KR790001783B1

KR790001783B1 - 발효법에 의한 5'-퓨린누클레오 타이드의 제조법

Info

Publication number: KR790001783B1
Application number: KR7802373A
Authority: KR
Inventors: 이강만
Original assignee: 임철수; 미원 주식회사
Priority date: 1978-08-02
Filing date: 1978-08-02
Publication date: 1979-12-18

Abstract

내용 없음.

Description

발효법에 의한 5'-퓨린누클레오 타이드의 제조법

본 발명은 탄소원, 질소원, 무기질 및 미량의 성장 촉진 물질 등을 첨가한 배지에 5'-퓨린누클레오타이드류의 생성능이 있는 미생물을 배양하여 액중에 5'-퓨린누클레오타이드류를 생성시키는 방법에 관한 것으로써 배양시에 용존산소를 조절하는 데에 그 특징을 두고 있다.

발효법에 의하여 핵산계 물질을 제조하는 경우 호기성 배양에 의하는 것이 보편적이지만 배양기간중의 용존 산소를 경시적으로 조절함으로써 핵산 발효의 수율을 향상시키는 보고는 발견되지 않고 있다.

호기성 미생물은 그의 생육조건으로서 일정량의 산소를 요구하고 있으며 그 요구량은 균종이나 배지 조성 및 균의 배양 경과 시간 등에 따라 차이가 있다. 특히 미생물의 배양시간 경과에 따른용존 산소의 요구량은 그 미생물 균체의 성장과 대사물의 분비에 있어서 매우 중요한 영향을 주고 있다.

즉, 미생물의 발육초기(lag phase)에서는 접종된 종균이 새로운 배지에 대해 적응을 시도하는 단계로서 균의 증식이 미약하므로 산소의 요구량도 적은 상태지만 대수증식기(log phase)에 들어서면 균의 증식속도는 기하급수적으로 증가되며 이에 따라 산소의 요구량도 급증하게 된다. 그러다가 성장기(stationary phase)에 접어들면 균의 증식은 일단 정지되면서 대사 작용이 활발히 전개되며, 쇠퇴기(decreasing phase)에 달하면 균체는 이윽고 자체 보유효소계에 의한 자기 분해 현상이 일어나게 되며 산소의 요구량은 격감하게 된다.

상술한 바와 같이 미생물의 성장에 따른 산소의 요구량의 추이는 핵산 발효에 관여되는 호기성 미생물, 예컨데, 바칠러스·스트렙토마이세스·아아스로박터. 마이크로코커스. 브리비박테리움. 아스펠지러스속 등 핵산발효에 관여하는 거의 모든 미생물에 적용되는 현상이다.

본 출원인이 브리비박테리움. 암모니아게네스에 대하여 배양시간의 경과에 따른 산소의 소비속도(IO₂)를 측정해 본 결과 표1과 같이 균의 대수증식기에 있어서 산소의 요구량이 가장 많이 요구됨을 알았다.

이에 본 출원인은 위와 같은 사실에 착안하고, 대수증식 기간중에 액중의 용존산소가 일정량 이상 공급되도록 통기량 및 교반속도 등을 조절해 줌으로써 5'-퓨린누클레오타이드의 분비촉진을 시도 하였던바, 액중의 용존산소의 농도가 대수증식기부터 성장기에 이르기까지 3.0mg/ℓ이상이 되도록 유지해 주었을때 5'-IMP를 비롯한 5'-퓨린누클 레오타이드류의 분비가 촉진됨을 발견 하였다.

[표 1] B. ammoniagenesis의 성장에 따른 산소소비 속도

즉, 30ℓ들이 쟈. 훠멘타에 포도당을 주탄소원으로 하는 배지 5ℓ를 사입한후 여기에 브레비박테리움. 암모니아 게네스 IFO 12072를 접종하여 산소의 흡수속도(Kd)에 따른 5'-IMP의 생성량을 검토하였던 바, 표 2와 같이 Kd가 1.12×10^-6g.mole. 0.2/atm. min. ml일때 5'-1MP의 축적량은 12.1g/ℓ로 최고치를 기록하였다. 이때의 교반속도는 350RPM, 통미량 0.5VVM탱크 압력 1.0kg/cm²였으며, 액중의 용존산소는 3.51mg/ℓ이었다.

실험에 사용된 쟈. 훠멘타는 260mm

×480mm교반날개는 상단에 2매, 하단에 4매로 모두 Vaned disc type이며 교반날개의 근경은 113mm이다.

