분리 제거하며 침전물을 약 30mι 정도의 탈염수에 용해시킨 후 50mι들이 메스플라스크로 옮긴다. 다시 탈염수를 가하여 전체 용적이 50mι가 되게 한 후 이 용액의 총당류 함량과 글루코오스 이성화 효소의 활성도를 구한다. 글루코오스 이성화 효소의 회수율은 95.28%이었고 총당류 회수율은 7.35%이었다. 글루코오스 이성화효소 활성도 1단위당 총당류의 량은 1.89(r/u)이었다. 다음에 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 습기가 있는 Amberlite IRA-904 수지 10mι를 넣은 후 글루코오스 이성화 효소액(T)을 포화농도가 55%인 황산암모늄으로 처리하여 전술한 방법으로 조제한 효소액 12mι(글루코오스 이성화 효소 3,145단위 함유)을 이 칼럼 중에 도입하고 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 칼럼을 통하여 순환시킨다.

Amberlite IRA-904 수지로 된 칼럼에서의 공급된 글루코오스 이성화 효소의 흡착율은 100%이었다.

[비교실시예 2]

실시예 6에서 조제한 글루코오스 이성화 효소액(T) 200mι(글루코오스 이성화 효소 13,754단위 및 당류 337.76mg 함유)을 1ι들이 비이커에 넣고 차거운 이소프로판올 400mι(최종 이소프로판올 농도 66.7%)을 교반하면서 서서히 가한다.

4℃에서 1시간 교반시킨 혼합물을 15000rpm에서 15분간 원심분리시킨 것의 상청액을 경사분리 제거하고 침전물을 약 30mι 정도의 탈염수 중에 용해시킨 후 50mι들이 메스플라스크에 옮겨 탈염수를 가하여 전체 용적이 50mι되게 한다. 이 용액의 총당류 함량과 글루코오스 이성화 효소 활성도를 구한다. 글루코오스 이성화 효소의 회수율은 98.47%인 반면 총당류의 회수율은 73.0%이었으며 글루코오스 이성화효소 활성도 1단위당 총당류의 량은 18.21(r/u)이었다.

다음에 크기가 1.6×20cm인 칼럼 중에 Ambelrite IRA-904 수지 10mι을 충전한 후 글루코오스 이성화 효소액(T)를 농도가 66.7용적%인 이소프로판올로 처리하여 조제한 효소액 12mι(글루코오스 이성화 효소 3,250단위 함유)을 이 칼럼 중에 도입하고 실온에서 1BVH의 유속으로 하루밤 동안 칼럼을 통하여 순환시킨다.

Amberlite IRA-904 수지로 된 칼럼 중에서의 공급된 글루코오스 이성화 효소의 흡착율은 46.3%이었다.

[기준실시예 1]

실시예 1에서 나온 방법에 따라 조제한 고착된 글루코오스 이성화 효소 10mι를 사용하여 칼럼(1.6×20cm) 중에 충전하고 칼럼온도를 60℃에서 유지시킨다.

다음에는 pH가 8.5인 0.002M MgCl2를 함유하는 50% 글루코오스액을 칼럼 중으로 계속하여 통과(초기유속3.5BVH)시켜 유출액을 수집한다. 초기유출액의 프룩토오스 함량(DS에 대한 것임)은 45%로 한다.

유속(BVH)을 점차 감소시켜 프룩토오스 함량을 이 정도에서 유지시킨다. 20일 후 유속을 초기유속의 50%에 도달토록 한다.

[기준실시예 2]

실시예 6에서 나온 방법에 따라 조제한 고착된 글루코오스 이성화효소 10mι를 사용하여 칼럼(1.6×20cm) 중에 충전하고 칼럼 온도를 60℃에서 유지시킨다.

다음에는 pH가 8.5인 0.002M MgCl₂를 함유하는 50% 글루코오스액을 칼럼중으로 계속하여 통과(초기유속 3.8BVH)시켜 유출액을 수집한다. 초기유출액의 프룩토오스 함량(DS에 대한 것임)은 45%로 한다.

유속(BVH)을 점차 감소시켜 프룩토오스 함량을 이 정도에서 유지시킨다. 22일 후 유속을 초기 유속의 50%에 도달토록 한다.

[기준실시예 3]

실시예 9에서 나온 방법에 따라 조제한 고착된 글루코오스 이성화효소 10mι(습기가 있는 것)을 사용하여 칼럼(1.6×20cm) 중에 충전하고 칼럼온도를 70℃에서 유지시킨다.

pH가 8,5인 0,002M MgCl₂를 함유하는 50% 글루코오스액을 칼럼 중으로 계속하여 통과(초기유속 6BVH)시켜 유출액을 수집한다.

초기유출액의 프룩토오스 함량(DS에 대한 것임)을 45%로 한다. 유속을 점차 감소시켜 프룩토오스 함량을 이 정도에서 유지시킨다.

6일 후 유속은 초기유속의 50%가 된다.

Claims (1)

1. 염기성 음이온 교환수지에서 글루코오스 이성화 효소의 흡착을 방해하는 고분자량 비투석성 다당류를 함유한 미정제 글루코오스 이성화 효소 조제물을 스트립토 마이세스 속의 미생물로부터 얻고, 다당류를 글루코오스 이성화 효소 조제물로부터 분리하기 위하여, 다당류를 선택적으로 흡착하지만 효소에 대해서는 불활성인 이온교환수지 혹은 효소를 선택적으로 침전시킬 수 있는 유기용매 또는 염과 접촉시켜 다당류가 완전히 없는 정제된 글루코오스 이성화 효소를 얻은 다음, 정제된 글루코오스 이성화 효소를 흡수 고착시키기 위해서 글루코오스 이성화 효소의 흡착을 방해하는 다당류를 흡수할 수 있는 염기성 음이온 교환수지와 접촉시키는 것으로 구성되는 고착 글루코오스 이성화 효소를 제조하는 방법.

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