[표2] Kd 변화에 따른 5'-IMP 축적량

따라서 산소의 소비속도(IO₂)가 급격히 상승하는 대수증식계에서 흔히 야기되는 용존 산소의 부족현상을 방지시켜주기 위하여 통기량, 교반속도, 교반날개의 형태등의 조정에 의해 배양액내의 용존산소의 잔류농도를 3.50mg/ℓ이상이 되도록 조절했던바, 5'-IMP의 액중분비량이 현저히 증가함을 발견하였다.

이 결과 얻어진 배양액내의 5'-퓨린 누클레오타이드류는 공지의 이온교환수지법에 의해 분별하여 결정을 취득할 수 있다. 다음 실시예에 의해서 상세히 설명을 보충하고 자 한다.

[실시예 1]

포도당(고형분 88%) 2.25kg, 제일인산카리 150g, 황산망간mg, 뇨소 20mg, 황산 마그네슘 100g, L-씨스틴 300mg, 니코틴아마이드 25mg, 마이오틴 0.3mg, 미트엑스 30g, 소포제 KM＃ 72(일본 신월화학제)등으로 된 배지 15ℓ(pH6.8)를 30ℓ들이 쟈. 훠멘타에 사입하고 120℃에서 10분간 살균. 냉각하였다. 여기에 아데닌 요구성의 브레비 박테리움. 암모니아게네스 IFO12072를 접종하고 33℃에서 공기를분당 10ℓ씩주입하면서 배양하였다. 이때의 탱크 내압은 0.75kg/cm²이었다. 균의 증식이 왕성해지는 10시간부터 교반수를 350rpm에서 450rpm으로 상승시키고 통기량도 분당 30ℓ로 증량하였다. 균의 생육기가 끝나는 70시간부터 교반속도를 300rpm으로 통기량은 15ℓ에서 7.5ℓ가 될때까지 서서히 하향조절 했던바, 100시간의 5'-IMP축적량은 20.5g/ℓ이었다. 용존산소의 무조절지(대조균)에서는 14.5g/ℓ이었다.

이것을 공지의 이온교환수지법에 의해 5'-IMP를 회수한후 정제하고 5'-이노신산소다(7.5H₂O) 345.6g을 얻었다.

[실시예 2]

실시예 1과 같은 조성의 배지에 코리네 박테리움. 클루타미쿰 ATCC21265의 아데닌 요구성 변이주를 접종하고 30℃에서 300rpm, 0.75VVM, 탱크내압 0.75kg/cm²의 조건하에서 배양하였다.

대수증식기가 시작된 13시간후부터 380rpm, 1.5VVM, 1kg/cm²으로 각각 재조정하여 배양을 계속하다가 균의 성장기인 53시간후부터 350rpm, 1.0VVM으로 80시간 후 부터는 다시 0.75VVM으로 통기를감량하여 95시간에 배양을 종료한 결과 5'-IMP의 액내 축적량은 15.5g/ℓ이었으며, 대조균에서는 11.7g/ℓ이었다.

발효종료액을 원심분리한 후 pH9.0으로 조정하고 이온교환수지에 흡착통액한 후 순수로 용출하고 공지의 정제법으로 처리하여 5'-이소신산소다(7.5H₂O) 266.2g을 얻었다.

[실시예 3]

실시예 1과 같은 조성의 배지에 마이크로 박테리움. 암모니아 휠럼의 아데닌요구성 변이주를 접종하고 30℃에서 교반수 300rpm, 통기량 0.92VVM, 탱크 내압 0.75kg/cm²의 조건으로 배양하여 용존산소의 농도를 2.0∼2.5mg/ℓ이 유지되도록 하였다.

접종 10시간후부터 교반속도 350rpm, 통기량 1.4VVM, 탱크내압 1.0kg/cm²의 조건으로 80시간 후까지 계속하였다.

배양종료후 공지의 회수·정제방법에 의하여 5'-이소신산소다(7.5H₂O) 247.1g을 얻었다.

Claims

5'-푸린누클레오타이드를 생성하는 미생물을 탄소원 함유배지에 배양함에 있어서 배양액중의 용존산소의 농도를 균체의 대수증식기에서 성장기가 끝날때까지 최소 3.0mg/ℓ 이상이 되도록 유지하여 줌으로써 배양액중에 다량의 5'-퓨린누클레오타이드를 분비시킴을 목적으로 하는 발효법에 의한 5'-퓨린누클레오타이드의 제조방법.